நீண்ட ஆம்பிளிகான்கள் பிசிபி மின்முனைகளைப் பயன்படுத்தி நீர் மாதிரிகளில் வைரஸ் நியூக்ளிக் அமிலங்களின் மின்வேதியியல் உணர்திறனுக்கான சிறந்த உணர்திறனை வழங்குகிறது.

Nature.com ஐப் பார்வையிட்டதற்கு நன்றி.நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவிப் பதிப்பில் CSS க்கு மட்டுப்படுத்தப்பட்ட ஆதரவு உள்ளது. சிறந்த அனுபவத்திற்காக, புதுப்பிக்கப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு பரிந்துரைக்கிறோம் (அல்லது Internet Explorer இல் பொருந்தக்கூடிய பயன்முறையை முடக்கவும்). இதற்கிடையில், உறுதிசெய்ய தொடர்ந்து ஆதரவு, பாணிகள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் தளத்தைக் காண்பிப்போம்.
கோவிட்-19 தொற்றுநோய் தொடங்கியதில் இருந்து சுற்றுச்சூழல் மாதிரிகளைக் கண்காணிப்பதன் முக்கியத்துவம் பெரிதும் பாராட்டப்பட்டது, மேலும் சில கண்காணிப்பு முயற்சிகள் தங்கத் தரத்தைப் பயன்படுத்தி மேற்கொள்ளப்படுகின்றன, இருப்பினும் qPCR- அடிப்படையிலான நுட்பங்கள் விலை உயர்ந்தவை. எலக்ட்ரோ கெமிக்கல் டிஎன்ஏ பயோசென்சர்கள் செலவு குறைந்தவையாக வழங்க முடியும். குறைந்த மற்றும் நடுத்தர வருமானம் உள்ள நாடுகளில் சுற்றுச்சூழல் நீர் மாதிரிகளைக் கண்காணிப்பதற்கான தீர்வு. இந்த வேலையில், ENIG ஐப் பயன்படுத்தி, ஸ்பைக் ஏரி நீர் மாதிரிகளிலிருந்து (SARS-CoV-2 க்கு பிரபலமான வாகை) பிரித்தெடுக்கப்பட்ட ஃபை6 பேஜிலிருந்து பெறப்பட்ட ஆம்பிளிகான்களின் மின்வேதியியல் கண்டறிதலை நாங்கள் நிரூபிக்கிறோம். மேற்பரப்பு மாற்றம் இல்லாமல் PCB மின்முனைகளை முடிக்க.பாலினம் பிசிஆர் மாஸ்டர் கலவையில் உள்ள உப்புகளின் விளைவு மெத்திலீன் ப்ளூ (எம்பி)-டிஎன்ஏ இடைவினைகளில் ஏற்படுகிறது. டிஎன்ஏ துண்டுகளின் நீளம் மின் வேதியியல் உணர்திறனை கணிசமாக தீர்மானிக்கிறது என்பதை எங்கள் முடிவுகள் காட்டுகின்றன. நீர் மாதிரிகள் உள்ள இடத்தில் அளவிடுவதற்கு முக்கியமானது.வைரஸ் சுமைக்கான முழுமையான தானியங்கு தீர்வு நன்றாக உள்ளது.
நீர்வழி வைரஸ் பரவுதல் 1940 களில் இருந்து ஒரு பொது சுகாதார அபாயமாக அறியப்படுகிறது, போலியோ மற்றும் ஹெபடைடிஸ் E1 இன் நீரில் பரவும் முதல் சான்றுகளுடன். உலக சுகாதார அமைப்பு (WHO) மிதமான மற்றும் உயர் ஆரோக்கிய முக்கியத்துவம் வாய்ந்த பல நீரில் பரவும் வைரஸ் நோய்க்கிருமிகளை வகைப்படுத்தியுள்ளது2. பாரம்பரிய வைரஸ் கண்டறிதல் முறைகள் தங்க-தரமான qPCR அடிப்படையிலான நுட்பங்களை நம்பியுள்ளன, அவை அதிக உணர்திறன் மற்றும் குறிப்பிட்டவை, ஆனால் விலையுயர்ந்த கருவிகளைப் பயன்படுத்தி ஆய்வகத்தில் சோதனை செய்ய திறமையான பணியாளர்கள் தேவைப்படுகிறார்கள். இருப்பினும், குறைந்த மற்றும் நடுத்தர வருமானம் கொண்ட நாடுகளில் (LMICs) குறைந்த வளங்களைக் கொண்ட, மனித சுற்றுச்சூழல் நீர் மாதிரி கண்காணிப்பை விட மாதிரி சோதனை முன்னுரிமை பெற வாய்ப்புள்ளது.எனவே, குறைந்த மற்றும் நடுத்தர வருமானம் கொண்ட நாடுகளில் தண்ணீர் மற்றும் கழிவு நீர் மாதிரிகளை நிலையான, நிகழ்நேர கண்காணிப்புக்கு மாற்று குறைந்த விலை முறைகள் தேவைப்படுகின்றன. அதன் மூலம் வைரஸ் தொற்றுநோய்களின் கடுமையான சமூகப் பொருளாதார தாக்கங்களிலிருந்து அவர்களைப் பாதுகாக்கிறது. நியூக்ளிக் அமிலங்களுக்கான குறைந்த விலை மின்வேதியியல் உயிரி உணரிகள் இந்த தேவைக்கு ஒரு நம்பிக்கைக்குரிய சாத்தியமான தீர்வை வழங்க முடியும். இந்த பல டிஎன்ஏ பயோசென்சர்கள் மின்முனையில் நிரப்பு டிஎன்ஏ இழைகள் அசையாமையால் செயல்படுகின்றன. மாதிரியில் பொருந்தக்கூடிய வரிசை இருக்கும் போது மேற்பரப்பு மற்றும் கலப்பினம். இது பொட்டாசியம் இரும்பு/ஃபெரோசயனைடு போன்ற ரெடாக்ஸ் மத்தியஸ்தர்களைப் பயன்படுத்தி பல்வேறு மின்வேதியியல் நுட்பங்களால் சமிக்ஞையாக மாற்றப்படலாம். இரட்டை இழை DNA (dsDNA) க்கு அதன் தனித்தனி டிஎன்ஏ 5,6 ஆகியவற்றுடன் இன்னும் குறிப்பிடப்படாத பிணைப்பு இருப்பதாக அறிவிக்கப்பட்டது. எம்பி-டிஎன்ஏ வளாகங்களை உருவாக்க MB களின் இடைக்கணிப்பு தன்மை பல மின் வேதியியல் டிஎன்ஏவில் ரெடாக்ஸ் மத்தியஸ்தர்களாக அவற்றை ஒரு பிரபலமான தேர்வாக ஆக்குகிறது. சென்சார் கட்டமைப்புகள்5,6,7,8,9.எம்பி மற்றும் டிஎன்ஏ வரையிலான இடைக்கணிப்பு குறிப்பிடப்படாததாக இருந்தாலும், இந்த மின்வேதியியல் சென்சாரின் தனித்தன்மை பெரும்பாலும் பிசிஆர் அல்லது சமவெப்ப பெருக்கத்திற்குப் பயன்படுத்தப்படும் ப்ரைமர்களின் தூய்மையைப் பொறுத்தது, இது உண்மையான செயல்பாட்டிற்கு மிகவும் பொருத்தமானது. -நேர மின்வேதியியல் அடிப்படையிலான qPCR அல்லது ஃப்ளோரசன்ஸ் சமவெப்ப பெருக்கம் டிஎன்ஏ செறிவு அளவீட்டுக்கு மாற்றாக 9 .அத்தகைய செயலாக்கத்தில், வோன் மற்றும் பலர் வேறுபட்ட துடிப்பு மின்னழுத்தம் (DPV) ஐப் பயன்படுத்தி MB உடன் PCR ஆம்ப்ளிகான்களை அளவிடுதல் 9. மற்ற சமயங்களில், ராமிரெஸ் மற்றும் பலர். திரையில் அச்சிடப்பட்ட மின்முனைகளுடன் MB ஐப் பயன்படுத்தி RT-LAMP எதிர்வினை மூலம் கழிவுநீரில் SARS-CoV-2 ஐக் கண்டறிதல். பிளாட்டினம் மின்முனைகளும் வினைகளின் போது மின் வேதியியல் முறையில் ஆம்பிளிகான்களைக் கண்டறிய வடிவமைக்கப்பட்ட மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் PCR இயங்குதளத்தில் சிட்டு எலக்ட்ரோடுகளைப் போலப் பயன்படுத்தப்படுகிறது.
ஏரி நீர் மாதிரிகளில் உள்ள செறிவூட்டப்பட்ட வைரஸ் துகள்களிலிருந்து பெறப்பட்ட ஆம்பிளிகான்களின் மின்வேதியியல் கண்டறிதலுக்கான பணிப்பாய்வு திட்டம்.
SARS-CoV-2 ஆம்ப்ளிகான்களின் மின்வேதியியல் உணர்திறன் மூலம் குறைந்த விலையில் அச்சிடப்பட்ட சர்க்யூட் போர்டு (PCB) மின்முனைகள் DPV மற்றும் சுழற்சி மின்னழுத்தம் (CV) ஆகியவற்றின் அடிப்படையில் MB-DNA வளாகங்களின் உறிஞ்சுதலால் தூண்டப்பட்ட மாற்றப்படாத மின்முனைகளின் மேற்பரப்பில் ஏற்படும் மாற்றங்கள்) தற்போதைய11.நீளமான டிஎன்ஏ துண்டுகள் (N1-N2, \({943}\, \hbox) CDC பரிந்துரைத்த N1 முன்னோக்கி மற்றும் N2 ரிவர்ஸ் ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்தி உருவாக்கப்பட்டன, குறுகிய துண்டுகளுடன் ஒப்பிடும்போது {bp}\)) சென்சார் பதிலில் சிறந்த நேர்கோட்டுத்தன்மையைக் காட்டியது. (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) N1 ஃபார்வர்ட் மற்றும் N1 ரிவர்ஸ் ப்ரைமர் செட்களைப் பயன்படுத்தி உருவாக்கப்பட்டது. இந்த ஆய்வுகள் நியூக்லீஸ் இல்லாத நீரில் தயாரிக்கப்பட்ட டிஎன்ஏ நீர்த்தங்களைப் பயன்படுத்தி அறிக்கை செய்யப்படுகின்றன. SARS-CoV ஐக் கண்டறியவும் இந்த தளம் பயன்படுத்தப்பட்டது. உருவகப்படுத்தப்பட்ட கழிவுநீர் மாதிரிகளில் -2 ஆம்பிளிகான்கள் (SARS-CoV-2 RNA உடன் மொத்த RNA மாதிரிகளை ஸ்பைக்கிங் செய்வதன் மூலம் பெறப்பட்டது). தனிமைப்படுத்தல் மற்றும் கீழ்நிலை செயலாக்கத்தின் போது RNA வெட்டுவதற்கு எளிதில் பாதிக்கப்படுவதால், 12,13 இந்த பன்முகத்தன்மை கொண்ட மாதிரியுடன் நீண்ட துண்டுகளை பெருக்குவது கடினம். எனவே, கழிவுநீரில் SARS-CoV-2 ஆம்ப்ளிகானின் மின்வேதியியல் உணர்திறன் விளக்கமானது குறுகிய \(72\,\hbox {bp}\) N1 துண்டிற்கு மட்டுமே.
இந்த வேலையில், ஏரி நீர் மாதிரிகளிலிருந்து (படம் 1) செறிவூட்டப்பட்ட மற்றும் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட பேஜ் Phi6 இன் ENIG PCB-அடிப்படையிலான மின்வேதியியல் உணர்திறனின் சாத்தியக்கூறுகளை ஆராய்ந்தோம். லிப்பிட் சவ்வு மற்றும் ஸ்பைக் புரதமும் உள்ளது. இந்த காரணங்களுக்காக, பாக்டீரியோபேஜ் ஃபை6 என்பது SARS-CoV-2 மற்றும் பிற உறைந்த நோய்க்கிருமி RNA வைரஸ்கள்14,15. ஆர்என்ஏ ஆகியவற்றுக்கான பிரபலமான மாற்று மருந்து ஆகும். 117 மற்றும் 503 அடிப்படை ஜோடி நீளமுள்ள இரண்டு DNA துண்டுகளைப் பெற PCR. எங்கள் முந்தைய வேலையில் \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 துண்டுகளைப் பெருக்கும் சவாலைக் கருத்தில் கொண்டு, இடைநிலை நீளத் துண்டுகளை (\(117) இலக்காகக் கொண்டுள்ளோம். \,\hbox {bp}\) மற்றும் \(503 \,\hbox {bp}\)), கிடைக்கக்கூடிய ப்ரைமர்களின் அடிப்படையில். எலக்ட்ரோ கெமிக்கல் சென்சார் பதில் ஒரு பரந்த செறிவு வரம்பில் முறையாக ஆய்வு செய்யப்பட்டது (\({10}\,{) \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) முதல் \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) உள்ள இரண்டு துண்டுகளுக்கும் MB இன் இருப்பு, சென்சார் பதிலில் உப்பின் தாக்கம் ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமெட்ரிக் அளவீடுகளால் வகைப்படுத்தப்பட்டு குறுக்கு-சரிபார்க்கப்படுகிறது. இந்த வேலையின் முக்கிய பங்களிப்புகள் பின்வருமாறு:
டிஎன்ஏ துண்டு நீளம் மற்றும் மாதிரியில் உப்பு இருப்பது உணர்திறனை கடுமையாக பாதிக்கிறது.டிஎன்ஏ செறிவு மற்றும் நீளத்தைப் பொறுத்து மின்வேதியியல் செயல்பாடு எம்பி, டிஎன்ஏ மற்றும் வோல்டாமெட்ரிக் பதிலில் உள்ள சென்சார் ஆகியவற்றின் தொடர்புகளின் வெவ்வேறு வழிமுறைகளைப் பொறுத்தது என்பதை எங்கள் முடிவுகள் காட்டுகின்றன. எம்பி மற்றும் டிஎன்ஏ.
டிஎன்ஏ செறிவு மாற்றப்படாத மின்முனைகளில் எம்பி-டிஎன்ஏ தொடர்புகளின் பொறிமுறையை தீர்மானிக்கிறது எம்பி-டிஎன்ஏ தொடர்புகளின் வெவ்வேறு வழிமுறைகள் டிஎன்ஏ செறிவைச் சார்ந்தது என்பதை நாங்கள் நிரூபிக்கிறோம். டிஎன்ஏ செறிவுகளில் சிறிய அளவு \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), மின்வேதியியல் மின்னோட்டப் பிரதிபலிப்பு முக்கியமாக மின்முனையில் MB-DNA இன் உறிஞ்சுதலால் தீர்மானிக்கப்படுவதைக் கவனித்தோம், அதே சமயம் குறைந்த செறிவுகளில் அதிக DNA செறிவுகளில், மின்வேதியியல் மின்னோட்டப் பதில் ரெடாக்ஸின் ஸ்டெரிக் தடுப்பால் தீர்மானிக்கப்படுகிறது. டிஎன்ஏ அடிப்படை ஜோடிகளுக்கு இடையே MB செருகுவதன் காரணமாக செயல்பாடு.
ஏரி நீர் மாதிரிகளில் வைரஸ் நியூக்ளிக் அமிலங்களின் ENIG PCB-அடிப்படையிலான மின்வேதியியல் உணர்தல், Powai ஏரி, IIT மும்பை வளாகத்தில் இருந்து நீர் மாதிரிகளிலிருந்து பெறப்பட்ட Phi6-சேர்க்கப்பட்ட \(503\,\hbox {bp}\) DNA துண்டுகளின் மின் வேதியியல் கண்டறிதல் மூலம் அவதானிப்புகள் சரிபார்க்கப்பட்டன. முடிவு பேஜ்.
செயல்படுத்துவதற்கான குறைந்த செலவு மற்றும் முழு தானியங்கு கண்காணிப்பு அமைப்புகள், ஒலிகோநியூக்ளியோடைடுகள் அல்லது நீண்ட கால ஆயுட்காலம் கொண்ட மின்முனைகளில் ஆப்டேமர்கள் ஆகியவற்றில் ஒருங்கிணைப்பதற்கான சாத்தியம்.
Phage Phi6 என்பது சைட்டோவிரிடே குடும்பத்தைச் சேர்ந்த ஒரு மூடிய dsRNA வைரஸ் ஆகும், இது சூடோமோனாஸ் சிரிங்கேவை பாதிக்கிறது. Phi6 பேஜின் மரபணு 3 துண்டுகளாக உள்ளது: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) மற்றும் L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\)) 16,17. Phi6 பேஜ் நோய்க்கிருமி அல்லாத BSL-1 சூடோமோனாஸ் விகாரத்தைப் பாதிக்கிறது என்பதால், அதைப் பயன்படுத்துவது பாதுகாப்பானது. ஆய்வகத்தில் எளிதாக வளர்க்கலாம். Phage Phi6 மற்றும் அதன் புரவலன் சூடோமோனாஸ் சிரிங்கே ஆகியவை பாக்டீரிய வைரஸ்களுக்கான Felix d'Herelle Reference Center, Laval University, Canada இலிருந்து வாங்கப்பட்டன (குறிப்பு மைய அட்டவணை எண்கள் முறையே HER-102 மற்றும் HER-1102 ஆகும்) .Phi6 phage மற்றும் அதன் புரவலன் குறிப்பு மையத்தின் வழிகாட்டுதலின்படி புத்துயிர் பெறப்பட்டது. Phi6 ஆனது பிளேட் லைசிஸ் மற்றும் எலுஷன் மூலம் சுத்திகரிக்கப்பட்டு \(\சுமார் 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (பிளேக் உருவாக்கும் அலகுகள்/ மில்லிலிட்டர்கள்).உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) ஐப் பயன்படுத்தி சுத்திகரிக்கப்பட்ட பேஜ் துகள்களிலிருந்து RNA தனிமைப்படுத்தப்பட்டது. சுருக்கமாக, ஒரு சுத்திகரிக்கப்பட்ட பேஜ் Phi6 இடைநீக்கம்\( 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) லைஸ் செய்யப்பட்டது மற்றும் லைசேட் ஒரு சுழல் நெடுவரிசையில் ஏற்றப்பட்டது, ஆர்என்ஏவை பிசின் நெடுவரிசையுடன் பிணைக்க அனுமதிக்கும் 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) கிட் வழங்கியது. \(260\,\hbox {nm}\) இல் உறிஞ்சுவதன் மூலம் ஆர்என்ஏவின் செறிவை மதிப்பிடவும். ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) மேலும் பயன்படுத்தும் வரை.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA சின்தஸிஸ் கிட் (பயோ -Rad Laboratories) உற்பத்தியாளரின் வழிமுறைகளைப் பின்பற்றி cDNA தொகுப்புக்கான டெம்ப்ளேட்டாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது. சுருக்கமாக, cDNA தொகுப்பு எதிர்வினை 3 படிகளைக் கொண்டுள்ளது: \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , \({20}\,{\hbox {min}}\) இன் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), மற்றும் ரிவர்ஸ் ரெக்கார்டர் \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) இல் \({1}\,{\hbox {min }}\).1% ஆகரோஸ் ஜெல்லில் இயங்கும் போது, ​​சிடிஎன்ஏ எதிர்பார்க்கப்பட்ட மூன்று ஆர்என்ஏ துண்டுகளுக்கு (தரவு காட்டப்படவில்லை) மூன்று பட்டைகளைக் காட்டியது. 117 மற்றும் 503 பிபி நீளமுள்ள இரண்டு டிஎன்ஏ துண்டுகளைப் பெருக்க பின்வரும் ப்ரைமர்கள் பயன்படுத்தப்பட்டன, மினிபிசிஆர்® மினி8 தெர்மல் சைக்லரில் சிடிஎன்ஏவை பிசிஆருக்கான டெம்ப்ளேட்டாகப் பயன்படுத்துதல்:
\(117\,\hbox {bp}\) மற்றும் \(503\,\hbox {bp}\) க்கான ப்ரைமர்கள் M பிரிவின் 1476-1575 நியூக்ளியோடைட்கள் மற்றும் L பிரிவின் 458-943 நியூக்ளியோடைட்கள், முறையே அமிலம் .அனைத்து பெருக்கப்பட்ட PCR தயாரிப்புகளும் 1% அகரோஸ் ஜெல்களில் எலக்ட்ரோபோரேஸ் செய்யப்பட்டன, மேலும் GeneJET ஜெல் பிரித்தெடுத்தல் கருவியை (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) பயன்படுத்தி பெருக்கப்பட்ட இலக்கு டிஎன்ஏ சுத்திகரிக்கப்பட்டது.
ஐஐடி மும்பை வளாகத்தில் உள்ள ஒரு ஏரி (போவாய் ஏரி, போவாய், மும்பை) பேஜ் துகள்களைச் சேர்க்க பயன்படுத்தப்பட்டது. ஏரி நீரை அகற்றுவதற்காக \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) சவ்வு மூலம் வடிகட்டப்பட்டது. இடைநிறுத்தப்பட்ட துகள்கள், பின்னர் Phi6 பேஜ் சேர்க்கப்பட்டது. \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} இல் \({1}\,{\hbox {ml}}\) சேர்க்கவும் \({100}\ ,{\hbox {ml}}\) வடிகட்டப்பட்ட ஏரி நீர், \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\).சிறிய அலிகோட் பிளேக் அஸ்ஸே மூலம் வைரஸ் சுமை அளவீட்டிற்காக ஒதுக்கப்பட்டுள்ளது. ஸ்பைக் செய்யப்பட்ட ஃபை6 வைரஸ் துகள்களை செறிவூட்ட இரண்டு வெவ்வேறு முறைகளை நாங்கள் சோதித்தோம்: (1) அலுமினியம் ஹைட்ராக்சைடு உறிஞ்சுதல்-வீழ்படிவு முறை,19 சுற்றுச்சூழலின் மாதிரிகளிலிருந்து பல உறைந்த RNA வைரஸ்களின் செறிவிற்காக சரிபார்க்கப்பட்டது, மற்றும் (2) ) பாலிஎதிலீன் கிளைகோல் (PEG) அடிப்படையிலான வைரஸ் செறிவு முறையானது ஃப்ளட் மற்றும் பலவற்றிலிருந்து தழுவி எடுக்கப்பட்டது.20 .அலுமினியம் ஹைட்ராக்சைடு முறையை விட PEG-அடிப்படையிலான முறையின் மீட்புத் திறன் சிறப்பாக இருப்பதாகக் கண்டறியப்பட்டதால், ஏரி நீர் மாதிரிகளிலிருந்து Phi6 துகள்களைக் குவிக்க PEG-அடிப்படையிலான முறை பயன்படுத்தப்பட்டது.
PEG முறை பின்வருமாறு பயன்படுத்தப்பட்டது: 8 % PEG 8000 மற்றும் \(0.2\,\hbox {M} \) \(Phi6-ஸ்பைக் ஏரி நீர் மாதிரிகளில் PEG 8000 மற்றும் \(\hbox {NaCl}\) சேர்க்கப்பட்டன. \ hbox {NaCl}\).மாதிரிகள் ஒரு ஷேக்கரில் அடைக்கப்பட்டுள்ளன\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), பின்னர் \(4700 \,\hbox {g}\) என்பது \({45}\,{\hbox {min}}\) மையவிலக்கு ஆகும். சூப்பர்நேட்டன்ட்டை நிராகரித்து, \({1}\, இல் பெல்லட்டை மீண்டும் இணைக்கவும். {\hbox {ml}}\) அதே சூப்பர்நேட்டண்டில் உள்ளது.அனைத்து ஸ்பைக்கிங் மற்றும் வைரஸ் செறிவு சோதனைகள் மும்மடங்கு செய்யப்பட்டன. செறிவூட்டலுக்குப் பிறகு, பிளேக் மதிப்பீட்டின் மூலம் மீட்பு செயல்திறனை அளவிடுவதற்கு ஒரு சிறிய அலிகோட் ஒதுக்கப்பட்டது.ஆர்என்ஏ முன்பு விவரிக்கப்பட்டது மற்றும் நீக்கப்பட்டது. கிட்-சப்ளை செய்யப்பட்ட எலுஷன் பஃபரில்\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\).ஆர்என்ஏ செறிவு மாதிரிக்கு மாதிரி மூன்று மடங்காக மாறுபடும் என்பதால், \({2}\,{\upmu \ ஆர்என்ஏவின் hbox {l}}\) மூன்றிற்கும் அதன் செறிவு cDNA தொகுப்பு மாதிரிகள் பயன்படுத்தப்படுகிறது. cDNA தொகுப்பு முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி செய்யப்பட்டது.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR க்கு 35 சுழற்சிகளுக்கு \ (117\,\hbox {bp}\) மற்றும் \(503\,\hbox {) டெம்ப்ளேட்டாக பயன்படுத்தப்பட்டது bp}\) துண்டுகள். இந்த மாதிரிகள் “1:1″, அதாவது நீர்த்துப்போகாமல் குறிப்பிடப்படுகின்றன. ஒரு டெம்ப்ளேட் இல்லாத கட்டுப்பாடு (NTC) எதிர்மறைக் கட்டுப்பாட்டாக அமைக்கப்பட்டது, அதே நேரத்தில் சுத்திகரிக்கப்பட்ட பேஜிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்ட RNA ஐப் பயன்படுத்தி ஒரு சிடிஎன்ஏ ஒருங்கிணைக்கப்பட்டது. நேர்மறை கட்டுப்பாட்டிற்கான (PC) டெம்ப்ளேட்டாக. அளவு PCR (qPCR) ஆனது ஸ்ட்ராடஜீன் Mx3000P RT-PCR கருவியில் புத்திசாலித்தனமான III அல்ட்ரா-ஃபாஸ்ட் SYBR கிரீன் QPCR மாஸ்டர் மிக்ஸ் (Agilent Technologies) ஐப் பயன்படுத்தி நிகழ்த்தப்பட்டது. அனைத்து மாதிரிகளுக்கும் சுழற்சி வரம்பு (Ct) பதிவு செய்யப்பட்டது. கூடுதலாக, நீர்த்த மாதிரிகள் \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) வடிகட்டப்பட்ட ஏரி நீரில் 1:100 நீர்த்த cDNA ஐப் பயன்படுத்தி \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) 35 சுழற்சிகளுக்கான PCR. இந்த மாதிரிகள் “1:100″ ஆக குறிப்பிடப்படுகின்றன.
கூடுதல் தங்க முலாம் தேவையில்லாமல் வணிகரீதியாகக் கிடைக்கும் குறைந்த விலை எலக்ட்ரோலெஸ் நிக்கல் இம்மர்ஷன் கோல்ட் (ENIG) செயல்முறையைப் பயன்படுத்தி PCB மின்முனைகள் புனையப்படுகின்றன. ENIG PCB எலக்ட்ரோடு விவரக்குறிப்புகள் எங்கள் முந்தைய வேலையில் விவரிக்கப்பட்டுள்ளன11. ENIG PCB மின்முனைகளுக்கு, பாரம்பரிய எலக்ட்ரோடு சுத்தம் செய்யும் முறைகள் பிரன்ஹா கரைசல் அல்லது சல்பூரிக் அமில சுழற்சி மின்னழுத்தம் பரிந்துரைக்கப்படவில்லை, ஏனெனில் அவை மெல்லிய தங்க அடுக்கு (தடிமன் \(\தோராயமாக\) \(100\,\hbox {nm }\)) உரிக்கப்படுவதற்கும், அடிபட்ட செப்பு அடுக்குகளை வெளிப்படுத்துவதற்கும் காரணமாக இருக்கலாம். அரிப்பு 21, 22, 23, 24, 25. எனவே, IPA உடன் ஈரப்படுத்தப்பட்ட பஞ்சு இல்லாத துணியால் மின்முனைகளை சுத்தம் செய்யவும். சோதிக்கப்பட வேண்டிய மாதிரி \({50}\,{\upmu \hbox {M}) எளிதாக செருகுவதற்கு \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) இல் }\) MB. எங்களின் முந்தைய வேலையில் , MB செறிவு 11 ஐ அதிகரிப்பதன் மூலம் சென்சாரின் உணர்திறன் மற்றும் நேர்கோட்டுத்தன்மை மேம்படுத்தப்பட்டதை நாங்கள் கவனித்தோம் .எங்கள் முந்தைய வேலையில் தெரிவிக்கப்பட்ட மேம்படுத்தல்களின் அடிப்படையில், \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB ஐப் பயன்படுத்தினோம். இந்த ஆய்வில் டிஎன்ஏவை உட்பொதிப்பதற்கான செறிவுகள். இரட்டை இழைகள் கொண்ட டிஎன்ஏ (டிஎஸ்-டிஎன்ஏ) இன் மின் வேதியியல் கண்டறிதலை அயோனிக் அல்லது கேஷனிக் இன்டர்கேலேட்டர்களைப் பயன்படுத்தி அடையலாம். அனானிக் இன்டர்கேலேட்டர்கள் டிஎன்ஏவை சிறந்த தேர்வுத்திறனுடன் கண்டறிந்தாலும், அவற்றுக்கு ஒரே இரவில் அடைகாத்தல் தேவைப்படுகிறது, இதன் விளைவாக நீண்ட கண்டறிதல் நேரம் கிடைக்கும். மறுபுறம், MB போன்ற கேஷனிக் இன்டர்கேலேட்டர்களுக்கு ds-DNA6 இன் மின்வேதியியல் கண்டறிதலுக்கு, தோராயமாக \({1}\,{\hbox {h}}\) குறுகிய அடைகாக்கும் நேரங்கள் தேவைப்படுகின்றன. ஒவ்வொரு அளவீட்டிலும் சோதனை செய்யப்படும் மாதிரியை வழங்குவது அடங்கும். மின்முனை\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), பின்னர் மற்றொரு மாதிரியுடன் தொடர்வதற்கு முன், IPA-ஈரமான துணியால் சுத்தம் செய்தல்.ஒரு அளவீடு.ஒவ்வொரு மாதிரியும் 5 வெவ்வேறு மின்முனைகளில் சோதிக்கப்பட்டது. வேறுவிதமாகக் கூறப்படாவிட்டால்.DPV மற்றும் CV அளவீடுகள் PalmSens Sensit Smart potentiostat ஐப் பயன்படுத்தி நிகழ்த்தப்பட்டன, மேலும் PSTrace மென்பொருள் பொட்டென்டியோஸ்டாட் உள்ளமைவு மற்றும் தரவுப் பெறுதலுக்கு பயன்படுத்தப்பட்டது, இதில் உச்ச மின்னோட்டக் கணக்கீடுகள் அடங்கும். பின்வரும் அமைப்புகள் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. DPV மற்றும் CV அளவீடுகளுக்கு:
DPV: சமநிலை நேரம் = \(8\,\hbox {s}\), மின்னழுத்த படி = \(3\,\hbox {mV}\), பல்ஸ் மின்னழுத்தம் = \(25\,\hbox {mV}\) , துடிப்பு காலம் = \(50\,\hbox {ms}\), ஸ்கேன் விகிதம் = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: சமநிலை நேரம் = \(8\,\hbox {s}\), மின்னழுத்த படி = \(3\,\hbox {mV}\), Sweep Rate = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV மற்றும் CV வோல்டாமோகிராம்கள் ENIG PCB மின்முனைகளில் பெறப்பட்டன \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB டிஎன்ஏ (10–\({20}\,{\ hbox {ng செறிவுகளில்) }/{\upmu \hbox {l}}}\) அதாவது 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(117\,\hbox {bp}\ ) மற்றும் 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) க்கான \(503\,\hbox {bp}\)).பிரதிநிதி வோல்டாமோகிராம்கள் துணைத் தகவலில் படம் S1 இல் காட்டப்பட்டுள்ளன. படம் 2 முடிவுகளைக் காட்டுகிறது. ஜெல்-சுத்திகரிக்கப்பட்ட PCR தயாரிப்புகளைப் பயன்படுத்தி DPV மற்றும் CV அளவீடுகளின் (உச்ச மின்னோட்டம்) CV அளவீடுகளுடன் ஒப்பிடுகையில், DPV அளவீடுகள் அதிக உணர்திறனைக் காட்டுகின்றன (தற்போதைய DNA செறிவு செயல்பாடாக) ஏனெனில் CV அளவீடுகளில் பின்னணி கொள்ளளவு மின்னோட்டங்கள் ஃபாரடாயிக் நீரோட்டங்களை மறைக்கிறது 26 .தரவு பாக்ஸ் ப்ளாட்டில் உள்ள ஒவ்வொரு பெட்டியிலும் 5 மின்முனைகளிலிருந்து அளவீடுகள் உள்ளன. எலக்ட்ரோடு-டு-எலக்ட்ரோடு மாறுபாட்டின் காரணமாக அளவீட்டு பிழைகளைத் தவிர்க்க அனைத்து அளவீடுகளும் ஒரே மாதிரியான மின்முனைகளைப் பயன்படுத்துகின்றன. டிபிவி மற்றும் சிவி டிஎன்ஏ செறிவு குறைந்த உச்ச மின்னோட்டங்களில் அதிகரித்து வருவதை நாங்கள் கண்டோம். , நீண்ட (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ உடன் ஒப்பிடும்போது \(117) ) துண்டு. இது எங்கள் முந்தைய வேலையில் தெரிவிக்கப்பட்ட எலக்ட்ரோடு உறிஞ்சுதலின் எதிர்பார்க்கப்படும் போக்குடன் ஒத்துப்போகிறது. MB-DNA வளாகத்தின் உறிஞ்சுதல், மின்முனையின் மீது சார்ஜ் பரிமாற்றத்தை எளிதாக்குகிறது, இது உச்ச மின்னோட்டத்தின் அதிகரிப்புக்கு பங்களிக்கிறது. மற்ற ஆய்வுகள் MB-DNA இன்டர்கலேஷன்27,28,29,30 இல் ஒலிகோநியூக்ளியோடைடு அளவு மற்றும் வரிசையின் விளைவைக் காட்டுகின்றன. இரண்டு ஆம்பிளிகான்களின் (\(117\,\hbox {bp}\) மற்றும் \(503\,\hbox {bp}\)) -சைட்டோசின் (GC) உள்ளடக்கம் தோராயமாக 50% ஆகும், இது கவனிக்கப்பட வேண்டிய வேறுபாடு காரணமாக உள்ளது என்பதைக் குறிக்கிறது. ஆம்ப்ளிகான் நீளத்திற்கு \) மற்றும் \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) க்கான \(117\,\hbox {bp}\)), நாங்கள் இரண்டு பெருக்கங்களைக் கவனிக்கிறோம் டிபிவி மற்றும் சிவி அளவீடுகள் இரண்டிலும் சப்களின் உச்ச மின்னோட்டங்கள் குறைக்கப்படுகின்றன. இதற்குக் காரணம் எம்பி டிஎன்ஏவின் அடிப்படை ஜோடிகளுக்கு இடையே செறிவூட்டுகிறது மற்றும் இடைக்கணிக்கிறது, இதன் விளைவாக MB31,32 இல் குறைக்கக்கூடிய குழுவின் ரெடாக்ஸ் செயல்பாட்டை ஸ்டெரிக் தடுக்கிறது.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
PCR மாஸ்டர் கலவைகளில் இருக்கும் உப்புகள் MB மற்றும் DNA இடையே மின்னியல் தொடர்புகளில் குறுக்கிடுகின்றன, எனவே \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) உடன் \({50} \,{\) சேர்ப்பதன் மூலம் upmu \hbox {M}}\) MB ஜெல்-சுத்திகரிக்கப்பட்ட தயாரிப்பு MB-DNA தொடர்புகளில் உப்பின் விளைவை ஆய்வு செய்ய. படம் 3 இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, அதிக DNA செறிவுகளுக்கு (\(>{2}\,{\) hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) மற்றும் \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) க்கான \(117\,\hbox {bp} \)), DPV மற்றும் CV இல் உப்பு சேர்ப்பது அளவீடுகளை கணிசமாக பாதிக்கவில்லை (பிரதிநிதித்துவ வோல்டாமோகிராம்களுக்கான துணைத் தகவலில் படம் S2 ஐப் பார்க்கவும்). இருப்பினும், மணிக்கு குறைந்த டிஎன்ஏ செறிவு, உப்பு சேர்ப்பது உணர்திறனை வெகுவாகக் குறைக்கிறது, இதன் விளைவாக டிஎன்ஏ செறிவூட்டலுடன் மின்னோட்டத்தில் குறிப்பிடத்தக்க மாற்றமில்லை. MB-DNA இடைவினைகள் மற்றும் இடைச்சேர்க்கையில் உப்பின் இதே போன்ற எதிர்மறையான விளைவுகள் மற்ற ஆராய்ச்சியாளர்களால் முன்னர் தெரிவிக்கப்பட்டுள்ளன33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) கேஷன்கள் டிஎன்ஏவின் எதிர்மறை பாஸ்பேட் முதுகெலும்புடன் பிணைக்கப்படுகின்றன, இதன் மூலம் MB மற்றும் DNA இடையே மின்னியல் தொடர்புகளைத் தடுக்கிறது. அதிக டிஎன்ஏ செறிவுகளில், ரெடாக்ஸ்-செயலில் உள்ள MBகளின் ஸ்டெரிக் தடுப்பானது குறைந்த உச்ச மின்னோட்டங்களை ஏற்படுத்துகிறது, எனவே மின்னியல் இடைவினைகள் சென்சார் பதிலைக் கணிசமாகப் பாதிக்காது. முக்கிய அம்சம் என்னவென்றால், அதிக டிஎன்ஏ செறிவுகளைக் கண்டறிய இந்த பயோசென்சர் மிகவும் பொருத்தமானது (அரிதாக \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) அல்லது அதற்கு மேற்பட்டது), முழுமையாக- சுற்றுச்சூழல் நீர் மாதிரிகளின் தானியங்கு செயலாக்கம், PCR தயாரிப்புகளின் ஜெல் சுத்திகரிப்பு சாத்தியமற்றதாக இருக்கலாம்.
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB உடன் சிக்கலான DNAவின் பல்வேறு செறிவுகளுக்கான அலைநீள வரம்பு 600–700 \(\hbox {nm}\) உறிஞ்சுதல் வளைவின் கீழ் பகுதி: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) உப்பு மற்றும் உப்பு இல்லாமல் (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) உப்பு மற்றும் உப்பு இல்லாமல் (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB மாதிரிகளுக்கு தொடர்புடைய DNA செறிவுகள் DNA இல்லை.
மேலே உள்ள முடிவுகளை மேலும் சரிபார்க்க, UV/Vis ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டர் (தெர்மோ சயின்டிஃபிக் மல்டிஸ்கான் GO) ஐப் பயன்படுத்தி ஆப்டிகல் அளவீடுகளைச் செய்தோம், ஒவ்வொன்றிற்கும் \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) மாதிரிகள் பயன்படுத்தப்பட்டன. அளவு nm}\) , படம் 4 இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி (உறிஞ்சுதல் ஸ்பெக்ட்ரம் துணைத் தகவலில் படம் S3 இல் காட்டப்பட்டுள்ளது). \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox ஐ விட குறைவான DNA செறிவு கொண்ட மாதிரிகளுக்கு {l}}}\), டிஎன்ஏ-கொண்ட மற்றும் MB-மட்டும் மாதிரிகள் (\(503\,\hbox {bp}\) மற்றும் \(117\,\hbox {bp}\) ஆகியவற்றுக்கு இடையே குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடு இல்லை. ) நீளத் துண்டுகள்), ரெடாக்ஸ்-ஆக்டிவ் MB இன் ஸ்டெரிக் தடுப்பு இல்லாததைக் குறிக்கிறது. அதிக டிஎன்ஏ செறிவுகளில், உறிஞ்சுதல் சமிக்ஞையில் படிப்படியாகக் குறைவதைக் கவனித்தோம் மற்றும் உப்பு முன்னிலையில் உறிஞ்சுதலில் குறைவான குறைவைக் கவனித்தோம். இந்த முடிவுகள் மூலக்கூறுக்குக் காரணம். டிஎன்ஏ கலப்பினங்களில் பேஸ் ஸ்டேக்கிங்குடன் இடைவினைகள் மற்றும் ஸ்டெரிக் இன்ஹிபிஷன் 36, 37, 38 அடுக்குகள் இடைக்கணிப்பு காரணமாக மின்னணு மாற்றங்கள்.
பேஜ் Phi6 இன் அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ்: ஏரி நீர் மாதிரிகளில் இருந்து \(117\,\hbox {bp}\) மற்றும் \(503\,\hbox {bp}\) நீளமுள்ள PCR தயாரிப்புகள்.M-DNA மார்க்கர்;NTC-நோ-டெம்ப்ளேட் கட்டுப்பாடு, தொடர்புடைய ஆம்பிளிகான்களைக் கொண்ட ப்ரைமர்கள்;பிசி நேர்மறை கட்டுப்பாடு;1, 2, 3-நீர்த்தப்படாத (1:1) மும்மடங்குகளில் ஸ்பைக் செய்யப்பட்ட ஏரி நீர் மாதிரிகள். \(\சுமார் 50\,\hbox {bp}\) இல் \(503\,\ இல் பயன்படுத்தப்படாத ஒலிகோநியூக்ளியோடைடுகள் காரணமாக ஒரு பேண்ட் தெரியும். hbox {bp}\) பாதை.
ஃபை6 பேஜுடன் கூடிய போவாய் ஏரி நீர் மாதிரிகளைப் பயன்படுத்தி சென்சாரின் பயன்பாட்டை மதிப்பீடு செய்தோம். பேஜ்-ஸ்பைக் செய்யப்பட்ட நீர் மாதிரிகளிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்ட ஆர்என்ஏ செறிவுகள் 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), சுத்திகரிக்கப்பட்ட பேஜ் இடைநீக்கங்களிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்டவை, RNA ஆனது தோராயமாக 1 மீட்டெடுப்புத் திறனுடன் \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) என மதிப்பிடப்பட்டது. %.RNA ஆனது சிடிஎன்ஏவில் மாற்றப்பட்டு PCR மற்றும் qPCRக்கான டெம்ப்ளேட்டாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது. சென்சார் மூலம் சோதனை செய்வதற்கு முன் தயாரிப்பு அளவு அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் (படம் 5) மூலம் உறுதிப்படுத்தப்பட்டது. இந்த மாதிரிகள் ஜெல் சுத்திகரிக்கப்படவில்லை, எனவே PCR இன் அனைத்து கூறுகளும் உள்ளன ஆர்வத்தின் ஆம்பிளிகான்கள். qPCR (அட்டவணை 1) இன் போது பதிவுசெய்யப்பட்ட Ct மதிப்புகள் தொடர்புடைய கூர்முனை நீர் மாதிரிகளிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்ட RNA செறிவுடன் தொடர்புபடுத்தப்பட்டுள்ளன. Ct மதிப்பு ஒளிரும் சமிக்ஞைக்கு தேவையான சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கையை வெளிப்படுத்துகிறது. வரம்பு அல்லது பின்னணி சமிக்ஞையை மீறுகிறது. அதிக Ct மதிப்புகள் குறைந்த டெம்ப்ளேட் செறிவுகளைக் குறிக்கின்றன மற்றும் நேர்மாறாகவும். NTC மாதிரிகளின் Ct மதிப்புகள் எதிர்பார்த்த அளவுக்கு அதிகமாக இருந்தன. \(\தோராயமாக 3\) Ct மதிப்புகளுக்கு இடையே உள்ள வேறுபாடு நேர்மறை கட்டுப்பாடு மற்றும் சோதனை மாதிரி மேலும் ஒவ்வொரு சோதனை மாதிரியும் நேர்மறை கட்டுப்பாட்டுடன் ஒப்பிடும்போது தோராயமாக 1% டெம்ப்ளேட்டைக் குறிக்கிறது. நீண்ட ஆம்பிளிகான்கள் சிறந்த உணர்திறனுக்கு வழிவகுக்கும் என்று நாங்கள் முன்பு விவாதித்தோம். பன்முகத்தன்மை வாய்ந்த சுற்றுச்சூழல் மாதிரிகளிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்ட நீண்ட துண்டுகளை பெருக்குவது குறைபாடுகளைக் கருத்தில் கொண்டு சவாலானது. குறைந்த வைரஸ் செறிவு மற்றும் RNA சிதைவு. எனினும், எங்கள் வைரஸ் செறிவூட்டல் மற்றும் PCR பெருக்க நெறிமுறை மூலம், மின்வேதியியல் உணர்விற்காக \(503\,\hbox {bp}\) பகுதியை வெற்றிகரமாக பெருக்க முடிந்தது.
படம் 6, \(503\,\hbox {bp}\) துண்டு ஆம்ப்ளிகானின் மின்வேதியியல் சென்சார் முடிவுகளைக் காட்டுகிறது, இவை இரண்டும் நீர்த்த சிடிஎன்ஏவை டெம்ப்ளேட்டாகவும் (1:1) மற்றும் 100 மடங்கு நீர்த்த சிடிஎன்ஏவை வார்ப்புருவாகவும் (1:100 ) பயன்படுத்துகிறது PCR , NTC மற்றும் PC உடன் ஒப்பிடும்போது (பிரதிநிதித்துவ வோல்டாமோகிராம்களுக்கான துணைத் தகவலில் படம் S4 ஐப் பார்க்கவும்).படம் 6 இல் உள்ள பாக்ஸ்ப்ளாட்டில் உள்ள ஒவ்வொரு பெட்டியும் 5 மின்முனைகளில் உள்ள மூன்று மாதிரிகளின் அளவீடுகளைக் கொண்டுள்ளது. அதே மின்முனைகள் மின்முனையினால் ஏற்படும் பிழைகளைத் தவிர்க்க அனைத்து மாதிரிகளையும் அளவிடப் பயன்படுத்தப்பட்டன. -க்கு-எலக்ட்ரோடு மாறுபாடு.CV அளவீடுகளுடன் ஒப்பிடுகையில், DPV அளவீடுகள் NTC களில் இருந்து சோதனை மற்றும் PC மாதிரிகளை வேறுபடுத்துவதற்கான சிறந்த தெளிவுத்திறனைக் காட்டுகின்றன, ஏனெனில், முன்பு குறிப்பிட்டபடி, Faradaic நீரோட்டங்கள் பிந்தையவற்றின் பின்னணி கொள்ளளவு மின்னோட்டங்களின் காரணமாக மறைக்கப்படுகின்றன. நீண்ட ஆம்பிளிகான்களுக்கு, நாங்கள் அதைக் கவனித்தோம். எதிர்மறைக் கட்டுப்பாடு (NTC) நேர்மறைக் கட்டுப்பாட்டுடன் ஒப்பிடும்போது அதிக CV ​​மற்றும் DPV உச்ச மின்னோட்டங்களை ஏற்படுத்தியது, அதேசமயம் நேர்மறை மற்றும் நீர்த்த சோதனை மாதிரிகள் DPV உச்ச மின்னோட்டங்களின் அதே உச்ச உயரங்களைக் காட்டியது. ஒவ்வொரு நீர்த்தப்படாத சராசரி மற்றும் சராசரி மதிப்புகள் (1:1) ) சோதனை மாதிரி மற்றும் PC ஆகியவை NTC மாதிரிக்கான சென்சார் வெளியீட்டில் இருந்து தெளிவாகத் தீர்க்கப்படும், அதே சமயம் 1:100 நீர்த்த மாதிரிக்கான தெளிவுத்திறன் குறைவாக உச்சரிக்கப்படுகிறது. சிடிஎன்ஏ 100 மடங்கு நீர்த்தலுக்கு, ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸின் போது எந்த பட்டையையும் நாங்கள் கவனிக்கவில்லை. (படம் 5 இல் காட்டப்படாத பாதைகள்), மற்றும் தொடர்புடைய DPV மற்றும் CV உச்ச மின்னோட்டங்கள் NTCக்கு எதிர்பார்த்ததைப் போலவே இருந்தன. \(117\,\hbox {bp}\) துண்டுக்கான முடிவுகள் துணைத் தகவலில் காட்டப்பட்டுள்ளன. எதிர்மறை எலெக்ட்ரோடில் இலவச MB இன் உறிஞ்சுதல் மற்றும் ஒற்றை-ஸ்ட்ராண்டட் ப்ரைமர் ஒலிகோநியூக்ளியோடைடுடன் MB இன் தொடர்பு காரணமாக PCB சென்சாரிலிருந்து ஒரு மின்வேதியியல் பதிலைக் கட்டுப்பாடு தூண்டியது.எனவே, ஒவ்வொரு முறையும் ஒரு மாதிரி சோதிக்கப்படும்போது, ​​எதிர்மறையான கட்டுப்பாட்டை இயக்க வேண்டும். சோதனை மாதிரியின் உச்ச மின்னோட்டம் எதிர்மறை கட்டுப்பாட்டால் பெறப்பட்ட உச்ச மின்னோட்டத்துடன் ஒப்பிடுகையில், சோதனை மாதிரியை நேர்மறை அல்லது எதிர்மறையாக வகைப்படுத்துவதற்கு வேறுபட்ட (உறவினர்) அளவீட்டை அடைய 39,40.
(அ) ​​DPV, மற்றும் (b) ஏரி நீர் மாதிரிகளில் \(503\,\hbox {bp}\) துண்டுகளின் மின்வேதியியல் கண்டறிதலுக்கான CV பீக் மின்னோட்டம். சோதனை மாதிரிகள் மும்மடங்காக அளவிடப்பட்டன மற்றும் டெம்ப்ளேட் கட்டுப்பாடுகள் இல்லாத (NTC) உடன் ஒப்பிடப்பட்டன. நேர்மறை கட்டுப்பாடுகள் (பிசி).
UV/Vis ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டரைப் பயன்படுத்தி ஆப்டிகல் அளவீடுகள் மூலம் சரிபார்க்கப்பட்ட செறிவுகளுடன், வெவ்வேறு டிஎன்ஏக்களுக்கான வெவ்வேறு நீளங்களின் ஆம்ப்ளிகான்களுக்கான மின்வேதியியல் சென்சார்களின் செயல்திறனைப் பாதிக்கும் வெவ்வேறு வழிமுறைகளை எங்கள் கண்டுபிடிப்புகள் விளக்குகின்றன. \(500\,\hbox {bp}\) அதிக உணர்திறனுடன் கண்டறியப்படலாம் மற்றும் மாதிரியில் உப்பு இருப்பது அதிக உணர்திறனை பாதிக்கும் உணர்திறன் DNA செறிவு அல்ல (அரிதாக \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) மற்றும் அதற்கு மேல்).மேலும், பல்வேறு வகையான மாதிரிகளின் விளைவை ஆராய்ந்தோம், இதில் உப்பு சேர்க்கப்பட்ட மற்றும் சேர்க்காத ஜெல்-சுத்திகரிக்கப்பட்ட ஆம்பிளிகான்கள் மற்றும் DPV மற்றும் CV அளவீடுகளில் ஏரி நீர் மாதிரிகளைச் சேர்த்துள்ளோம்.DPV சிறந்த தெளிவுத்திறனை வழங்குவதை நாங்கள் கவனித்தோம், ஏனெனில் பின்னணி கொள்ளளவு மின்னோட்டம் CV அளவீட்டையும் பாதிக்கிறது, இது குறைவான உணர்திறன் கொண்டது.
நீண்ட துண்டுகளின் பெருக்கம் வைரஸ் மரபணு ஆர்என்ஏவின் ஒருமைப்பாட்டைச் சார்ந்துள்ளது. சுற்றுச்சூழலில் ஆர்என்ஏவின் சிதைவு மற்றும் தனிமைப்படுத்தலின் போது பிளவுபடுவதற்கான சாத்தியக்கூறுகள் காரணமாக நீண்ட துண்டுகளின் பெருக்கம் எப்போதும் திறமையாக இருக்காது என்று பல ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன. .அலுமினியம் ஹைட்ராக்சைடு-அடிப்படையிலான வைரஸ் செறிவு முறையைக் காட்டிலும், ஏரி நீர் மாதிரிகளில் ஸ்பைக் செய்யப்பட்ட பேஜ் ஃபை-6 ஐ செறிவூட்டுவதில் PEG-அடிப்படையிலான வைரஸ் செறிவு முறை மிகவும் பயனுள்ளதாக இருப்பதை நாங்கள் கவனித்தோம். நீண்ட டிஎன்ஏ துண்டுகளைக் கண்டறியும் திறன் மல்டிபிளக்ஸ் PCR இன் தேவையை நிரூபித்தது. பல குறுகிய நீள டெம்ப்ளேட்களை பெருக்க மற்றும் குறுக்கு-குறிப்பிட்ட சாத்தியத்தை குறைக்க.
உயிரியல் மாதிரிகள் குறைவு, எனவே சோதனைக்கு குறைந்தபட்ச மாதிரிகள் தேவைப்படும் பயோசென்சரை வடிவமைக்க வேண்டிய அவசியம் உள்ளது. இந்த ஆய்வில் பயன்படுத்தப்படும் ENIG PCB மின்முனைகளுக்கு \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) எலெக்ட்ரோடுகளின் பயனுள்ள பகுதியை மறைப்பதற்கான சோதனைக்கான மாதிரிகள். கூடுதலாக, அடுத்த மாதிரியை விநியோகிக்கும் முன் அதே மின்முனையை சுத்தம் செய்த பிறகு மீண்டும் பயன்படுத்தலாம். பெருக்கப்பட்ட மாதிரிகள் மெத்திலீன் நீலத்தைத் தவிர வேறு எந்த இரசாயனத்தையும் சேர்க்கத் தேவையில்லை, இது மலிவானது. மற்றும் பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் ரசாயனம்.ஒவ்வொரு மின்முனையும் தயாரிப்பதற்கு சுமார் $0.55 (அல்லது INR 40) செலவாகும் என்பதால், இந்த பயோசென்சர் தற்போதுள்ள கண்டறிதல் தொழில்நுட்பங்களுக்குச் செலவு குறைந்த மாற்றாக இருக்கலாம். நீண்ட காலமாக இலக்கியத்தில் பதிவாகியுள்ள மற்ற உணரிகளுடன் இந்த வேலையை ஒப்பிட்டு அட்டவணை 2 காட்டுகிறது. பன்முக மாதிரிகளில் டிஎன்ஏ துண்டுகள்.
MB-அடிப்படையிலான மின்வேதியியல் கண்டறிதல் நெறிமுறைகள் PCR இன் தனித்தன்மையை நம்பியிருப்பதால், இந்த முறையின் முக்கிய வரம்பு, கழிவுநீர் மற்றும் ஏரி நீர் போன்ற பன்முகத்தன்மை கொண்ட மாதிரிகளில் குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கத்திற்கான சாத்தியம் அல்லது குறைந்த தூய்மையான ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்துகிறது. மாற்றப்படாத ENIG PCB மின்முனைகளைப் பயன்படுத்தி சுத்திகரிக்கப்படாத PCR தயாரிப்புகளை DNA கண்டறிவதற்கான மின்வேதியியல் கண்டறிதல் முறைகள், பயன்படுத்தப்படாத dNTPகள் மற்றும் ப்ரைமர்களால் அறிமுகப்படுத்தப்பட்ட பிழைகளை நன்கு புரிந்துகொள்வது மற்றும் எதிர்வினை நிலைமைகள் மற்றும் மதிப்பீட்டு நெறிமுறைகளை மேம்படுத்துவது அவசியம். pH, வெப்பநிலை மற்றும் உயிரியல் போன்ற கூடுதல் இயற்பியல் வேதியியல் அளவுருக்கள் அளவீட்டின் துல்லியத்தை மேம்படுத்த, நீர் மாதிரியின் ஆக்ஸிஜன் தேவை (BOD) அளவிடப்பட வேண்டும்.
முடிவில், சுற்றுச்சூழல் (ஏரி நீர்) மாதிரிகளில் வைரஸ் கண்டறிதலுக்கான குறைந்த விலை மின்வேதியியல் ENIG PCB சென்சார் ஒன்றை நாங்கள் முன்மொழிகிறோம். அசையாத ஒலிகோநியூக்ளியோடைடு மின்முனைகள் அல்லது டிஎன்ஏ உணர்திறனுக்கான தனிப்பயன் அடி மூலக்கூறுகள் போலல்லாமல், உணர்திறனை பராமரிக்க கிரையோஜெனிக் சேமிப்பு தேவைப்படும், 53,54 எங்கள் நுட்பம் மாற்றப்படாத PCB ஐப் பயன்படுத்துகிறது. நீண்ட கால ஆயுட்காலம் மற்றும் குறிப்பிட்ட சேமிப்பகத் தேவைகள் இல்லாத மின்முனைகள், எனவே LMICகளில் பயன்படுத்தப்படும் தானியங்கு மாதிரி செயலாக்கத்துடன் கூடிய அளவீட்டு தீர்வுகளின் வளர்ச்சிக்கு ஏற்றது. பயோசென்சர் இலக்கு ஆம்பிளிகான்களை விரைவாகக் கண்டறிய விலையில்லா டிஎன்ஏ-இன்டர்கேட்டிங் ரெடாக்ஸ் சாயங்களை (எம்பி) பயன்படுத்துகிறது. குறிப்பிடப்படாத பெருக்கம் சுற்றுச்சூழல் மாதிரிகளில் பொதுவானது, இந்த உணர்திறன் முறையின் தனித்தன்மையைக் குறைக்கிறது, ஏனெனில் MBகள் ஒற்றை மற்றும் இரட்டை இழை ஒலிகோநியூக்ளியோடைடுகளுடன் பிணைக்கப்படுகின்றன.எனவே, இந்த சோதனையின் பிரத்தியேகமானது ப்ரைமர்கள் மற்றும் PCR எதிர்வினை நிலைகளின் தேர்வுமுறையைப் பொறுத்தது. கூடுதலாக, CV மற்றும் சோதனை செய்யப்பட்ட மாதிரிகளிலிருந்து பெறப்பட்ட DPV உச்ச மின்னோட்டங்கள் ஒவ்வொரு சோதனைக்கும் எதிர்மறைக் கட்டுப்பாட்டிலிருந்து (NTC) பெறப்பட்ட பதில்களுடன் தொடர்புடையதாக விளக்கப்பட வேண்டும். இந்த வேலையில் வழங்கப்பட்ட மின்வேதியியல் சென்சார் வடிவமைப்புகள் மற்றும் முறைகள் ஆட்டோசாம்ப்லர்களுடன் ஒருங்கிணைக்கப்பட்டு முழுமையாக தானியங்கு மற்றும் குறைந்த உருவாக்கம் செய்யப்படலாம். மாதிரிகளைச் சேகரித்து பகுப்பாய்வு செய்து, ஆய்வகத்திற்கு வயர்லெஸ் முறையில் முடிவுகளை அனுப்பும் செலவு தீர்வு.
கேஷ்டாலர், ஜே. & வைமர், எல். நீர் மாதிரிகளிலிருந்து வைரஸ்களின் ஆரம்ப செறிவுக்கான முறைகள்: சமீபத்திய ஆய்வுகளின் ஆய்வு மற்றும் மெட்டா பகுப்பாய்வு. ஜே.Application.microorganism.115, pp. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL நீர்வழி வைரஸ்கள்: பாதுகாப்பான குடிநீருக்கான தடைகள். PLoS நோய்க்கிருமிகள்.11, E1004867 (2015).
ஷ்ரேஸ்தா, எஸ். மற்றும் பலர். குறைந்த மற்றும் நடுத்தர-வருமான நாடுகளில் COVID-19 இன் செலவு குறைந்த பெரிய அளவிலான கண்காணிப்புக்கான கழிவு நீர் தொற்றுநோயியல்: சவால்கள் மற்றும் வாய்ப்புகள். நீர் 13, 2897 (2021).
பலேசெக், இ. & பார்டோசிக், எம். நியூக்ளிக் அமில மின் வேதியியல். இரசாயனம்.112, 3427–3481 (2012).
டானி, ஏ., தாம்சன், ஏஜே & பட், ஜேஎன் மெத்திலீன் நீலம் ஒரு மின் வேதியியல் பாகுபாடு என ஒற்றை மற்றும் இரட்டை இழை ஒலிகோநியூக்ளியோடைடுகள் தங்க அடி மூலக்கூறுகளில் அசையாது. ஆய்வாளர் 126, 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparison of Cation and Anion Intercalators for the Electrochemical Transduction of DNA Hybridization by Long-range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
வோங், இஎல் & குடிங், டிஎன்ஏ மூலம் ஜேஜே சார்ஜ் பரிமாற்றம்: தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட மின்வேதியியல் டிஎன்ஏ biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
ஃபாங், TH மற்றும் பலர். ஒரே நேரத்தில் மின்வேதியியல் கண்டறிதலுடன் கூடிய நிகழ்நேர PCR மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் சாதனம்.உயிரியல் உணரி
Win, BY et al. டிஎன்ஏ உடன் மெத்திலீன் ப்ளூவின் தொடர்புகளின் அடிப்படையில் மின்வேதியியல் நிகழ்நேர PCR அமைப்பின் சிக்னலிங் பொறிமுறை ஆய்வு மற்றும் செயல்திறன் சரிபார்ப்பு. ஆய்வாளர் 136, 1573–1579 (2011).
ராமிரெஸ்-சவர்ரியா, ஆர்ஜி மற்றும் பலர். கழிவுநீர் மாதிரிகளில் சார்ஸ்-கோவ்-2 ஐக் கண்டறிவதற்கான லூப்-மத்தியஸ்த சமவெப்ப பெருக்க அடிப்படையிலான மின்வேதியியல் சென்சார். ஜே.சுற்றுச்சூழல்.ரசாயனம்.பிரிட்டன்.10, 107488 (2022).
குமார், எம். மற்றும் பலர். PCB மின்முனைகளுடன் கூடிய SARS-CoV-2 ஆம்பிளிகான்களின் மின்வேதியியல் உணர்திறன். சென்சார் செயல்படுத்தப்பட்டது.B வேதியியல்.343, 130169 (2021).
கிடமுரா, கே., சதாமாசு, கே., முரமாட்சு, எம். & யோஷிடா, எச். கழிவுநீர்
Alygizakis, N. et al. கழிவுநீரில் SARS-CoV-2 கண்டறிதலுக்கான பகுப்பாய்வு முறைகள்: நெறிமுறை மற்றும் எதிர்கால முன்னோக்குகள்.TraC போக்கு anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. ஆவியாக்கப்பட்ட உமிழ்நீர்த் துளிகளில் கண்ணாடிப் பரப்புகளில் படிந்துள்ள பாக்டீரியோபேஜ் ஃபை6 (SARS-CoV-2க்கான மாற்று) சர்வைவல்.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ சுதந்திரமான அமீபாவில் SARS-CoV-2 வாகை (Phi6) இன் சுற்றுச்சூழல் நிலைத்தன்மை. ஜே.நீர் ஆரோக்கியம் 20, 83 (2021).
மிண்டிச், எல். இரட்டை இழைகள் கொண்ட ஆர்என்ஏ பாக்டீரியோபேஜின் மூன்று மரபணு துண்டுகளின் துல்லியமான பேக்கேஜிங்\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, DH RNA பேஜ்\(\varphi\)6 பேக்கேஜிங் பகுதியின் இரண்டாம் நிலை அமைப்பு.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap - பாக்டீரியோபேஜ்களின் ஆய்வகப் பங்குகளைத் தயாரிப்பதற்கான வேகமான மற்றும் திறமையான நெறிமுறை.PeerJ 4, e2261 (2016).