Благодарим вас за посещение Nature.com. Используемая вами версия браузера имеет ограниченную поддержку CSS. Для оптимальной работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). Тем временем, чтобы обеспечить продолжение поддержки, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Важность мониторинга образцов из окружающей среды была высоко оценена с начала пандемии COVID-19, и некоторые усилия по мониторингу выполняются с использованием золотого стандарта, хотя методы, основанные на количественной ПЦР, дороги. Электрохимические биосенсоры ДНК могут обеспечить потенциально экономически эффективное решение. решение для мониторинга проб воды в окружающей среде в странах с низким и средним уровнем дохода. В этой работе мы демонстрируем электрохимическое обнаружение ампликонов, полученных из фага Phi6, выделенного из образцов озерной воды с добавлением (популярный суррогат SARS-CoV-2), с использованием ENIG комплектовать электроды для печатных плат без модификации поверхности.пол. Отклик электрохимического сенсора был тщательно охарактеризован для двух фрагментов ДНК разной длины (\({117}\,\hbox {bp}\) и \({503}\,\hbox {bp}\)), а Влияние солей в мастер-миксах для ПЦР на взаимодействие метиленового синего (МС) с ДНК. Наши результаты показывают, что длина фрагментов ДНК в значительной степени определяет электрохимическую чувствительность, и демонстрируют в этой работе, что способность обнаруживать длинные ампликоны без гель-очистки продуктов ПЦР является важно для измерения проб воды на месте.Полностью автоматизированное решение для вирусной нагрузки служит хорошим предзнаменованием.
Передача вируса через воду известна как опасность для общественного здравоохранения с 1940-х годов, когда появились первые доказательства передачи полиомиелита и гепатита E1 через воду. методы обнаружения основаны на методах золотого стандарта на основе количественной ПЦР, которые обладают высокой чувствительностью и специфичностью, но требуют квалифицированного персонала для тестирования в лаборатории с использованием дорогостоящих инструментов. Однако в странах с низким и средним уровнем дохода (СНСД) с ограниченными ресурсами человеческий тестирование проб, вероятно, будет иметь приоритет перед мониторингом проб воды из окружающей среды. Поэтому необходимы альтернативные недорогие методы для устойчивого мониторинга проб воды и сточных вод в режиме реального времени в странах с низким и средним уровнем дохода в качестве раннего предупреждения о возникающих вспышках заболеваний, тем самым защищая их от серьезных социально-экономических последствий пандемии вируса. Недорогие электрохимические биосенсоры для нуклеиновых кислот могут обеспечить многообещающее потенциальное решение этой неудовлетворенной потребности. Многие из этих биосенсоров ДНК работают благодаря тому факту, что комплементарные нити ДНК иммобилизованы на электроде. поверхность и гибридизоваться, когда в образце присутствует совпадающая последовательность. Затем ее можно преобразовать в сигнал с помощью различных электрохимических методов с использованием окислительно-восстановительных посредников, таких как железо/ферроцианид калия. Метиленовый синий (МС) является одной из таких окислительно-восстановительно-активных молекул, которая имеет сообщалось, что они встраиваются в двухцепочечную ДНК (дцДНК) в дополнение к более неспецифическому связыванию с одноцепочечной ДНК5,6. Интеркалирующая природа MB с образованием комплексов MB-ДНК делает их популярным выбором в качестве медиаторов окислительно-восстановительного потенциала в нескольких электрохимических ДНК. сенсорных конфигураций5,6,7,8,9. Хотя интеркаляция MB в ДНК неспецифична, а специфичность этого электрохимического сенсора во многом зависит от чистоты праймеров, используемых для ПЦР или изотермической амплификации, он хорошо подходит для реализации реальных основанная на электрохимическом анализе времени количественная ПЦР или флуоресцентная изотермическая амплификация в качестве альтернативы измерению концентрации ДНК. измерение ампликонов ПЦР с МБ с использованием дифференциальной импульсной вольтамперометрии (ДПВ)9. В других случаях Рамирез и др. Обнаружение SARS-CoV-2 в сточных водах с помощью реакции RT-LAMP с использованием МБ с трафаретными электродами. Платиновые электроды также были используются в качестве электродов in situ в микрожидкостной ПЦР-платформе, предназначенной для электрохимического обнаружения ампликонов во время реакций 8 . Все эти исследования требуют модификации поверхности электродов, что подразумевает увеличение производственных и эксплуатационных расходов из-за особых требований к хранению для стабильности этих функционализированных электродов.
Схема рабочего процесса электрохимического обнаружения ампликонов, полученных из концентрированных вирусных частиц в пробах озерной воды.
Недавно мы продемонстрировали электрохимическое зондирование ампликонов SARS-CoV-2 с недорогими электродами на печатной плате (PCB) на основе DPV и циклической вольтамперометрии (CV), индуцированной адсорбцией комплексов MB-DNA на поверхности немодифицированных электродов) изменения пика текущий11.Мы сообщаем, что более длинные фрагменты ДНК (N1-N2, \({943}\, \hbox), образованные с использованием рекомендованных CDC прямых и обратных праймеров N1, по сравнению с более короткими фрагментами {bp}\)) показали лучшую линейность отклика сенсора. ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) образован с использованием наборов прямых и обратных праймеров N1. Эти исследования представлены с использованием разведений ДНК, приготовленных в воде, не содержащей нуклеаз. Платформа также использовалась для обнаружения SARS-CoV. -2 в смоделированных образцах сточных вод (полученных путем добавления РНК SARS-CoV-2 в образцы тотальной РНК). Поскольку РНК подвержена сдвигу во время выделения и последующей обработки,12,13 сложно амплифицировать более длинные фрагменты с помощью этого гетерогенного образца. Поэтому демонстрация электрохимического определения ампликона SARS-CoV-2 в сточных водах ограничена более коротким \(72\,\hbox {bp}\) фрагментом N1.
В этой работе мы исследовали возможность электрохимического зондирования на основе ENIG PCB фага Phi6, концентрированного и выделенного из проб озерной воды (рис. 1). Фаги Phi6 по размеру (80-100 нм) сопоставимы с SARS-CoV-2 и также имеют липидную мембрану и шиповидный белок. По этим причинам бактериофаг Phi6 является популярным заменителем SARS-CoV-2 и других оболочечных патогенных РНК-вирусов14,15. РНК, выделенная из фаговых частиц, использовалась в качестве матрицы для синтеза кДНК с последующим ПЦР для получения двух фрагментов ДНК длиной 117 и 503 пар оснований. Учитывая проблему амплификации \(943\,\hbox {bp}\) фрагментов N1-N2 в нашей предыдущей работе, мы нацелены на фрагменты промежуточной длины (\(117 \,\hbox {bp}\) и \(503 \,\hbox {bp}\)), на основе доступных праймеров. Реакция электрохимического сенсора систематически изучалась в широком диапазоне концентраций (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) в \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\}} для обоих фрагментов в В присутствии MB влияние соли на отклик сенсора было охарактеризовано и подтверждено с помощью спектрофотометрических измерений. Основные результаты этой работы заключаются в следующем:
Длина фрагмента ДНК и наличие соли в образце сильно влияют на чувствительность.Наши результаты показывают, что электрохимическая активность зависит от разных механизмов взаимодействия МВ, ДНК и сенсора в вольтамперометрическом отклике, в зависимости от концентрации и длины ДНК, причем более длинные фрагменты проявляют более высокую чувствительность, хотя соль оказывает негативное влияние на электростатические взаимодействия между МБ и ДНК.
Концентрация ДНК определяет механизм взаимодействия МБ-ДНК в немодифицированных электродах. Мы показываем, что различные механизмы взаимодействия МБ-ДНК зависят от концентрации ДНК. При концентрациях ДНК ниже небольшого количества \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), мы наблюдали, что электрохимический токовый отклик в основном определялся адсорбцией MB-ДНК на электроде, в то время как при более низких концентрациях при высоких концентрациях ДНК электрохимический токовый отклик определялся стерическим ингибированием окислительно-восстановительного потенциала. активность за счет вставки MB между парами оснований ДНК.
Электрохимическое обнаружение вирусных нуклеиновых кислот в пробах озерной воды на основе ПХБ ENIG Наблюдения были подтверждены электрохимическим обнаружением фрагментов ДНК \(503\,\hbox {bp}\) с добавлением Phi6, полученных из проб воды из озера Повай, кампус ИИТ в Мумбаи. Фаг результата.
Низкая стоимость внедрения и возможность интеграции в полностью автоматизированные системы мониторинга, олигонуклеотиды или аптамеры на электродах с более длительным сроком хранения.
Фаг Phi6 представляет собой оболочечный dsRNA-вирус семейства Cytoviridae, инфицирующий Pseudomonas syringae. Геном фага Phi6 существует в виде 3-х фрагментов: S (\(2,95\,\hbox{Kb}\)), M (\(4,07 \,\hbox {Kb}\)) и L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Поскольку фаг Phi6 инфицирует непатогенный штамм BSL-1 Pseudomonas, его безопасно использовать. и могут быть легко выращены в лаборатории. Фаг Phi6 и его хозяин Pseudomonas syringae были приобретены в Справочном центре бактериальных вирусов Феликса д'Эреля, Университет Лаваля, Канада (каталожные номера справочного центра: HER-102 и HER-1102 соответственно). Фаг .Phi6 и его хозяин были восстановлены в соответствии с указаниями справочного центра. Фаг Phi6 был очищен путем лизиса и элюции на планшетах для получения конечных титров с \(\около 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { мл}}\) (бляшкообразующие единицы/мл). РНК выделяли из очищенных фаговых частиц с использованием универсального набора для очистки общей РНК GenElute™ (Sigma-Aldrich) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, очищенную фаговую суспензию Phi6\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) лизировали, и лизат загружали на спин-колонку, чтобы позволить РНК связываться с колонкой со смолой. Затем РНК элюировали элюирующим раствором \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), предоставленных набором. Оцените концентрацию РНК по поглощению при \(260\,\hbox {нм}\). РНК хранили аликвотами в \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) до дальнейшего использования.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Набор для синтеза кДНК iScript (Bio -Rad Laboratories) использовали в качестве шаблона для синтеза кДНК в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, реакция синтеза кДНК состоит из 3 стадий: праймирование в \({25}\, {^{\circ}\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min}}\) , обратная транскрипция \({20}\,{\hbox {min}}\) в точке \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) и наоборот. Самописец находится в режиме \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) в течение \({1}\,{\hbox {мин. }}\). При анализе на 1% агарозном геле кДНК показала три полосы, соответствующие ожидаемым трем фрагментам РНК (данные не показаны). Следующие праймеры использовали для амплификации двух фрагментов ДНК длиной 117 и 503 п.н. с использованием кДНК в качестве матрицы для ПЦР в термоциклере miniPCR® mini8:
Праймеры для \(117\,\hbox {bp}\) и \(503\,\hbox {bp}\) соответствуют 1476-1575 нуклеотидам М-сегмента и 458-943 нуклеотидам L-сегмента соответственно. Все амплифицированные продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 1% агарозных гелях, а амплифицированную ДНК-мишень очищали с использованием набора для извлечения из геля GeneJET (Thermo Fisher Scientific).
Озеро в кампусе ИИТ в Мумбаи (озеро Повай, Поваи, Мумбаи) использовалось для добавления фаговых частиц. Вода в озере фильтровалась через мембрану \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) для удаления взвешенные частицы, а затем добавляли фаг Phi6. Добавляли \({1}\,{\hbox {мл}}\) из \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {мл}} \) до \( {100}\ ,{\hbox {мл}}\) отфильтрованной озерной воды, в \({4}\,{^{\circ}\hbox {C}}\). зарезервирован для измерения вирусной нагрузки с помощью анализа бляшек. Мы протестировали два разных метода концентрирования частиц вируса Phi6 с шипами: (1) метод адсорбции-осаждения гидроксидом алюминия,19 который был подтвержден для концентрации нескольких оболочечных РНК-вирусов из образцов окружающей среды, и (2) ) Метод концентрации вируса на основе полиэтиленгликоля (ПЭГ) был адаптирован из Flood et al.20. Поскольку было обнаружено, что эффективность извлечения методом на основе ПЭГ выше, чем у метода с гидроксидом алюминия, метод на основе ПЭГ использовался для концентрирования частиц Phi6 из проб озерной воды.
Используемый метод ПЭГ был следующим: ПЭГ 8000 и \(\hbox {NaCl}\) добавляли к образцам озерной воды с добавлением Phi6 для получения 8% ПЭГ 8000 и \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\). Образцы инкубировали на шейкере \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), затем центрифугируют при \(4700 \,\hbox {g}\) до \({45}\,{\hbox {мин}}\). Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в \({1}\, {\hbox {мл}}\) в одном и том же супернатанте. Все эксперименты по добавлению и концентрации вируса были выполнены в трех повторах. После концентрирования небольшая аликвота была зарезервирована для измерения эффективности извлечения с помощью анализа бляшек. РНК была выделена, как описано ранее, и элюирована. в буфере для элюирования, входящем в комплект поставки \({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Поскольку концентрация РНК будет варьироваться от образца к образцу в трех повторностях, hbox {l}}\) РНК используется для всех трех независимо от ее концентрации. Синтез кДНК образцов. Синтез кДНК проводили, как описано ранее. \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) использовали в качестве шаблона для \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) ПЦР в течение 35 циклов для амплификации \(117\,\hbox {bp}\) и \(503\,\hbox { bp}\) фрагментов. Эти образцы представлены как «1:1», т.е. без разведения. В качестве отрицательного контроля использовали контроль без матрицы (NTC), а в качестве отрицательного контроля использовали кДНК, синтезированную с использованием РНК, выделенной из очищенного фага. в качестве матрицы для положительного контроля (ПК). Количественную ПЦР (кПЦР) проводили на приборе Stratagene Mx3000P RT-PCR с использованием Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Реакции проводили в трех повторах, как и ранее. описан. Порог цикла (Ct) был записан для всех образцов. \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) ПЦР в течение 35 циклов. Эти образцы представлены как «1:100».
Электроды для печатных плат изготавливаются с использованием имеющегося в продаже недорогого процесса электролитического никелирования в иммерсионное золото (ENIG) без необходимости дополнительного золочения. Спецификации электродов для печатных плат ENIG подробно описаны в нашей предыдущей работе11. раствора пираньи или циклическая вольтамперометрия с серной кислотой не рекомендуются, так как они могут вызвать отслоение тонкого слоя золота (толщина \(\приблизительно) \(100\,\hbox {нм }\)) и обнажить нижележащие слои меди, которые склонны к коррозии 21, 22, 23, 24, 25. Поэтому очистите электроды безворсовой тканью, смоченной изопропиловым спиртом. Образец для испытаний инкубировали с \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) МБ в \({4}\,{^{\circ}\hbox {C}}\)\({1}\,{\hbox {h}}\) для легкой вставки. В нашей предыдущей работе , мы заметили, что чувствительность и линейность датчика улучшились за счет увеличения концентрации MB 11 . На основе оптимизаций, о которых сообщалось в нашей предыдущей работе, мы использовали \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB концентрации для встраивания ДНК в этом исследовании. Электрохимическое обнаружение двухцепочечной ДНК (дц-ДНК) может быть достигнуто с использованием анионных или катионных интеркаляторов. Хотя анионные интеркаляторы обнаруживают ДНК с большей селективностью, они требуют инкубации в течение ночи, что приводит к увеличению времени обнаружения. с другой стороны, катионные интеркаляторы, такие как MB, требуют более короткого времени инкубации, примерно \({1}\,{\hbox {h}}\) для электрохимического обнаружения дц-ДНК6. Каждое измерение включает дозирование образца для тестирования на электрод \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), затем очистите тряпкой, смоченной IPA, прежде чем приступить к другому образцу.одно измерение. Каждый образец был испытан на 5 различных электродах, если не указано иное. Измерения DPV и CV проводились с использованием потенциостата PalmSens Sensit Smart, а программное обеспечение PSTrace использовалось для настройки потенциостата и сбора данных, включая расчет пикового тока. Используются следующие настройки. для измерений DPV и CV:
DPV: время равновесия = \(8\,\hbox {с}\), шаг напряжения = \(3\,\hbox {мВ}\), импульсное напряжение = \(25\,\hbox {мВ}\), длительность импульса = \(50\,\hbox {мс}\), частота сканирования = \({20}\,\hbox {мВ/с}\)
CV: время равновесия = \(8\,\hbox {с}\), шаг напряжения = \(3\,\hbox {мВ}\), скорость развертки = \({300}\,\hbox {мВ/с }\)
Пиковые токи, полученные из вольтамперограмм ДНК в комплексе с \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Вольтамперограммы ДПВ и ЦВА получали на электродах из ПХБ ЭНИГ \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB в комплексе с ДНК (при концентрациях 10–\({20}\,{\hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) т.е. 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) для \(117\,\hbox {bp}\ ) и 0,03 –\({0,06}\,{\upmu \hbox {M}}\) для \(503\,\hbox {bp}\)). Репрезентативные вольтамперограммы показаны на рисунке S1 в дополнительной информации. На рисунке 2 показаны результаты. измерений DPV и CV (пиковый ток) с использованием очищенных гелем продуктов ПЦР. По сравнению с измерениями CV, измерения DPV демонстрируют более высокую чувствительность (ток как функция концентрации ДНК), поскольку фоновые емкостные токи при измерениях CV скрывают фарадеевские токи 26 . для каждого прямоугольника на диаграмме показаны измерения с 5 электродов. Во всех измерениях используется один и тот же набор электродов, чтобы избежать ошибок измерения из-за различий между электродами. Мы наблюдали тенденцию к увеличению пиковых токов DPV и CV для более низких концентраций ДНК. , более длинный (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ по сравнению с \(117)) фрагмент. Это согласуется с ожидаемой тенденцией адсорбции электрода, о которой сообщалось в нашей предыдущей работе. адсорбция комплекса MB-ДНК облегчает перенос заряда на электрод, что способствует увеличению пикового тока. Другие исследования показали влияние размера и последовательности олигонуклеотидов на интеркаляцию MB-ДНК27,28,29,30. Гуанин -содержание цитозина (GC) в двух ампликонах (\(117\,\hbox {bp}\) и \(503\,\hbox {bp}\)) составляло примерно 50%, что указывает на то, что наблюдение. к длине ампликона. Однако для более высоких концентраций ДНК (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), для \(503\,\hbox {bp} \) и \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) для \(117\,\hbox {bp}\)), мы наблюдаем два усиления пиковые токи сабвуферов снижаются как при измерениях DPV, так и CV. Это связано с тем, что MB насыщает и интеркалирует между парами оснований ДНК, что приводит к стерическому ингибированию окислительно-восстановительной активности восстанавливаемой группы в MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl}_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) ДПВ, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Соли, присутствующие в мастер-миксах ПЦР, мешают электростатическим взаимодействиям между MB и ДНК, поэтому добавление \(2\,\hbox {мМ}\) \(\hbox {MgCl}_2\) с \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) Гель-очищенный продукт MB для изучения влияния соли на взаимодействие MB-ДНК. Как показано на рисунке 3, мы наблюдали, что при более высоких концентрациях ДНК (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp}\) и \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) для \(117\,\hbox {bp} \)), в DPV и CV Добавление соли не оказало существенного влияния на измерения (см. рисунок S2 в дополнительной информации для репрезентативных вольтамперограмм). Однако при При более низких концентрациях ДНК добавление соли значительно снижает чувствительность, в результате чего не происходит существенного изменения тока в зависимости от концентрации ДНК. Подобные негативные эффекты соли на взаимодействие и интеркаляцию MB-ДНК ранее сообщались другими исследователями33,34.\(\hbox { Катионы Mg}^{2+}\) связываются с отрицательным фосфатным остовом ДНК, тем самым препятствуя электростатическому взаимодействию между MB и ДНК. При более высоких концентрациях ДНК стерическое ингибирование редокс-активных MB приводит к более низким пиковым токам, поэтому электростатические взаимодействия не оказывают существенного влияния на реакцию сенсора. Ключевым моментом является то, что этот биосенсор лучше подходит для обнаружения более высоких концентраций ДНК (редко \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) или выше), для полностью автоматизированной обработки проб воды из окружающей среды, где гель-очистка продуктов ПЦР может оказаться невозможной.
Площадь под кривой поглощения для диапазона длин волн 600–700 мкм для различных концентраций ДНК в комплексе с \({50}\,{\upmu \hbox {М}}\) МБ: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) с солью и без нее (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (б) \( 117\, \hbox {bp}\) с солью и без соли (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Концентрации ДНК, соответствующие \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) образцам МБ Нет ДНК.
Для дальнейшей проверки вышеприведенных результатов мы провели оптические измерения с использованием спектрофотометра UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), образцы \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) были использованы для каждого Измерение. Сигнатура поглощения уменьшается с увеличением концентрации ДНК, как видно из тренда площади под кривой поглощения для диапазона длин волн от \(600\,\hbox {нм}\) до \(700\,\hbox { нм}\) , как показано на рис. 4 (спектр поглощения показан на рис. S3 в дополнительной информации). Для образцов с концентрациями ДНК менее \({1}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), не было существенной разницы в поглощении между образцами, содержащими ДНК, и образцами, содержащими только MB (для \(503\,\hbox {bp}\) и \(117\,\hbox {bp}\ ) фрагменты длины), что указывает на отсутствие стерического ингибирования редокс-активного MB. При более высоких концентрациях ДНК мы наблюдали постепенное снижение сигнала поглощения и отмечали меньшее снижение поглощения в присутствии соли. Эти результаты были приписаны молекулярным взаимодействия и стерическое ингибирование с укладкой оснований в гибридах ДНК. Наши результаты согласуются с сообщениями в литературе о спектроскопических исследованиях интеркаляции MB-ДНК, которые связывают гипохроматичность со сниженными уровнями энергии в \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) электронные переходы за счет интеркаляционных слоев 36, 37, 38.
Электрофорез фага Phi6 в агарозном геле: продукты ПЦР длиной \(117\,\hbox {bp}\) и \(503\,\hbox {bp}\) из образцов озерной воды. Маркер М-ДНК;контроль NTC-без матрицы, праймеры, содержащие соответствующие ампликоны;ПК положительный контроль;1, 2, 3-неразбавленные (1:1) пробы озерной воды с добавлением в трех экземплярах. Полоса видна на \(\около 50\,\hbox {bp}\) из-за неиспользованных олигонуклеотидов в \(503\,\ hbox {bp}\) пер.
Мы оценили полезность датчика, используя образцы воды озера Повай, в которые был добавлен фаг Phi6. Концентрации РНК, выделенные из образцов воды, в которые были добавлены фаги, варьировались от 15,8 до мл}}\), в то время как те, которые были выделены из очищенных фаговых суспензий. По оценкам, РНК составляла \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) с эффективностью извлечения примерно 1 %. РНК была обратно транскрибирована в кДНК и использована в качестве матрицы для ПЦР и количественной ПЦР. Размер продукта был подтвержден электрофорезом в агарозном геле (рис. 5) перед тестированием с помощью датчика. Эти образцы не подвергались гель-очистке и, следовательно, содержат все компоненты ПЦР, как а также интересующие ампликоны. Было показано, что значения Ct, зарегистрированные во время количественной ПЦР (таблица 1), коррелируют с концентрацией РНК, выделенной из соответствующих образцов воды с добавлением. Значение Ct показывает количество циклов, необходимых для флуоресцентного сигнала. превышает пороговый или фоновый сигнал. Более высокие значения Ct указывают на более низкие концентрации шаблона и наоборот. Значения Ct образцов NTC были такими же высокими, как и ожидалось. Разница в \(\приблизительно 3\) значениях Ct между положительный контроль и тестовый образец также указывают на то, что каждый тестовый образец содержит примерно 1% матрицы по сравнению с положительным контролем. Ранее мы обсуждали, что более длинные ампликоны приводят к лучшей чувствительности. Амплификация более длинных фрагментов, выделенных из гетерогенных образцов окружающей среды, является сложной задачей, учитывая недостатки низкой концентрации вируса и деградации РНК. Однако с нашим протоколом обогащения вируса и амплификации ПЦР мы смогли успешно амплифицировать фрагмент \(503\,\hbox {bp}\) для электрохимического зондирования.
На рис. 6 показаны результаты электрохимического сенсора фрагмента ампликона \(503\,\hbox {bp}\), как с использованием неразбавленной кДНК в качестве матрицы (1:1), так и с 100-кратно разведенной кДНК в качестве матрицы (1:100), проведенной ПЦР. , по сравнению с NTC и PC (см. рисунок S4 в дополнительной информации для репрезентативных вольтамперограмм). Каждый прямоугольник на диаграмме на рисунке 6 содержит измерения трех образцов на 5 электродах. Для измерения всех образцов использовались одни и те же электроды, чтобы избежать ошибок из-за электрода. вариации от электрода к электроду. По сравнению с измерениями CV, измерения DPV показывают лучшее разрешение, чтобы отличить тестовые образцы и образцы PC от NTC, потому что, как упоминалось ранее, фарадеевские токи скрыты из-за фоновых емкостных токов в последних. Для более длинных ампликонов мы наблюдали, что отрицательный контроль (NTC) привел к более высоким пиковым токам CV и DPV по сравнению с положительным контролем, тогда как положительные и неразведенные тестовые образцы показали одинаковую высоту пиков пиковых токов DPV. Измеренные средние и медианные значения для каждого неразбавленного (1: 1) ) тестовый образец и ПК можно четко разделить на выходе датчика для образца NTC, в то время как разрешение для образца, разведенного 1:100, менее выражено. Для 100-кратного разведения кДНК мы не наблюдали каких-либо полос во время гель-электрофореза. (дорожки, не показанные на рисунке 5), и соответствующие пиковые токи DPV и CV были аналогичны ожидаемым для NTC. Результаты для фрагмента \(117\,\hbox {bp}\) показаны в дополнительной информации. контроль индуцировал электрохимический ответ датчика ПХБ из-за адсорбции свободного МБ на электроде и взаимодействия МБ с одноцепочечным олигонуклеотидом-праймером. Поэтому каждый раз при тестировании образца необходимо запускать отрицательный контроль и пиковый ток испытуемого образца по сравнению с пиковым током, полученным в отрицательном контроле, для получения дифференциального (относительного) измерения39,40 для классификации испытуемого образца как положительного или отрицательного.
(a) DPV и (b) пиковый ток CV для электрохимического обнаружения фрагментов \(503\,\hbox {bp}\) в пробах озерной воды. Тестовые образцы измеряли в трех повторностях и сравнивали с контролем без матрицы (NTC) и положительные контроли (ПК).
Наши результаты иллюстрируют различные механизмы, влияющие на работу электрохимических сенсоров для ампликонов разной длины для разных ДНК, при этом концентрации подтверждаются оптическими измерениями с использованием спектрофотометра в УФ/видимой области. \(500\,\hbox {bp}\) могут быть обнаружены с более высокой чувствительностью и что присутствие соли в образце не влияет на концентрацию ДНК, влияющую на более высокую чувствительность (редко \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) и выше). Кроме того, мы исследовали влияние различных типов образцов, включая очищенные гелем ампликоны с добавлением соли и без него, а также добавление образцов озерной воды при измерениях DPV и CV.Мы заметили, что DPV обеспечивает лучшее разрешение, поскольку фоновый емкостный ток также влияет на измерение CV, делая его менее чувствительным.
Амплификация более длинных фрагментов зависит от целостности вирусной геномной РНК. Несколько исследований показали, что амплификация более длинных фрагментов не всегда эффективна из-за деградации РНК в окружающей среде и возможности сплайсинга во время выделения11,41,42,43,44. .Мы заметили, что метод концентрации вируса на основе ПЭГ был более эффективным для концентрации фага Phi-6, добавленного в пробы озерной воды, чем метод концентрации вируса на основе гидроксида алюминия. Доказано, что способность обнаруживать длинные фрагменты ДНК преодолевает потребность в мультиплексной ПЦР. для усиления нескольких шаблонов меньшей длины и уменьшения возможности перекрестной специфичности.
Биологических образцов мало, поэтому необходимо разработать биосенсор, который требует минимального количества образцов для тестирования. Электроды ENIG PCB, использованные в этом исследовании, требовали только \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) образцы для тестирования, чтобы покрыть эффективную площадь электродов. Кроме того, один и тот же электрод можно использовать повторно после очистки перед дозированием следующего образца. Амплифицированные образцы не требуют добавления каких-либо химических веществ, кроме метиленового синего, который является недорогим и обычно используемые химические вещества. Поскольку производство каждого электрода стоит около 0,55 долларов США (или 40 индийских рупий), этот биосенсор может быть рентабельной альтернативой существующим технологиям обнаружения. Фрагменты ДНК в гетерогенных образцах.
Учитывая, что протоколы электрохимического обнаружения на основе МБ основаны на специфичности ПЦР, основным ограничением этого метода является возможность неспецифической амплификации в гетерогенных образцах, таких как сточные воды и озерная вода, или с использованием праймеров низкой чистоты. Для повышения чувствительности электрохимических методов обнаружения ДНК неочищенных продуктов ПЦР с использованием немодифицированных электродов ENIG PCB необходимо лучше понять ошибки, вызванные неиспользованными dNTP и праймерами, а также оптимизировать условия реакции и протоколы анализа. Дополнительные физико-химические параметры, такие как pH, температура и биологические потребность в кислороде (БПК) пробы воды также может потребоваться измерить, чтобы повысить точность измерения.
В заключение мы предлагаем недорогой электрохимический датчик ENIG PCB для обнаружения вирусов в образцах окружающей среды (вода озера). электроды с более длительным сроком хранения и без особых требований к хранению, поэтому они подходят для разработки измерительных решений с автоматизированной обработкой образцов, развернутых в странах с низким и средним доходом. общий в образцах окружающей среды снижает специфичность этого метода зондирования из-за неспецифического связывания MB с одно- и двухцепочечными олигонуклеотидами. Таким образом, специфичность этого теста зависит от оптимизации праймеров и условий реакции ПЦР. Кроме того, CV и пиковые токи DPV, полученные от тестируемых образцов, следует интерпретировать относительно ответов, полученных от отрицательного контроля (NTC) для каждого теста. Конструкции электрохимических датчиков и методы, представленные в этой работе, могут быть интегрированы с автоматическими пробоотборниками для разработки полностью автоматизированного и низкого недорогое решение, которое может собирать и анализировать образцы и передавать результаты по беспроводной сети обратно в лабораторию.
Кэшдоллар, Дж. и Ваймер, Л. Методы начальной концентрации вирусов в пробах воды: обзор и метаанализ недавних исследований.Приложение.микроорганизм.115, стр. 1-11 (2013).
Галл, А. М., Мариньяс, Б. Дж., Лу, Ю. и Шислер, Дж. Л. Вирусы, передающиеся через воду: барьеры на пути к безопасной питьевой воде. Патогены PLoS. 11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Эпидемиология сточных вод для экономически эффективного крупномасштабного эпиднадзора за COVID-19 в странах с низким и средним уровнем дохода: проблемы и возможности. Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Электрохимия нуклеиновых кислот.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Тани, А., Томсон, А.Дж. и Батт, Дж.Н. Метиленовый синий как электрохимический дискриминатор одно- и двухцепочечных олигонуклеотидов, иммобилизованных на золотых субстратах. Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Вонг, Э.Л., Эрохкин, П. и Гудинг, Дж.Дж. Сравнение катионных и анионных интеркаляторов для электрохимической трансдукции гибридизации ДНК с помощью переноса электронов на большие расстояния. Электрохимия.comminicate.6, 648–654 (2004).
Вонг, Э.Л. и Гудинг, Дж.Дж. Перенос заряда через ДНК: селективный электрохимический ДНК-биосенсор.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al. Микрожидкостное устройство для ПЦР в реальном времени с одновременным электрохимическим обнаружением. Биологический датчик. Bioelectronics. 24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. Изучение механизма передачи сигналов и проверка эффективности электрохимической системы ПЦР в реальном времени, основанной на взаимодействии метиленового синего с ДНК. Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al. Электрохимический датчик на основе изотермической амплификации с петлевой связью для обнаружения sars-cov-2 в образцах сточных вод. J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Кумар М. и др. Электрохимическое обнаружение ампликонов SARS-CoV-2 с электродами из ПХБ. Сенсор активирован. B Chemistry. 343, 130169 (2021).
Китамура К., Садамасу К., Мурамацу М. и Йошида Х. Эффективное обнаружение РНК SARS-CoV-2 в твердой фракции сточных вод.научная.общая среда.763, 144587 (2021).
Алигизакис Н. и др. Аналитические методы обнаружения SARS-CoV-2 в сточных водах: протокол и перспективы на будущее. TraC Trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Федоренко А., Гринберг М., Ореви Т. и Каштан Н. Выживание оболочечного бактериофага Phi6 (суррогат SARS-CoV-2) в каплях испаренной слюны, осевших на стеклянных поверхностях.10, 1–10 (2020).
Дей Р., Длусская Э. и Эшболт Н. Дж. Стойкость суррогата SARS-CoV-2 (Phi6) в окружающей среде у свободноживущих амёб.Здоровье воды 20, 83 (2021).
Mindich, L. Точная упаковка трех геномных фрагментов двухцепочечной РНК бактериофага\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Пирттимаа, М. Дж. и Бэмфорд, Вторичная структура области упаковки фага DH РНК \ (\ varphi \) 6. РНК 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al. Phages on the Tap — быстрый и эффективный протокол подготовки лабораторных запасов бактериофагов. PeerJ 4, e2261 (2016).
Время публикации: 27 мая 2022 г.