Obrigado por visitar Nature.com.A versão do navegador que você está usando tem suporte limitado para CSS.Para uma melhor experiência, recomendamos que você use um navegador atualizado (ou desative o modo de compatibilidade no Internet Explorer).Enquanto isso, para garantir suporte contínuo, exibiremos o site sem estilos e JavaScript.
A importância do monitoramento de amostras ambientais tem sido muito apreciada desde o início da pandemia de COVID-19, e alguns esforços de monitoramento estão sendo realizados usando o padrão ouro, embora as técnicas baseadas em qPCR sejam caras.Os biossensores eletroquímicos de DNA podem fornecer uma solução potencialmente econômica solução para monitorar amostras de água ambiental em países de baixa e média renda. para completar eletrodos PCB sem modificação de superfície.sexo. A resposta do sensor eletroquímico foi completamente caracterizada para dois fragmentos de DNA de comprimentos diferentes (\({117}\,\hbox {bp}\) e \({503}\,\hbox {bp}\)), e o efeito de sais em master mixes de PCR em interações de azul de metileno (MB)-DNA. importante para a medição in situ de amostras de água.Uma solução totalmente automatizada para carga viral é um bom presságio.
A transmissão de vírus pela água é conhecida como um perigo para a saúde pública desde a década de 1940, com a primeira evidência de transmissão de poliomielite e hepatite E1 pela água. métodos de detecção dependem de técnicas baseadas em qPCR padrão-ouro, que são altamente sensíveis e específicas, mas requerem pessoal qualificado para testar em laboratório usando instrumentos caros. é provável que o teste de amostras tenha precedência sobre o monitoramento de amostras de água ambiental. Portanto, métodos alternativos de baixo custo são necessários para monitoramento sustentável e em tempo real de amostras de água e águas residuais em países de baixa e média renda como alertas precoces de surtos de doenças emergentes, protegendo-os, assim, dos graves impactos socioeconômicos da pandemia do vírus. Biossensores eletroquímicos de baixo custo para ácidos nucleicos podem fornecer uma solução potencial promissora para essa necessidade não atendida. Muitos desses biossensores de DNA funcionam pelo fato de que cadeias de DNA complementares são imobilizadas no eletrodo superfície e hibridizam quando uma sequência correspondente está presente na amostra. Isso pode então ser convertido em um sinal por várias técnicas eletroquímicas usando mediadores redox, como ferro/ferrocianeto de potássio. O azul de metileno (MB) é uma dessas moléculas redox-ativas, que tem foi relatado que se intercalam no DNA de fita dupla (dsDNA), além de sua ligação mais inespecífica ao DNA de fita simples5,6. A natureza intercalada dos MBs para formar complexos MB-DNA os torna uma escolha popular como mediadores redox em vários DNAs eletroquímicos configurações do sensor5,6,7,8,9. Embora a intercalação de MB ao DNA seja inespecífica e a especificidade desse sensor eletroquímico dependa em grande parte da pureza dos primers usados para PCR ou amplificação isotérmica, é adequado para a implementação real qPCR baseada em eletroquímica de tempo ou amplificação isotérmica de fluorescência como alternativa à medição da concentração de DNA 9 . Em uma dessas implementações, Won et al. A superfície dos eletrodos de ouro foi modificada com 6-mercapto-1-hexanol (MCH) para tempo real medição de amplicons de PCR com MB usando voltametria de pulso diferencial (DPV)9. Em outros casos, Ramirez et al. Detecção de SARS-CoV-2 em águas residuais por reação RT-LAMP usando MB com eletrodos impressos em tela. Eletrodos de platina também foram usados como eletrodos in situ em uma plataforma de PCR microfluídica projetada para detectar amplicons eletroquimicamente durante reações 8 .Todos esses estudos requerem modificação de superfície dos eletrodos, implicando aumento de produção e custos operacionais devido a requisitos especiais de armazenamento para a estabilidade desses eletrodos funcionalizados.
Esquema do fluxo de trabalho para detecção eletroquímica de amplicons obtidos de partículas virais concentradas em amostras de água de lago.
Recentemente, demonstramos a detecção eletroquímica de amplicons de SARS-CoV-2 com eletrodos de placa de circuito impresso (PCB) de baixo custo baseados em DPV e voltametria cíclica (CV) induzida por adsorção de complexos MB-DNA na superfície de eletrodos não modificados) mudanças no pico atual11.Relatamos que fragmentos de DNA mais longos (N1-N2, \({943}\, \hbox) formados usando os primers N1 forward e N2 reverse recomendados pelo CDC em comparação com fragmentos mais curtos {bp}\)) mostraram melhor linearidade na resposta do sensor ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) formados usando conjuntos de primers N1 forward e N1 reverse. Esses estudos são relatados usando diluições de DNA preparadas em água livre de nuclease. A plataforma também foi usada para detectar SARS-CoV -2 amplicons em amostras simuladas de águas residuais (obtidas pela adição de amostras de RNA total com RNA SARS-CoV-2). Como o RNA é suscetível a cisalhamento durante o isolamento e processamento a jusante,12,13 é difícil amplificar fragmentos mais longos com esta amostra heterogênea. Portanto, a demonstração da detecção eletroquímica do amplicon SARS-CoV-2 em águas residuais é limitada ao fragmento N1 \(72\,\hbox {bp}\) mais curto.
Neste trabalho, investigamos a viabilidade da detecção eletroquímica baseada em ENIG PCB do fago Phi6 concentrado e isolado de amostras de água do lago (Fig. 1). Os fagos Phi6 são comparáveis em tamanho (80-100 nm) ao SARS-CoV-2 e também têm uma membrana lipídica e uma proteína spike. Por essas razões, o bacteriófago Phi6 é um substituto popular para SARS-CoV-2 e outros vírus de RNA patogênicos envelopados14,15.RNA isolado de partículas de fago foi usado como modelo para síntese de cDNA seguido por PCR para obter dois fragmentos de DNA de 117 e 503 pares de bases de comprimento.Dado o desafio de amplificar \(943\,\hbox {bp}\) fragmentos N1-N2 em nosso trabalho anterior, visamos fragmentos de comprimento intermediário (\(117 \,\hbox {bp}\) e \(503 \,\hbox {bp}\)), com base nos primers disponíveis. A resposta do sensor eletroquímico foi sistematicamente estudada em uma ampla faixa de concentração (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) para \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Para ambos os fragmentos em na presença de MB, o efeito do sal na resposta do sensor foi caracterizado e validado por medições espectrofotométricas. As principais contribuições deste trabalho são as seguintes:
O comprimento do fragmento de DNA e a presença de sal na amostra afetam fortemente a sensibilidade.Nossos resultados mostram que a atividade eletroquímica depende de diferentes mecanismos de interação de MB, DNA e do sensor na resposta voltamétrica, dependendo da concentração e comprimento do DNA, com fragmentos mais longos apresentam maior sensibilidade, embora o sal tenha um efeito negativo nas interações eletrostáticas entre MB e DNA.
A concentração de DNA determina o mecanismo de interação MB-DNA em eletrodos não modificados Demonstramos que diferentes mecanismos de interação MB-DNA dependem da concentração de DNA. Em concentrações de DNA abaixo de uma pequena quantidade de \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), observamos que a resposta de corrente eletroquímica foi determinada principalmente pela adsorção de MB-DNA no eletrodo, enquanto em concentrações mais baixas Em altas concentrações de DNA, a resposta de corrente eletroquímica foi determinada pela inibição estérica de redox devido à inserção de MB entre pares de bases de DNA.
Detecção eletroquímica baseada em PCB ENIG de ácidos nucleicos virais em amostras de água do lago Fago de resultado.
Baixo custo de implementação e potencial de integração em sistemas de monitoramento totalmente automatizados, oligonucleotídeos ou aptâmeros em eletrodos com vida útil mais longa.
O fago Phi6 é um vírus dsRNA envelopado da família Cytoviridae que infecta Pseudomonas syringae. O genoma do fago Phi6 existe na forma de 3 fragmentos: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07 \,\hbox {Kb}\)) e L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Como o fago Phi6 infecta uma cepa de Pseudomonas BSL-1 não patogênica, é seguro usar e pode ser facilmente cultivado em laboratório. O fago Phi6 e seu hospedeiro Pseudomonas syringae foram adquiridos do Felix d'Herelle Reference Center for Bacterial Viruses, Laval University, Canadá (os números de catálogo do centro de referência são HER-102 e HER-1102, respectivamente) .O fago Phi6 e seu hospedeiro foram revividos conforme indicado pelo centro de referência. O fago Phi6 foi purificado por lise em placa e eluição para obter títulos finais com \(\cerca de 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (unidades formadoras de placas/mililitros).RNA foi isolado de partículas de fago purificadas usando o GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) de acordo com as instruções do fabricante.Resumidamente, uma suspensão de fago Phi6 purificada\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) foi lisado e o lisado foi carregado em uma coluna giratória para permitir que o RNA se ligue à coluna de resina. O RNA é então eluído na solução de eluição \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) fornecido pelo kit.Estime a concentração de RNA por absorbância em \(260\,\hbox {nm}\).RNA foi armazenado em alíquotas em \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) até uso posterior.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) O iScript cDNA Synthesis Kit (Bio -Rad Laboratories) foi usado como modelo para a síntese de cDNA seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, uma reação de síntese de cDNA consiste em 3 etapas: iniciação em \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , transcrição reversa de \({20}\,{\hbox {min}}\) em \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), e reverso O gravador está em \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) para \({1}\,{\hbox {min }}\). Quando executado em um gel de agarose a 1%, o cDNA mostrou três bandas correspondentes aos três fragmentos de RNA esperados (dados não mostrados). Os seguintes primers foram usados para amplificar dois fragmentos de DNA de 117 e 503 pb de comprimento, usando cDNA como modelo para PCR em um termociclador miniPCR® mini8:
Os primers para \(117\,\hbox {bp}\) e \(503\,\hbox {bp}\) correspondem a 1476-1575 nucleotídeos do segmento M e 458-943 nucleotídeos do segmento L, respectivamente ácidos .Todos os produtos de PCR amplificados foram submetidos a eletroforese em géis de agarose a 1% e o DNA-alvo amplificado foi purificado usando o GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
Um lago no campus do IIT em Mumbai (Lago Powai, Powai, Mumbai) foi usado para adicionar partículas de fago. A água do lago foi filtrada através de uma membrana \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) para remover partículas suspensas e, em seguida, o fago Phi6 foi adicionado. Adicionar \({1}\,{\hbox {ml}}\) de \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) para \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) água filtrada do lago, em \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Uma pequena alíquota foi reservado para medição de carga viral por ensaio de placa. Testamos dois métodos diferentes para concentrar partículas de vírus Phi6 enriquecidas: (1) o método de adsorção-precipitação de hidróxido de alumínio,19 que foi validado para a concentração de vários vírus de RNA envelopados de amostras ambientais e (2) ) O método de concentração de vírus baseado em polietilenoglicol (PEG) foi adaptado de Flood et al.20. Uma vez que a eficiência de recuperação do método baseado em PEG foi considerada melhor do que a do método de hidróxido de alumínio, o método baseado em PEG foi usado para concentrar as partículas Phi6 de amostras de água do lago.
O método PEG utilizado foi o seguinte: PEG 8000 e \(\hbox {NaCl}\) foram adicionados a amostras de água do lago com adição de Phi6 para obter 8% de PEG 8000 e \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).As amostras foram incubadas em agitador\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), então centrifugado a \(4700 \,\hbox {g}\) é \({45}\,{\hbox {min}}\). Descarte o sobrenadante e ressuspenda o sedimento em \({1}\, {\hbox {ml}}\) no mesmo sobrenadante. Todos os experimentos de adição e concentração de vírus foram realizados em triplicado. Após a concentração, uma pequena alíquota foi reservada para medição da eficiência de recuperação por ensaio de placa. O RNA foi isolado conforme descrito anteriormente e eluído no tampão de eluição fornecido pelo kit\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Como a concentração de RNA varia de amostra para amostra em triplicado, o \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) de RNA é usado para todos os três, independentemente de sua concentração síntese de cDNA de amostras. A síntese de cDNA foi realizada conforme descrito anteriormente.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA foi usado como modelo para \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR por 35 ciclos para amplificar \ (117\,\hbox {bp}\) e \(503\,\hbox { bp}\) fragmentos. Essas amostras são representadas como "1:1", ou seja, sem diluição. Um controle sem modelo (NTC) foi configurado como um controle negativo, enquanto um cDNA sintetizado usando RNA isolado de fago purificado foi configurado como modelo para um controle positivo (PC). A PCR quantitativa (qPCR) foi realizada em um instrumento Stratagene Mx3000P RT-PCR usando Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). As reações foram configuradas em triplicado como anteriormente descrito. O limiar do ciclo (Ct) foi registrado para todas as amostras. Além disso, as amostras diluídas foram \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) usando cDNA diluído 1:100 em água do lago filtrada como \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR para 35 ciclos. Estas amostras são representadas como “1:100″.
Os eletrodos PCB são fabricados usando um processo de imersão em ouro de níquel eletrolítico (ENIG) de baixo custo, disponível comercialmente, sem a necessidade de revestimento de ouro adicional. As especificações do eletrodo ENIG PCB são detalhadas em nosso trabalho anterior11. solução de piranha ou voltametria cíclica de ácido sulfúrico não são recomendados, pois podem causar descamação da fina camada de ouro (espessura \(\aprox\) \(100\,\hbox {nm }\)) e expor as camadas de cobre subjacentes que são propensas à corrosão 21, 22, 23, 24, 25. Portanto, limpe os eletrodos com um pano sem fiapos umedecido com IPA. A amostra a ser testada foi incubada com \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB em \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) para fácil inserção.Em nosso trabalho anterior , observamos que a sensibilidade e a linearidade do sensor foram melhoradas com o aumento da concentração de MB 11 . Com base nas otimizações relatadas em nosso trabalho anterior, usamos \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB concentrações para incorporar o DNA neste estudo. A detecção eletroquímica de DNA de fita dupla (ds-DNA) pode ser obtida usando intercaladores aniônicos ou catiônicos. Embora os intercaladores aniônicos detectem o DNA com melhor seletividade, eles requerem incubação durante a noite, resultando em tempos de detecção mais longos. por outro lado, intercaladores catiônicos como o MB requerem tempos de incubação mais curtos, aproximadamente \({1}\,{\hbox {h}}\) para detecção eletroquímica de ds-DNA6. Cada medição envolve dispensar a amostra a ser testada no eletrodo\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), em seguida, limpe com um pano umedecido com IPA, antes de prosseguir com outra amostra.uma medição.Cada amostra foi testada em 5 eletrodos diferentes, salvo indicação em contrário.As medições de DPV e CV foram realizadas usando um potenciostato PalmSens Sensit Smart e o software PSTrace foi usado para configuração do potenciostato e aquisição de dados, incluindo cálculos de corrente de pico.As configurações a seguir são usadas para medições DPV e CV:
DPV: Tempo de Equilíbrio = \(8\,\hbox {s}\), Passo de Tensão = \(3\,\hbox {mV}\), Tensão de Pulso = \(25\,\hbox {mV}\) , duração do pulso = \(50\,\hbox {ms}\), taxa de varredura = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Tempo de Equilíbrio = \(8\,\hbox {s}\), Passo de Tensão = \(3\,\hbox {mV}\), Taxa de Varredura = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Correntes de pico obtidas a partir de voltamogramas de DNA complexados com \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Voltamogramas DPV e CV foram obtidos em eletrodos ENIG PCB \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB complexados com DNA (em concentrações de 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) ou seja, 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) para \(117\,\hbox {bp}\ ) e 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) para \(503\,\hbox {bp}\)). Voltamogramas representativos são mostrados na Figura S1 em Informações Suplementares. A Figura 2 mostra os resultados de medições DPV e CV (corrente de pico) usando produtos de PCR purificados em gel. Em comparação com as medições CV, as medições DPV mostram maior sensibilidade (corrente em função da concentração de DNA) porque as correntes capacitivas de fundo nas medições CV ocultam as correntes faradaicas 26 .Os dados para cada caixa no boxplot contém medições de 5 eletrodos. Todas as medições usam o mesmo conjunto de eletrodos para evitar erros de medição devido à variação de eletrodo para eletrodo. Observamos uma tendência crescente nas correntes de pico medidas de DPV e CV para concentrações mais baixas de DNA , mais longo (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ em comparação com \(117) ) fragmento. Isso é consistente com a tendência esperada de adsorção de eletrodo relatada em nosso trabalho anterior. a adsorção do complexo MB-DNA facilita a transferência de carga no eletrodo, o que contribui para o aumento da corrente de pico. -o conteúdo de citosina (GC) dos dois amplicons (\(117\,\hbox {bp}\) e \(503\,\hbox {bp}\)) foi de aproximadamente 50%, indicando que a observação A diferença é devida ao comprimento do amplicon. No entanto, para concentrações de DNA mais altas (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), para \(503\,\hbox {bp} \) e \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) para \(117\,\hbox {bp}\)), observamos duas amplificações as correntes de pico dos subs são reduzidas nas medições de DPV e CV. Isso ocorre porque MB satura e intercala entre pares de bases de DNA, resultando em inibição estérica da atividade redox do grupo redutível em MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Os sais presentes nas master mixes de PCR interferem nas interações eletrostáticas entre MB e DNA, portanto, adicionando \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) com \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) Produto purificado em gel MB para estudar o efeito do sal na interação MB-DNA. Conforme mostrado na Figura 3, observamos que para concentrações mais altas de DNA (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) e \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) para \(117\,\hbox {bp} \)), em DPV e CV A adição de sal não afetou significativamente as medições (consulte a Figura S2 em Informações Suplementares para voltamogramas representativos). concentrações mais baixas de DNA, a adição de sal reduz muito a sensibilidade, resultando em nenhuma mudança significativa na corrente com a concentração de DNA. Efeitos negativos semelhantes do sal nas interações MB-DNA e intercalação foram relatados anteriormente por outros pesquisadores33,34.\(\hbox { Os cátions Mg}^{2+}\) ligam-se ao esqueleto de fosfato negativo do DNA, dificultando assim a interação eletrostática entre o MB e o DNA. não afetam significativamente a resposta do sensor. O ponto principal é que este biossensor é mais adequado para detectar concentrações mais altas de DNA (raramente \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ou superior), para processamento totalmente automatizado de amostras de água ambiental, onde a purificação em gel de produtos de PCR pode não ser viável.
Área sob a curva de absorção para a faixa de comprimento de onda 600–700 \(\hbox {nm}\) para várias concentrações de DNA complexado com \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) com e sem sal (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) com e sem sal (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Concentrações de DNA correspondentes a \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) amostras MB Sem DNA.
Para verificar melhor os resultados acima, realizamos medições ópticas usando um espectrofotômetro UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), as amostras \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) foram usadas para cada Medição. A assinatura de absorção diminui com o aumento da concentração de DNA, como pode ser visto na tendência da área sob a curva de absorção para a faixa de comprimento de onda \(600\,\hbox {nm}\) a \(700\,\hbox { nm}\) , conforme mostrado na Fig. 4 (espectro de absorção mostrado na Fig. S3 em Informações Suplementares). Para amostras com concentrações de DNA menores que \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), não houve diferença significativa na captação entre as amostras contendo DNA e apenas MB (para \(503\,\hbox {bp}\) e \(117\,\hbox {bp}\ ) fragmentos de comprimento), indicando a ausência de inibição estérica de MB redox-ativo. Em concentrações mais altas de DNA, observamos uma diminuição gradual no sinal de absorbância e notamos uma diminuição menor na absorbância na presença de sal. Esses resultados foram atribuídos a moléculas interações e inibição estérica com empilhamento de bases em híbridos de DNA. ) transições eletrônicas devido à intercalação das Camadas 36, 37, 38.
Eletroforese em gel de agarose do fago Phi6: produtos de PCR de comprimento \(117\,\hbox {bp}\) e \(503\,\hbox {bp}\) de amostras de água de lago.Marcador M-DNA;controle NTC-no-template, primers contendo amplicons correspondentes;PC controle positivo;1, 2, 3 amostras de água do lago não diluídas (1:1) em triplicado. Uma banda é visível em \(\cerca de 50\,\hbox {bp}\) devido a oligonucleotídeos não utilizados no \(503\,\ hbox {bp}\) pista.
Avaliamos a utilidade do sensor usando amostras de água do lago Powai enriquecidas com fago Phi6. ml}}\), enquanto aqueles isolados de suspensões de fagos purificados O RNA foi estimado em \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) com uma eficiência de recuperação de aproximadamente 1 %. O RNA foi transcrito reversamente em cDNA e usado como modelo para PCR e qPCR. O tamanho do produto foi confirmado por eletroforese em gel de agarose (Figura 5) antes do teste com o sensor. Essas amostras não são purificadas em gel e, portanto, contêm todos os componentes de PCR como bem como os amplicons de interesse. Os valores de Ct registrados durante qPCR (Tabela 1) mostraram estar correlacionados com a concentração de RNA isolado das amostras de água enriquecidas correspondentes. O valor de Ct revela o número de ciclos necessários para o sinal fluorescente exceder o limite ou sinal de fundo. Valores de Ct mais altos indicam concentrações de modelo mais baixas e vice-versa. Os valores de Ct das amostras de NTC foram tão altos quanto o esperado. o controle positivo e a amostra de teste indicam ainda que cada amostra de teste tem aproximadamente 1% de modelo em comparação com o controle positivo.Discutimos anteriormente que amplicons mais longos levam a uma melhor sensibilidade.Amplificação de fragmentos mais longos isolados de amostras ambientais heterogêneas é um desafio devido às desvantagens de baixa concentração viral e degradação de RNA. No entanto, com nosso protocolo de enriquecimento de vírus e amplificação por PCR, conseguimos amplificar com sucesso o fragmento \(503\,\hbox {bp}\) para detecção eletroquímica.
A Figura 6 mostra os resultados do sensor eletroquímico do amplicon do fragmento \(503\,\hbox {bp}\), ambos usando cDNA não diluído como modelo (1:1) e cDNA diluído 100 vezes como modelo (1:100) realizado PCR , em comparação com NTC e PC (consulte a Figura S4 em Informações Suplementares para voltamogramas representativos). Cada caixa no boxplot na Figura 6 contém medições de três amostras em 5 eletrodos. Os mesmos eletrodos foram usados para medir todas as amostras para evitar erros devido ao eletrodo Variação -para-eletrodo. Em comparação com as medições CV, as medições DPV mostram melhor resolução para distinguir amostras de teste e PC de NTCs porque, como mencionado anteriormente, as correntes faradaicas são ocultadas devido a correntes capacitivas de fundo no último. Para amplicons mais longos, observamos que o controle negativo (NTC) resultou em correntes de pico CV e DPV mais altas em relação ao controle positivo, enquanto amostras de teste positivas e não diluídas mostraram alturas de pico semelhantes de correntes de pico DPV. Os valores médios e medianos medidos para cada não diluído (1:1 ) amostra de teste e PC podem ser claramente resolvidos a partir da saída do sensor para a amostra NTC, enquanto a resolução para a amostra diluída 1:100 é menos pronunciada. Para uma diluição de 100 vezes do cDNA, não observamos nenhuma banda durante a eletroforese em gel (pistas não mostradas na Figura 5), e as correntes de pico DPV e CV correspondentes foram semelhantes às esperadas para NTC. Os resultados para o fragmento \(117\,\hbox {bp}\) são mostrados em Informações Suplementares. controle induziu uma resposta eletroquímica do sensor PCB devido à adsorção de MB livre no eletrodo e a interação do MB com o oligonucleotídeo iniciador de fita simples. Portanto, cada vez que uma amostra é testada, um controle negativo deve ser executado e o corrente de pico da amostra de teste em comparação com a corrente de pico obtida pelo controle negativo para obter uma medição diferencial (relativa)39,40 para classificar a amostra de teste como positiva ou negativa.
(a) DPV e (b) corrente de pico CV para detecção eletroquímica de fragmentos \(503\,\hbox {bp}\) em amostras de água do lago. As amostras de teste foram medidas em triplicado e comparadas com controles sem modelo (NTC) e controles positivos (PC).
Nossas descobertas ilustram diferentes mecanismos que afetam o desempenho de sensores eletroquímicos para amplicons de diferentes comprimentos para diferentes DNAs, com concentrações verificadas por medições ópticas usando um espectrofotômetro UV/Vis. \(500\,\hbox {bp}\) pode ser detectado com maior sensibilidade e que a presença de sal na amostra não afeta Sensibilidade Concentração de DNA que afeta maior sensibilidade (raramente \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) e acima). Além disso, investigamos o efeito de diferentes tipos de amostras, incluindo amplicons purificados em gel com e sem adição de sal e adição de amostras de água do lago em medições de DPV e CV.Observamos que o DPV forneceu melhor resolução, pois a corrente capacitiva de fundo também afeta a medição de CV, tornando-a menos sensível.
A amplificação de fragmentos mais longos depende da integridade do RNA genômico viral. Vários estudos mostraram que a amplificação de fragmentos mais longos nem sempre é eficiente devido à degradação do RNA no ambiente e ao potencial de splicing durante o isolamento11,41,42,43,44 .Observamos que o método de concentração de vírus baseado em PEG foi mais eficaz na concentração de fago Phi-6 adicionado em amostras de água de lago do que o método de concentração de vírus baseado em hidróxido de alumínio. para amplificar vários modelos de comprimento mais curto e reduzir a possibilidade de especificidade cruzada.
As amostras biológicas são escassas, por isso há a necessidade de projetar um biossensor que requer amostras mínimas para teste.Os eletrodos ENIG PCB usados neste estudo requereram apenas \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) amostras para teste para cobrir a área efetiva dos eletrodos. Além disso, o mesmo eletrodo pode ser reutilizado após a limpeza antes de dispensar a próxima amostra. Amostras amplificadas não requerem a adição de nenhum produto químico além do azul de metileno, que é um produto barato e produtos químicos comumente usados. Uma vez que cada eletrodo custa cerca de $ 0,55 (ou INR 40) para fabricar, este biossensor pode ser uma alternativa econômica às tecnologias de detecção existentes. A Tabela 2 mostra uma comparação deste trabalho com outros sensores relatados na literatura por muito tempo Fragmentos de DNA em amostras heterogêneas.
Dado que os protocolos de detecção eletroquímica baseados em MB dependem da especificidade da PCR, uma das principais limitações desse método é o potencial para amplificação não específica em amostras heterogêneas, como águas residuais e águas de lagos ou usando primers de baixa pureza. Para melhorar a sensibilidade de métodos de detecção eletroquímica para detecção de DNA de produtos de PCR não purificados usando eletrodos ENIG PCB não modificados, é necessário entender melhor os erros introduzidos por dNTPs e primers não utilizados e otimizar as condições de reação e protocolos de ensaio. Parâmetros físico-químicos adicionais, como pH, temperatura e parâmetros biológicos a demanda de oxigênio (BOD) da amostra de água também pode precisar ser medida para melhorar a precisão da medição.
Em conclusão, propomos um sensor ENIG PCB eletroquímico de baixo custo para detecção de vírus em amostras ambientais (água de lago). eletrodos com vida útil mais longa e sem requisitos de armazenamento específicos e, portanto, adequados para o desenvolvimento de soluções de medição com processamento automatizado de amostras implantados em LMICs. O biossensor utiliza corantes redox intercalados de DNA (MB) baratos para detecção rápida de amplicons alvo. comum em amostras ambientais reduz a especificidade desse método de detecção devido à ligação inespecífica de MBs a oligonucleotídeos de fita simples e dupla. Portanto, a especificidade desse teste depende da otimização de primers e condições de reação de PCR. Além disso, o CV e as correntes de pico DPV obtidas das amostras testadas devem ser interpretadas em relação às respostas obtidas do controle negativo (NTC) para cada teste. solução de baixo custo que pode coletar e analisar amostras e transmitir resultados sem fio de volta ao laboratório.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Métodos para concentração inicial de vírus em amostras de água: uma revisão e meta-análise de estudos recentes.J.Application.microorganism.115, pp. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Vírus transmitidos pela água: Barreiras à água potável segura.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.Epidemiologia de águas residuais para vigilância em larga escala econômica de COVID-19 em países de baixa e média renda: desafios e oportunidades.Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Azul de metileno como discriminador eletroquímico de oligonucleotídeos de cadeia simples e dupla imobilizados em substratos de ouro.Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparação de intercaladores de cátions e ânions para transdução eletroquímica de hibridação de DNA por transferência de elétrons de longo alcance.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Transferência de carga através do DNA: um DNA eletroquímico seletivo biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Dispositivo microfluídico de PCR em tempo real com detecção eletroquímica simultânea.sensor biológico.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. Estudo do mecanismo de sinalização e verificação do desempenho de um sistema de PCR eletroquímico em tempo real baseado na interação do azul de metileno com o DNA.Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Sensor eletroquímico baseado em amplificação isotérmica mediada por loop para detecção de sars-cov-2 em amostras de águas residuais.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al. Detecção eletroquímica de amplicons SARS-CoV-2 com eletrodos PCB. O sensor é ativado. B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Detecção eficiente de SARS-CoV-2 RNA na fração sólida de águas residuais.ciência.ambiente geral.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Analytical Methods for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Sobrevivência do bacteriófago Phi6 envelopado (um substituto para SARS-CoV-2) em gotículas de saliva evaporadas depositadas em superfícies de vidro.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Persistência ambiental de um substituto SARS-CoV-2 (Phi6) em ameba de vida livre.J.Water Health 20, 83 (2021).
Mindich, L. Embalagem precisa de três fragmentos genômicos de bacteriófago de RNA de cadeia dupla\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, estrutura secundária do DH RNA fago\(\varphi\)6 região de empacotamento.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – Um protocolo rápido e eficiente para preparar estoques laboratoriais de bacteriófagos.PeerJ 4, e2261 (2016).
Horário de postagem: 27 de maio de 2022