Tack för att du besöker Nature.com. Webbläsarversionen du använder har begränsat stöd för CSS. För bästa upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller stänger av kompatibilitetsläget i Internet Explorer). Under tiden, för att säkerställa fortsatt support kommer vi att visa webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Vikten av att övervaka miljöprover har uppskattats mycket sedan början av covid-19-pandemin, och vissa övervakningsinsatser utförs med hjälp av guldstandarden, även om qPCR-baserade tekniker är dyra. Elektrokemiska DNA-biosensorer skulle kunna ge en potentiellt kostnadseffektiv lösning för att övervaka vattenprover i miljön i låg- och medelinkomstländer. I detta arbete demonstrerar vi den elektrokemiska detekteringen av amplikoner erhållna från Phi6-fager isolerade från spetsade sjövattenprover (ett populärt surrogat för SARS-CoV-2), med hjälp av ENIG för att komplettera PCB-elektroder utan ytmodifiering.sex. Det elektrokemiska sensorsvaret karakteriserades noggrant för två DNA-fragment av olika längd (\({117}\,\hbox {bp}\) och \({503}\,\hbox {bp}\)), och effekt av salter i PCR-masterblandningar på metylenblått (MB)-DNA-interaktioner. Våra resultat visar att längden på DNA-fragment signifikant bestämmer den elektrokemiska känsligheten och visar i detta arbete att förmågan att detektera långa amplikoner utan gelrening av PCR-produkter är viktigt för in situ mätning av vattenprover.En helautomatisk lösning för virusbelastning bådar gott.
Vattenburen virusöverföring har varit känd som en folkhälsofara sedan 1940-talet, med de första bevisen för vattenburen överföring av polio och hepatit E1. Världshälsoorganisationen (WHO) har klassificerat flera vattenburna viruspatogener av måttlig till hög hälsobetydelse2. Traditionellt virus detektionsmetoder förlitar sig på qPCR-baserade tekniker med guldstandard, som är mycket känsliga och specifika, men som kräver utbildad personal för att testa i laboratoriet med dyra instrument. Men i låg- och medelinkomstländer (LMIC) med begränsade resurser, provtagning kommer sannolikt att ha företräde framför övervakning av vattenprover i miljön. Därför behövs alternativa lågkostnadsmetoder för hållbar realtidsövervakning av vatten- och avloppsvattenprover i låg- och medelinkomstländer som tidiga varningar om nya sjukdomsutbrott, och därmed skydda dem från de allvarliga socioekonomiska effekterna av viruspandemin. Billiga elektrokemiska biosensorer för nukleinsyror skulle kunna ge en lovande potentiell lösning på detta otillfredsställda behov. Många av dessa DNA-biosensorer fungerar genom att komplementära DNA-strängar är immobiliserade på elektroden ytan och hybridisera när en matchande sekvens finns i provet. Denna kan sedan omvandlas till en signal genom olika elektrokemiska tekniker med hjälp av redoxmediatorer såsom kaliumjärn/ferrocyanid. Metylenblått (MB) är en sådan redoxaktiv molekyl, som har rapporterats interkalera till dubbelsträngat DNA (dsDNA) utöver dess mer ospecifika bindning till enkelsträngat DNA5,6. MBs interkalerande karaktär för att bilda MB-DNA-komplex gör dem till ett populärt val som redoxmediatorer i flera elektrokemiska DNA sensorkonfigurationer5,6,7,8,9. Även om interkaleringen av MB till DNA är ospecifik, och specificiteten hos denna elektrokemiska sensor beror till stor del på renheten hos primrarna som används för PCR eller isotermisk amplifiering, är den väl lämpad för att implementera verklig -tid elektrokemisk-baserad qPCR eller fluorescens isotermisk amplifiering som ett alternativ till DNA-koncentrationsmätning 9. I en sådan implementering, Won et al. Ytan på guldelektroder modifierades med 6-merkapto-1-hexanol (MCH) för realtid mätning av PCR-amplikoner med MB med hjälp av differentiell pulsvoltammetri (DPV)9.I andra fall har Ramirez et al. Detektion av SARS-CoV-2 i avloppsvatten genom RT-LAMP-reaktion med MB med screentryckta elektroder. Platinaelektroder har också varit används som in situ-elektroder i en mikrofluidisk PCR-plattform utformad för att elektrokemiskt detektera amplikoner under reaktioner 8. Alla dessa studier kräver ytmodifiering av elektroderna, vilket innebär ökade produktions- och driftskostnader på grund av speciella lagringskrav för stabiliteten hos dessa funktionaliserade elektroder.
Schematisk över arbetsflödet för elektrokemisk detektion av amplikoner erhållna från koncentrerade viruspartiklar i sjövattenprover.
Vi demonstrerade nyligen elektrokemisk avkänning av SARS-CoV-2-amplikoner med lågkostnadselektroder för tryckta kretskort (PCB) baserade på DPV och cyklisk voltammetri (CV) inducerad av adsorption av MB-DNA-komplex på ytan av omodifierade elektroder) förändringar i topp aktuell11.Vi rapporterar att längre DNA-fragment (N1-N2, \({943}\, \hbox) bildade med de CDC-rekommenderade N1-framåt- och N2-reversprimrarna jämfört med kortare fragment {bp}\)) visade bättre linjäritet i sensorsvaret ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) bildad med hjälp av N1 framåtriktade och N1 omvända primeruppsättningar. Dessa studier rapporteras med hjälp av DNA-spädningar framställda i nukleasfritt vatten. Plattformen användes också för att detektera SARS-CoV -2 amplikoner i simulerade avloppsvattenprover (erhållna genom att spika totala RNA-prover med SARS-CoV-2 RNA). Eftersom RNA är mottagligt för skjuvning under isolering och nedströms bearbetning,12,13 är det svårt att amplifiera längre fragment med detta heterogena prov. Därför är demonstrationen av elektrokemisk avkänning av SARS-CoV-2-amplikon i avloppsvatten begränsad till det kortare \(72\,\hbox {bp}\) N1-fragmentet.
I detta arbete undersökte vi genomförbarheten av ENIG PCB-baserad elektrokemisk avkänning av fag Phi6 koncentrerad och isolerad från sjövattenprover (Fig. 1). Phi6-fager är jämförbara i storlek (80-100 nm) med SARS-CoV-2 och har också ett lipidmembran och ett spikprotein. Av dessa skäl är bakteriofag Phi6 ett populärt surrogat för SARS-CoV-2 och andra höljeförsedda patogena RNA-virus14,15.RNA isolerat från fagpartiklar användes som mall för cDNA-syntes följt av PCR för att erhålla två DNA-fragment med 117 och 503 baspar i längd. Med tanke på utmaningen att amplifiera \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2-fragment i vårt tidigare arbete, riktar vi oss mot fragment av mellanlängd (\(117) \,\hbox {bp}\) och \(503 \,\hbox {bp}\)), baserat på tillgängliga primers. Det elektrokemiska sensorsvaret studerades systematiskt över ett brett koncentrationsområde (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) till \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\))) För båda fragmenten i förekomsten av MB, effekten av salt på sensorsvaret har karakteriserats och korsvaliderats genom spektrofotometriska mätningar. De huvudsakliga bidragen från detta arbete är följande:
DNA-fragmentets längd och närvaron av salt i provet påverkar starkt känsligheten.Våra resultat visar att elektrokemisk aktivitet beror på olika mekanismer för interaktionen mellan MB, DNA och sensorn i det voltammetriska svaret, beroende på DNA-koncentration och längd, med längre Fragment visar högre känslighet, även om salt har en negativ effekt på elektrostatiska interaktioner mellan MB och DNA.
DNA-koncentration bestämmer mekanismen för MB-DNA-interaktion i omodifierade elektroder. Vi visar att olika mekanismer för MB-DNA-interaktion beror på DNA-koncentration. Vid DNA-koncentrationer under en liten mängd \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), observerade vi att det elektrokemiska strömsvaret huvudsakligen bestämdes av adsorptionen av MB-DNA på elektroden, medan vid lägre koncentrationer Vid höga DNA-koncentrationer bestämdes det elektrokemiska strömsvaret av den steriska inhiberingen av redox aktivitet på grund av MB-insättning mellan DNA-baspar.
ENIG PCB-baserad elektrokemisk avkänning av virala nukleinsyror i sjövattenprover. Observationerna validerades genom elektrokemisk detektering av Phi6-tillsatta \(503\,\hbox {bp}\) DNA-fragment erhållna från vattenprover från Powai Lake, IIT Mumbai Campus Resultat fag.
Låg implementeringskostnad och potential för integration i helautomatiska övervakningssystem, oligonukleotider eller aptamerer på elektroder med längre hållbarhet.
Phage Phi6 är ett höljeförsett dsRNA-virus från Cytoviridae-familjen som infekterar Pseudomonas syringae. Genomet av Phi6-fagen finns i form av 3 fragment: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) och L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Eftersom Phi6-fagen infekterar en icke-patogen BSL-1 Pseudomonas-stam är den säker att använda och kan enkelt odlas i laboratoriet.Phage Phi6 och dess värd Pseudomonas syringae köptes från Felix d'Herelle Reference Center for Bacterial Viruses, Laval University, Kanada (referenscentrets katalognummer är HER-102 respektive HER-1102) .Phi6-fagen och dess värd återupplivades enligt anvisningarna från referenscentret. Phage Phi6 renades genom plattlys och eluering för att erhålla slutliga titrar med \(\omkring 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (plackbildande enheter/ milliliter).RNA isolerades från renade fagpartiklar med användning av GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) enligt tillverkarens instruktioner. Kortfattat, en renad fag Phi6-suspension\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) lyserades och lysatet laddades på en spinnkolonn för att tillåta RNA att binda till hartskolonnen. RNA:t elueras sedan i elueringslösningen \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) som tillhandahålls av kitet. Uppskatta koncentrationen av RNA genom absorbans vid \(260\,\hbox {nm}\).RNA lagrades i alikvoter i \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) tills vidare användning.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA Synthesis Kit (Bio) -Rad Laboratories) användes som mall för cDNA-syntes enligt tillverkarens instruktioner. Kortfattat består en cDNA-syntesreaktion av 3 steg: priming vid \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , omvänd transkription av \({20}\,{\hbox {min}}\) vid \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), och omvänd Inspelaren är i \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) för \({1}\,{\hbox {min. }}\). När det kördes på en 1 % agarosgel visade cDNA:t tre band motsvarande de förväntade tre RNA-fragmenten (data visas inte). Följande primrar användes för att amplifiera två DNA-fragment med en längd på 117 och 503 bp, använda cDNA som mall för PCR i en miniPCR® mini8 termisk cykler:
Primrarna för \(117\,\hbox {bp}\) och \(503\,\hbox {bp}\) motsvarar 1476-1575 nukleotider av M-segmentet och 458-943 nukleotider av L-segmentet, respektive syra Alla amplifierade PCR-produkter underkastades elektrofores på 1 % agarosgeler och amplifierat mål-DNA renades med användning av GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
En sjö vid IIT Mumbai campus (Powai Lake, Powai, Mumbai) användes för att lägga till fagpartiklar. Sjövattnet filtrerades genom ett \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) membran för att avlägsna suspenderade partiklar, och sedan lades Phi6-fagen till. Lägg till \({1}\,{\hbox {ml}}\) av \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) till \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) filtrerat sjövatten, i \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). En liten alikvot var reserverad för mätning av viral belastning med plackanalys. Vi testade två olika metoder för att koncentrera spetsade Phi6-viruspartiklar: (1) adsorptions-utfällningsmetoden för aluminiumhydroxid,19 som har validerats för koncentrationen av flera höljeförsedda RNA-virus från miljöprover, och (2) ) Den polyetylenglykol (PEG)-baserade viruskoncentrationsmetoden anpassades från Flood et al.20. Eftersom återvinningseffektiviteten för den PEG-baserade metoden visade sig vara bättre än den för aluminiumhydroxidmetoden, användes den PEG-baserade metoden för att koncentrera Phi6-partiklar från sjövattenprover.
PEG-metoden som användes var följande: PEG 8000 och \(\hbox {NaCl}\) tillsattes till Phi6-spetsade sjövattenprover för att erhålla 8 % PEG 8000 och \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\). Prover inkuberades på en shaker\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), sedan centrifugeras vid \(4700 \,\hbox {g}\) är \({45}\,{\hbox {min}}\). Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i \({1}\, {\hbox {ml}}\) i samma supernatant. Alla spik- och viruskoncentrationsexperiment utfördes i tre exemplar. Efter koncentrering reserverades en liten alikvot för mätning av återvinningseffektiviteten genom plackanalys. RNA isolerades som tidigare beskrivits och eluerades i kit-levererad elueringsbuffert\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Eftersom RNA-koncentrationen kommer att variera från prov till prov i tre exemplar, är \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) av RNA används för alla tre oavsett dess koncentration cDNA-syntes av prover.cDNA-syntes utfördes som tidigare beskrivits.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA användes som mall för \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR under 35 cykler för att förstärka \ (117\,\hbox {bp}\) och \(503\,\hbox { bp}\)-fragment. Dessa prover representeras som "1:1", dvs utan utspädning. En kontroll utan mall (NTC) sattes upp som en negativ kontroll, medan ett cDNA syntetiserat med RNA isolerat från renad fag sattes upp som mall för en positiv kontroll (PC). Kvantitativ PCR (qPCR) utfördes i ett Stratagene Mx3000P RT-PCR-instrument med användning av Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Reaktioner sattes upp i tre exemplar som tidigare. beskrivs. Cykeltröskeln (Ct) registrerades för alla prover. Dessutom var de utspädda proverna \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) med användning av cDNA utspätt 1:100 i filtrerat sjövatten som \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR för 35 cykler. Dessa prover representeras som “1:100″.
PCB-elektroderna tillverkas med hjälp av en kommersiellt tillgänglig lågkostnadsprocess Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) utan behov av ytterligare guldplätering. ENIG PCB-elektrodspecifikationer finns detaljerade i vårt tidigare arbete11.För ENIG PCB-elektroder, traditionella elektrodrengöringsmetoder som t.ex. piranhalösning eller svavelsyra cyklisk voltammetri rekommenderas inte eftersom de kan orsaka avskalning av det tunna guldskiktet (tjocklek \(\approx\) \(100\,\hbox {nm }\)) och exponera de underliggande kopparskikten som är utsatta till korrosion 21, 22, 23, 24, 25. Rengör därför elektroderna med en luddfri trasa fuktad med IPA. Provet som skulle testas inkuberades med \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB i \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) för enkel insättning. I vårt tidigare arbete , observerade vi att sensorns känslighet och linjäritet förbättrades genom att öka MB-koncentrationen 11 . Baserat på optimeringar som rapporterats i vårt tidigare arbete använde vi \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB koncentrationer för att bädda in DNA i denna studie. Elektrokemisk detektion av dubbelsträngat DNA (ds-DNA) kan uppnås med användning av anjoniska eller katjoniska interkalatorer. Även om anjoniska interkalatorer detekterar DNA med bättre selektivitet, kräver de inkubation över natten, vilket resulterar i längre detektionstider. å andra sidan kräver katjoniska interkalatorer som MB kortare inkubationstider, ungefär \({1}\,{\hbox {h}}\) för elektrokemisk detektering av ds-DNA6. Varje mätning innebär dispensering av provet som ska testas på elektrod\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), rengör sedan med en IPA-fuktad trasa, innan du fortsätter med ett nytt prov.en mätning. Varje prov testades på 5 olika elektroder om inte annat anges. DPV- och CV-mätningar utfördes med en PalmSens Sensit Smart potentiostat, och PSTrace-mjukvaran användes för potentiostatkonfiguration och datainsamling, inklusive toppströmsberäkningar. Följande inställningar används för DPV- och CV-mätningar:
DPV: Jämviktstid = \(8\,\hbox {s}\), Spänningssteg = \(3\,\hbox {mV}\), Pulsspänning = \(25\,\hbox {mV}\) , pulslängd = \(50\,\hbox {ms}\), skanningshastighet = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Jämviktstid = \(8\,\hbox {s}\), Spänningssteg = \(3\,\hbox {mV}\), Sweep Rate = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Toppströmmar erhållna från voltammogram av DNA komplexbundet med \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV- och CV-voltammogram erhölls på ENIG PCB-elektroder \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB komplexbunden med DNA (vid koncentrationer av 10–\({20}\,{\ hbox {ng) }/{\upmu \hbox {l}}}\) dvs 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) för \(117\,\hbox {bp}\ ) och 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) för \(503\,\hbox {bp}\)). Representativa voltammogram visas i figur S1 i tilläggsinformation. Figur 2 visar resultaten av DPV- och CV-mätningar (toppström) med gelrenade PCR-produkter. Jämfört med CV-mätningar visar DPV-mätningar högre känslighet (ström som funktion av DNA-koncentration) eftersom de kapacitiva bakgrundsströmmarna i CV-mätningar döljer faradaiska strömmar 26 .Datan för varje ruta i boxplotten innehåller mätningar från 5 elektroder. Alla mätningar använder samma uppsättning elektroder för att undvika mätfel på grund av elektrod-till-elektrod-variation. Vi observerade en ökande trend i DPV- och CV-uppmätta toppströmmar för lägre koncentrationer av DNA , längre (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ jämfört med \(117) ) fragment. Detta överensstämmer med den förväntade trenden för elektrodadsorption som rapporterats i vårt tidigare arbete. adsorption av MB-DNA-komplexet underlättar laddningsöverföringen på elektroden, vilket bidrar till ökningen av toppströmmen. Andra studier har visat effekten av oligonukleotidstorlek och sekvens på MB-DNA-interkalering27,28,29,30.Guanin -cytosin (GC)-innehållet i de två amplikonerna (\(117\,\hbox {bp}\) och \(503\,\hbox {bp}\))) var cirka 50 %, vilket indikerar att observationen. Skillnaden beror på till amplikonlängd. Men för högre DNA-koncentrationer (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), för \(503\,\hbox {bp} \) och \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) för \(117\,\hbox {bp}\)), observerar vi två förstärkningar. toppströmmar för subs reduceras i både DPV- och CV-mätningar. Detta beror på att MB mättar och interkalerar mellan baspar av DNA, vilket resulterar i sterisk hämning av redoxaktiviteten hos den reducerbara gruppen i MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Salter som finns i PCR-masterblandningar stör elektrostatiska interaktioner mellan MB och DNA, så genom att lägga till \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) med \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB gelrenad produkt för att studera effekten av salt på MB-DNA-interaktion. Som visas i figur 3 observerade vi att för högre DNA-koncentrationer (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) och \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) för \(117\,\hbox {bp} \)), i DPV och CV Tillsatsen av salt påverkade inte mätningarna nämnvärt (se figur S2 i Tilläggsinformation för representativa voltammogram). lägre DNA-koncentrationer, tillsats av salt minskar känsligheten avsevärt, vilket inte resulterar i någon signifikant förändring av strömmen med DNA-koncentrationen. Liknande negativa effekter av salt på MB-DNA-interaktioner och interkalering har tidigare rapporterats av andra forskare33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) katjoner binder till den negativa fosfatryggraden i DNA, vilket hindrar den elektrostatiska interaktionen mellan MB och DNA. Vid högre DNA-koncentrationer resulterar sterisk hämning av redoxaktiva MB i lägre toppströmmar, så elektrostatiska interaktioner påverkar inte sensorns respons nämnvärt. Det viktiga är att denna biosensor är bättre lämpad för att detektera högre DNA-koncentrationer (sällan \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) eller högre), för helt automatiserad bearbetning av vattenprover från miljön, där gelrening av PCR-produkter kanske inte är genomförbar.
Area under absorptionskurvan för våglängdsområdet 600–700 \(\hbox {nm}\) för olika koncentrationer av DNA komplexbundet med \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) med och utan salt (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) med och utan salt (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) DNA-koncentrationer som motsvarar \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB-prover Inget DNA.
För att ytterligare verifiera ovanstående resultat utförde vi optiska mätningar med en UV/Vis-spektrofotometer (Thermo Scientific Multiskan GO), proverna \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) användes för varje Mätning. Absorptionssignaturen minskar med ökande DNA-koncentration, vilket kan ses av trenden för arean under absorptionskurvan för våglängdsområdet \(600\,\hbox {nm}\) till \(700\,\hbox { nm}\), som visas i Fig. 4 (absorptionsspektrum visas i Fig. S3 i Tilläggsinformation). För prover med DNA-koncentrationer mindre än \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), fanns det ingen signifikant skillnad i upptag mellan prover som innehåller DNA och endast MB (för \(503\,\hbox {bp}\) och \(117\,\hbox {bp}\ ) längdfragment), vilket indikerar frånvaron av sterisk hämning av redoxaktivt MB. Vid högre DNA-koncentrationer observerade vi en gradvis minskning av absorbanssignalen och noterade en mindre minskning i absorbans i närvaro av salt. Dessa resultat tillskrevs molekylärt interaktioner och sterisk hämning med basstapling i DNA-hybrider. Våra resultat överensstämmer med rapporter i litteraturen om spektroskopiska studier av MB-DNA-interkalering som associerar hypokromaticitet med minskade energinivåer i \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) elektroniska övergångar på grund av interkalering Lager 36, 37, 38.
Agarosgelelektrofores av fag Phi6: PCR-produkter med längden \(117\,\hbox {bp}\) och \(503\,\hbox {bp}\) från sjövattenprover.M-DNA-markör;NTC-no-template-kontroll, primers som innehåller motsvarande amplikoner;PC positiv kontroll;1, 2, 3-outspädda (1:1) spetsade sjövattenprover i tre exemplar. Ett band är synligt vid \(\ca 50\,\hbox {bp}\) på grund av oanvända oligonukleotider i \(503\,\ hbox {bp}\) körfält.
Vi utvärderade användbarheten av sensorn med hjälp av Powai Lake-vattenprover spikade med Phi6-fag. RNA-koncentrationerna isolerade från fag-spetsade vattenprover varierade från 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), medan de isolerade från renade fagsuspensioner. RNA uppskattades vara \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) med en återvinningseffektivitet på cirka 1 %.RNA transkriberades omvänt till cDNA och användes som mall för PCR och qPCR. Produktstorleken bekräftades med agarosgelelektrofores (Figur 5) före testning med sensorn. Dessa prover är inte gelrenade och innehåller därför alla komponenter i PCR som såväl som amplikonerna av intresse. Ct-värdena som registrerades under qPCR (tabell 1) visades korrelera med koncentrationen av RNA isolerat från motsvarande spetsade vattenprover. Ct-värdet avslöjar antalet cykler som krävs för att den fluorescerande signalen ska överskrider tröskeln eller bakgrundssignalen. Högre Ct-värden indikerar lägre mallkoncentrationer och vice versa. Ct-värdena för NTC-proverna var så höga som förväntat. Skillnaden i \(\ca 3\) Ct-värden mellan den positiva kontrollen och testprovet indikerar vidare att varje testprov har cirka 1 % mall jämfört med den positiva kontrollen. Vi har tidigare diskuterat att längre amplikoner leder till bättre känslighet. Amplifiering av längre fragment isolerade från heterogena miljöprover är utmanande med tanke på nackdelarna med låg viral koncentration och RNA-nedbrytning. Med vårt virusanriknings- och PCR-amplifieringsprotokoll kunde vi dock framgångsrikt amplifiera \(503\,\hbox {bp}\)-fragmentet för elektrokemisk avkänning.
Figur 6 visar de elektrokemiska sensorresultaten för \(503\,\hbox {bp}\)-fragmentamplikonet, både med outspädd cDNA som mall (1:1) och 100-faldigt utspädd cDNA som mall (1:100 ) utförd PCR , jämfört med NTC och PC (se figur S4 i tilläggsinformation för representativa voltammogram). Varje ruta i boxplotten i figur 6 innehåller mätningar från tre prover vid 5 elektroder. Samma elektroder användes för att mäta alla prover för att undvika fel på grund av elektrod -till-elektrodvariation. Jämfört med CV-mätningar visar DPV-mätningar bättre upplösning för att skilja test- och PC-prover från NTC:er eftersom, som tidigare nämnts, Faradaic-strömmar är dolda på grund av bakgrundskapacitiva strömmar i de senare. För längre amplikoner observerade vi att den negativa kontrollen (NTC) resulterade i högre CV- och DPV-toppströmmar i förhållande till den positiva kontrollen, medan positiva och outspädda testprover visade liknande topphöjder för DPV-toppströmmar. De uppmätta medel- och medianvärdena för varje outspädd (1:1) ) testprov och PC kan tydligt lösas från sensorutgången för NTC-provet, medan upplösningen för det utspädda provet 1:100 är mindre uttalad. För en 100-faldig utspädning av cDNA observerade vi inga band under gelelektrofores (banor visas inte i figur 5), och motsvarande DPV- och CV-toppströmmar liknade de som förväntades för NTC. Resultaten för \(117\,\hbox {bp}\)-fragmentet visas i kompletterande information. Det negativa kontroll inducerade ett elektrokemiskt svar från PCB-sensorn på grund av adsorptionen av fritt MB på elektroden och interaktionen av MB med den enkelsträngade primeroligonukleotiden. Varje gång ett prov testas måste därför en negativ kontroll köras och toppströmmen för testprovet jämfört med toppströmmen som erhålls av den negativa kontrollen för att uppnå en differentiell (relativ) mätning39,40 för att klassificera testprovet som positivt eller negativt.
(a) DPV och (b) CV-toppström för elektrokemisk detektion av \(503\,\hbox {bp}\) fragment i sjövattenprover. Testprover mättes i tre exemplar och jämfördes med inga mallkontroller (NTC) och positiva kontroller (PC).
Våra fynd illustrerar olika mekanismer som påverkar prestandan hos elektrokemiska sensorer för amplikoner av olika längd för olika DNA, med koncentrationer verifierade genom optiska mätningar med en UV/Vis-spektrofotometer. Våra observationer understryker insikten att längre DNA-fragment upp till \(\approx\) \(500\,\hbox {bp}\) kan detekteras med högre känslighet och att närvaron av salt i provet inte gör det. Sensitivitet DNA-koncentration som påverkar högre känslighet (sällan \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) och ovan). Dessutom undersökte vi effekten av olika typer av prover, inklusive gelrenade amplikoner med och utan tillsatt salt, och tillsats av sjövattenprover i DPV- och CV-mätningar.Vi observerade att DPV gav bättre upplösning, eftersom den kapacitiva bakgrundsströmmen också påverkar CV-mätningen, vilket gör den mindre känslig.
Amplifiering av längre fragment beror på integriteten hos det virala genomiska RNA:t. Flera studier har visat att amplifiering av längre fragment inte alltid är effektiv på grund av nedbrytning av RNA i miljön och potentialen för splitsning under isolering11,41,42,43,44 .Vi observerade att den PEG-baserade viruskoncentrationsmetoden var effektivare för att koncentrera fag Phi-6 spetsad i sjövattenprover än den aluminiumhydroxidbaserade viruskoncentrationsmetoden. Förmågan att detektera långa DNA-fragment visade sig övervinna kravet på multiplex PCR för att förstärka flera mallar med kortare längd och minska möjligheten för korsspecificitet.
Biologiska prover är få, så det finns ett behov av att designa en biosensor som kräver minimala prover för testning. ENIG PCB-elektroderna som används i denna studie krävde bara \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) prover för testning för att täcka elektrodernas effektiva yta. Dessutom kan samma elektrod återanvändas efter rengöring innan nästa prov dispenseras. Förstärkta prover kräver inte tillsats av andra kemikalier än metylenblått, vilket är en billig och vanlig kemikalie. Eftersom varje elektrod kostar cirka 0,55 USD (eller 40 INR) att tillverka, kan denna biosensor vara ett kostnadseffektivt alternativ till befintliga detektionsteknologier. Tabell 2 visar en jämförelse av detta arbete med andra sensorer som rapporterats i litteraturen under lång tid. DNA-fragment i heterogena prover.
Med tanke på att MB-baserade elektrokemiska detektionsprotokoll förlitar sig på specificiteten hos PCR, är en stor begränsning av denna metod potentialen för ospecifik amplifiering i heterogena prover såsom avloppsvatten och sjövatten eller med användning av lågrenhetsprimrar. För att förbättra känsligheten för elektrokemiska detektionsmetoder för DNA-detektion av orenade PCR-produkter med omodifierade ENIG PCB-elektroder, är det nödvändigt att bättre förstå fel som introduceras av oanvända dNTP:er och primers, och för att optimera reaktionsförhållanden och analysprotokoll. Ytterligare fysikalisk-kemiska parametrar såsom pH, temperatur och biologiska syrebehovet (BOD) för vattenprovet kan också behöva mätas för att förbättra mätningens noggrannhet.
Sammanfattningsvis föreslår vi en billig elektrokemisk ENIG PCB-sensor för virusdetektion i miljöprover (sjövattenprover). Till skillnad från immobiliserade oligonukleotidelektroder eller anpassade substrat för DNA-avkänning som kräver kryogen lagring för att bibehålla känsligheten,53,54 använder vår teknik omodifierat PCB elektroder med längre hållbarhet och inga specifika lagringskrav och därför lämpliga för utveckling av mätlösningar med automatiserad provbehandling som används i LMICs. Biosensorn använder billiga DNA-interkalerande redoxfärgämnen (MB) för snabb detektering av målamplikoner. Den ospecifika amplifieringen vanliga i miljöprover minskar specificiteten för denna avkänningsmetod på grund av den ospecifika bindningen av MB till enkel- och dubbelsträngade oligonukleotider. Därför beror specificiteten för detta test på optimeringen av primrar och PCR-reaktionsförhållanden. och DPV-toppströmmar som erhållits från de testade proverna bör tolkas i förhållande till svaren som erhålls från den negativa kontrollen (NTC) för varje test. De elektrokemiska sensorkonstruktionerna och metoderna som presenteras i detta arbete kan integreras med autosamplare för att utveckla en helautomatisk och låg -kostnadslösning som kan samla in och analysera prover och trådlöst överföra resultat tillbaka till laboratoriet.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Metoder för initial koncentration av virus från vattenprover: en översikt och metaanalys av nyare studier.J.Application.microorganism.115, s. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Vattenburna virus: Barriärer för säkert dricksvatten. PLoS Patogener.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.Avloppsepidemiologi för kostnadseffektiv storskalig övervakning av covid-19 i låg- och medelinkomstländer: utmaningar och möjligheter.Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Metylenblått som en elektrokemisk diskriminator av enkel- och dubbelsträngade oligonukleotider immobiliserade på guldsubstrat.Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Jämförelse av katjon- och anjoninterkalatorer för elektrokemisk transduktion av DNA-hybridisering genom långvägselektronöverföring.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Laddningsöverföring genom DNA: en selektiv elektrokemisk DNA-biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al. Realtids-PCR-mikrofluidisk enhet med samtidig elektrokemisk detektion.biologisk sensor.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. Signalmekanismstudie och prestandaverifiering av ett elektrokemiskt realtids-PCR-system baserat på interaktionen av metylenblått med DNA.Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al. Slingförmedlad isotermisk amplifieringsbaserad elektrokemisk sensor för detektion av sars-cov-2 i avloppsvattenprover.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Elektrokemisk avkänning av SARS-CoV-2-amplikoner med PCB-elektroder.Sensorn är aktiverad.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Effektiv detektion av SARS-CoV-2 RNA i den fasta fraktionen av avloppsvatten.vetenskap.allmän miljö.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Analytical Methods for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Survival of the enveloped bacteriophage Phi6 (ett surrogat för SARS-CoV-2) i förångade salivdroppar avsatta på glasytor.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Miljöbeständighet hos ett SARS-CoV-2-surrogat (Phi6) i frilevande amöbor.J.Water Health 20, 83 (2021).
Mindich, L. Exakt förpackning av tre genomiska fragment av dubbelsträngad RNA-bakteriofag\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149-160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Sekundär struktur av DH RNA-fagen\(\varphi\)6 förpackningsregionen.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al. Phages on the Tap – Ett snabbt och effektivt protokoll för att förbereda laboratorielager av bakteriofager. PeerJ 4, e2261 (2016).
Posttid: 27 maj 2022