Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Ang bersyon ng browser na iyong ginagamit ay may limitadong suporta para sa CSS. Para sa pinakamahusay na karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o i-off ang compatibility mode sa Internet Explorer). Pansamantala, upang matiyak patuloy na suporta, ipapakita namin ang site nang walang mga istilo at JavaScript.
Ang kahalagahan ng pagsubaybay sa mga sample ng kapaligiran ay lubos na pinahahalagahan mula noong simula ng pandemya ng COVID-19, at ang ilang pagsusumikap sa pagsubaybay ay ginagawa gamit ang pamantayang ginto, bagama't mahal ang mga diskarteng nakabatay sa qPCR. Ang mga electrochemical DNA biosensor ay maaaring magbigay ng potensyal na cost-effective solusyon para sa pagsubaybay sa mga sample ng tubig sa kapaligiran sa mga bansang mababa at nasa gitna ang kita. Sa gawaing ito, ipinapakita namin ang electrochemical detection ng mga amplicon na nakuha mula sa Phi6 phage na nakahiwalay sa mga spiked na sample ng tubig sa lawa (isang sikat na surrogate para sa SARS-CoV-2), gamit ang ENIG upang makumpleto ang mga electrodes ng PCB nang walang pagbabago sa ibabaw.sex. Ang tugon ng electrochemical sensor ay lubusang nailalarawan para sa dalawang fragment ng DNA na magkaibang haba (\({117}\,\hbox {bp}\) at \({503}\,\hbox {bp}\)), at ang epekto ng mga asing-gamot sa PCR master mixes sa methylene blue (MB)-DNA na mga pakikipag-ugnayan. Ang aming mga resulta ay nagpapakita na ang haba ng mga fragment ng DNA ay makabuluhang tinutukoy ang electrochemical sensitivity at ipinapakita sa gawaing ito na ang kakayahang makakita ng mahabang amplicons nang walang gel purification ng mga produkto ng PCR ay mahalaga para sa in situ na pagsukat ng mga sample ng tubig.Ang isang ganap na automated na solusyon para sa viral load ay mahusay na nagbabadya.
Ang pagpapadala ng waterborne virus ay kilala bilang isang panganib sa kalusugan ng publiko mula noong 1940s, na may unang ebidensya ng waterborne transmission ng polio at hepatitis E1. Inuri ng World Health Organization (WHO) ang ilang waterborne viral pathogen na may katamtaman hanggang mataas na kahalagahan sa kalusugan2. Tradisyonal na virus Ang mga paraan ng pagtuklas ay umaasa sa pamantayang ginto na qPCR-based na mga diskarte, na lubhang sensitibo at partikular, ngunit nangangailangan ng mga bihasang tauhan upang magsubok sa laboratoryo gamit ang mga mamahaling instrumento. Gayunpaman, sa mga bansang mababa at nasa gitna ang kita (LMICs) na may limitadong mapagkukunan, ang tao ang sample testing ay malamang na mauna kaysa sa environmental water sample monitoring.Samakatuwid, ang mga alternatibong murang paraan ay kailangan para sa sustainable, real-time na pagsubaybay sa mga sample ng tubig at wastewater sa mga bansang mababa at nasa gitna ang kita bilang maagang mga babala sa mga umuusbong na paglaganap ng sakit, sa gayo'y pinoprotektahan sila mula sa matinding socioeconomic na epekto ng pandemya ng virus. Ang mga murang electrochemical biosensor para sa mga nucleic acid ay maaaring magbigay ng isang promising potensyal na solusyon sa hindi natutugunan na pangangailangan na ito. ibabaw at mag-hybrid kapag may tumutugmang pagkakasunud-sunod sa sample. Maaari itong ma-convert sa isang signal sa pamamagitan ng iba't ibang electrochemical techniques gamit ang redox mediator gaya ng potassium iron/ferrocyanide. Ang methylene blue (MB) ay isa sa redox-active molecule, na mayroong naiulat na intercalate sa double-stranded DNA (dsDNA) bilang karagdagan sa mas hindi tiyak na pagbubuklod nito sa single-stranded DNA5,6. mga configuration ng sensor5,6,7,8,9. Bagama't hindi tiyak ang intercalation ng MB sa DNA, at ang pagtitiyak ng electrochemical sensor na ito ay higit na nakasalalay sa kadalisayan ng mga primer na ginagamit para sa PCR o isothermal amplification, ito ay angkop para sa pagpapatupad ng tunay. -time electrochemical-based qPCR o fluorescence isothermal amplification bilang isang alternatibo sa pagsukat ng konsentrasyon ng DNA 9 . Sa isang naturang pagpapatupad, Won et al. Ang ibabaw ng gold electrodes ay binago ng 6-mercapto-1-hexanol (MCH) para sa real-time pagsukat ng mga PCR amplicon na may MB gamit ang differential pulse voltammetry (DPV)9.Sa ibang mga kaso, Ramirez et al.Detection of SARS-CoV-2 in wastewater by RT-LAMP reaction using MB with screen-printed electrodes.Platinum electrodes have also been ginagamit bilang in situ electrodes sa isang microfluidic PCR platform na idinisenyo para electrochemically detect amplicons sa panahon ng mga reaksyon 8 .
Schematic ng workflow para sa electrochemical detection ng mga amplicon na nakuha mula sa puro viral particle sa mga sample ng tubig sa lawa.
Nagpakita kami kamakailan ng electrochemical sensing ng SARS-CoV-2 amplicons na may murang printed circuit board (PCB) na mga electrodes batay sa DPV at cyclic voltammetry (CV) na dulot ng adsorption ng MB-DNA complexes sa ibabaw ng hindi nabagong mga electrodes) na mga pagbabago sa peak kasalukuyang11.Iniuulat namin na ang mas mahahabang DNA fragment (N1-N2, \({943}\, \hbox) na nabuo gamit ang N1 forward at N2 reverse primer na inirerekomenda ng CDC kumpara sa mas maiikling fragment {bp}\)) ay nagpakita ng mas mahusay na linearity sa tugon ng sensor. ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) na nabuo gamit ang N1 forward at N1 reverse primer set. Ang mga pag-aaral na ito ay iniulat gamit ang mga dilution ng DNA na inihanda sa nuclease-free na tubig. Ginamit din ang platform para makita ang SARS-CoV -2 amplicons sa simulate wastewater samples (nakuha sa pamamagitan ng spiking kabuuang RNA samples na may SARS-CoV-2 RNA).Dahil ang RNA ay madaling kapitan sa paggugupit sa panahon ng isolation at downstream processing,12,13 mahirap palakihin ang mas mahahabang fragment gamit ang heterogenous na sample na ito. Samakatuwid, ang pagpapakita ng electrochemical sensing ng SARS-CoV-2 amplicon sa wastewater ay limitado sa mas maikling \(72\,\hbox {bp}\) N1 fragment.
Sa gawaing ito, sinisiyasat namin ang pagiging posible ng ENIG PCB-based electrochemical sensing ng phage Phi6 concentrated at isolated mula sa mga sample ng tubig sa lawa (Fig. 1). Ang Phi6 phages ay maihahambing sa laki (80-100 nm) sa SARS-CoV-2 at mayroon ding lipid membrane at spike protein. Para sa mga kadahilanang ito, ang bacteriophage Phi6 ay isang tanyag na kahalili para sa SARS-CoV-2 at iba pang nakabalot na pathogenic RNA virus14,15.Ginamit ang RNA na nakahiwalay sa mga particle ng phage bilang template para sa cDNA synthesis na sinusundan ng PCR para makakuha ng dalawang DNA fragment na 117 at 503 base pairs ang haba. Dahil sa hamon ng pagpapalaki ng \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 fragment sa aming nakaraang trabaho, tina-target namin ang mga intermediate length fragment (\(117 \,\hbox {bp}\) at \(503 \,\hbox {bp}\)), batay sa mga available na primer. Ang tugon ng electrochemical sensor ay sistematikong pinag-aralan sa isang malawak na hanay ng konsentrasyon (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) hanggang \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Para sa parehong mga fragment sa ang pagkakaroon ng MB, ang epekto ng asin sa tugon ng sensor ay nailalarawan at na-cross-validated ng mga pagsukat ng spectrophotometric. Ang mga pangunahing kontribusyon ng gawaing ito ay ang mga sumusunod:
Ang haba ng fragment ng DNA at ang pagkakaroon ng asin sa sample ay malakas na nakakaapekto sa sensitivity.Ipinapakita ng aming mga resulta na ang aktibidad ng electrochemical ay nakasalalay sa iba't ibang mga mekanismo ng pakikipag-ugnayan ng MB, DNA, at ang sensor sa voltammetric na tugon, depende sa konsentrasyon at haba ng DNA, na may mas mahabang Fragment ay nagpapakita ng mas mataas na sensitivity, bagaman ang asin ay may negatibong epekto sa electrostatic na pakikipag-ugnayan sa pagitan MB at DNA.
Tinutukoy ng konsentrasyon ng DNA ang mekanismo ng pakikipag-ugnayan ng MB-DNA sa mga hindi nabagong electrodes Ipinapakita namin na ang iba't ibang mekanismo ng pakikipag-ugnayan ng MB-DNA ay nakasalalay sa konsentrasyon ng DNA. Sa mga konsentrasyon ng DNA sa ibaba ng maliit na halaga ng \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), napagmasdan namin na ang electrochemical current response ay pangunahing tinutukoy ng adsorption ng MB-DNA sa electrode, habang sa mas mababang konsentrasyon Sa mataas na konsentrasyon ng DNA, ang electrochemical current response ay tinutukoy ng steric inhibition ng redox aktibidad dahil sa pagpasok ng MB sa pagitan ng mga pares ng base ng DNA.
ENIG PCB-Based Electrochemical Sensing of Viral Nucleic Acids in Lake Water Samples Ang mga obserbasyon ay napatunayan ng electrochemical detection ng Phi6-added \(503\,\hbox {bp}\) mga fragment ng DNA na nakuha mula sa mga sample ng tubig mula sa Powai Lake, IIT Mumbai Campus Resulta phage.
Mababang halaga ng pagpapatupad at potensyal para sa pagsasama sa ganap na automated na mga sistema ng pagsubaybay , oligonucleotides o aptamer sa mga electrodes na may mas mahabang buhay ng istante.
Ang Phage Phi6 ay isang enveloped dsRNA virus ng pamilyang Cytoviridae na nakakahawa sa Pseudomonas syringae. Umiiral ang genome ng Phi6 phage sa anyo ng 3 fragment: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) at L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Dahil ang Phi6 phage ay nakakahawa ng isang non-pathogenic na BSL-1 Pseudomonas strain, ligtas itong gamitin at madaling mapalago sa laboratoryo. Ang Phage Phi6 at ang host nito na Pseudomonas syringae ay binili mula sa Felix d'Herelle Reference Center for Bacterial Viruses, Laval University, Canada (ang mga reference center catalog number ay HER-102 at HER-1102, ayon sa pagkakabanggit) .Phi6 phage at host nito ay muling binuhay ayon sa direksyon ng reference center.Phage Phi6 ay dinalisay sa pamamagitan ng plate lysis at elution upang makakuha ng mga huling titer na may \(\mga 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (plaque forming units/ milliliters). Nahiwalay ang RNA sa mga purified phage particle gamit ang GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) ayon sa mga tagubilin ng manufacturer. Sa madaling sabi, isang purified phage Phi6 suspension\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) ay na-lysed at ang lysate ay na-load sa isang spin column upang payagan ang RNA na magbigkis sa column ng resin . Ang RNA ay pagkatapos ay i-eluted sa elution solution \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) na ibinigay ng kit.Tantyahin ang konsentrasyon ng RNA sa pamamagitan ng pagsipsip sa \(260\,\hbox {nm}\).Ang RNA ay nakaimbak sa mga aliquot sa \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) hanggang sa karagdagang paggamit.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Ang iScript cDNA Synthesis Kit (Bio -Rad Laboratories) ay ginamit bilang template para sa cDNA synthesis kasunod ng mga tagubilin ng manufacturer. Sa madaling sabi, ang cDNA synthesis reaction ay binubuo ng 3 hakbang: priming sa \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , reverse transcription ng \({20}\,{\hbox {min}}\) sa \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), at baligtarin Ang recorder ay nasa \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) para sa \({1}\,{\hbox {min }}\).Kapag tumakbo sa isang 1% agarose gel, nagpakita ang cDNA ng tatlong banda na tumutugma sa inaasahang tatlong fragment ng RNA (hindi ipinakita ang data). Ang mga sumusunod na primer ay ginamit upang palakihin ang dalawang fragment ng DNA na 117 at 503 bp ang haba, gamit ang cDNA bilang template para sa PCR sa isang miniPCR® mini8 thermal cycler:
Ang mga panimulang aklat para sa \(117\,\hbox {bp}\) at \(503\,\hbox {bp}\) ay tumutugma sa 1476-1575 nucleotides ng M segment at 458-943 nucleotides ng L segment, ayon sa pagkakabanggit ng acid .Lahat ng amplified PCR na produkto ay na-electrophores sa 1% agarose gels, at na-purify ang amplified target na DNA gamit ang GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
Ang isang lawa sa IIT Mumbai campus (Powai Lake, Powai, Mumbai) ay ginamit upang magdagdag ng mga phage particle. Ang tubig ng lawa ay sinala sa pamamagitan ng isang \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) lamad upang alisin mga nasuspinde na particle, at pagkatapos ay idinagdag ang Phi6 phage. Idagdag ang \({1}\,{\hbox {ml}}\) ng \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) sa \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) na-filter na tubig sa lawa, sa \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\).Ang isang maliit na aliquot ay nakalaan para sa pagsukat ng viral load sa pamamagitan ng plaque assay. Sinubukan namin ang dalawang magkaibang pamamaraan para pag-concentrate ang mga spiked Phi6 virus particle: (1) ang aluminum hydroxide adsorption-precipitation method,19 na na-validate para sa konsentrasyon ng ilang enveloped RNA virus mula sa environmental samples, at (2) ) Ang paraan ng konsentrasyon ng virus na nakabatay sa polyethylene glycol (PEG) ay inangkop mula sa Flood et al.20 .Dahil ang kahusayan sa pagbawi ng pamamaraang nakabatay sa PEG ay nakitang mas mahusay kaysa sa paraan ng aluminyo hydroxide, ginamit ang pamamaraang nakabatay sa PEG upang i-concentrate ang mga particle ng Phi6 mula sa mga sample ng tubig sa lawa.
Ang ginamit na paraan ng PEG ay ang mga sumusunod: Ang PEG 8000 at \(\hbox {NaCl}\) ay idinagdag sa Phi6-spiked lake water samples upang makakuha ng 8 % PEG 8000 at \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\). Ang mga sample ay incubated sa isang shaker\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), pagkatapos ay i-centrifuge sa \(4700 \,\hbox {g}\) ay \({45}\,{\hbox {min}}\).Itapon ang supernatant at muling suspindihin ang pellet sa \({1}\, {\hbox {ml}}\) sa parehong supernatant. Ang lahat ng spiking at mga eksperimento sa konsentrasyon ng virus ay isinagawa sa triplicate. Pagkatapos ng konsentrasyon, isang maliit na aliquot ang nakalaan para sa pagsukat ng kahusayan sa pagbawi sa pamamagitan ng plaque assay. Ang RNA ay ibinukod gaya ng naunang inilarawan at na-eluted sa kit-supplied elution buffer\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\).Dahil ang konsentrasyon ng RNA ay mag-iiba mula sa sample sa sample sa triplicate, ang \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) ng RNA ay ginagamit para sa lahat ng tatlo anuman ang konsentrasyon nito cDNA synthesis ng mga sample. Ang cDNA synthesis ay isinagawa gaya ng naunang inilarawan.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA ay ginamit bilang template para sa \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR para sa 35 cycle upang palakihin ang \ (117\,\hbox {bp}\) at \(503\,\hbox { bp}\) mga fragment. Ang mga sample na ito ay kinakatawan bilang “1:1″, ibig sabihin, walang dilution. Isang walang-template na kontrol (NTC) ang na-set up bilang isang negatibong kontrol, habang ang isang cDNA na na-synthesize gamit ang RNA na nakahiwalay sa purified phage ay na-set up bilang isang template para sa isang positibong kontrol (PC). Ang quantitative PCR (qPCR) ay isinagawa sa isang Stratagene Mx3000P RT-PCR na instrumento gamit ang Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Ang mga reaksyon ay na-set up sa triplicate gaya ng dati. inilarawan. Ang cycle threshold (Ct) ay naitala para sa lahat ng mga sample. Bilang karagdagan, ang mga diluted sample ay \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) gamit ang cDNA diluted 1:100 sa na-filter na tubig sa lawa bilang \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR para sa 35 cycle. Ang mga sample na ito ay kinakatawan bilang “1:100″.
Ang mga PCB electrodes ay gawa-gawa gamit ang isang komersyal na available na murang Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) na proseso nang hindi nangangailangan ng karagdagang gold plating. Ang mga detalye ng ENIG PCB electrode ay nakadetalye sa aming nakaraang trabaho11. Para sa ENIG PCB electrodes, tradisyonal na pamamaraan ng paglilinis ng elektrod tulad ng Ang piranha solution o sulfuric acid cyclic voltammetry ay hindi inirerekomenda dahil maaari silang maging sanhi ng pagbabalat ng manipis na layer ng ginto (kapal \(\approx\) \(100\,\hbox {nm }\)) at ilantad ang pinagbabatayan na mga layer ng tanso na madaling kapitan ng sakit. sa kaagnasan 21, 22, 23, 24, 25. Samakatuwid, linisin ang mga electrodes gamit ang isang lint-free na tela na binasa ng IPA. Ang sample na susuriin ay incubated na may \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB sa \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) para sa madaling pagpasok. Sa aming nakaraang gawain , napagmasdan namin na ang sensitivity at linearity ng sensor ay napabuti sa pamamagitan ng pagtaas ng konsentrasyon ng MB 11 .Batay sa mga pag-optimize na iniulat sa aming naunang gawain, ginamit namin ang \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB concentrations para i-embed ang DNA sa pag-aaral na ito.Maaaring makamit ang electrochemical detection ng double-stranded DNA (ds-DNA) gamit ang anionic o cationic intercalators. sa kabilang banda, ang mga cationic intercalator tulad ng MB ay nangangailangan ng mas maiikling oras ng incubation, humigit-kumulang \({1}\,{\hbox {h}}\) para sa electrochemical detection ng ds-DNA6. Ang bawat pagsukat ay nagsasangkot ng pagbibigay ng sample na susuriin sa electrode\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), pagkatapos ay linisin gamit ang basahan na basa ng IPA, bago magpatuloy sa isa pang sample.isang pagsukat. Sinuri ang bawat sample sa 5 magkakaibang electrodes maliban kung iba ang nakasaad. Ang mga pagsukat ng DPV at CV ay isinagawa gamit ang PalmSens Sensit Smart potentiostat, at ginamit ang PSTrace software para sa potentiostat configuration at pagkuha ng data, kasama ang peak current calculations. Ginagamit ang mga sumusunod na setting para sa mga sukat ng DPV at CV:
DPV: Equilibrium Time = \(8\,\hbox {s}\), Boltahe Step = \(3\,\hbox {mV}\), Pulse Voltage = \(25\,\hbox {mV}\) , tagal ng pulso = \(50\,\hbox {ms}\), rate ng pag-scan = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Equilibrium Time = \(8\,\hbox {s}\), Boltahe Step = \(3\,\hbox {mV}\), Sweep Rate = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Mga peak na alon na nakuha mula sa mga voltammograms ng DNA na pinagsama-sama ng \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Ang DPV at CV voltammograms ay nakuha sa ENIG PCB electrodes \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB complexed sa DNA (sa mga konsentrasyon ng 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) ibig sabihin, 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) para sa \(117\,\hbox {bp}\ ) at 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) para sa \(503\,\hbox {bp}\)). Ang mga kinatawan ng voltammogram ay ipinapakita sa Figure S1 sa Karagdagang Impormasyon. Ipinapakita ng Figure 2 ang mga resulta ng DPV at CV measurements (peak current) gamit ang gel-purified PCR products. Kung ikukumpara sa CV measurements, ang DPV measurements ay nagpapakita ng mas mataas na sensitivity (current as a function of DNA concentration) dahil ang background capacitive currents sa CV measurements ay nagtatago ng Faradaic currents 26 .Ang data para sa bawat kahon sa boxplot ay naglalaman ng mga sukat mula sa 5 electrodes. Ang lahat ng mga sukat ay gumagamit ng parehong hanay ng mga electrodes upang maiwasan ang mga error sa pagsukat dahil sa electrode-to-electrode variation. Naobserbahan namin ang pagtaas ng trend sa DPV at CV na sinusukat ang mga peak currents para sa mas mababang konsentrasyon ng DNA , mas mahaba (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ kumpara sa \(117) ) fragment. Ito ay pare-pareho sa inaasahang trend ng electrode adsorption na iniulat sa aming nakaraang trabaho. Ang Ang adsorption ng MB-DNA complex ay nagpapadali sa paglilipat ng singil sa elektrod, na nag-aambag sa pagtaas ng peak current. Ang iba pang mga pag-aaral ay nagpakita ng epekto ng oligonucleotide size at sequence sa MB-DNA intercalation27,28,29,30.The guanine -cytosine (GC) na nilalaman ng dalawang amplicon (\(117\,\hbox {bp}\) at \(503\,\hbox {bp}\)) ay humigit-kumulang 50%, na nagpapahiwatig na ang obserbasyon Ang pagkakaiba ay dahil sa haba ng amplicon. Gayunpaman, para sa mas mataas na konsentrasyon ng DNA (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), para sa \(503\,\hbox {bp} \) at \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) para sa \(117\,\hbox {bp}\)), napansin namin ang dalawang amplification Ang Ang mga peak currents ng subs ay nababawasan sa parehong mga sukat ng DPV at CV. Ito ay dahil ang MB ay saturates at intercalates sa pagitan ng mga base pairs ng DNA, na nagreresulta sa steric inhibition ng redox na aktibidad ng reducible group sa MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Ang mga asin na nasa PCR master mix ay nakakasagabal sa mga electrostatic na interaksyon sa pagitan ng MB at DNA, kaya sa pamamagitan ng pagdaragdag ng \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) sa \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB gel-purified na produkto upang pag-aralan ang epekto ng asin sa pakikipag-ugnayan ng MB-DNA. Gaya ng ipinapakita sa Figure 3, napansin namin na para sa mas mataas na konsentrasyon ng DNA (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) at \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) para sa \(117\,\hbox {bp} \)), sa DPV at CV Ang pagdaragdag ng asin ay hindi gaanong nakaapekto sa mga sukat (tingnan ang Larawan S2 sa Karagdagang Impormasyon para sa mga kinatawan ng voltammograms). Gayunpaman, sa mas mababang mga konsentrasyon ng DNA, ang pagdaragdag ng asin ay lubos na nakakabawas ng sensitivity, na nagreresulta sa walang makabuluhang pagbabago sa kasalukuyang may konsentrasyon ng DNA. Ang mga katulad na negatibong epekto ng asin sa mga interaksyon at intercalation ng MB-DNA ay naiulat na dati ng ibang mga mananaliksik33,34.\(\hbox { Ang mga Mg}^{2+}\) cation ay nagbubuklod sa negatibong phosphate backbone ng DNA, at sa gayon ay humahadlang sa electrostatic interaction sa pagitan ng MB at DNA. hindi gaanong makakaapekto sa tugon ng sensor. Ang pangunahing punto ay ang biosensor na ito ay mas angkop na makakita ng mas mataas na mga konsentrasyon ng DNA (bihirang \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) o mas mataas), para sa ganap na- Awtomatikong pagpoproseso ng mga sample ng tubig sa kapaligiran, kung saan ang paglilinis ng gel ng mga produkto ng PCR ay maaaring hindi magagawa.
Lugar sa ilalim ng absorption curve para sa wavelength range na 600–700 \(\hbox {nm}\) para sa iba't ibang konsentrasyon ng DNA na pinagsama-sama ng \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) na may asin at walang asin (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) na may asin at walang asin (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Mga konsentrasyon ng DNA na tumutugma sa \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) mga sample ng MB Walang DNA.
Upang higit pang mapatunayan ang mga resulta sa itaas, nagsagawa kami ng mga optical na sukat gamit ang isang UV/Vis spectrophotometer (Thermo Scientific Multiskan GO), ang mga sample na \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) ay ginamit para sa bawat Pagsukat. Bumababa ang absorption signature sa pagtaas ng konsentrasyon ng DNA, gaya ng makikita mula sa trend ng lugar sa ilalim ng absorption curve para sa wavelength range \(600\,\hbox {nm}\) hanggang \(700\,\hbox { nm}\) , gaya ng ipinapakita sa Fig. 4 (absorption spectrum na ipinapakita sa Fig. S3 sa Karagdagang Impormasyon). Para sa mga sample na may mga konsentrasyon ng DNA na mas mababa sa \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), walang makabuluhang pagkakaiba sa uptake sa pagitan ng DNA-containing at MB-only sample (para sa \(503\,\hbox {bp}\) at \(117\,\hbox {bp}\ ) haba ng mga fragment), na nagpapahiwatig ng kawalan ng steric inhibition ng redox-active MB. Sa mas mataas na konsentrasyon ng DNA, napansin namin ang unti-unting pagbaba sa absorbance signal at napansin ang mas mababang pagbaba sa absorbance sa pagkakaroon ng asin. Ang mga resultang ito ay naiugnay sa molekular pakikipag-ugnayan at steric inhibition sa base stacking sa DNA hybrids. Ang aming mga resulta ay pare-pareho sa mga ulat sa literatura sa spectroscopic na pag-aaral ng MB-DNA intercalation na nag-uugnay ng hypochromaticity sa pinababang antas ng enerhiya sa \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) mga electronic transition dahil sa intercalation Layers 36, 37, 38.
Agarose gel electrophoresis ng phage Phi6: Mga produktong PCR na may haba \(117\,\hbox {bp}\) at \(503\,\hbox {bp}\) mula sa mga sample ng tubig sa lawa.M-DNA marker;NTC-no-template control, mga panimulang aklat na naglalaman ng kaukulang mga amplicon;PC positibong kontrol;1, 2, 3-undiluted (1:1) spiked lake water sample sa triplicate. Nakikita ang isang banda sa \(\mga 50\,\hbox {bp}\) dahil sa hindi nagamit na oligonucleotides sa \(503\,\ hbox {bp}\) lane.
Sinuri namin ang utility ng sensor gamit ang mga sample ng tubig ng Powai Lake na may spike na Phi6 phage. Ang mga konsentrasyon ng RNA na nakahiwalay sa mga sample ng phage-spiked na tubig ay mula sa 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), habang ang mga nakahiwalay sa purified phage suspension Ang RNA ay tinatantya na \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) na may kahusayan sa pagbawi na humigit-kumulang 1 Ang %.RNA ay binaligtad na na-transcribe sa cDNA at ginamit bilang template para sa PCR at qPCR. Ang laki ng produkto ay nakumpirma ng agarose gel electrophoresis (Larawan 5) bago ang pagsubok gamit ang sensor. Ang mga sample na ito ay hindi napurify ng gel at samakatuwid ay naglalaman ng lahat ng bahagi ng PCR bilang pati na rin ang mga amplicon ng interes. Ang mga halaga ng Ct na naitala sa panahon ng qPCR (Talahanayan 1) ay ipinakita na nauugnay sa konsentrasyon ng RNA na nakahiwalay sa mga kaukulang spiked na sample ng tubig. Ang halaga ng Ct ay nagpapakita ng bilang ng mga cycle na kinakailangan para sa fluorescent signal sa lumampas sa threshold o signal sa background. Ang mas mataas na Ct values ay nagpapahiwatig ng mas mababang konsentrasyon ng template at vice versa. Ang mga Ct value ng mga sample ng NTC ay kasing taas ng inaasahan. Ang pagkakaiba sa \(\humigit-kumulang 3\) Ct values sa pagitan ang positibong kontrol at ang sample ng pagsubok ay higit pang nagpapahiwatig na ang bawat sample ng pagsubok ay may humigit-kumulang 1% na template kumpara sa positibong kontrol. Napag-usapan namin dati na ang mas mahahabang amplicon ay humahantong sa mas mahusay na sensitivity. Ang amplification ng mas mahabang mga fragment na nakahiwalay sa mga heterogenous na sample ng kapaligiran ay mahirap dahil sa mga disadvantages ng mababang konsentrasyon ng viral at pagkasira ng RNA. Gayunpaman, sa aming virus enrichment at PCR amplification protocol, matagumpay naming na-amplify ang \(503\,\hbox {bp}\) fragment para sa electrochemical sensing.
Ipinapakita ng Figure 6 ang mga resulta ng electrochemical sensor ng \(503\,\hbox {bp}\) fragment amplicon, na parehong gumagamit ng undiluted cDNA bilang template (1:1) at 100-fold diluted cDNA bilang template (1:100 ) na ginanap na PCR , kumpara sa NTC at PC (tingnan ang Figure S4 sa Karagdagang Impormasyon para sa mga kinatawan ng voltammograms). Ang bawat kahon sa boxplot sa Figure 6 ay naglalaman ng mga sukat mula sa tatlong sample sa 5 electrodes. Ang parehong mga electrodes ay ginamit upang sukatin ang lahat ng mga sample upang maiwasan ang mga error dahil sa elektrod -to-electrode variation. Kung ikukumpara sa mga pagsukat ng CV, ang mga sukat ng DPV ay nagpapakita ng mas mahusay na resolution upang makilala ang mga sample ng pagsubok at PC mula sa mga NTC dahil, tulad ng nabanggit na, ang mga Faradaic na alon ay nakatago dahil sa background capacitive currents sa huli. Para sa mas mahabang mga amplicon, naobserbahan namin na ang negatibong kontrol (NTC) ay nagresulta sa mas mataas na CV at DPV peak currents na may kaugnayan sa positibong kontrol, samantalang ang positibo at undiluted na mga sample ng pagsubok ay nagpakita ng magkatulad na taas ng peak ng DPV peak currents. Ang sinusukat na mean at median na halaga para sa bawat undiluted (1:1). ) ang sample ng pagsubok at PC ay maaaring malinaw na malutas mula sa output ng sensor para sa sample ng NTC, habang ang resolution para sa 1:100 diluted sample ay hindi gaanong binibigkas. Para sa isang 100-fold dilution ng cDNA, hindi namin naobserbahan ang anumang mga banda sa panahon ng gel electrophoresis (mga linyang hindi ipinapakita sa Figure 5), at ang katumbas na DPV at CV peak currents ay katulad ng inaasahan para sa NTC. Ang mga resulta para sa \(117\,\hbox {bp}\) fragment ay ipinapakita sa Karagdagang Impormasyon. Ang negatibo Ang control ay nag-udyok ng electrochemical response mula sa PCB sensor dahil sa adsorption ng libreng MB sa electrode at ang interaksyon ng MB sa single-stranded primer na oligonucleotide. Samakatuwid, sa tuwing susuriin ang isang sample, isang negatibong kontrol ang dapat patakbuhin at ang peak current ng test sample kumpara sa peak current na nakuha ng negatibong control para makamit ang differential (relative) measurement39,40 para i-classify ang test sample bilang positive o negative.
(a) DPV, at (b) CV peak current para sa electrochemical detection ng \(503\,\hbox {bp}\) na mga fragment sa mga sample ng tubig sa lawa. Ang mga sample ng pagsubok ay sinusukat sa triplicate at inihambing sa walang template controls (NTC) at mga positibong kontrol (PC).
Ang aming mga natuklasan ay naglalarawan ng iba't ibang mekanismo na nakakaapekto sa pagganap ng mga electrochemical sensor para sa mga amplicon na may iba't ibang haba para sa iba't ibang DNA, na may mga konsentrasyon na na-verify sa pamamagitan ng optical measurements gamit ang UV/Vis spectrophotometer. Binibigyang-diin ng aming mga obserbasyon ang insight na mas mahahabang DNA fragment hanggang sa \(\approx\) Maaaring matukoy ang \(500\,\hbox {bp}\) na may mas mataas na sensitivity at na ang presensya ng asin sa sample ay hindi Sensitivity DNA concentration na nakakaapekto sa mas mataas na sensitivity (bihirang \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) at sa itaas). Bilang karagdagan, sinisiyasat namin ang epekto ng iba't ibang uri ng mga sample, kabilang ang mga gel-purified amplicon na may at walang idinagdag na asin, at pagdaragdag ng mga sample ng tubig sa lawa sa mga sukat ng DPV at CV.Napansin namin na ang DPV ay nagbigay ng mas mahusay na resolution, dahil ang background capacitive current ay nakakaapekto rin sa pagsukat ng CV, na ginagawa itong hindi gaanong sensitibo.
Ang pagpapalakas ng mas mahabang mga fragment ay nakasalalay sa integridad ng viral genomic RNA. Ipinakita ng ilang pag-aaral na ang amplification ng mas mahabang mga fragment ay hindi palaging mahusay dahil sa pagkasira ng RNA sa kapaligiran at ang potensyal para sa splicing sa panahon ng paghihiwalay11,41,42,43,44 .Napagmasdan namin na ang paraan ng konsentrasyon ng virus na nakabatay sa PEG ay mas epektibo sa pag-concentrate ng phage Phi-6 na may spike sa mga sample ng tubig sa lawa kaysa sa paraan ng konsentrasyon ng virus na nakabatay sa aluminyo hydroxide. upang palakihin ang maramihang mas maikling haba ng mga template at bawasan ang posibilidad ng cross-specificity.
Kakaunti ang mga biological sample, kaya kailangang magdisenyo ng biosensor na nangangailangan ng kaunting sample para sa pagsubok. Ang ENIG PCB electrodes na ginamit sa pag-aaral na ito ay nangangailangan lamang ng \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) mga sample para sa pagsubok upang masakop ang epektibong lugar ng mga electrodes. Bukod dito, ang parehong elektrod ay maaaring gamitin muli pagkatapos ng paglilinis bago ibigay ang susunod na sample. Ang mga amplified sample ay hindi nangangailangan ng pagdaragdag ng anumang mga kemikal maliban sa methylene blue, na isang murang at karaniwang ginagamit na kemikal.Dahil ang bawat electrode ay nagkakahalaga ng humigit-kumulang $0.55 (o INR 40) sa paggawa, ang biosensor na ito ay maaaring maging isang cost-effective na alternatibo sa mga kasalukuyang teknolohiya sa pag-detect. Ipinapakita ng Talahanayan 2 ang paghahambing ng gawaing ito sa iba pang mga sensor na iniulat sa literatura nang matagal. Mga fragment ng DNA sa mga heterogenous na sample.
Dahil umaasa ang mga protocol ng electrochemical detection na nakabatay sa MB sa specificity ng PCR, isang pangunahing limitasyon ng pamamaraang ito ay ang potensyal para sa hindi partikular na amplification sa mga heterogenous na sample gaya ng wastewater at tubig sa lawa o paggamit ng mga low-purity primers. Upang mapabuti ang sensitivity ng mga pamamaraan ng electrochemical detection para sa DNA detection ng hindi nalinis na mga produkto ng PCR gamit ang hindi binagong ENIG PCB electrodes, kinakailangan upang mas maunawaan ang mga error na ipinakilala ng mga hindi nagamit na dNTP at primer, at upang ma-optimize ang mga kondisyon ng reaksyon at mga protocol ng assay. Karagdagang mga parameter ng physicochemical tulad ng pH, temperatura, at biological Ang pangangailangan ng oxygen (BOD) ng sample ng tubig ay maaaring kailanganin ding sukatin upang mapabuti ang katumpakan ng pagsukat.
Bilang konklusyon, nagmumungkahi kami ng murang electrochemical ENIG PCB sensor para sa pagtuklas ng virus sa mga sample ng kapaligiran (tubig sa lawa). mga electrodes na may mas mahabang buhay ng istante at walang tiyak na mga kinakailangan sa imbakan at samakatuwid ay angkop para sa pagbuo ng mga solusyon sa pagsukat na may awtomatikong pagpoproseso ng sample na naka-deploy sa mga LMIC. Gumagamit ang biosensor ng murang DNA-intercalating redox dyes (MB) para sa mabilis na pagtuklas ng mga target na amplicon. Ang hindi tiyak na amplification karaniwan sa mga sample ng kapaligiran ay binabawasan ang pagtitiyak ng pamamaraang ito ng sensing dahil sa hindi tiyak na pagbubuklod ng mga MB sa single- at double-stranded oligonucleotides. Samakatuwid, ang pagtitiyak ng pagsubok na ito ay nakasalalay sa pag-optimize ng mga primer at kondisyon ng reaksyon ng PCR. Bilang karagdagan, ang CV at DPV peak currents na nakuha mula sa mga nasubok na sample ay dapat bigyang-kahulugan na may kaugnayan sa mga tugon na nakuha mula sa negatibong kontrol (NTC) para sa bawat pagsubok. Ang mga disenyo at pamamaraan ng electrochemical sensor na ipinakita sa gawaing ito ay maaaring isama sa mga autosampler upang bumuo ng isang ganap na awtomatiko at mababa -solusyon sa gastos na maaaring mangolekta at magsuri ng mga sample at wireless na magpadala ng mga resulta pabalik sa laboratoryo .
Cashdollar, J. & Wymer, L. Mga pamamaraan para sa paunang konsentrasyon ng mga virus mula sa mga sample ng tubig: isang pagsusuri at meta-analysis ng mga kamakailang pag-aaral.J.Paglalapat.microorganism.115, pp. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Waterborne virus: Mga hadlang sa ligtas na inuming tubig.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.Wastewater epidemiology para sa cost-effective na malakihang pagsubaybay sa COVID-19 sa mga bansang mababa at nasa gitna ang kita: mga hamon at pagkakataon.Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylene blue bilang isang electrochemical discriminator ng single- at double-stranded oligonucleotides na hindi kumikilos sa mga gintong substrate. Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Paghahambing ng Cation at Anion Intercalators para sa Electrochemical Transduction ng DNA Hybridization sa pamamagitan ng Long-Range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Paglipat ng singil sa pamamagitan ng DNA: isang selective electrochemical DNA biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Real-time na PCR microfluidic device na may kasabay na electrochemical detection.biological sensor.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al.Pag-aaral ng mekanismo ng pagsenyas at pagpapatunay ng pagganap ng isang electrochemical real-time na PCR system batay sa interaksyon ng methylene blue sa DNA.Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Loop-mediated isothermal amplification-based electrochemical sensor para sa pagtuklas ng sars-cov-2 sa mga sample ng wastewater.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Electrochemical sensing ng SARS-CoV-2 amplicons na may mga PCB electrodes.Na-activate ang sensor.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Mahusay na pagtuklas ng SARS-CoV-2 RNA sa solidong bahagi ng wastewater.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Analytical Methods for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Survival of the enveloped bacteriophage Phi6 (isang surrogate for SARS-CoV-2) in evaporated saliva droplets na nakadeposito sa glass surface.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Pangkapaligiran na pagtitiyaga ng isang SARS-CoV-2 surrogate (Phi6) sa malayang buhay na amoeba.J.Kalusugan ng Tubig 20, 83 (2021).
Mindich, L. Tumpak na packaging ng tatlong genomic fragment ng double-stranded RNA bacteriophage\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Pangalawang istraktura ng DH RNA phage\(\varphi\)6 packaging region.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – Isang mabilis at mahusay na protocol para sa paghahanda ng mga laboratoryo ng mga bacteriophage.PeerJ 4, e2261 (2016).
Oras ng post: Mayo-27-2022