Cảm ơn bạn đã truy cập Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt cập nhật (hoặc tắt chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo tiếp tục hỗ trợ, chúng tôi sẽ hiển thị trang web không có kiểu và JavaScript.
Tầm quan trọng của việc giám sát các mẫu môi trường đã được đánh giá rất cao kể từ khi bắt đầu xảy ra đại dịch COVID-19 và một số nỗ lực giám sát đang được thực hiện bằng cách sử dụng tiêu chuẩn vàng, mặc dù các kỹ thuật dựa trên qPCR rất tốn kém. Bộ cảm biến sinh học DNA điện hóa có thể mang lại hiệu quả về chi phí tiềm năng giải pháp giám sát các mẫu nước trong môi trường ở các quốc gia có thu nhập thấp và trung bình. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chứng minh khả năng phát hiện điện hóa các bộ khuếch đại thu được từ thể thực khuẩn Phi6 được phân lập từ các mẫu nước hồ có gai (một chất thay thế phổ biến cho SARS-CoV-2), sử dụng ENIG để hoàn thành các điện cực PCB mà không cần sửa đổi bề mặt.giới tính. Phản ứng của cảm biến điện hóa được đặc trưng kỹ lưỡng cho hai đoạn DNA có độ dài khác nhau (\({117}\,\hbox {bp}\) và \({503}\,\hbox {bp}\)) và ảnh hưởng của muối trong hỗn hợp PCR tổng thể đối với tương tác methylene blue (MB)-DNA. Kết quả của chúng tôi cho thấy độ dài của các đoạn DNA quyết định đáng kể độ nhạy điện hóa và chứng minh trong nghiên cứu này rằng khả năng phát hiện các bộ khuếch đại dài mà không cần tinh chế gel của các sản phẩm PCR là quan trọng để đo tại chỗ các mẫu nước.Một giải pháp hoàn toàn tự động cho tín hiệu tải lượng vi-rút tốt.
Sự lây truyền vi-rút qua đường nước đã được biết đến như một mối nguy hiểm đối với sức khỏe cộng đồng từ những năm 1940, với bằng chứng đầu tiên về sự lây truyền bệnh bại liệt và viêm gan E1 qua đường nước. Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã phân loại một số mầm bệnh vi-rút trong nước có mức độ ảnh hưởng sức khỏe từ trung bình đến cao2. Vi-rút truyền thống các phương pháp phát hiện dựa vào các kỹ thuật dựa trên qPCR tiêu chuẩn vàng, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, nhưng yêu cầu nhân viên có tay nghề cao kiểm tra trong phòng thí nghiệm bằng các dụng cụ đắt tiền. Tuy nhiên, ở các quốc gia có thu nhập thấp và trung bình (LMIC) với nguồn lực hạn chế, con người xét nghiệm mẫu có thể được ưu tiên hơn so với giám sát mẫu nước trong môi trường. Do đó, cần có các phương pháp thay thế chi phí thấp để giám sát bền vững, theo thời gian thực các mẫu nước và nước thải ở các quốc gia có thu nhập thấp và trung bình để cảnh báo sớm về sự bùng phát dịch bệnh mới nổi, do đó bảo vệ chúng khỏi những tác động kinh tế xã hội nghiêm trọng của đại dịch vi-rút. Các bộ cảm biến sinh học điện hóa chi phí thấp cho axit nucleic có thể cung cấp một giải pháp tiềm năng đầy hứa hẹn cho nhu cầu chưa được đáp ứng này. Nhiều bộ cảm biến sinh học DNA này hoạt động nhờ thực tế là các chuỗi DNA bổ sung được cố định trên điện cực bề mặt và lai hóa khi có trình tự phù hợp trong mẫu. Sau đó, tín hiệu này có thể được chuyển đổi thành tín hiệu bằng các kỹ thuật điện hóa khác nhau sử dụng các chất trung gian oxi hóa khử như kali sắt/ferrocyanua. Methylene xanh (MB) là một trong những phân tử hoạt tính oxi hóa khử như vậy, có đã được báo cáo là xen kẽ vào DNA sợi đôi (dsDNA) ngoài liên kết không đặc hiệu hơn của nó với DNA sợi đơn5,6. Bản chất xen kẽ của MB để tạo thành phức hợp MB-DNA khiến chúng trở thành lựa chọn phổ biến làm chất trung gian oxi hóa khử trong một số DNA điện hóa cấu hình cảm biến5,6,7,8,9. Mặc dù sự xen kẽ của MB với DNA là không đặc hiệu và tính đặc hiệu của cảm biến điện hóa này phụ thuộc phần lớn vào độ tinh khiết của mồi được sử dụng cho PCR hoặc khuếch đại đẳng nhiệt, nhưng nó rất phù hợp để triển khai thực tế. -qPCR dựa trên điện hóa thời gian hoặc khuếch đại đẳng nhiệt huỳnh quang thay thế cho phép đo nồng độ DNA 9. Trong một lần thực hiện như vậy, Won và cộng sự. Bề mặt của các điện cực vàng đã được sửa đổi bằng 6-mercapto-1-hexanol (MCH) cho thời gian thực phép đo các bộ khuếch đại PCR với MB bằng phương pháp vôn kế xung vi sai (DPV)9. Trong các trường hợp khác, Ramirez và cộng sự. Phát hiện SARS-CoV-2 trong nước thải bằng phản ứng RT-LAMP sử dụng MB với các điện cực được in trên màn hình. Các điện cực bạch kim cũng đã được thử nghiệm được sử dụng làm điện cực tại chỗ trong nền tảng PCR vi lỏng được thiết kế để phát hiện điện hóa các bộ khuếch đại trong các phản ứng 8. Tất cả các nghiên cứu này đều yêu cầu sửa đổi bề mặt của các điện cực, ngụ ý tăng chi phí sản xuất và vận hành do yêu cầu lưu trữ đặc biệt đối với sự ổn định của các điện cực chức năng hóa này.
Sơ đồ quy trình phát hiện điện hóa các bộ khuếch đại thu được từ các hạt virus đậm đặc trong các mẫu nước hồ.
Gần đây, chúng tôi đã chứng minh khả năng cảm biến điện hóa của các bộ khuếch đại SARS-CoV-2 với các điện cực bảng mạch in (PCB) chi phí thấp dựa trên DPV và vôn kế tuần hoàn (CV) được tạo ra bởi sự hấp phụ của các phức hợp MB-DNA trên bề mặt của các điện cực không biến đổi ) thay đổi cực đại hiện tại11.Chúng tôi báo cáo rằng các đoạn DNA dài hơn (N1-N2, \({943}\, \hbox) được hình thành bằng cách sử dụng đoạn mồi ngược N1 và N2 do CDC khuyến nghị so với các đoạn ngắn hơn {bp}\)) cho thấy độ tuyến tính tốt hơn trong phản ứng của cảm biến ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) được hình thành bằng cách sử dụng bộ mồi N1 xuôi và ngược N1. Các nghiên cứu này được báo cáo bằng cách sử dụng các dung dịch pha loãng DNA được chuẩn bị trong nước không có nuclease. Nền tảng này cũng được sử dụng để phát hiện SARS-CoV -2 bộ khuếch đại trong các mẫu nước thải mô phỏng (thu được bằng cách thêm các mẫu RNA tổng số bằng RNA của SARS-CoV-2). Vì RNA dễ bị cắt trong quá trình phân lập và xử lý tiếp theo,12,13 rất khó để khuếch đại các đoạn dài hơn với mẫu không đồng nhất này. Do đó, việc chứng minh khả năng cảm biến điện hóa của bộ khuếch đại SARS-CoV-2 trong nước thải chỉ giới hạn ở đoạn \(72\,\hbox {bp}\) N1 ngắn hơn.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu tính khả thi của cảm biến điện hóa dựa trên PCB ENIG của phage Phi6 được cô đặc và phân lập từ các mẫu nước hồ (Hình 1). Các phage Phi6 có kích thước tương đương (80-100 nm) với SARS-CoV-2 và cũng có màng lipid và protein dạng gai. Vì những lý do này, thể thực khuẩn Phi6 là chất thay thế phổ biến cho SARS-CoV-2 và các vi rút RNA gây bệnh có vỏ bọc khác14,15.RNA được phân lập từ các hạt thể thực khuẩn được sử dụng làm khuôn mẫu để tổng hợp cDNA, sau đó là PCR để thu được hai đoạn DNA có độ dài 117 và 503 cặp bazơ. Với thách thức khuếch đại các đoạn \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 trong công việc trước đây của chúng tôi, chúng tôi nhắm mục tiêu các đoạn có độ dài trung gian (\(117 \,\hbox {bp}\) và \(503 \,\hbox {bp}\)), dựa trên các đoạn mồi có sẵn. Phản ứng của cảm biến điện hóa đã được nghiên cứu một cách có hệ thống trên một dải nồng độ rộng (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) đến \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Đối với cả hai đoạn trong sự hiện diện của MB, ảnh hưởng của muối đối với phản ứng của cảm biến đã được đặc trưng và xác thực chéo bằng các phép đo quang phổ. Những đóng góp chính của công trình này như sau:
Chiều dài đoạn DNA và sự hiện diện của muối trong mẫu ảnh hưởng mạnh đến độ nhạy.Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng hoạt động điện hóa phụ thuộc vào các cơ chế tương tác khác nhau của MB, DNA và cảm biến trong phản ứng vôn kế, tùy thuộc vào nồng độ và độ dài DNA, với các Mảnh vỡ dài hơn cho thấy độ nhạy cao hơn, mặc dù muối có tác động tiêu cực đến tương tác tĩnh điện giữa MB và ADN.
Nồng độ DNA xác định cơ chế tương tác MB-DNA trong các điện cực không biến đổi Chúng tôi chứng minh rằng các cơ chế tương tác MB-DNA khác nhau phụ thuộc vào nồng độ DNA. Ở nồng độ DNA dưới một lượng nhỏ \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), chúng tôi quan sát thấy rằng phản ứng dòng điện hóa chủ yếu được xác định bởi sự hấp phụ MB-DNA trên điện cực, trong khi ở nồng độ thấp hơn. Ở nồng độ DNA cao, phản ứng dòng điện hóa được xác định bởi sự ức chế không gian của quá trình oxy hóa khử hoạt động do chèn MB giữa các cặp bazơ DNA.
ENIG Cảm biến điện hóa dựa trên PCB của axit nucleic của virut trong các mẫu nước hồ Các quan sát được xác thực bằng cách phát hiện điện hóa các đoạn DNA \(503\,\hbox {bp}\) được thêm vào Phi6 thu được từ các mẫu nước từ Hồ Powai, Cơ sở IIT Mumbai Kết quả phage.
Chi phí triển khai thấp và tiềm năng tích hợp vào các hệ thống giám sát hoàn toàn tự động , oligonucleotide hoặc aptamer trên các điện cực có thời hạn sử dụng lâu hơn.
Phage Phi6 là một virus DSRNA có vỏ bọc thuộc họ Cytoviridae lây nhiễm Pseudomonas syringae. Bộ gen của phage Phi6 tồn tại ở dạng 3 đoạn: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07 \,\hbox {Kb}\)) và L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Vì thể thực khuẩn Phi6 lây nhiễm chủng Pseudomonas BSL-1 không gây bệnh, nên sử dụng an toàn và có thể dễ dàng nuôi cấy trong phòng thí nghiệm.Phage Phi6 và Pseudomonas syringae ký chủ của nó được mua từ Trung tâm tham khảo Felix d'Herelle về vi rút vi khuẩn, Đại học Laval, Canada (số catalô của trung tâm tham khảo lần lượt là HER-102 và HER-1102) Thể thực khuẩn .Phi6 và vật chủ của nó đã được hồi sinh theo chỉ dẫn của trung tâm tham chiếu.Phage Phi6 đã được tinh chế bằng phương pháp ly giải đĩa và rửa giải để thu được các chuẩn độ cuối cùng với \(\about 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (đơn vị hình thành mảng bám/ml).RNA được phân lập từ các hạt thể thực khuẩn tinh khiết bằng cách sử dụng GenElute™ Universal Total RNA Purifying Kit (Sigma-Aldrich) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm lại, huyền phù thể thực khuẩn tinh khiết Phi6\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) đã bị ly giải và dịch ly giải được nạp vào cột kéo sợi để cho phép RNA liên kết với cột nhựa . Sau đó, RNA được rửa giải trong dung dịch rửa giải \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) do bộ công cụ cung cấp. Ước tính nồng độ RNA bằng độ hấp thụ tại \(260\,\hbox {nm}\).RNA được lưu trữ trong các phần dịch chiết trong \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) cho đến khi sử dụng tiếp.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Bộ công cụ tổng hợp iScript cDNA (Bio -Rad Laboratories) đã được sử dụng làm khuôn mẫu để tổng hợp cDNA theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm lại, phản ứng tổng hợp cDNA bao gồm 3 bước: mồi tại \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , sao chép ngược của \({20}\,{\hbox {min}}\) tại \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) và đảo ngược Đầu ghi nằm trong \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) cho \({1}\,{\hbox {min }}\).Khi chạy trên gel agarose 1%, cDNA cho thấy ba dải tương ứng với ba đoạn RNA dự kiến (dữ liệu không được hiển thị). Các đoạn mồi sau được sử dụng để khuếch đại hai đoạn DNA có chiều dài 117 và 503 bp, sử dụng cDNA làm khuôn mẫu cho PCR trong máy luân nhiệt miniPCR® mini8:
Các đoạn mồi cho \(117\,\hbox {bp}\) và \(503\,\hbox {bp}\) tương ứng với 1476-1575 nucleotide của đoạn M và 458-943 nucleotide của đoạn L, tương ứng với axit .Tất cả các sản phẩm PCR khuếch đại được điện di trên gel agarose 1% và DNA đích khuếch đại được tinh chế bằng cách sử dụng Bộ tách chiết Gel GeneJET (Thermo Fisher Khoa học).
Một hồ nước tại khuôn viên IIT Mumbai (Hồ Powai, Powai, Mumbai) đã được sử dụng để thêm các hạt thể thực khuẩn. Nước hồ được lọc qua màng \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) để loại bỏ các hạt lơ lửng và sau đó phage Phi6 được thêm vào. Thêm \({1}\,{\hbox {ml}}\) của \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) thành \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) nước hồ đã lọc, trong \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). dành riêng cho phép đo tải lượng vi-rút bằng xét nghiệm mảng bám. Chúng tôi đã thử nghiệm hai phương pháp khác nhau để cô đặc các hạt vi-rút Phi6 có gai: (1) phương pháp kết tủa hấp phụ hydroxit nhôm,19 đã được xác nhận về nồng độ của một số vi-rút RNA bao bọc từ các mẫu môi trường và (2) ) Phương pháp tập trung vi rút dựa trên polyetylen glycol (PEG) được điều chỉnh từ Flood et al.20. Vì hiệu quả thu hồi của phương pháp dựa trên PEG được cho là tốt hơn so với phương pháp nhôm hydroxit nên phương pháp dựa trên PEG đã được sử dụng để cô đặc các hạt Phi6 từ các mẫu nước hồ.
Phương pháp PEG được sử dụng như sau: PEG 8000 và \(\hbox {NaCl}\) được thêm vào các mẫu nước hồ có pha thêm Phi6 để thu được 8 % PEG 8000 và \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Các mẫu được ủ trên máy lắc\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), sau đó ly tâm ở \(4700 \,\hbox {g}\) là \({45}\,{\hbox {min}}\). Loại bỏ phần nổi phía trên và tái tạo huyền phù viên trong \({1}\, {\hbox {ml}}\) trong cùng một chất nổi phía trên. Tất cả các thí nghiệm xác định nồng độ virus và tăng đột biến được thực hiện ba lần. Sau khi cô đặc, một lượng nhỏ được dành riêng để đo lường hiệu quả phục hồi bằng xét nghiệm mảng bám.RNA được phân lập như đã mô tả trước đây và rửa giải trong dung dịch đệm rửa giải do bộ kit cung cấp\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Vì nồng độ RNA sẽ thay đổi từ mẫu này sang mẫu khác trong ba lần, nên \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) của RNA được sử dụng cho cả ba loại bất kể nồng độ của nó Quá trình tổng hợp cDNA của các mẫu. Quá trình tổng hợp cDNA được thực hiện như mô tả trước đó.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA đã được sử dụng làm mẫu cho PCR \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) trong 35 chu kỳ để khuếch đại \(117\,\hbox {bp}\) và \(503\,\hbox { bp}\). Các mẫu này được biểu diễn dưới dạng “1:1″, nghĩa là không pha loãng. Một biện pháp kiểm soát không có mẫu (NTC) được thiết lập làm đối chứng âm tính, trong khi một cDNA được tổng hợp bằng cách sử dụng RNA được phân lập từ thể thực khuẩn tinh sạch được thiết lập làm khuôn mẫu cho kiểm soát dương tính (PC). PCR định lượng (qPCR) được thực hiện trong thiết bị RT-PCR Stratagene Mx3000P sử dụng Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Công nghệ Agilent). Các phản ứng được thiết lập ba lần như trước đây được mô tả. Ngưỡng chu kỳ (Ct) được ghi lại cho tất cả các mẫu. Ngoài ra, các mẫu được pha loãng là \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) bằng cách sử dụng cDNA pha loãng 1:100 trong nước hồ đã lọc như \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR trong 35 chu kỳ. Các mẫu này được biểu thị là “1:100″.
Các điện cực PCB được chế tạo bằng cách sử dụng quy trình Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) chi phí thấp có bán trên thị trường mà không cần mạ vàng bổ sung. Thông số kỹ thuật của điện cực ENIG PCB được trình bày chi tiết trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi11. Đối với các điện cực ENIG PCB, các phương pháp làm sạch điện cực truyền thống như dung dịch piranha hoặc vôn kế vòng axit sunfuric không được khuyến nghị vì chúng có thể gây bong tróc lớp vàng mỏng (độ dày \(\approx\) \(100\,\hbox {nm }\)) và làm lộ các lớp đồng bên dưới dễ bị ăn mòn 21, 22, 23, 24, 25. Do đó, hãy làm sạch các điện cực bằng vải không xơ thấm IPA. Mẫu cần thử nghiệm được ủ với \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB trong \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) để chèn dễ dàng. Trong công việc trước đây của chúng tôi , chúng tôi quan sát thấy rằng độ nhạy và độ tuyến tính của cảm biến đã được cải thiện bằng cách tăng nồng độ MB 11 . Dựa trên các tối ưu hóa được báo cáo trong công việc trước đó, chúng tôi đã sử dụng \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB nồng độ để nhúng DNA trong nghiên cứu này. Có thể phát hiện điện hóa DNA sợi kép (ds-DNA) bằng cách sử dụng các chất xen kẽ anion hoặc cation. Mặc dù các chất xen kẽ anion phát hiện DNA với độ chọn lọc tốt hơn, nhưng chúng cần ủ qua đêm, dẫn đến thời gian phát hiện lâu hơn. Bật mặt khác, các chất xen kẽ cation như MB yêu cầu thời gian ủ ngắn hơn, xấp xỉ \({1}\,{\hbox {h}}\) để phát hiện điện hóa của DS-DNA6. Mỗi phép đo liên quan đến việc phân phối mẫu cần thử nghiệm trên điện cực\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), sau đó làm sạch bằng giẻ thấm IPA trước khi tiếp tục với mẫu khác.một phép đo. Mỗi mẫu được kiểm tra trên 5 điện cực khác nhau trừ khi có quy định khác. Phép đo DPV và CV được thực hiện bằng cách sử dụng bộ điều chỉnh điện áp PalmSens Sensit Smart và phần mềm PSTrace được sử dụng để cấu hình bộ điều chỉnh điện áp và thu thập dữ liệu, bao gồm tính toán dòng điện cực đại. Các cài đặt sau được sử dụng đối với phép đo DPV và CV:
DPV: Thời gian cân bằng = \(8\,\hbox {s}\), Bước điện áp = \(3\,\hbox {mV}\), Điện áp xung = \(25\,\hbox {mV}\) , thời lượng xung = \(50\,\hbox {ms}\), tốc độ quét = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Thời gian cân bằng = \(8\,\hbox {s}\), Bước điện áp = \(3\,\hbox {mV}\), Tốc độ quét = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Dòng cực đại thu được từ điện tâm đồ của DNA được tạo phức với \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Điện tâm đồ DPV và CV thu được trên các điện cực PCB ENIG \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB được tạo phức với DNA (ở nồng độ 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) tức là 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) cho \(117\,\hbox {bp}\ ) và 0,03 –\({0,06}\,{\upmu \hbox {M}}\) cho \(503\,\hbox {bp}\)). Điện tâm đồ đại diện được hiển thị trong Hình S1 trong Thông tin bổ sung. Hình 2 cho thấy kết quả của các phép đo DPV và CV (dòng điện cực đại) bằng cách sử dụng các sản phẩm PCR được tinh chế bằng gel. So với phép đo CV, phép đo DPV cho thấy độ nhạy cao hơn (dòng điện là một hàm của nồng độ DNA) vì dòng điện dung nền trong phép đo CV ẩn dòng điện Faradaic 26 . Dữ liệu đối với mỗi hộp trong biểu đồ hộp chứa các phép đo từ 5 điện cực. Tất cả các phép đo đều sử dụng cùng một bộ điện cực để tránh sai số đo do sự biến đổi giữa điện cực với điện cực. Chúng tôi đã quan sát thấy xu hướng gia tăng về dòng điện cực đại đo được của DPV và CV đối với nồng độ DNA thấp hơn , dài hơn (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ so với đoạn \(117) ). Điều này phù hợp với xu hướng hấp phụ điện cực dự kiến được báo cáo trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi. sự hấp phụ của phức hợp MB-DNA tạo điều kiện thuận lợi cho sự truyền điện tích trên điện cực, góp phần làm tăng dòng điện cực đại. Các nghiên cứu khác đã chỉ ra ảnh hưởng của kích thước và trình tự oligonucleotide đối với sự xen kẽ MB-DNA27,28,29,30. guanine Hàm lượng -cytosine (GC) của hai bộ khuếch đại (\(117\,\hbox {bp}\) và \(503\,\hbox {bp}\)) xấp xỉ 50%, cho thấy quan sát thấy sự khác biệt là do đến độ dài khuếch đại. Tuy nhiên, đối với nồng độ DNA cao hơn (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), đối với \(503\,\hbox {bp} \) và \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) cho \(117\,\hbox {bp}\)), chúng tôi quan sát thấy hai sự khuếch đại dòng điện cực đại của subs bị giảm trong cả phép đo DPV và CV. Điều này là do MB bão hòa và xen kẽ giữa các cặp bazơ của DNA, dẫn đến sự ức chế không gian đối với hoạt động oxi hóa khử của nhóm có thể khử trong MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Các muối có trong hỗn hợp PCR chính cản trở tương tác tĩnh điện giữa MB và DNA, vì vậy bằng cách thêm \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) với \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) Sản phẩm tinh khiết bằng gel MB để nghiên cứu ảnh hưởng của muối đối với tương tác giữa MB-DNA. Như được hiển thị trong Hình 3, chúng tôi quan sát thấy rằng đối với nồng độ DNA cao hơn (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) và \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) cho \(117\,\hbox {bp} \)), trong DPV và CV Việc bổ sung muối không ảnh hưởng đáng kể đến các phép đo (xem Hình S2 trong Thông tin bổ sung về điện tâm đồ đại diện). Tuy nhiên, tại nồng độ DNA thấp hơn, việc bổ sung muối làm giảm đáng kể độ nhạy, dẫn đến không có thay đổi đáng kể về nồng độ DNA hiện tại. Tác động tiêu cực tương tự của muối đối với tương tác và xen kẽ MB-DNA đã được các nhà nghiên cứu khác báo cáo trước đây33,34.\(\hbox { Các cation Mg}^{2+}\) liên kết với xương sống phốt phát âm của DNA, do đó cản trở tương tác tĩnh điện giữa MB và DNA. Ở nồng độ DNA cao hơn, sự ức chế không gian của MB hoạt động oxy hóa khử dẫn đến dòng điện cực đại thấp hơn, do đó tương tác tĩnh điện không ảnh hưởng đáng kể đến phản ứng của cảm biến. Điểm mấu chốt là bộ cảm biến sinh học này phù hợp hơn để phát hiện nồng độ DNA cao hơn (hiếm khi \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) trở lên), để xử lý hoàn toàn tự động các mẫu nước môi trường, nơi mà quá trình tinh chế gel của các sản phẩm PCR có thể không khả thi.
Diện tích dưới đường cong hấp thụ cho dải bước sóng 600–700 \(\hbox {nm}\) đối với các nồng độ khác nhau của DNA được tạo phức với \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) có và không có muối (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) có và không có muối (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Nồng độ DNA tương ứng với các mẫu \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB Không có DNA.
Để xác minh thêm các kết quả trên, chúng tôi đã thực hiện các phép đo quang học bằng máy đo quang phổ UV/Vis (Thermo Science Multiskan GO), các mẫu \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) được sử dụng cho mỗi Phép đo. Dấu hiệu hấp thụ giảm khi tăng nồng độ DNA, như có thể thấy từ xu hướng của khu vực dưới đường cong hấp thụ cho dải bước sóng \(600\,\hbox {nm}\) đến \(700\,\hbox { nm}\) , như trong Hình 4 (phổ hấp thụ trong Hình S3 trong Thông tin bổ sung). Đối với các mẫu có nồng độ DNA nhỏ hơn \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), không có sự khác biệt đáng kể về mức độ hấp thu giữa các mẫu chứa DNA và chỉ chứa MB (đối với \(503\,\hbox {bp}\) và \(117\,\hbox {bp}\ ) đoạn dài), cho thấy không có sự ức chế không gian của MB hoạt tính oxi hóa khử. Ở nồng độ DNA cao hơn, chúng tôi quan sát thấy tín hiệu hấp thụ giảm dần và ghi nhận mức giảm hấp thụ ít hơn khi có muối. Những kết quả này được cho là do phân tử tương tác và ức chế không gian với sự sắp xếp bazơ trong các giống lai DNA. Kết quả của chúng tôi phù hợp với các báo cáo trong tài liệu về nghiên cứu quang phổ về sự xen kẽ MB-DNA có liên quan đến hiện tượng giảm sắc tố với mức năng lượng giảm trong \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) chuyển tiếp điện tử do xen kẽ Lớp 36, 37, 38.
Điện di trên gel agarose của phage Phi6: Sản phẩm PCR có độ dài \(117\,\hbox {bp}\) và \(503\,\hbox {bp}\) từ mẫu nước hồ.M-DNA marker;Điều khiển NTC-no-template, các đoạn mồi chứa các bộ khuếch đại tương ứng;PC kiểm soát tích cực;Các mẫu nước hồ có pha 1, 2, 3 không pha loãng (1:1) được làm ba lần. Một dải có thể nhìn thấy ở \(\about 50\,\hbox {bp}\) do các oligonucleotide không được sử dụng trong \(503\,\ hbox {bp}\) làn đường.
Chúng tôi đã đánh giá tiện ích của cảm biến bằng cách sử dụng các mẫu nước ở Hồ Powai được thêm phage Phi6. Nồng độ RNA được phân lập từ các mẫu nước có phage của phage dao động trong khoảng 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), trong khi những RNA được phân lập từ huyền phù thể thực khuẩn tinh khiết RNA được ước tính là \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) với hiệu suất thu hồi xấp xỉ 1 %.RNA được phiên mã ngược thành cDNA và được sử dụng làm khuôn mẫu cho PCR và qPCR. Kích thước sản phẩm được xác nhận bằng điện di trên gel agarose (Hình 5) trước khi thử nghiệm với cảm biến. Các mẫu này không được tinh chế bằng gel và do đó chứa tất cả các thành phần của PCR như cũng như các bộ khuếch đại quan tâm. Các giá trị Ct được ghi lại trong quá trình qPCR (Bảng 1) được chứng minh là tương quan với nồng độ RNA được phân lập từ các mẫu nước có pha thêm tương ứng. Giá trị Ct cho thấy số chu kỳ cần thiết cho tín hiệu huỳnh quang để vượt quá ngưỡng hoặc tín hiệu nền. Giá trị Ct cao hơn cho thấy nồng độ mẫu thấp hơn và ngược lại. Giá trị Ct của các mẫu NTC cao như mong đợi. Sự khác biệt về giá trị Ct \(\xấp xỉ 3\) giữa các giá trị Ct đối chứng dương tính và mẫu thử nghiệm cho biết thêm rằng mỗi mẫu thử nghiệm có khoảng 1% mẫu so với đối chứng dương tính. Chúng tôi đã thảo luận trước đây rằng các bộ khuếch đại dài hơn dẫn đến độ nhạy tốt hơn. Việc khuếch đại các đoạn dài hơn được phân lập từ các mẫu môi trường không đồng nhất là một thách thức do những nhược điểm có nồng độ vi-rút thấp và sự phân hủy RNA. Tuy nhiên, với giao thức khuếch đại PCR và làm giàu vi-rút, chúng tôi đã có thể khuếch đại thành công đoạn \(503\,\hbox {bp}\) cho cảm biến điện hóa.
Hình 6 cho thấy kết quả cảm biến điện hóa của bộ khuếch đại đoạn \(503\,\hbox {bp}\), cả hai đều sử dụng cDNA không pha loãng làm mẫu (1:1) và cDNA pha loãng 100 lần làm mẫu (1:100 ) đã thực hiện PCR , so với NTC và PC (xem Hình S4 trong Thông tin bổ sung để biết điện tâm đồ đại diện). Mỗi ô trong sơ đồ hộp trong Hình 6 chứa các phép đo từ ba mẫu ở 5 điện cực. Các điện cực giống nhau được sử dụng để đo tất cả các mẫu để tránh sai số do điện cực biến thể -to-electrode. So với phép đo CV, phép đo DPV cho thấy độ phân giải tốt hơn để phân biệt các mẫu thử nghiệm và mẫu PC với NTC bởi vì, như đã đề cập trước đó, dòng điện Faradaic bị ẩn do dòng điện dung nền trong phần sau. Đối với các bộ khuếch đại dài hơn, chúng tôi đã quan sát thấy rằng đối chứng âm (NTC) dẫn đến dòng điện đỉnh CV và DPV cao hơn so với đối chứng dương, trong khi các mẫu thử nghiệm dương tính và mẫu không pha loãng cho thấy chiều cao cực đại của dòng điện đỉnh DPV tương tự nhau. Giá trị trung bình và giá trị trung bình đo được cho từng mẫu không pha loãng (1:1 ) mẫu thử nghiệm và PC có thể được phân giải rõ ràng từ đầu ra cảm biến cho mẫu NTC, trong khi độ phân giải cho mẫu pha loãng 1:100 kém rõ rệt hơn. Đối với cDNA pha loãng 100 lần, chúng tôi không quan sát thấy bất kỳ dải nào trong quá trình điện di trên gel (các làn đường không được hiển thị trong Hình 5) và các dòng điện cực đại DPV và CV tương ứng tương tự như dòng điện dự kiến cho NTC. Kết quả cho đoạn \(117\,\hbox {bp}\) được hiển thị trong Thông tin bổ sung. điều khiển gây ra phản ứng điện hóa từ cảm biến PCB do sự hấp phụ MB tự do trên điện cực và sự tương tác của MB với mồi oligonucleotide chuỗi đơn. Do đó, mỗi lần thử nghiệm mẫu, phải chạy đối chứng âm và dòng điện cực đại của mẫu thử nghiệm so với dòng điện cực đại thu được từ đối chứng âm để đạt được phép đo chênh lệch (tương đối)39,40 để phân loại mẫu thử nghiệm là dương tính hay âm tính.
(a) DPV và (b) Dòng điện cực đại CV để phát hiện điện hóa các mảnh \(503\,\hbox {bp}\) trong các mẫu nước hồ. Các mẫu thử nghiệm được đo ba lần và được so sánh với các mẫu không có mẫu điều khiển (NTC) và kiểm soát tích cực (PC).
Phát hiện của chúng tôi minh họa các cơ chế khác nhau ảnh hưởng đến hiệu suất của cảm biến điện hóa đối với các bộ khuếch đại có độ dài khác nhau đối với các DNA khác nhau, với nồng độ được xác minh bằng các phép đo quang học bằng máy đo quang phổ UV/Vis. Các quan sát của chúng tôi nhấn mạnh cái nhìn sâu sắc rằng các đoạn DNA dài hơn lên đến \(\xấp xỉ\) \(500\,\hbox {bp}\) có thể được phát hiện với độ nhạy cao hơn và sự hiện diện của muối trong mẫu không Độ nhạy Nồng độ DNA ảnh hưởng đến độ nhạy cao hơn (hiếm khi \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) trở lên). Ngoài ra, chúng tôi đã nghiên cứu tác động của các loại mẫu khác nhau, bao gồm các bộ khuếch đại tinh khiết bằng gel có và không thêm muối, đồng thời bổ sung các mẫu nước hồ trong phép đo DPV và CV.Chúng tôi quan sát thấy rằng DPV cung cấp độ phân giải tốt hơn, vì dòng điện dung nền cũng ảnh hưởng đến phép đo CV, khiến nó kém nhạy hơn.
Sự khuếch đại của các đoạn dài hơn phụ thuộc vào tính toàn vẹn của RNA bộ gen của virus. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc khuếch đại các đoạn dài hơn không phải lúc nào cũng hiệu quả do sự phân hủy RNA trong môi trường và khả năng ghép nối trong quá trình phân lập11,41,42,43,44 .Chúng tôi quan sát thấy rằng phương pháp cô đặc vi rút dựa trên PEG hiệu quả hơn trong việc cô đặc phage Phi-6 có gai nhọn trong các mẫu nước hồ so với phương pháp cô đặc vi rút dựa trên nhôm hydroxit. Khả năng phát hiện các đoạn DNA dài đã chứng minh là vượt qua yêu cầu đối với phản ứng PCR đa hợp để khuếch đại nhiều mẫu có độ dài ngắn hơn và giảm khả năng đặc hiệu chéo.
Các mẫu sinh học khan hiếm, vì vậy cần thiết kế một bộ cảm biến sinh học yêu cầu tối thiểu các mẫu để thử nghiệm. Các điện cực PCB ENIG được sử dụng trong nghiên cứu này chỉ yêu cầu \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) các mẫu để thử nghiệm bao phủ vùng hiệu dụng của các điện cực. Ngoài ra, có thể tái sử dụng cùng một điện cực sau khi làm sạch trước khi phân phối mẫu tiếp theo. Các mẫu được khuếch đại không yêu cầu thêm bất kỳ hóa chất nào ngoài xanh methylene, đây là một chất không tốn kém và hóa chất thường được sử dụng. Vì mỗi điện cực tốn khoảng 0,55 USD (hoặc 40 INR) để sản xuất nên cảm biến sinh học này có thể là giải pháp thay thế hiệu quả về mặt chi phí cho các công nghệ phát hiện hiện có. Bảng 2 cho thấy sự so sánh công việc này với các cảm biến khác đã được báo cáo trong tài liệu từ lâu Các đoạn DNA trong các mẫu không đồng nhất.
Do các giao thức phát hiện điện hóa dựa trên MB dựa vào tính đặc hiệu của PCR, hạn chế chính của phương pháp này là khả năng khuếch đại không đặc hiệu trong các mẫu không đồng nhất như nước thải và nước hồ hoặc sử dụng mồi có độ tinh khiết thấp. Để cải thiện độ nhạy của các phương pháp phát hiện điện hóa để phát hiện DNA của các sản phẩm PCR chưa tinh sạch sử dụng điện cực PCB ENIG chưa biến tính, cần phải hiểu rõ hơn về các lỗi do dNTP và mồi không sử dụng gây ra, đồng thời tối ưu hóa các điều kiện phản ứng và quy trình xét nghiệm. Các thông số hóa lý bổ sung như pH, nhiệt độ và sinh học nhu cầu oxy (BOD) của mẫu nước cũng có thể cần được đo để cải thiện độ chính xác của phép đo.
Để kết luận, chúng tôi đề xuất một cảm biến ENIG PCB điện hóa chi phí thấp để phát hiện vi-rút trong các mẫu môi trường (nước hồ). Không giống như các điện cực oligonucleotide cố định hoặc chất nền tùy chỉnh cho cảm biến DNA yêu cầu lưu trữ đông lạnh để duy trì độ nhạy,53,54 kỹ thuật của chúng tôi sử dụng PCB không biến đổi các điện cực có thời hạn sử dụng lâu hơn và không có yêu cầu lưu trữ cụ thể, do đó phù hợp để phát triển các giải pháp đo lường với quá trình xử lý mẫu tự động được triển khai trong LMIC. Bộ cảm biến sinh học sử dụng thuốc nhuộm oxi hóa khử xen kẽ DNA (MB) rẻ tiền để phát hiện nhanh các bộ khuếch đại mục tiêu. Sự khuếch đại không đặc hiệu phổ biến trong các mẫu môi trường làm giảm tính đặc hiệu của phương pháp cảm biến này do sự liên kết không đặc hiệu của MB với oligonucleotide chuỗi đơn và chuỗi kép. Do đó, tính đặc hiệu của xét nghiệm này phụ thuộc vào việc tối ưu hóa mồi và điều kiện phản ứng PCR. Ngoài ra, CV và dòng điện cực đại DPV thu được từ các mẫu được thử nghiệm nên được diễn giải tương ứng với các phản ứng thu được từ đối chứng âm (NTC) cho mỗi thử nghiệm. Các phương pháp và thiết kế cảm biến điện hóa được trình bày trong công trình này có thể được tích hợp với bộ lấy mẫu tự động để phát triển hoàn toàn tự động và thấp -giải pháp tiết kiệm chi phí có thể thu thập và phân tích các mẫu và truyền kết quả không dây về phòng thí nghiệm .
Cashdollar, J. & Wymer, L. Các phương pháp xác định nồng độ ban đầu của vi-rút từ các mẫu nước: đánh giá và phân tích tổng hợp các nghiên cứu gần đây.J.Application.microorganism.115, tr. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Vi-rút trong nước: Rào cản đối với nước uống an toàn.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. và cộng sự. Dịch tễ học nước thải để giám sát COVID-19 quy mô lớn hiệu quả về chi phí ở các quốc gia có thu nhập thấp và trung bình: thách thức và cơ hội. Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Điện hóa học axit nucleic.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylene xanh như một chất phân biệt điện hóa của oligonucleotide sợi đơn và sợi đôi cố định trên chất nền vàng. Nhà phân tích 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ So sánh các chất xen kẽ cation và anion cho quá trình tải nạp điện hóa của lai hóa DNA bằng cách truyền điện tử tầm xa.Electrochemy.commincate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Truyền điện tích qua DNA: bộ cảm biến sinh học DNA điện hóa chọn lọc.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Thiết bị vi lỏng PCR thời gian thực với phát hiện điện hóa đồng thời.cảm biến sinh học.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. Nghiên cứu cơ chế truyền tín hiệu và xác minh hiệu suất của hệ thống PCR thời gian thực điện hóa dựa trên sự tương tác của xanh methylene với DNA. Nhà phân tích 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG và cộng sự. Cảm biến điện hóa dựa trên khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp để phát hiện sars-cov-2 trong các mẫu nước thải.J.Môi trường.Hóa chất.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. và cộng sự.Cảm biến điện hóa của bộ khuếch đại SARS-CoV-2 bằng điện cực PCB. Cảm biến được kích hoạt.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Phát hiện hiệu quả RNA của SARS-CoV-2 trong phần rắn của nước thải.khoa học.môi trường chung.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. và cộng sự.Các phương pháp phân tích để phát hiện SARS-CoV-2 trong nước thải: Giao thức và các viễn cảnh trong tương lai.TraC có xu hướng hậu môn.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Sự sống sót của thể thực khuẩn được bao bọc Phi6 (đại diện thay thế cho SARS-CoV-2) trong các giọt nước bọt bay hơi lắng đọng trên bề mặt thủy tinh.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Sự tồn tại trong môi trường của chất thay thế SARS-CoV-2 (Phi6) ở amip sống tự do.J.Sức khỏe của nước 20, 83 (2021).
Mindich, L. Đóng gói chính xác ba đoạn gen của thể thực khuẩn RNA sợi đôi\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Cấu trúc thứ cấp của vùng đóng gói phage DH RNA\(\varphi\)6.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – Một giao thức nhanh chóng và hiệu quả để chuẩn bị dự trữ vi khuẩn trong phòng thí nghiệm.PeerJ 4, e2261 (2016).
Thời gian đăng: 27-05-2022