Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com. Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu pre CSS. Ak chcete dosiahnuť najlepší zážitok, odporúčame vám použiť aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v Internet Exploreri). pokračujúcu podporu, budeme stránku zobrazovať bez štýlov a JavaScriptu.
Dôležitosť monitorovania vzoriek životného prostredia sa od začiatku pandémie COVID-19 veľmi cení a určité snahy o monitorovanie sa vykonávajú pomocou zlatého štandardu, hoci techniky založené na qPCR sú drahé. Elektrochemické biosenzory DNA by mohli poskytnúť potenciálne nákladovo efektívne riešenie na monitorovanie environmentálnych vzoriek vody v krajinách s nízkymi a strednými príjmami. V tejto práci demonštrujeme elektrochemickú detekciu amplikónov získaných z fágu Phi6 izolovaného z obohatených vzoriek vody z jazier (populárna náhrada za SARS-CoV-2), pomocou ENIG na kompletizáciu DPS elektród bez povrchovej úpravy.pohlavie. Odozva elektrochemického senzora bola dôkladne charakterizovaná pre dva fragmenty DNA rôznych dĺžok (\({117}\,\hbox {bp}\) a \({503}\,\hbox {bp}\)) a vplyv solí v PCR master mixoch na interakcie metylénovej modrej (MB)-DNA. Naše výsledky ukazujú, že dĺžka fragmentov DNA významne určuje elektrochemickú citlivosť a v tejto práci demonštrujú, že schopnosť detegovať dlhé amplikóny bez gélovej purifikácie produktov PCR je dôležité pre meranie vzoriek vody in situ.Plne automatizované riešenie vírusovej záťaže je dobrým znamením.
Prenos vírusu prenášaného vodou je známy ako riziko pre verejné zdravie od 40. rokov 20. storočia s prvým dôkazom o prenose detskej obrny a hepatitídy E1 vodou. Svetová zdravotnícka organizácia (WHO) klasifikovala niekoľko vírusových patogénov prenášaných vodou so stredným až vysokým zdravotným významom2. Tradičný vírus metódy detekcie sa spoliehajú na techniky založené na qPCR zlatého štandardu, ktoré sú vysoko citlivé a špecifické, ale vyžadujú si kvalifikovaný personál na testovanie v laboratóriu pomocou drahých prístrojov. V krajinách s nízkymi a strednými príjmami (LMIC) s obmedzenými zdrojmi však testovanie vzoriek bude mať pravdepodobne prednosť pred monitorovaním vzoriek vody z prostredia. Preto sú potrebné alternatívne nízkonákladové metódy na udržateľné monitorovanie vzoriek vody a odpadových vôd v reálnom čase v krajinách s nízkymi a strednými príjmami ako včasné varovanie pred vypuknutím nových chorôb, čím ich chráni pred závažnými sociálno-ekonomickými dopadmi vírusovej pandémie. Nízkonákladové elektrochemické biosenzory pre nukleové kyseliny by mohli poskytnúť sľubné potenciálne riešenie tejto nenaplnenej potreby. Mnohé z týchto biosenzorov DNA fungujú vďaka skutočnosti, že komplementárne vlákna DNA sú imobilizované na elektróde povrch a hybridizujú, keď je vo vzorke prítomná zhodná sekvencia. Ten sa potom môže premeniť na signál rôznymi elektrochemickými technikami s použitím redoxných mediátorov, ako je železo/ferokyanid draselný. Metylénová modrá (MB) je jednou z takýchto redoxne aktívnych molekúl, ktoré bolo hlásené, že interkaluje do dvojvláknovej DNA (dsDNA) okrem svojej nešpecifickejšej väzby na jednovláknovú DNA5,6. Interkalačná povaha MB pri vytváraní komplexov MB-DNA z nich robí populárnu voľbu ako redoxných mediátorov v niekoľkých elektrochemických DNA konfigurácie senzora5,6,7,8,9. Hoci interkalácia MB do DNA je nešpecifická a špecifickosť tohto elektrochemického senzora závisí vo veľkej miere od čistoty primerov použitých na PCR alebo izotermickú amplifikáciu, je vhodný na implementáciu skutočných -časová elektrochemická qPCR alebo fluorescenčná izotermická amplifikácia ako alternatíva k meraniu koncentrácie DNA 9. V jednej takejto implementácii Won et al. Povrch zlatých elektród bol modifikovaný 6-merkapto-1-hexanolom (MCH) v reálnom čase meranie PCR amplikónov s MB pomocou diferenciálnej pulznej voltametrie (DPV)9. V iných prípadoch Ramirez et al. Detekcia SARS-CoV-2 v odpadovej vode reakciou RT-LAMP pomocou MB so sieťotlačovými elektródami. Platinové elektródy boli tiež používané ako elektródy in situ v mikrofluidnej platforme PCR určenej na elektrochemickú detekciu amplikónov počas reakcií 8 . Všetky tieto štúdie vyžadujú povrchovú úpravu elektród, čo znamená zvýšené výrobné a prevádzkové náklady v dôsledku špeciálnych požiadaviek na skladovanie na stabilitu týchto funkcionalizovaných elektród.
Schéma pracovného postupu pre elektrochemickú detekciu amplikónov získaných z koncentrovaných vírusových častíc vo vzorkách jazernej vody.
Nedávno sme demonštrovali elektrochemické snímanie amplikónov SARS-CoV-2 lacnými elektródami dosky plošných spojov (PCB) na báze DPV a cyklickej voltametrie (CV) indukovanej adsorpciou komplexov MB-DNA na povrchu nemodifikovaných elektród ) zmeny vrcholu prúd 11.Uvádzame, že dlhšie fragmenty DNA (N1-N2, \({943}\, \hbox) vytvorené pomocou primérov N1 forward a N2 odporúčaných CDC v porovnaní s kratšími fragmentmi {bp}\)) vykazovali lepšiu linearitu v odozve senzora (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) vytvorené pomocou N1 forwardových a N1 reverzných primérových sád. Tieto štúdie sa uvádzajú s použitím riedení DNA pripravených vo vode bez nukleázy. Platforma sa tiež použila na detekciu SARS-CoV -2 amplikóny v simulovaných vzorkách odpadových vôd (získaných pridaním vzoriek celkovej RNA RNA SARS-CoV-2). Keďže RNA je náchylná na strihanie počas izolácie a následného spracovania,12,13 je ťažké amplifikovať dlhšie fragmenty pomocou tejto heterogénnej vzorky. Preto je demonštrácia elektrochemického snímania amplikónu SARS-CoV-2 v odpadovej vode obmedzená na kratší fragment \(72\,\hbox {bp}\) N1.
V tejto práci sme skúmali uskutočniteľnosť elektrochemického snímania fágu Phi6 koncentrovaného a izolovaného zo vzoriek vody z jazera na báze ENIG PCB (obr. 1). Fágy Phi6 sú svojou veľkosťou porovnateľné (80-100 nm) so SARS-CoV-2 a majú tiež lipidovú membránu a spike proteín. Z týchto dôvodov je bakteriofág Phi6 populárnou náhradou SARS-CoV-2 a iných obalených patogénnych RNA vírusov14,15. RNA izolovaná z fágových častíc sa použila ako templát pre syntézu cDNA, po ktorej nasledoval PCR na získanie dvoch fragmentov DNA s dĺžkou 117 a 503 párov báz. Vzhľadom na výzvu amplifikácie \(943\,\hbox {bp}\) fragmentov N1-N2 v našej predchádzajúcej práci sa zameriavame na fragmenty strednej dĺžky (\(117 \,\hbox {bp}\) a \(503 \,\hbox {bp}\)), na základe dostupných primérov. Odozva elektrochemického senzora bola systematicky študovaná v širokom rozsahu koncentrácií (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) na \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Pre oba fragmenty v prítomnosť MB, vplyv soli na odozvu senzora bol charakterizovaný a krížovo overený spektrofotometrickými meraniami. Hlavné prínosy tejto práce sú nasledovné:
Dĺžka fragmentu DNA a prítomnosť soli vo vzorke výrazne ovplyvňujú citlivosť.Naše výsledky ukazujú, že elektrochemická aktivita závisí od rôznych mechanizmov interakcie MB, DNA a senzora vo voltametrickej odozve v závislosti od koncentrácie a dĺžky DNA, pričom dlhšie fragmenty vykazujú vyššiu citlivosť, hoci soľ má negatívny vplyv na elektrostatické interakcie medzi MB a DNA.
Koncentrácia DNA určuje mechanizmus interakcie MB-DNA v nemodifikovaných elektródach Ukazujeme, že rôzne mechanizmy interakcie MB-DNA závisia od koncentrácie DNA. Pri koncentráciách DNA pod malým množstvom \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), pozorovali sme, že elektrochemická prúdová odozva bola určená hlavne adsorpciou MB-DNA na elektróde, zatiaľ čo pri nižších koncentráciách Pri vysokých koncentráciách DNA bola elektrochemická prúdová odozva určená stérickou inhibíciou redoxného aktivita v dôsledku inzercie MB medzi páry báz DNA.
Elektrochemické snímanie vírusových nukleových kyselín vo vzorkách jazernej vody na báze ENIG PCB Pozorovania boli potvrdené elektrochemickou detekciou fragmentov DNA \(503\,\hbox {bp}\) pridaných Phi6 získaných zo vzoriek vody z jazera Powai, IIT Mumbai Campus Výsledný fág.
Nízke náklady na implementáciu a potenciál integrácie do plne automatizovaných monitorovacích systémov, oligonukleotidov alebo aptamérov na elektródach s dlhšou skladovateľnosťou.
Phage Phi6 je obalený dsRNA vírus z čeľade Cytoviridae, ktorý infikuje Pseudomonas syringae. Genóm fágu Phi6 existuje vo forme 3 fragmentov: S (\(2,95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4,07 \,\hbox {Kb}\)) a L (\ (6,37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Keďže fág Phi6 infikuje nepatogénny kmeň BSL-1 Pseudomonas, je bezpečné ho použiť a dá sa ľahko pestovať v laboratóriu. Phage Phi6 a jeho hostiteľ Pseudomonas syringae boli zakúpené od Felix d'Herelle Reference Center for Bacterial Viruses, Laval University, Canada (katalógové čísla referenčného centra sú HER-102 a HER-1102, v tomto poradí) .Phi6 fág a jeho hostiteľ boli oživení podľa pokynov referenčného centra. Fág Phi6 bol purifikovaný lýzou platne a elúciou, aby sa získali konečné titre s \(\asi 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (jednotky tvoriace plak/mililitre). RNA sa izolovala z purifikovaných fágových častíc pomocou súpravy GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) podľa pokynov výrobcu. Stručne povedané, suspenzia purifikovaného fága Phi6\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) sa lýzoval a lyzát sa naniesol na rotačnú kolónu, aby sa RNA mohla naviazať na kolónu živice. RNA sa potom eluuje v elučnom roztoku \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) poskytnutý súpravou. Odhadnite koncentráciu RNA pomocou absorbancie pri \(260\,\hbox {nm}\). RNA bola uložená v alikvótoch v \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) až do ďalšieho použitia.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Súprava iScript cDNA Synthesis Kit (Bio -Rad Laboratories) bol použitý ako šablóna pre syntézu cDNA podľa pokynov výrobcu. Stručne povedané, reakcia syntézy cDNA pozostáva z 3 krokov: aktivácia pri \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , spätný prepis \({20}\,{\hbox {min}}\) na \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), a spätne Záznamník je v \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) pre \({1}\,{\hbox {min }}\). Keď sa uskutočnila na 1% agarózovom géli, cDNA ukázala tri pásy zodpovedajúce očakávaným trom RNA fragmentom (údaje nie sú uvedené). Nasledujúce priméry sa použili na amplifikáciu dvoch DNA fragmentov s dĺžkou 117 a 503 bp, s použitím cDNA ako templátu pre PCR v termocykléri miniPCR® mini8:
Priméry pre \(117\,\hbox {bp}\) a \(503\,\hbox {bp}\) zodpovedajú 1476-1575 nukleotidom segmentu M a 458-943 nukleotidom segmentu L, respektíve kyseline Všetky amplifikované produkty PCR boli podrobené elektroforéze na 1 % agarózových géloch a amplifikovaná cieľová DNA bola purifikovaná pomocou súpravy GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
Jazero v kampuse IIT Mumbai (Powai Lake, Powai, Mumbai) sa použilo na pridanie fágových častíc. Voda v jazere bola filtrovaná cez membránu \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\), aby sa odstránila suspendované častice a potom sa pridal fág Phi6. Pridajte \({1}\,{\hbox {ml}}\) z \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) do \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) filtrovanej jazernej vody, v \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Malá alikvotná časť bola rezervované na meranie vírusovej záťaže pomocou plakového testu. Testovali sme dve rôzne metódy na koncentrovanie obohatených častíc vírusu Phi6: (1) metódu adsorpcie a zrážania hydroxidom hlinitým,19 ktorá bola overená na koncentráciu niekoľkých obalených RNA vírusov zo vzoriek prostredia a (2) ) Metóda koncentrácie vírusu na báze polyetylénglykolu (PEG) bola upravená podľa Flood et al.20. Keďže sa zistilo, že účinnosť regenerácie metódy založenej na PEG je lepšia ako pri metóde hydroxidu hlinitého, na koncentrovanie častíc Phi6 zo vzoriek vody z jazera sa použila metóda založená na PEG.
Použitá metóda PEG bola nasledovná: PEG 8000 a \(\hbox {NaCl}\) sa pridali do vzoriek vody z jazera obohateného Phi6, aby sa získalo 8 % PEG 8000 a \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Vzorky boli inkubované na trepačke\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), potom sa centrifuguje pri \(4700 \,\hbox {g}\) je \({45}\,{\hbox {min}}\). Zlikvidujte supernatant a resuspendujte pelet v \({1}\, {\hbox {ml}}\) v rovnakom supernatante. Všetky experimenty s prídavkom a koncentráciou vírusu sa uskutočnili v troch vyhotoveniach. Po zahustení sa malý alikvot vyhradil na meranie účinnosti regenerácie pomocou plakového testu. RNA sa izolovala, ako bolo opísané vyššie, a eluovala sa v elučnom pufri dodanom súpravou\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Keďže koncentrácia RNA sa bude líšiť od vzorky ku vzorke v trojitom vyhotovení, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) RNA sa používa pre všetky tri bez ohľadu na jej koncentráciu syntéza cDNA vzoriek. Syntéza cDNA sa uskutočnila tak, ako bolo opísané vyššie.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA bol použitý ako šablóna pre \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR pre 35 cyklov na amplifikáciu \ (117\,\hbox {bp}\) a \(503\,\hbox { bp}\) fragmenty. Tieto vzorky sú reprezentované ako „1:1“, tj bez riedenia. Beztemplátová kontrola (NTC) bola nastavená ako negatívna kontrola, zatiaľ čo cDNA syntetizovaná pomocou RNA izolovanej z purifikovaného fága bola nastavená ako templát pre pozitívnu kontrolu (PC). Kvantitatívna PCR (qPCR) sa uskutočnila v zariadení Stratagene Mx3000P RT-PCR s použitím Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Reakcie sa uskutočňovali trojmo ako predtým Prah cyklu (Ct) bol zaznamenaný pre všetky vzorky. Okrem toho boli zriedené vzorky \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) pomocou cDNA zriedenej v pomere 1:100 vo filtrovanej jazernej vode ako \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR pre 35 cyklov.Tieto vzorky sú označené ako „1:100″.
Elektródy PCB sa vyrábajú pomocou komerčne dostupného lacného procesu Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) bez potreby dodatočného pokovovania. Špecifikácie elektród ENIG PCB sú podrobne uvedené v našej predchádzajúcej práci11. Pre elektródy ENIG PCB sa používajú tradičné metódy čistenia elektród, ako napr. roztok pirane alebo cyklická voltametria s kyselinou sírovou sa neodporúčajú, pretože môžu spôsobiť odlupovanie tenkej zlatej vrstvy (hrúbka \(\cca\) \(100\,\hbox {nm}\)) a odkryť pod ňou náchylné vrstvy medi na koróziu 21, 22, 23, 24, 25. Elektródy preto očistite handričkou, ktorá nepúšťa vlákna, navlhčenou v IPA. Vzorka, ktorá sa má testovať, bola inkubovaná s \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB v \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) pre jednoduché vloženie.V našej predchádzajúcej práci , pozorovali sme, že citlivosť a linearita senzora sa zlepšila zvýšením koncentrácie MB 11 .Na základe optimalizácií uvedených v našej skoršej práci sme použili \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB koncentrácie na začlenenie DNA do tejto štúdie.Elektrochemickú detekciu dvojvláknovej DNA (ds-DNA) možno dosiahnuť použitím aniónových alebo katiónových interkalátorov.Aj keď aniónové interkalátory detegujú DNA s lepšou selektivitou, vyžadujú inkubáciu cez noc, čo vedie k dlhším časom detekcie. na druhej strane katiónové interkalátory ako MB vyžadujú kratšie inkubačné časy, približne \({1}\,{\hbox {h}}\) na elektrochemickú detekciu ds-DNA6. Každé meranie zahŕňa dávkovanie vzorky, ktorá sa má testovať na elektródu\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), potom vyčistite handrou navlhčenou IPA a potom pokračujte s ďalšou vzorkou.jedno meranie. Každá vzorka bola testovaná na 5 rôznych elektródach, pokiaľ nie je uvedené inak. Merania DPV a CV sa uskutočňovali pomocou potenciostatu PalmSens Sensit Smart a na konfiguráciu potenciostatu a získavanie údajov vrátane výpočtov špičkového prúdu sa použil softvér PSTrace. pre merania DPV a CV:
DPV: Rovnovážny čas = \(8\,\hbox {s}\), Krok napätia = \(3\,\hbox {mV}\), Pulzné napätie = \(25\,\hbox {mV}\) , trvanie impulzu = \(50\,\hbox {ms}\), rýchlosť skenovania = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Rovnovážny čas = \(8\,\hbox {s}\), Napäťový krok = \(3\,\hbox {mV}\), Sweep Rate = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
Maximálne prúdy získané z voltamogramov DNA v komplexe s \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV a CV voltamogramy boli získané na ENIG PCB elektródach \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB v komplexe s DNA (v koncentráciách 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) tj 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) pre \(117\,\hbox {bp}\ ) a 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) pre \(503\,\hbox {bp}\)). Reprezentatívne voltamogramy sú zobrazené na obrázku S1 v doplnkových informáciách.Obrázok 2 zobrazuje výsledky meraní DPV a CV (špičkový prúd) pomocou produktov PCR purifikovaných na géli. V porovnaní s meraniami CV vykazujú merania DPV vyššiu citlivosť (prúd ako funkcia koncentrácie DNA), pretože kapacitné prúdy pozadia v meraniach CV skrývajú Faradaove prúdy 26 . pre každé políčko v boxplote obsahuje merania z 5 elektród. Všetky merania používajú rovnakú sadu elektród, aby sa predišlo chybám merania v dôsledku variácií elektród od elektród. Pozorovali sme rastúci trend v DPV a CV nameraných špičkových prúdoch pre nižšie koncentrácie DNA , dlhší (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ v porovnaní s \(117) ) fragmentom. Je to v súlade s očakávaným trendom adsorpcie elektród, ktorý sme zaznamenali v našej predchádzajúcej práci. adsorpcia komplexu MB-DNA uľahčuje prenos náboja na elektródu, čo prispieva k zvýšeniu špičkového prúdu. Ďalšie štúdie preukázali vplyv veľkosti a sekvencie oligonukleotidov na interkaláciu MB-DNA27,28,29,30.guanín - obsah cytozínu (GC) v dvoch amplikónoch (\(117\,\hbox {bp}\) a \(503\,\hbox {bp}\)) bol približne 50 %, čo naznačuje, že pozorovanie Rozdiel je spôsobený na dĺžku amplikónu. Avšak pre vyššie koncentrácie DNA (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), pre \(503\,\hbox {bp} \) a \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) pre \(117\,\hbox {bp}\)), pozorujeme dve zosilnenia vrcholové prúdy subs sú znížené pri meraniach DPV aj CV. Je to preto, že MB saturuje a interkaluje medzi pármi báz DNA, čo vedie k stérickej inhibícii redoxnej aktivity redukovateľnej skupiny v MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Soli prítomné v hlavných zmesiach PCR interferujú s elektrostatickými interakciami medzi MB a DNA, takže pridaním \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) s \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) produkt purifikovaný MB gélom na štúdium účinku soli na interakciu MB-DNA. Ako je znázornené na obrázku 3, pozorovali sme, že pri vyšších koncentráciách DNA (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) a \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) pre \(117\,\hbox {bp} \)), v DPV a CV Pridanie soli významne neovplyvnilo merania (pozri obrázok S2 v doplnkových informáciách pre reprezentatívne voltamogramy). nižšie koncentrácie DNA, pridanie soli výrazne znižuje citlivosť, výsledkom čoho nie je žiadna významná zmena prúdu s koncentráciou DNA. Podobné negatívne účinky soli na interakcie a interkaláciu MB-DNA už predtým hlásili iní výskumníci33,34.\(\hbox { Katióny Mg}^{2+}\) sa viažu na negatívny fosfátový hlavný reťazec DNA, čím bránia elektrostatickej interakcii medzi MB a DNA. Pri vyšších koncentráciách DNA vedie stérická inhibícia redox-aktívnych MB k nižším špičkovým prúdom, takže elektrostatické interakcie významne neovplyvňujú odozvu senzora. Kľúčovým bodom je, že tento biosenzor je vhodnejší na detekciu vyšších koncentrácií DNA (zriedka \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) alebo vyššie), pre plne automatizované spracovanie vzoriek vody z prostredia, kde gélové čistenie produktov PCR nemusí byť možné.
Oblasť pod absorpčnou krivkou pre rozsah vlnových dĺžok 600–700 \(\hbox {nm}\) pre rôzne koncentrácie DNA v komplexe s \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) so soľou a bez soli (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) so soľou a bez soli (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) koncentrácie DNA zodpovedajúce \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB vzoriek Žiadna DNA.
Na ďalšie overenie vyššie uvedených výsledkov sme vykonali optické merania pomocou UV/Vis spektrofotometra (Thermo Scientific Multiskan GO), vzorky \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) boli použité pre každý Meranie. Absorpčný podpis klesá so zvyšujúcou sa koncentráciou DNA, ako je možné vidieť z trendu plochy pod absorpčnou krivkou pre rozsah vlnových dĺžok \(600\,\hbox {nm}\) až \(700\,\hbox { nm}\), ako je znázornené na obr. 4 (absorpčné spektrum zobrazené na obr. S3 v doplnkových informáciách). Pre vzorky s koncentráciami DNA nižšími ako \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), nebol medzi vzorkami obsahujúcimi DNA a vzorkami obsahujúcimi iba MB žiadny významný rozdiel v absorpcii (pre \(503\,\hbox {bp}\) a \(117\,\hbox {bp}\ ) fragmenty dĺžky), čo naznačuje absenciu stérickej inhibície redox-aktívneho MB. Pri vyšších koncentráciách DNA sme pozorovali postupný pokles absorbančného signálu a zaznamenali sme menší pokles absorbancie v prítomnosti soli. Tieto výsledky boli pripísané molekulárnej interakcie a stérická inhibícia so skladaním báz v hybridoch DNA. Naše výsledky sú v súlade so správami v literatúre o spektroskopických štúdiách interkalácie MB-DNA, ktoré spájajú hypochromatickosť so zníženými hladinami energie v \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) elektronické prechody v dôsledku interkalácie Vrstvy 36, 37, 38.
Elektroforéza fága Phi6 na agarózovom géli: PCR produkty dĺžky \(117\,\hbox {bp}\) a \(503\,\hbox {bp}\) zo vzoriek vody z jazera. Marker M-DNA;kontrola NTC bez šablóny, priméry obsahujúce zodpovedajúce amplikóny;PC pozitívna kontrola;1, 2, 3-neriedené (1:1) obohatené vzorky jazernej vody v troch vyhotoveniach. Pás je viditeľný pri \(\asi 50\,\hbox {bp}\) v dôsledku nepoužitých oligonukleotidov v \(503\,\ hbox {bp}\) pruh.
Vyhodnotili sme užitočnosť senzora pomocou vzoriek vody z jazera Powai obohatených fágom Phi6. Koncentrácie RNA izolované zo vzoriek vody obohatenej fágmi sa pohybovali v rozmedzí 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), zatiaľ čo tie izolované z purifikovaných fágových suspenzií Odhaduje sa, že RNA je \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) s účinnosťou regenerácie približne 1 %.RNA bola reverzne transkribovaná do cDNA a použitá ako templát pre PCR a qPCR. Veľkosť produktu bola potvrdená elektroforézou na agarózovom géli (obrázok 5) pred testovaním pomocou senzora. Tieto vzorky nie sú gélovo purifikované, a preto obsahujú všetky zložky PCR ako ako aj záujmové amplikóny. Ukázalo sa, že hodnoty Ct zaznamenané počas qPCR (tabuľka 1) korelujú s koncentráciou RNA izolovanej zo zodpovedajúcich vzoriek obohatenej vody. Hodnota Ct odhaľuje počet cyklov potrebných na to, aby fluorescenčný signál prekročiť prahovú hodnotu alebo signál pozadia.Vyššie hodnoty Ct indikujú nižšie koncentrácie templátu a naopak. Hodnoty Ct vzoriek NTC boli také vysoké, ako sa očakávalo. Rozdiel v \(\približne 3\) hodnotách Ct medzi pozitívna kontrola a testovaná vzorka ďalej naznačujú, že každá testovaná vzorka má približne 1 % templátu v porovnaní s pozitívnou kontrolou. Už sme predtým diskutovali o tom, že dlhšie amplikóny vedú k lepšej citlivosti. Amplifikácia dlhších fragmentov izolovaných z heterogénnych environmentálnych vzoriek je náročná vzhľadom na nevýhody s nízkou vírusovou koncentráciou a degradáciou RNA. Avšak pomocou nášho obohacovania vírusu a protokolu PCR amplifikácie sme boli schopní úspešne amplifikovať fragment \(503\,\hbox {bp}\) na elektrochemické snímanie.
Obrázok 6 ukazuje výsledky elektrochemického senzora amplikónu fragmentu \(503\,\hbox {bp}\), oba s použitím nezriedenej cDNA ako templátu (1:1) a 100-násobne zriedenej cDNA ako templátu (1:100) uskutočnenej PCR , v porovnaní s NTC a PC (pozri obrázok S4 v doplnkových informáciách pre reprezentatívne voltamogramy). Každý rámček v rámčeku na obrázku 6 obsahuje merania z troch vzoriek na 5 elektródach. Na meranie všetkých vzoriek sa použili rovnaké elektródy, aby sa predišlo chybám spôsobeným elektródou - variácia elektródy. V porovnaní s meraniami CV ukazujú merania DPV lepšie rozlíšenie na rozlíšenie testovacích a PC vzoriek od NTC, pretože, ako už bolo spomenuté, Faradaické prúdy sú skryté kvôli kapacitným prúdom v pozadí v NTC. Pri dlhších amplikónoch sme zistili, že negatívna kontrola (NTC) mala za následok vyššie CV a DPV vrcholové prúdy v porovnaní s pozitívnou kontrolou, zatiaľ čo pozitívne a nezriedené testované vzorky vykazovali podobné výšky vrcholov DPV vrcholových prúdov. Namerané stredné a stredné hodnoty pre každý neriedený (1:1) ) testovacia vzorka a PC môžu byť jasne rozlíšené z výstupu senzora pre vzorku NTC, zatiaľ čo rozlíšenie pre vzorku zriedenú v pomere 1:100 je menej výrazné. Pri 100-násobnom zriedení cDNA sme počas gélovej elektroforézy nepozorovali žiadne pásy (pruhy nie sú zobrazené na obrázku 5) a zodpovedajúce špičkové prúdy DPV a CV boli podobné tým, ktoré sa očakávali pre NTC. Výsledky pre fragment \(117\,\hbox {bp}\) sú uvedené v doplnkových informáciách. Negatívne kontrola vyvolala elektrochemickú odozvu zo senzora PCB v dôsledku adsorpcie voľného MB na elektróde a interakcie MB s jednovláknovým primerovým oligonukleotidom. Preto sa pri každom testovaní vzorky musí vykonať negatívna kontrola a špičkový prúd testovanej vzorky v porovnaní so špičkovým prúdom získaným negatívnou kontrolou na dosiahnutie diferenciálneho (relatívneho) merania39,40 na klasifikáciu testovanej vzorky ako pozitívnej alebo negatívnej.
(a) DPV a (b) CV špičkový prúd na elektrochemickú detekciu \(503\,\hbox {bp}\) fragmentov vo vzorkách jazernej vody. Testované vzorky sa merali trojmo a porovnávali sa s kontrolami bez templátu (NTC) a pozitívne kontroly (PC).
Naše zistenia ilustrujú rôzne mechanizmy ovplyvňujúce výkon elektrochemických senzorov pre amplikóny rôznych dĺžok pre rôzne DNA, pričom koncentrácie sú overené optickými meraniami pomocou UV/Vis spektrofotometra. Naše pozorovania podčiarkujú poznatok, že dlhšie fragmenty DNA až \(\cca\) \(500\,\hbox {bp}\) môže byť detekovaný s vyššou citlivosťou a že prítomnosť soli vo vzorke nespôsobuje citlivosť Koncentrácia DNA, ktorá ovplyvňuje vyššiu citlivosť (zriedka \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) a vyššie). Okrem toho sme skúmali vplyv rôznych typov vzoriek, vrátane gélovo purifikovaných amplikónov s pridanou soľou a bez nej, a pridania vzoriek jazernej vody pri meraniach DPV a CV.Zistili sme, že DPV poskytuje lepšie rozlíšenie, pretože kapacitný prúd pozadia ovplyvňuje aj meranie CV, čím je menej citlivý.
Amplifikácia dlhších fragmentov závisí od integrity vírusovej genómovej RNA. Niekoľko štúdií ukázalo, že amplifikácia dlhších fragmentov nie je vždy účinná v dôsledku degradácie RNA v prostredí a potenciálu zostrihu počas izolácie11,41,42,43,44 Zistili sme, že metóda koncentrácie vírusu založená na PEG bola účinnejšia pri koncentrácii fágu Phi-6 obohateného vo vzorkách vody z jazera ako metóda koncentrácie vírusu na báze hydroxidu hlinitého. Schopnosť detekovať dlhé fragmenty DNA dokázala prekonať požiadavku na multiplexnú PCR na amplifikáciu viacerých šablón s kratšou dĺžkou a zníženie možnosti krížovej špecifickosti.
Biologické vzorky sú vzácne, preto je potrebné navrhnúť biosenzor, ktorý vyžaduje minimálne vzorky na testovanie. ENIG PCB elektródy použité v tejto štúdii vyžadovali iba \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) vzorky na testovanie, aby sa pokryla účinná plocha elektród. Okrem toho možno tú istú elektródu znova použiť po vyčistení pred nanesením ďalšej vzorky. Amplifikované vzorky nevyžadujú pridanie žiadnych chemikálií okrem metylénovej modrej, ktorá je lacná a bežne používaná chemikália. Keďže výroba každej elektródy stojí približne 0,55 USD (alebo 40 INR), tento biosenzor môže byť nákladovo efektívnou alternatívou k existujúcim detekčným technológiám. Tabuľka 2 ukazuje porovnanie tejto práce s inými senzormi, o ktorých sa v literatúre už dlho píše. Fragmenty DNA v heterogénnych vzorkách.
Vzhľadom na to, že protokoly elektrochemickej detekcie založené na MB sa spoliehajú na špecifickosť PCR, hlavným obmedzením tejto metódy je možnosť nešpecifickej amplifikácie v heterogénnych vzorkách, ako je odpadová voda a jazerná voda, alebo použitie primérov s nízkou čistotou. Na zlepšenie citlivosti elektrochemické detekčné metódy na detekciu DNA nepurifikovaných produktov PCR pomocou nemodifikovaných ENIG PCB elektród, je potrebné lepšie pochopiť chyby spôsobené nepoužitými dNTP a primermi a optimalizovať reakčné podmienky a protokoly testov. Ďalšie fyzikálno-chemické parametre ako pH, teplota a biologické Na zlepšenie presnosti merania môže byť potrebné merať aj spotrebu kyslíka (BSK) vzorky vody.
Na záver navrhujeme lacný elektrochemický ENIG PCB senzor na detekciu vírusov vo vzorkách životného prostredia (jazernej vody). elektródy s dlhšou skladovateľnosťou a bez špecifických požiadaviek na skladovanie, a preto sú vhodné pre vývoj meracích riešení s automatizovaným spracovaním vzoriek nasadených v LMIC. Biosenzor využíva lacné DNA-interkalačné redoxné farbivá (MB) na rýchlu detekciu cieľových amplikónov. Nešpecifická amplifikácia bežné vo vzorkách prostredia znižuje špecifickosť tejto metódy snímania v dôsledku nešpecifickej väzby MB na jedno- a dvojvláknové oligonukleotidy. Špecifickosť tohto testu preto závisí od optimalizácie primerov a podmienok reakcie PCR. Okrem toho CV a DPV vrcholové prúdy získané z testovaných vzoriek by sa mali interpretovať vo vzťahu k odozvám získaným z negatívnej kontroly (NTC) pre každý test. Návrhy elektrochemických senzorov a metódy prezentované v tejto práci môžu byť integrované s automatickými vzorkovačmi, aby sa vyvinul plne automatizovaný a nízky -nákladové riešenie, ktoré dokáže zbierať a analyzovať vzorky a bezdrôtovo prenášať výsledky späť do laboratória.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Metódy počiatočnej koncentrácie vírusov zo vzoriek vody: prehľad a metaanalýza nedávnych štúdií. J.Aplikácia.mikroorganizmus.115, str. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Vodou prenášané vírusy: Bariéry bezpečnej pitnej vody.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Epidemiológia odpadových vôd pre nákladovo efektívny rozsiahly dohľad nad COVID-19 v krajinách s nízkymi a strednými príjmami: výzvy a príležitosti. Voda 13, 2897 (2021).
Paleček, E. & Bartošík, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427 – 3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Metylénová modrá ako elektrochemický diskriminátor jedno- a dvojvláknových oligonukleotidov imobilizovaných na zlatých substrátoch. Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Porovnanie katiónových a aniónových interkalátorov na elektrochemickú transdukciu hybridizácie DNA pomocou prenosu elektrónov na veľké vzdialenosti. Elektrochemistry.commicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Prenos náboja cez DNA: selektívny elektrochemický biosenzor DNA.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH a kol. Mikrofluidné zariadenie PCR v reálnom čase so súbežnou elektrochemickou detekciou.biologický senzor.Bioelektronika.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY a kol. Štúdium signalizačného mechanizmu a overenie výkonu elektrochemického systému PCR v reálnom čase založeného na interakcii metylénovej modrej s DNA. Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG a kol. Elektrochemický senzor na báze izotermickej amplifikácie sprostredkovaný slučkou na detekciu sars-cov-2 vo vzorkách odpadových vôd.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Elektrochemické snímanie amplikónov SARS-CoV-2 pomocou elektród PCB. Senzor je aktivovaný.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Efektívna detekcia SARS-CoV-2 RNA v pevnej frakcii odpadových vôd.science.všeobecné prostredie.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. a kol. Analytické metódy na detekciu SARS-CoV-2 v odpadových vodách: Protokol a budúce perspektívy. Trendy traC anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Prežitie obaleného bakteriofága Phi6 (náhrada za SARS-CoV-2) v odparených kvapôčkach slín uložených na sklenených povrchoch.science.Rep.10, 1 – 10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Environmentálna perzistencia náhrady SARS-CoV-2 (Phi6) vo voľne žijúcej amébe.J.Zdravie vody 20, 83 (2021).
Mindich, L. Presné balenie troch genómových fragmentov dvojvláknovej RNA bakteriofága\(\varphi\)6.mikroorganizmu.Moore.biology.Rev.63, 149-160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Sekundárna štruktúra oblasti balenia DH RNA fágu\(\varphi\)6. RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. a kol. Phages on the Tap – Rýchly a efektívny protokol na prípravu laboratórnych zásob bakteriofágov. PeerJ 4, e2261 (2016).
Čas odoslania: 27. mája 2022