Takk for at du besøker Nature.com. Nettleserversjonen du bruker har begrenset støtte for CSS. For den beste opplevelsen anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller slår av kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi vise nettstedet uten stiler og JavaScript.
Viktigheten av å overvåke miljøprøver har blitt satt stor pris på siden begynnelsen av COVID-19-pandemien, og noen overvåkingstiltak utføres ved bruk av gullstandarden, selv om qPCR-baserte teknikker er dyre. Elektrokjemiske DNA-biosensorer kan gi en potensielt kostnadseffektiv løsning for overvåking av miljøvannprøver i lav- og mellominntektsland. I dette arbeidet demonstrerer vi den elektrokjemiske påvisningen av amplikoner hentet fra Phi6-fag isolert fra innsjøvannprøver (et populært surrogat for SARS-CoV-2), ved hjelp av ENIG for å komplettere PCB-elektroder uten overflatemodifisering.sex.Den elektrokjemiske sensorresponsen ble grundig karakterisert for to DNA-fragmenter av forskjellige lengder (\({117}\,\hbox {bp}\) og \({503}\,\hbox {bp}\)), og effekt av salter i PCR-masterblandinger på metylenblått (MB)-DNA-interaksjoner. Våre resultater viser at lengden på DNA-fragmenter i betydelig grad bestemmer den elektrokjemiske sensitiviteten og viser i dette arbeidet at evnen til å oppdage lange amplikoner uten gelrensing av PCR-produkter er viktig for in situ måling av vannprøver.En helautomatisert løsning for viral belastning lover godt.
Vannbåren virusoverføring har vært kjent som en folkehelsefare siden 1940-tallet, med de første bevisene for vannbåren overføring av polio og hepatitt E1. Verdens helseorganisasjon (WHO) har klassifisert flere vannbårne viruspatogener av moderat til høy helsemessig betydning2. Tradisjonelt virus deteksjonsmetoder er avhengige av gullstandard qPCR-baserte teknikker, som er svært sensitive og spesifikke, men krever dyktig personell for å teste i laboratoriet ved hjelp av dyre instrumenter. Men i lav- og mellominntektsland (LMIC) med begrensede ressurser, prøvetesting vil sannsynligvis ha forrang over vannprøveovervåking i miljøet. Derfor er det nødvendig med alternative lavkostmetoder for bærekraftig sanntidsovervåking av vann- og avløpsvannprøver i lav- og mellominntektsland som tidlige varsler om nye sykdomsutbrudd, og dermed beskytte dem mot de alvorlige sosioøkonomiske konsekvensene av viruspandemien. Rimelige elektrokjemiske biosensorer for nukleinsyrer kan gi en lovende potensiell løsning på dette udekkede behovet. Mange av disse DNA-biosensorene fungerer ved at komplementære DNA-tråder er immobilisert på elektroden overflaten og hybridisere når en matchende sekvens er tilstede i prøven. Dette kan deretter konverteres til et signal ved hjelp av ulike elektrokjemiske teknikker ved bruk av redoksmediatorer som kaliumjern/ferrocyanid. Metylenblått (MB) er et slikt redoksaktivt molekyl, som har blitt rapportert å interkalere til dobbelttrådet DNA (dsDNA) i tillegg til dets mer uspesifikke binding til enkelttrådet DNA5,6. Den interkalerende naturen til MB-er for å danne MB-DNA-komplekser gjør dem til et populært valg som redoksmediatorer i flere elektrokjemiske DNA sensorkonfigurasjoner5,6,7,8,9. Selv om interkaleringen av MB til DNA er uspesifikk, og spesifisiteten til denne elektrokjemiske sensoren i stor grad avhenger av renheten til primerne som brukes til PCR eller isotermisk amplifikasjon, er den godt egnet for implementering av ekte -tid elektrokjemisk-basert qPCR eller fluorescens isotermisk amplifikasjon som et alternativ til DNA-konsentrasjonsmåling 9. I en slik implementering, Won et al. Overflaten av gullelektroder ble modifisert med 6-merkapto-1-heksanol (MCH) for sanntid måling av PCR-amplikoner med MB ved bruk av differensialpulsvoltammetri (DPV)9.I andre tilfeller har Ramirez et al.Deteksjon av SARS-CoV-2 i avløpsvann ved RT-LAMP-reaksjon ved bruk av MB med skjermtrykte elektroder.Platinaelektroder har også blitt brukes som in situ-elektroder i en mikrofluidisk PCR-plattform designet for å elektrokjemisk oppdage amplikoner under reaksjoner 8. Alle disse studiene krever overflatemodifisering av elektrodene, noe som innebærer økte produksjons- og driftskostnader på grunn av spesielle lagringskrav for stabiliteten til disse funksjonaliserte elektrodene.
Skjematisk av arbeidsflyten for elektrokjemisk påvisning av amplikoner hentet fra konsentrerte viruspartikler i innsjøvannprøver.
Vi demonstrerte nylig elektrokjemisk sensing av SARS-CoV-2-amplikoner med rimelige kretskortelektroder (PCB) basert på DPV og syklisk voltammetri (CV) indusert av adsorpsjon av MB-DNA-komplekser på overflaten av umodifiserte elektroder) endringer i topp nåværende11.Vi rapporterer at lengre DNA-fragmenter (N1-N2, \({943}\, \hbox) dannet ved bruk av de CDC-anbefalte N1-forover- og N2-reversprimerne sammenlignet med kortere fragmenter {bp}\)) viste bedre linearitet i sensorresponsen ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) dannet ved bruk av N1 forover og N1 revers primersett. Disse studiene er rapportert ved bruk av DNA-fortynninger fremstilt i nukleasefritt vann. Plattformen ble også brukt til å oppdage SARS-CoV -2 amplikoner i simulerte avløpsvannprøver (oppnådd ved å spike totale RNA-prøver med SARS-CoV-2 RNA). Siden RNA er mottakelig for skjæring under isolasjon og nedstrøms prosessering,12,13 er det vanskelig å amplifisere lengre fragmenter med denne heterogene prøven. Derfor er demonstrasjonen av elektrokjemisk sensing av SARS-CoV-2-amplikon i avløpsvann begrenset til det kortere \(72\,\hbox {bp}\) N1-fragmentet.
I dette arbeidet undersøkte vi muligheten for ENIG PCB-basert elektrokjemisk sensing av fag Phi6 konsentrert og isolert fra innsjøvannprøver (fig. 1). Phi6-fager er sammenlignbare i størrelse (80-100 nm) med SARS-CoV-2 og har også en lipidmembran og et piggprotein. Av disse grunnene er bakteriofag Phi6 et populært surrogat for SARS-CoV-2 og andre innkapslede patogene RNA-virus14,15.RNA isolert fra fagpartikler ble brukt som mal for cDNA-syntese etterfulgt av PCR for å oppnå to DNA-fragmenter på 117 og 503 basepar i lengde. Gitt utfordringen med å amplifisere \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2-fragmenter i vårt tidligere arbeid, målretter vi fragmenter med middels lengde (\(117) \,\hbox {bp}\) og \(503 \,\hbox {bp}\)), basert på tilgjengelige primere. Den elektrokjemiske sensorresponsen ble systematisk studert over et bredt konsentrasjonsområde (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) til \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\))) For begge fragmentene i tilstedeværelsen av MB, effekten av salt på sensorresponsen har blitt karakterisert og kryssvalidert ved spektrofotometriske målinger. Hovedbidragene til dette arbeidet er som følger:
DNA-fragmentlengden og tilstedeværelsen av salt i prøven påvirker sterkt følsomheten.Våre resultater viser at elektrokjemisk aktivitet avhenger av ulike mekanismer for interaksjonen mellom MB, DNA og sensoren i den voltammetriske responsen, avhengig av DNA-konsentrasjon og lengde, med lengre Fragmenter viser høyere følsomhet, selv om salt har en negativ effekt på elektrostatiske interaksjoner mellom MB og DNA.
DNA-konsentrasjon bestemmer mekanismen for MB-DNA-interaksjon i umodifiserte elektroder. Vi demonstrerer at ulike mekanismer for MB-DNA-interaksjon avhenger av DNA-konsentrasjon. Ved DNA-konsentrasjoner under en liten mengde \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), observerte vi at den elektrokjemiske strømresponsen hovedsakelig ble bestemt av adsorpsjonen av MB-DNA på elektroden, mens ved lavere konsentrasjoner Ved høye DNA-konsentrasjoner ble den elektrokjemiske strømresponsen bestemt av den steriske inhiberingen av redoks aktivitet på grunn av MB-innsetting mellom DNA-basepar.
ENIG PCB-basert elektrokjemisk sensing av virale nukleinsyrer i innsjøvannsprøver Observasjonene ble validert ved elektrokjemisk påvisning av Phi6-tilsatt \(503\,\hbox {bp}\) DNA-fragmenter hentet fra vannprøver fra Powai Lake, IIT Mumbai Campus Resultat fag.
Lave implementeringskostnader og potensial for integrering i helautomatiserte overvåkingssystemer, oligonukleotider eller aptamerer på elektroder med lengre holdbarhet.
Phage Phi6 er et innhyllet dsRNA-virus fra Cytoviridae-familien som infiserer Pseudomonas syringae. Genomet til Phi6-fagen eksisterer i form av 3 fragmenter: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) og L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Siden Phi6-fagen infiserer en ikke-patogen BSL-1 Pseudomonas-stamme, er den trygt å bruke og kan enkelt dyrkes i laboratoriet.Phage Phi6 og dens vert Pseudomonas syringae ble kjøpt fra Felix d'Herelle Reference Center for Bacterial Viruses, Laval University, Canada (referansesenterets katalognummer er henholdsvis HER-102 og HER-1102) .Phi6-fag og dens vert ble gjenopplivet som anvist av referansesenteret.Phage Phi6 ble renset ved platelyse og eluering for å oppnå endelige titere med \(\omtrent 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (plakkdannende enheter/ milliliter).RNA ble isolert fra rensede fagpartikler ved bruk av GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt en renset fag Phi6-suspensjon\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) ble lysert og lysatet ble lastet på en spinnkolonne for å la RNA binde seg til harpikskolonnen. RNA elueres deretter i elueringsløsningen \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) levert av settet. Anslå konsentrasjonen av RNA ved absorbans ved \(260\,\hbox {nm}\).RNA ble lagret i alikvoter i \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) inntil videre bruk.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA Synthesis Kit (Bio -Rad Laboratories) ble brukt som en mal for cDNA-syntese etter produsentens instruksjoner. Kort fortalt består en cDNA-syntesereaksjon av 3 trinn: priming ved \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , omvendt transkripsjon av \({20}\,{\hbox {min}}\) ved \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), og omvendt Opptakeren er i \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) for \({1}\,{\hbox {min. }}\).Når det ble kjørt på en 1 % agarosegel, viste cDNA tre bånd som tilsvarer de forventede tre RNA-fragmentene (data ikke vist). Følgende primere ble brukt til å amplifisere to DNA-fragmenter på 117 og 503 bp lange, ved å bruke cDNA som mal for PCR i en miniPCR® mini8 termisk syklus:
Primerne for \(117\,\hbox {bp}\) og \(503\,\hbox {bp}\) tilsvarer henholdsvis 1476-1575 nukleotider i M-segmentet og 458-943 nukleotider i L-segmentet, Alle amplifiserte PCR-produkter ble underkastet elektroforese på 1 % agarosegeler, og amplifisert mål-DNA ble renset ved bruk av GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
En innsjø ved IIT Mumbai campus (Powai Lake, Powai, Mumbai) ble brukt til å tilsette fagpartikler. Vannet i innsjøen ble filtrert gjennom en \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) membran for å fjerne suspenderte partikler, og deretter ble Phi6-fagen tilsatt.Legg til \({1}\,{\hbox {ml}}\) av \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) til \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) filtrert innsjøvann, i \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). En liten alikvot ble reservert for viral belastningsmåling ved plakkanalyse. Vi testet to forskjellige metoder for å konsentrere tilsatte Phi6-viruspartikler: (1) aluminiumhydroksidadsorpsjons-utfellingsmetoden,19 som har blitt validert for konsentrasjonen av flere innkapslede RNA-virus fra miljøprøver, og (2) ) Den polyetylenglykol (PEG)-baserte viruskonsentrasjonsmetoden ble tilpasset fra Flood et al.20. Siden utvinningseffektiviteten til den PEG-baserte metoden ble funnet å være bedre enn den for aluminiumhydroksidmetoden, ble den PEG-baserte metoden brukt til å konsentrere Phi6-partikler fra innsjøvannprøver.
PEG-metoden som ble brukt var som følger: PEG 8000 og \(\hbox {NaCl}\) ble tilsatt Phi6-piggede innsjøvannprøver for å oppnå 8 % PEG 8000 og \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\). Prøver ble inkubert på en shaker\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), deretter sentrifugert ved \(4700 \,\hbox {g}\) er \({45}\,{\hbox {min}}\). Kast supernatanten og resuspender pelleten i \({1}\, {\hbox {ml}}\) i samme supernatant. Alle spiking- og viruskonsentrasjonseksperimenter ble utført i tre eksemplarer. Etter konsentrasjon ble en liten aliquot reservert for måling av utvinningseffektivitet ved plakkanalyse. RNA ble isolert som tidligere beskrevet og eluert i kit-levert elueringsbuffer\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Siden RNA-konsentrasjonen vil variere fra prøve til prøve i tre eksemplarer, vil \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) av RNA brukes for alle tre uavhengig av konsentrasjonen. cDNA-syntese av prøver. cDNA-syntese ble utført som tidligere beskrevet.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA ble brukt som mal for \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR i 35 sykluser for å forsterke \ (117\,\hbox {bp}\) og \(503\,\hbox { bp}\)-fragmenter. Disse prøvene er representert som "1:1", dvs. uten fortynning. En no-template-kontroll (NTC) ble satt opp som en negativ kontroll, mens et cDNA syntetisert ved bruk av RNA isolert fra renset fag ble satt opp som mal for en positiv kontroll (PC). Kvantitativ PCR (qPCR) ble utført i et Stratagene Mx3000P RT-PCR-instrument ved bruk av Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Reaksjoner ble satt opp i tre eksemplarer som tidligere beskrevet. Syklusterskelen (Ct) ble registrert for alle prøver. I tillegg var de fortynnede prøvene \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) ved bruk av cDNA fortynnet 1:100 i filtrert innsjøvann som \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR i 35 sykluser. Disse prøvene er representert som “1:100″.
PCB-elektrodene er fremstilt ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig lavpris Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) prosess uten behov for ekstra gullbelegg. ENIG PCB-elektrodespesifikasjoner er detaljert i vårt tidligere arbeid11.For ENIG PCB-elektroder, tradisjonelle elektroderengjøringsmetoder som f.eks. piranha-løsning eller svovelsyre syklisk voltammetri anbefales ikke, da de kan forårsake avskalling av det tynne gulllaget (tykkelse \(\ca\) \(100\,\hbox {nm }\)) og eksponere de underliggende kobberlagene som er utsatt for til korrosjon 21, 22, 23, 24, 25. Rengjør derfor elektrodene med en lofri klut fuktet med IPA. Prøven som skal testes ble inkubert med \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB i \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) for enkel innsetting. I vårt tidligere arbeid , vi observerte at følsomheten og lineariteten til sensoren ble forbedret ved å øke MB-konsentrasjonen 11 . Basert på optimaliseringer rapportert i vårt tidligere arbeid, brukte vi \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB konsentrasjoner for å bygge inn DNA i denne studien. Elektrokjemisk påvisning av dobbelttrådet DNA (ds-DNA) kan oppnås ved å bruke anioniske eller kationiske interkalatorer. Selv om anioniske interkalatorer oppdager DNA med bedre selektivitet, krever de inkubasjon over natten, noe som resulterer i lengre deteksjonstider. på den annen side krever kationiske interkalatorer som MB kortere inkubasjonstider, omtrent \({1}\,{\hbox {h}}\) for elektrokjemisk påvisning av ds-DNA6. Hver måling innebærer dispensering av prøven som skal testes på elektrode\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), deretter rengjøres med en IPA-fuktet fille, før du fortsetter med en ny prøve.én måling. Hver prøve ble testet på 5 forskjellige elektroder med mindre annet er angitt. DPV- og CV-målinger ble utført ved bruk av en PalmSens Sensit Smart potensiostat, og PSTrace-programvare ble brukt for potensiostatkonfigurasjon og datainnsamling, inkludert toppstrømberegninger. Følgende innstillinger er brukt. for DPV- og CV-målinger:
DPV: Likevektstid = \(8\,\hbox {s}\), spenningstrinn = \(3\,\hbox {mV}\), pulsspenning = \(25\,\hbox {mV}\) , pulsvarighet = \(50\,\hbox {ms}\), skannehastighet = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Likevektstid = \(8\,\hbox {s}\), spenningstrinn = \(3\,\hbox {mV}\), sveipehastighet = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Toppstrømmer oppnådd fra voltammogrammer av DNA kompleksisert med \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV- og CV-voltammogrammer ble oppnådd på ENIG PCB-elektroder \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB kompleksbundet med DNA (ved konsentrasjoner på 10–\({20}\,{\ hbox {ng) }/{\upmu \hbox {l}}}\) dvs. 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) for \(117\,\hbox {bp}\ ) og 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) for \(503\,\hbox {bp}\)).Representative voltammogrammer er vist i figur S1 i tilleggsinformasjon.Figur 2 viser resultatene av DPV- og CV-målinger (toppstrøm) ved bruk av gelrensede PCR-produkter. Sammenlignet med CV-målinger viser DPV-målinger høyere sensitivitet (strøm som funksjon av DNA-konsentrasjon) fordi de kapasitive bakgrunnsstrømmene i CV-målinger skjuler faradaiske strømmer 26 .Dataene for hver boks i boksplotten inneholder målinger fra 5 elektroder. Alle målinger bruker samme sett med elektroder for å unngå målefeil på grunn av elektrode-til-elektrode variasjon. Vi observerte en økende trend i DPV og CV målte toppstrømmer for lavere konsentrasjoner av DNA , lengre (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ sammenlignet med \(117) ) fragment. Dette er i samsvar med den forventede trenden for elektrodeadsorpsjon rapportert i vårt tidligere arbeid. adsorpsjon av MB-DNA-komplekset letter ladningsoverføringen på elektroden, noe som bidrar til økningen av toppstrømmen. Andre studier har vist effekten av oligonukleotidstørrelse og -sekvens på MB-DNA-interkalering27,28,29,30.Guaninen -cytosin (GC)-innholdet i de to amplikonene (\(117\,\hbox {bp}\) og \(503\,\hbox {bp}\))) var omtrent 50 %, noe som indikerer at observasjonen. Forskjellen skyldes til amplikonlengde.Men for høyere DNA-konsentrasjoner (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), for \(503\,\hbox {bp} \) og \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) for \(117\,\hbox {bp}\)), observerer vi to forsterkninger. toppstrømmene til subs reduseres i både DPV- og CV-målinger. Dette er fordi MB metter og interkalerer mellom basepar av DNA, noe som resulterer i sterisk hemming av redoksaktiviteten til den reduserbare gruppen i MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Salter som finnes i PCR-masterblandinger forstyrrer elektrostatiske interaksjoner mellom MB og DNA, så ved å legge til \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) med \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB gelrenset produkt for å studere effekten av salt på MB-DNA-interaksjon. Som vist i figur 3, observerte vi at for høyere DNA-konsentrasjoner (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) og \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) for \(117\,\hbox {bp} \)), i DPV og CV Tilsetningen av salt påvirket ikke målingene nevneverdig (se figur S2 i Tilleggsinformasjon for representative voltammogrammer).Men kl. lavere DNA-konsentrasjoner, reduserer tilsetning av salt følsomheten kraftig, noe som ikke resulterer i noen signifikant endring i strøm med DNA-konsentrasjon. Lignende negative effekter av salt på MB-DNA-interaksjoner og interkalering er tidligere rapportert av andre forskere33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) kationer binder seg til den negative fosfatryggraden i DNA, og hindrer derved den elektrostatiske interaksjonen mellom MB og DNA. Ved høyere DNA-konsentrasjoner resulterer sterisk inhibering av redoksaktive MB i lavere toppstrømmer, så elektrostatiske interaksjoner påvirker ikke sensorresponsen nevneverdig. Hovedpoenget er at denne biosensoren er bedre egnet til å oppdage høyere DNA-konsentrasjoner (sjelden \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) eller høyere), for helautomatisert behandling av miljøvannprøver, der gelrensing av PCR-produkter kanskje ikke er mulig.
Areal under absorpsjonskurven for bølgelengdeområdet 600–700 \(\hbox {nm}\) for ulike konsentrasjoner av DNA kompleksbundet med \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) med og uten salt (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) med og uten salt (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) DNA-konsentrasjoner som tilsvarer \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB-prøver Ingen DNA.
For ytterligere å bekrefte resultatene ovenfor utførte vi optiske målinger ved bruk av et UV/Vis-spektrofotometer (Thermo Scientific Multiskan GO), prøvene \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) ble brukt for hver Måling. Absorpsjonssignaturen avtar med økende DNA-konsentrasjon, som man kan se av trenden til området under absorpsjonskurven for bølgelengdeområdet \(600\,\hbox {nm}\) til \(700\,\hbox { nm}\), som vist i fig. 4 (absorpsjonsspektrum vist i fig. S3 i tilleggsinformasjon). For prøver med DNA-konsentrasjoner mindre enn \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), var det ingen signifikant forskjell i opptak mellom prøver som inneholder DNA og prøver som kun inneholder MB (for \(503\,\hbox {bp}\) og \(117\,\hbox {bp}\ ) lengdefragmenter), som indikerer fravær av sterisk hemming av redoksaktivt MB. Ved høyere DNA-konsentrasjoner observerte vi en gradvis reduksjon i absorbanssignalet og bemerket en mindre reduksjon i absorbans i nærvær av salt. Disse resultatene ble tilskrevet molekylært interaksjoner og sterisk inhibering med basestabling i DNA-hybrider. Resultatene våre samsvarer med rapporter i litteraturen om spektroskopiske studier av MB-DNA-interkalering som assosierer hypokromaticitet med reduserte energinivåer i \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) elektroniske overganger på grunn av interkalering Lag 36, 37, 38.
Agarosegelelektroforese av fag Phi6: PCR-produkter med lengde \(117\,\hbox {bp}\) og \(503\,\hbox {bp}\) fra innsjøvannsprøver.M-DNA-markør;NTC-no-template-kontroll, primere som inneholder tilsvarende amplikoner;PC positiv kontroll;1, 2, 3 ufortynnede (1:1) tilsatt innsjøvannprøver i tre eksemplarer. Et bånd er synlig ved \(\ca. 50\,\hbox {bp}\) på grunn av ubrukte oligonukleotider i \(503\,\ hbox {bp}\) kjørefelt.
Vi evaluerte nytten av sensoren ved å bruke Powai Lake-vannprøver tilsatt Phi6-fag. RNA-konsentrasjonene isolert fra fag-tilsatt vannprøver varierte fra 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), mens de isolert fra rensede fagsuspensjoner. RNA ble estimert til å være \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) med en utvinningseffektivitet på omtrent 1 %.RNA ble omvendt transkribert til cDNA og brukt som mal for PCR og qPCR. Produktstørrelsen ble bekreftet ved agarosegelelektroforese (figur 5) før testing med sensoren. Disse prøvene er ikke gelrenset og inneholder derfor alle PCR-komponentene som samt amplikonene av interesse. Ct-verdiene registrert under qPCR (tabell 1) ble vist å korrelere med konsentrasjonen av RNA isolert fra de tilsvarende tilsatt vannprøver. Ct-verdien avslører antall sykluser som kreves for at det fluorescerende signalet skal overskrider terskelen eller bakgrunnssignalet. Høyere Ct-verdier indikerer lavere malkonsentrasjoner og omvendt. Ct-verdiene til NTC-prøvene var så høye som forventet. Forskjellen i \(\ca. 3\) Ct-verdier mellom den positive kontrollen og testprøven indikerer videre at hver testprøve har omtrent 1 % mal sammenlignet med den positive kontrollen. Vi har tidligere diskutert at lengre amplikoner fører til bedre sensitivitet. Amplifisering av lengre fragmenter isolert fra heterogene miljøprøver er utfordrende gitt ulempene med lav viral konsentrasjon og RNA-nedbrytning. Med vår virusberikelse og PCR-amplifikasjonsprotokoll klarte vi imidlertid å amplifisere \(503\,\hbox {bp}\)-fragmentet for elektrokjemisk sensing.
Figur 6 viser de elektrokjemiske sensorresultatene til \(503\,\hbox {bp}\) fragmentamplikonet, både ved bruk av ufortynnet cDNA som mal (1:1) og 100 ganger fortynnet cDNA som mal (1:100 ) utført PCR , sammenlignet med NTC og PC (se figur S4 i tilleggsinformasjon for representative voltammogrammer). Hver boks i boksplotten i figur 6 inneholder målinger fra tre prøver på 5 elektroder. De samme elektrodene ble brukt til å måle alle prøver for å unngå feil på grunn av elektrode -til-elektrode-variasjon. Sammenlignet med CV-målinger viser DPV-målinger bedre oppløsning for å skille test- og PC-prøver fra NTC-er fordi, som tidligere nevnt, er faradaiske strømmer skjult på grunn av kapasitive bakgrunnsstrømmer i sistnevnte. For lengre amplikoner observerte vi at den negative kontrollen (NTC) resulterte i høyere CV- og DPV-toppstrømmer i forhold til den positive kontrollen, mens positive og ufortynnede testprøver viste lignende topphøyder for DPV-toppstrømmer. De målte gjennomsnitts- og medianverdiene for hver ufortynnet (1:1) ) testprøve og PC kan tydelig løses fra sensorutgangen for NTC-prøven, mens oppløsningen for den fortynnede prøven 1:100 er mindre uttalt. For en 100 gangers fortynning av cDNA observerte vi ingen bånd under gelelektroforese (baner ikke vist i figur 5), og de tilsvarende DPV- og CV-toppstrømmene var lik de som var forventet for NTC. Resultatene for \(117\,\hbox {bp}\)-fragmentet er vist i tilleggsinformasjon. Den negative kontroll induserte en elektrokjemisk respons fra PCB-sensoren på grunn av adsorpsjonen av fritt MB på elektroden og interaksjonen av MB med det enkelttrådede primer-oligonukleotidet. Derfor må hver gang en prøve testes, en negativ kontroll kjøres og toppstrøm av testprøven sammenlignet med toppstrøm oppnådd av den negative kontrollen for å oppnå en differensiell (relativ) måling39,40 for å klassifisere testprøven som positiv eller negativ.
(a) DPV og (b) CV toppstrøm for elektrokjemisk påvisning av \(503\,\hbox {bp}\) fragmenter i innsjøvannsprøver. Testprøver ble målt i tre eksemplarer og sammenlignet med ingen malkontroller (NTC) og positive kontroller (PC).
Funnene våre illustrerer forskjellige mekanismer som påvirker ytelsen til elektrokjemiske sensorer for amplikoner av forskjellig lengde for forskjellige DNA-er, med konsentrasjoner verifisert ved optiske målinger ved hjelp av et UV/Vis-spektrofotometer. Våre observasjoner understreker innsikten om at lengre DNA-fragmenter opp til \(\ca\) \(500\,\hbox {bp}\) kan påvises med høyere følsomhet og at tilstedeværelsen av salt i prøven ikke gjør Sensitivitet DNA-konsentrasjon som påvirker høyere sensitivitet (sjelden \({\hbox {ng}/{\upmu) \hbox {l}}}\) og over).I tillegg undersøkte vi effekten av ulike typer prøver, inkludert gelrensede amplikoner med og uten tilsatt salt, og tilsetning av innsjøvannsprøver i DPV- og CV-målinger.Vi observerte at DPV ga bedre oppløsning, siden den kapasitive bakgrunnsstrømmen også påvirker CV-målingen, noe som gjør den mindre følsom.
Amplifisering av lengre fragmenter avhenger av integriteten til det virale genomiske RNA. Flere studier har vist at amplifisering av lengre fragmenter ikke alltid er effektiv på grunn av nedbrytning av RNA i miljøet og potensialet for spleising under isolasjon11,41,42,43,44 .Vi observerte at den PEG-baserte viruskonsentrasjonsmetoden var mer effektiv til å konsentrere fag Phi-6 tilsatt i innsjøvannprøver enn den aluminiumhydroksidbaserte viruskonsentrasjonsmetoden. Evnen til å oppdage lange DNA-fragmenter viste seg å overvinne kravet til multipleks PCR for å forsterke flere maler med kortere lengde og redusere muligheten for kryssspesifisitet.
Biologiske prøver er knappe, så det er behov for å designe en biosensor som krever minimalt med prøver for testing. ENIG PCB-elektrodene som ble brukt i denne studien krevde bare \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) prøver for testing for å dekke det effektive området til elektrodene. I tillegg kan den samme elektroden gjenbrukes etter rengjøring før neste prøve dispenseres. Forsterkede prøver krever ikke tilsetning av andre kjemikalier enn metylenblått, som er rimelig og ofte brukt kjemikalie. Siden hver elektrode koster omtrent $ 0,55 (eller INR 40) å produsere, kan denne biosensoren være et kostnadseffektivt alternativ til eksisterende deteksjonsteknologier. Tabell 2 viser en sammenligning av dette arbeidet med andre sensorer som er rapportert i litteraturen i lang tid. DNA-fragmenter i heterogene prøver.
Gitt at MB-baserte elektrokjemiske deteksjonsprotokoller er avhengige av spesifisiteten til PCR, er en stor begrensning ved denne metoden potensialet for ikke-spesifikk amplifikasjon i heterogene prøver som avløpsvann og innsjøvann eller ved bruk av lavrenhetsprimere. For å forbedre sensitiviteten til elektrokjemiske deteksjonsmetoder for DNA-deteksjon av urensede PCR-produkter ved bruk av umodifiserte ENIG PCB-elektroder, er det nødvendig å bedre forstå feil introdusert av ubrukte dNTP-er og primere, og for å optimalisere reaksjonsbetingelser og analyseprotokoller. Ytterligere fysisk-kjemiske parametere som pH, temperatur og biologiske oksygenbehovet (BOD) for vannprøven må kanskje også måles for å forbedre målingens nøyaktighet.
Avslutningsvis foreslår vi en rimelig elektrokjemisk ENIG PCB-sensor for virusdeteksjon i miljøprøver (vannprøver). I motsetning til immobiliserte oligonukleotidelektroder eller tilpassede substrater for DNA-sensor som krever kryogen lagring for å opprettholde følsomheten,53,54 bruker vår teknikk umodifisert PCB elektroder med lengre holdbarhet og ingen spesifikke lagringskrav og derfor egnet for utvikling av måleløsninger med automatisert prøvebehandling utplassert i LMICs. Biosensoren bruker rimelige DNA-interkalerende redoksfargestoffer (MB) for rask deteksjon av målamplikoner. Den uspesifikke amplifikasjonen vanlig i miljøprøver reduserer spesifisiteten til denne sansemetoden på grunn av den uspesifikke bindingen av MB til enkelt- og dobbelttrådete oligonukleotider. Derfor avhenger spesifisiteten til denne testen av optimalisering av primere og PCR-reaksjonsbetingelser. og DPV toppstrømmer oppnådd fra de testede prøvene bør tolkes i forhold til responsene oppnådd fra den negative kontrollen (NTC) for hver test. De elektrokjemiske sensordesignene og metodene som presenteres i dette arbeidet kan integreres med autosamplere for å utvikle en helautomatisert og lav -kostnadsløsning som kan samle inn og analysere prøver og trådløst overføre resultater tilbake til laboratoriet.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Metoder for initial konsentrasjon av virus fra vannprøver: en gjennomgang og metaanalyse av nyere studier.J.Application.microorganism.115, s. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Vannbårne virus: Barrierer for trygt drikkevann. PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.Wastewater epidemiology for kostnadseffektiv storskala overvåking av COVID-19 i lav- og mellominntektsland: utfordringer og muligheter.Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Metylenblått som en elektrokjemisk diskriminator av enkelt- og dobbelttrådete oligonukleotider immobilisert på gullsubstrater.Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Sammenligning av kation- og anioninterkalatorer for elektrokjemisk transduksjon av DNA-hybridisering ved langdistanseelektronoverføring.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Ladningsoverføring gjennom DNA: en selektiv elektrokjemisk DNA-biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al. Sanntids PCR-mikrofluidisk enhet med samtidig elektrokjemisk deteksjon.biologisk sensor.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. Signalmekanismestudie og ytelsesverifisering av et elektrokjemisk sanntids PCR-system basert på interaksjonen av metylenblått med DNA.Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al. Sløyfemediert isotermisk amplifikasjonsbasert elektrokjemisk sensor for påvisning av sars-cov-2 i avløpsvannprøver.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al. Elektrokjemisk sensing av SARS-CoV-2-amplikoner med PCB-elektroder. Sensoren er aktivert.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Effektiv påvisning av SARS-CoV-2 RNA i den faste fraksjonen av avløpsvann.vitenskap.generelt miljø.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Analytical Methods for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Overlevelse av den innhyllede bakteriofagen Phi6 (et surrogat for SARS-CoV-2) i fordampede spyttdråper avsatt på glassoverflater.vitenskap.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Miljømessig persistens av et SARS-CoV-2-surrogat (Phi6) i frittlevende amøber.J.Vannhelse 20, 83 (2021).
Mindich, L. Nøyaktig pakking av tre genomiske fragmenter av dobbelttrådet RNA-bakteriofag\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149-160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Sekundær struktur av DH RNA-fagen\(\varphi\)6 pakkeregionen.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al. Phages on the Tap – En rask og effektiv protokoll for å lage laboratorielager av bakteriofager. PeerJ 4, e2261 (2016).
Innleggstid: 27. mai 2022