Krioflessiesword algemeen gebruik vir die kriogeniese berging van sellyne en ander kritieke biologiese materiale, in dewar-ketels gevul met vloeibare stikstof.

Daar is verskeie stadiums betrokke by die suksesvolle bewaring van selle in vloeibare stikstof. Terwyl die basiese beginsel 'n stadige vries is, hang die presiese tegniek wat gebruik word af van die seltipe en kriobeskermingsmiddel wat gebruik word. Daar is verskeie veiligheidsoorwegings en beste praktyke om in ag te neem wanneer selle by sulke lae temperature gestoor word.

Hierdie plasing poog om 'n oorsig te gee van hoe krio-flessies in vloeibare stikstof gestoor word.

Wat is krio-flessies

Krioflesse is klein, toegedopte flessies wat ontwerp is vir die berging van vloeibare monsters teen uiters lae temperature. Hulle verseker dat selle wat in kriobeskermingsmiddel bewaar word, nie in direkte kontak met die vloeibare stikstof kom nie, wat die risiko van sellulêre frakture verminder terwyl steeds voordeel getrek word uit die uiterste verkoelingseffek van vloeibare stikstof.

Die flessies is gewoonlik beskikbaar in 'n reeks volumes en ontwerpe – hulle kan intern of ekstern geskroef wees met plat of afgeronde bodems. Steriele en nie-steriele formate is ook beskikbaar.

Wie gebruikCyrovialsom selle in vloeibare stikstof te stoor

'n Reeks NHS- en privaat laboratoriums, sowel as navorsingsinstellings wat spesialiseer in naelstringbloedbankdienste, epiteelselbiologie, immunologie en stamselbiologie, gebruik krio-flessies om selle te kriopreserveer.

Selle wat op hierdie manier bewaar word, sluit in B- en T-selle, CHO-selle, hematopoïetiese stam- en voorloperselle, hibridomas, dermselle, makrofage, mesenkiemale stam- en voorloperselle, monosiete, myeloom, NK-selle en pluripotente stamselle.

Oorsig van hoe om krio-flessies in vloeibare stikstof te bêre

Kriopreservasie is 'n proses wat selle en ander biologiese konstrukte preserveer deur hulle tot baie lae temperature af te koel. Selle kan jare lank in vloeibare stikstof gestoor word sonder verlies aan sel-lewensvatbaarheid. Hier is 'n uiteensetting van die prosedures wat gebruik word.

Selvoorbereiding

Die presiese metode vir die voorbereiding van monsters sal wissel na gelang van die seltipe, maar oor die algemeen word die selle versamel en gesentrifugeer om 'n selverryke pellet te ontwikkel. Hierdie pellet word dan hersuspendeer in die supernatant gemeng met kriopreservant of 'n kriopreservasiemedium.

Kriopreservasiemedium

Hierdie medium word gebruik om selle te bewaar in die lae-temperatuur omgewings waaraan hulle blootgestel sal word deur die vorming van intra- en ekstrasellulêre kristalle en dus seldood te inhibeer. Hul rol is om 'n veilige, beskermende omgewing vir selle en weefsels te bied tydens die vries-, bergings- en ontdooiingsprosesse.

'n Medium soos vars bevrore plasma (FFP), gehepariniseerde plasmalietoplossing of serumvrye, dierlike komponentvrye oplossings word gemeng met krioprotekteermiddels soos dimetielsulfoksied (DMSO) of gliserol.

Die hervloeibare monsterpellet word in polipropileen-krioviales soosSuzhou Ace Biomediese maatskappy Kriogeniese Bergingsflessies.

Dit is belangrik om nie die krio-flessies te oorvol te maak nie, aangesien dit die risiko van krake en die moontlike vrystelling van inhoud sal verhoog (1).

Beheerde Vrieskoers

Oor die algemeen word 'n stadige beheerde vriestempo gebruik vir die suksesvolle kriopreservasie van selle.

Nadat monsters in kriogeniese flessies verdeel is, word hulle op nat ys of in 'n 4℃-yskas geplaas en die vriesprosedure word binne 5 minute begin. As 'n algemene riglyn word selle teen 'n tempo van -1 tot -3 per minuut afgekoel (2). Dit word bereik deur 'n programmeerbare verkoeler te gebruik of deur flessies in 'n geïsoleerde boks te plaas wat in 'n beheerde tempo-vrieskas van -70°C tot -90°C geplaas word.

Oordrag na vloeibare stikstof

Die bevrore kriogeniese flessies word dan vir onbepaalde tydperke na 'n vloeibare stikstoftenk oorgeplaas, mits 'n temperatuur van minder as -135 ℃ gehandhaaf word.

Hierdie ultra-lae temperature kan verkry word deur onderdompeling in die vloeibare of dampfase stikstof.

Vloeistof- of dampfase?

Berging in vloeibare fase stikstof is bekend daarvoor dat dit die koue temperatuur met absolute konsekwentheid handhaaf, maar word dikwels nie aanbeveel om die volgende redes nie:

• Die behoefte aan groot volumes (diepte) vloeibare stikstof wat 'n potensiële gevaar inhou. Brandwonde of versmoring as gevolg hiervan is 'n werklike risiko.
• Gedokumenteerde gevalle van kruiskontaminasie deur aansteeklike agente soos aspergillus, hep B en virusverspreiding via die vloeibare stikstofmedium (2,3)
• Die potensiaal vir vloeibare stikstof om in die flessies te lek tydens onderdompeling. Wanneer dit uit die berging verwyder word en tot kamertemperatuur verhit word, sit die stikstof vinnig uit. Gevolglik kan die flessie verbrokkel wanneer dit uit die vloeibare stikstofberging verwyder word, wat 'n gevaar skep as gevolg van beide vlieënde puin en blootstelling aan die inhoud (1, 4).

Om hierdie redes word ultra-lae temperatuur berging meestal in dampfase stikstof geskied. Wanneer monsters in die vloeibare fase gestoor moet word, moet gespesialiseerde krioflex-buise gebruik word.

Die nadeel van die dampfase is dat 'n vertikale temperatuurgradiënt kan voorkom wat temperatuurskommelings tussen -135℃ en -190℃ tot gevolg het. Dit noodsaak noukeurige en ywerige monitering van die vloeibare stikstofvlakke en temperatuurvariasies (5).

Baie vervaardigers beveel aan dat krio-flessies geskik is vir berging tot -135 ℃ of slegs vir gebruik in die dampfase.

Ontdooiing van jou kriopreserveerde selle

Die ontdooiingsprosedure is stresvol vir 'n bevrore kultuur, en behoorlike hantering en tegniek is nodig om optimale lewensvatbaarheid, herstel en funksionaliteit van die selle te verseker. Die presiese ontdooiingsprotokolle sal afhang van spesifieke seltipes. Vinnige ontdooiing word egter as standaard beskou om:

• Verminder enige impak op sellulêre herstel
• Help om die blootstellingstyd aan die opgeloste stowwe in die vriesmedia te verminder
• Minimaliseer enige skade deur ysherkristallisasie

Waterbaddens, kraalbaddens of gespesialiseerde outomatiese instrumente word algemeen gebruik om monsters te ontdooi.

Meestal word 1 sellyn op 'n slag vir 1-2 minute ontdooi, deur dit saggies in 'n 37℃ waterbad te roer totdat daar net 'n klein bietjie ys in die flessie oor is voordat dit in 'n voorafverwarmde groeimedium gewas word.

Vir sommige selle soos soogdierembrio's, is stadige opwarming noodsaaklik vir hul oorlewing.

Die selle is nou gereed vir selkultuur, sel-isolasie, of in die geval van hematopoïetiese stamselle – lewensvatbaarheidstudies om die integriteit van die skenkerstamselle voor myeloablatiewe terapie te waarborg.

Dit is normale praktyk om klein hoeveelhede van die voorafgewaste monster te neem wat gebruik word om 'n seltelling uit te voer om selkonsentrasies vir uitplating in kultuur te bepaal. Jy kan dan die resultate van sel-isolasieprosedures assesseer en sel-lewensvatbaarheid bepaal.

Beste praktyke vir die berging van krio-flessies

Die suksesvolle kriopreservasie van monsters wat in kriofioele gestoor word, hang af van baie elemente in die protokol, insluitend behoorlike berging en rekordhouding.

• Verdeel selle tussen stoorplekke– Indien volumes dit toelaat, verdeel selle tussen flessies en bêre hulle op aparte plekke om die risiko van monsterverlies as gevolg van toerustingfoute te verminder.
• Voorkom kruiskontaminasie– Kies vir enkelgebruik steriele kriogeniese flessies of outoklaaf voor daaropvolgende gebruik
• Gebruik gepaste grootte flessies vir jou selle– flessies kom in 'n reeks volumes tussen 1 en 5 ml. Vermy oorvul van flessies om die risiko van krake te verminder.
• Kies interne of eksterne skroefdraad kriogeniese flessies– Intern geskroefde flessies word deur sommige universiteite aanbeveel vir veiligheidsmaatreëls – hulle kan ook kontaminasie tydens vulling of wanneer dit in die vloeibare stikstof gestoor word, voorkom.
• Voorkom lekkasie- Gebruik bi-ingespuite seëls wat in die skroefdop of O-ringe gegiet is om lekkasie en kontaminasie te voorkom.
• Gebruik 2D-strepieskodes en etiketteer flessies– om naspeurbaarheid te verseker, maak flessies met groot skryfareas dit moontlik om elke flessie voldoende te etiket. 2D-strepieskodes kan help met bergingsbestuur en rekordhouding. Kleurgekodeerde doppies is nuttig vir makliker identifikasie.
• Voldoende bergingsonderhoud- Om te verseker dat selle nie verlore gaan nie, moet stoorvate die temperatuur en vloeibare stikstofvlakke voortdurend monitor. Alarms moet aangebring word om gebruikers van foute te waarsku.

Veiligheidsmaatreëls

Vloeibare stikstof het algemene praktyk in moderne navorsing geword, maar hou die risiko van ernstige besering in indien dit verkeerd gebruik word.

Behoorlike persoonlike beskermende toerusting (PPE) moet gedra word om die risiko van bevriesing, brandwonde en ander nadelige voorvalle te verminder wanneer vloeibare stikstof hanteer word.

• Kriogeniese handskoene
• Laboratoriumjas
• Impakbestande volgesigskerm wat ook die nek bedek
• Toe-toon skoene
• Spatvaste plastiek voorskoot

Vloeibare stikstof-yskaste moet in goed geventileerde areas geplaas word om die risiko van versmoring te verminder – ontsnapte stikstof verdamp en verplaas atmosferiese suurstof. Groot hoeveelhede stoorplek moet alarmstelsels vir lae suurstof hê.

Dit is ideaal om in pare te werk wanneer vloeibare stikstof hanteer word en die gebruik daarvan buite normale werksure moet verbied word.

Krioflessies om jou werkvloei te ondersteun

Suzhou Ace Biomedical bied 'n wye verskeidenheid produkte wat aan u kriopreservasiebehoeftes vir verskillende soorte selle voldoen. Die portefeulje sluit 'n reeks buise sowel as 'n reeks steriele krio-flessies in.

Ons krio-flessies is:

• Laboratoriumskroefdop 0.5 ml 1.5 ml 2.0 ml Kriofles Kriogeniese flessies Koniese bodem-kriobuis met pakking

  ● 0.5ml, 1.5ml, 2.0ml spesifikasie, met romp of sonder romp
  ● Koniese of selfstaande ontwerp, steriel of nie-steriel is albei beskikbaar
  ● Skroefdopbuise is gemaak van mediese graad polipropileen
  ● PP-kriobuisflessies kan herhaaldelik gevries en ontdooi word
  ● Die ontwerp van die eksterne dop kan die waarskynlikheid van kontaminasie tydens monsterbehandeling verminder.
  ● Skroefdop kriogeniese buise Universele skroefdraad vir gebruik
  ● Buise pas op die meeste algemene rotors
  ● Kriogeniese buis o-ring buise pas standaard 1-duim en 2-duim, 48 putjies, 81 putjies, 96 putjies en 100 putjies vrieskassies
  ● Outoklaafbaar tot 121°C en vriesbaar tot -86°C

  DEEL NR	MATERIAAL	VOLUME	CAPKLEUR	PCS/SAK	SAKKE/DOOS
  ACT05-BL-N	PP	0.5ML	Swart, Geel, Blou, Rooi, Pers, Wit	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1.5ML	Swart, Geel, Blou, Rooi, Pers, Wit	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1.5ML	Swart, Geel, Blou, Rooi, Pers, Wit	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0ML	Swart, Geel, Blou, Rooi, Pers, Wit	500	10