Misaotra anao nitsidika ny Nature.com. Ny kinova mpitety tranonkala ampiasainao dia manana fanohanana voafetra ho an'ny CSS. Mba hahazoana traikefa tsara indrindra, dia manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na vonoy ny fomba fampifanarahana amin'ny Internet Explorer). fanohizana fanohanana, dia hampiseho ny tranokala tsy misy fomba sy JavaScript.
Ny maha-zava-dehibe ny fanaraha-maso ny santionany momba ny tontolo iainana dia nankasitrahana tokoa hatramin'ny niandohan'ny valan'aretina COVID-19, ary ny ezaka fanaraha-maso sasany dia atao amin'ny fampiasana ny fenitra volamena, na dia lafo aza ny teknika mifototra amin'ny qPCR. Vahaolana amin'ny fanaraha-maso ny santionan'ny rano amin'ny tontolo iainana any amin'ny firenena ambany sy antonony. Amin'ity asa ity, dia asehontsika ny fitiliana electrochemical ny amplicons azo avy amin'ny Phi6 phage mitoka-monina avy amin'ny santionan'ny rano amin'ny farihy spiked (solon-tena malaza ho an'ny SARS-CoV-2), mampiasa ENIG hamita ny electrodes PCB tsy misy fanovana ambonin'ny.firaisana ara-nofo. Ny valin'ny sensor electrochemical dia nofaritana tsara ho an'ny sombiny ADN roa samy hafa ny halavany (\({117}\,\hbox {bp}\) sy \({503}\,\hbox {bp}\)), ary ny Ny vokatry ny sira ao amin'ny PCR master mixes amin'ny methylene blue (MB) -DNA interactions.Ny valiny dia mampiseho fa ny halavan'ny sombin-tsarin'ny ADN dia mamaritra ny fahatsapan'ny electrochemical ary mampiseho amin'ity asa ity fa ny fahaizana mamantatra amplicons lava tsy misy fanadiovana gel ny vokatra PCR dia zava-dehibe amin'ny fandrefesana santionany amin'ny rano.Vahaolana mandeha ho azy tanteraka ho an'ny viriosy mitondra entana tsara.
Ny fifindran'ny viriosy avy amin'ny rano dia fantatra ho loza ara-pahasalamana ho an'ny daholobe hatramin'ny taona 1940, miaraka amin'ny porofo voalohany amin'ny fifindran'ny lefakozatra amin'ny rano sy ny hepatita E1. Ny Fikambanana Iraisam-pirenena Momba ny Fahasalamana (OMS) dia nanasokajy ireo otrikaretina viraliny avy amin'ny rano izay manana lanjany ara-pahasalamana antonony ka hatramin'ny avo2.Virus nentim-paharazana Ny fomba fitiliana dia miankina amin'ny teknika mifototra amin'ny qPCR manara-penitra volamena, izay tena saro-pady sy manokana, saingy mitaky mpiasa mahay hanao fitiliana any amin'ny laboratoara mampiasa fitaovana lafo vidy. Ny fitiliana santionany dia azo atao laharam-pahamehana noho ny fanaraha-maso ny santionan'ny rano amin'ny tontolo iainana.Noho izany, ilaina ny fomba hafa lafo vidy ho an'ny fanaraha-maso maharitra sy ara-potoana ny rano sy ny rano maloto any amin'ny firenena ambany sy antonony ho fampitandremana mialoha ny firongatry ny aretina, ka miaro azy ireo amin'ny fiantraika ara-piarahamonina mahery vaika ateraky ny valan'aretina viriosy.Ny biosensor elektrokimia mora vidy ho an'ny asidra nokleika dia afaka manome vahaolana azo antoka ho an'ity filàna tsy voatanisa ity. miorim-paka sy mitambatra rehefa misy filaharana mifanandrify amin'ny santionany. Izany dia azo avadika ho famantarana amin'ny alalan'ny teknika electrochemical isan-karazany amin'ny fampiasana mpanelanelana redox toy ny vy potasioma / ferrocyanide. Ny manga methylene (MB) dia iray amin'ireo molekiola redox mavitrika, izay manana Voalaza fa nifamatotra tamin'ny ADN tady roa (dsDNA) ho fanampin'ny fatorana tsy voafaritra kokoa amin'ny ADN5,6. sensor configurations5,6,7,8,9. Na dia tsy voafaritra aza ny intercalation ny MB amin'ny ADN, ary ny maha-tokana an'ity sensor electrochemical ity dia miankina betsaka amin'ny fahadiovan'ny primers ampiasaina amin'ny PCR na isothermal amplification, dia mety tsara amin'ny fampiharana ny tena izy. -time electrochemical-based qPCR na fluorescence isothermal amplification ho solon'ny fandrefesana ny ADN 9 . Ao anatin'ny fampiharana iray toy izany, Won et al. Ny elektrôda volamena dia novaina tamin'ny 6-mercapto-1-hexanol (MCH) ho an'ny tena fotoana. fandrefesana ny amplicons PCR miaraka amin'ny MB mampiasa differential pulse voltammetry (DPV)9. Amin'ny tranga hafa, Ramirez et al.Ny fahitana ny SARS-CoV-2 amin'ny rano maloto amin'ny alàlan'ny RT-LAMP dia mampiasa MB miaraka amin'ny electrodes vita printy. ampiasaina toy ny in situ electrodes ao amin'ny microfluidic PCR sehatra natao mba electrochemically mamantatra amplicons mandritra ny fanehoan-kevitra 8. Ireo fandinihana rehetra ireo dia mitaky fanovana ambonin'ny ny electrodes, midika fa mitombo ny famokarana sy ny vola lany noho ny fitahirizana manokana fepetra takiana ho an'ny fahamarinan-toerana ireo electrodes functionalized.
Schematic ny workflow ho an'ny electrochemical detection ny amplicons azo avy amin'ny poti viriosy mivondrona ao amin'ny farihy santionany.
Vao haingana izahay no naneho ny fahatsapana elektrokimia an'ny amplicons SARS-CoV-2 miaraka amin'ny elektrôda elektronika vita pirinty (PCB) mora vidy mifototra amin'ny DPV sy voltammetry cyclic (CV) ateraky ny adsorption ny komples MB-DNA eo amin'ny tontolon'ny electrodes tsy voaova) ankehitriny11.Notaterinay fa ny sombintsombiny ADN lava kokoa (N1-N2, \({943}\, \hbox) niforona tamin'ny fampiasana ny N1 natolotry ny CDC sy ny N2 reverse primers raha oharina amin'ny sombiny fohy kokoa {bp} \)) dia nampiseho tsipika tsara kokoa amin'ny valin'ny sensor. (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) niforona tamin'ny fampiasana ny N1 mandroso sy ny N1 reverse primer sets. Ireo fanadihadiana ireo dia voalaza amin'ny fampiasana ny dilution ADN voaomana amin'ny rano tsy misy nokleary. Nampiasaina ihany koa ny sehatra hamantarana ny SARS-CoV -2 amplicons amin'ny santionan'ny rano maloto simulates (azo amin'ny alàlan'ny spiking total santionany RNA miaraka amin'ny SARS-CoV-2 RNA). Satria ny RNA dia mora simba mandritra ny fitokana-monina sy ny fanodinana ambany, 12,13 dia sarotra ny manamafy ny sombiny lava kokoa miaraka amin'ity santionany heterogène ity. Noho izany, ny fanehoana ny fahatsapana electrochemical an'ny SARS-CoV-2 amplicon amin'ny rano maloto dia voafetra amin'ny ampahany kely kokoa \(72\,\hbox {bp}\) N1.
Tao anatin'ity asa ity dia nanadihady ny fahafahan'ny ENIG PCB mifototra amin'ny electrochemical sensing ny phage Phi6 mifantoka sy mitoka-monina avy amin'ny farihy santionany rano (sary 1). manana membrane lipida sy proteinina spike.Noho ireo antony ireo, ny bacteriophage Phi6 dia mpisolo toerana malaza ho an'ny SARS-CoV-2 sy ireo viriosy RNA pathogenic hafa voarakotra14,15. PCR hahazoana sombiny ADN roa misy tsiroaroa fototra 117 sy 503 ny halavany. Noho ny fanamby amin'ny fampitomboana ny sombiny \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 tamin'ny asantsika teo aloha, dia lasibatra ny sombin-dava manelanelana (\(117) \,\hbox {bp}\) sy \(503 \,\hbox {bp}\)), mifototra amin'ny primers misy. \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) mankany \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) ho an'ireo sombiny ao amin'ny Ny fisian'ny MB, ny fiantraikan'ny sira amin'ny valin'ny sensor dia voamarika ary voamarina amin'ny alàlan'ny fandrefesana spectrophotometric. Ny fandraisan'anjaran'ity asa ity dia toy izao manaraka izao:
Ny halavan'ny sombintsombiny ADN sy ny fisian'ny sira ao anatin'ilay santionany dia misy fiantraikany mafy amin'ny fahatsapan-tena.Ny vokatra azonay dia mampiseho fa ny hetsika electrochemical dia miankina amin'ny mekanika samihafa amin'ny fifandraisan'ny MB, ADN, ary ny sensor amin'ny valin'ny voltammetric, miankina amin'ny fifantohan'ny ADN sy ny halavany, miaraka amin'ny Fragments lava kokoa dia mampiseho fahatsapana ambony kokoa, na dia misy fiantraikany ratsy amin'ny fifandraisana elektrostatika aza ny sira. MB sy ADN.
Ny fifantohana ADN dia mamaritra ny fomba fiasan'ny fifandraisana MB-ADN amin'ny electrodes tsy voaova Asehontsika fa miankina amin'ny fifantohana ADN ny mekanika samihafa amin'ny fifandraisana MB-ADN. {l}}}\), dia nanamarika izahay fa ny valin'ny electrochemical amin'izao fotoana izao dia voafaritra indrindra amin'ny adsorption ny MB-DNA eo amin'ny electrode, raha amin'ny ambany concentrations Amin'ny ADN avo concentrations, ny electrochemical valin'ny ankehitriny dia voafaritra amin'ny alalan'ny steric inhibition ny redox. hetsika noho ny fampidirana MB eo anelanelan'ny mpivady fototra ADN.
ENIG PCB-Based Electrochemical Sensing of Viral Nucleic Acid in Lake Water Samples Ny fandinihana dia nohamarinina tamin'ny alalan'ny electrochemical detection of Phi6-added \(503\,\hbox {bp}\) sombiny ADN azo avy amin'ny santionany rano avy amin'ny Powai Lake, IIT Mumbai Campus Vokatra phage.
Vidin'ny fampiharana sy mety hampidirana azy amin'ny rafitra fanaraha-maso mandeha ho azy tanteraka, oligonucleotides na aptamers amin'ny electrodes manana fiainana lava kokoa.
Phage Phi6 dia otrik'aretina dsRNA voafono ao amin'ny fianakaviana Cytoviridae izay mamindra ny Pseudomonas syringae. Ny fototarazon'ny Phi6 phage dia misy amin'ny endrika 3 sombiny: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07). \,\hbox {Kb}\)) ary L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Koa satria ny Phi6 phage dia voan'ny tsindrona BSL-1 Pseudomonas tsy misy pathogen, dia azo antoka ny fampiasana azy. ary azo ambolena mora foana ao amin'ny laboratoara.Phage Phi6 sy Pseudomonas syringae mpampiantrano azy dia novidina tao amin'ny Felix d'Herelle Reference Center for Bacterial Viruses, Laval University, Canada (ny laharan'ny katalaogy foibe dia HER-102 sy HER-1102, tsirairay avy) .Phi6 phage sy ny mpampiantrano azy dia novelomina araka ny toromarika avy amin'ny foibe reference.Phage Phi6 dia nodiovina tamin'ny alalan'ny plate lysis sy ny elution mba hahazoana titer farany amin'ny \(\ eo amin'ny 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (fikambanana mamorona takela-by/ milliliter). Notokanana tamin'ny poti- phage voadio tamin'ny alalan'ny GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) ny ARN araka ny torolalan'ny mpanamboatra. Fohy ny fampiatoana phage Phi6 voadio\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) dia nopotehina ary ny lysate dia napetaka teo amin'ny tsanganana spine mba ahafahan'ny RNA mifatotra amin'ny tsanganana resin. 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) nomen'ny kit. Tombantombana ny fitanan'ny RNA amin'ny alàlan'ny absorbance amin'ny \(260\,\hbox {nm}\). ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) mandra-pampiasaina bebe kokoa.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Ny Kit Synthesis cDNA iScript (Bio -Rad Laboratories) dia nampiasaina ho modely amin'ny synthesis cDNA manaraka ny torolalan'ny mpanamboatra. Raha fohifohy dia misy dingana 3 ny fanehoan-kevitra momba ny synthesis cDNA: priming amin'ny \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , fandikana mifamadika amin'ny \({20}\,{\hbox {min}}\) amin'ny \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), ary mifamadika Ny mpitam-peo dia ao amin'ny \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) ho an'ny \({1}\,{\hbox {min }}\).Rehefa mihazakazaka amin'ny gel agarose 1%, ny cDNA dia nampiseho tarika telo mifanaraka amin'ny sombintsombin'ny ARN telo andrasana (tsy hita ny angon-drakitra). Ireto primer manaraka ireto dia nampiasaina mba hanamafisana ny ampahany roa amin'ny ADN amin'ny 117 sy 503 bp ny halavany, mampiasa cDNA ho maodely ho an'ny PCR amin'ny cycler thermal miniPCR® mini8:
Ny primers ho an'ny \(117\,\hbox {bp}\) sy \(503\,\hbox {bp}\) dia mifanitsy amin'ny nucleotides 1476-1575 amin'ny fizarana M ary ny nucleotides 458-943 amin'ny fizarana L, tsirairay avy amin'ny asidra. .Ny vokatra PCR nampitomboina rehetra dia nodiovina tamin'ny gel 1% agarose, ary nodiovina tamin'ny fampiasana ny GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
Farihy iray ao amin'ny tobim-pianarana IIT Mumbai (Farihy Powai, Powai, Mumbai) no nampiasaina mba hampidirana poti-phage. Nosivanina tamin'ny alalan'ny membrane \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) ny ranon'ny farihy mba hanesorana. potikely mihantona, ary nampiana Phi6 phage. Ampio \({1}\,{\hbox {ml}}\) ny \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) mankany \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) rano farihy voasivana, ao amin'ny \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). natokana ho an'ny fandrefesana ny viriosy amin'ny alàlan'ny fandrefesana takelaka. Nanandrana fomba roa samy hafa izahay mba hampifantohana ireo poti-tsimok'aretina Phi6: (1) ny fomba fandoroana ny rotsak'orana hydroxide aluminium, 19 izay nohamarinina ho an'ny fifantohan'ny viriosy RNA voafono maromaro avy amin'ny santionany momba ny tontolo iainana, ary (2) ) Ny fomba fifantohana amin'ny viriosy mifototra amin'ny polyethylene glycol (PEG) dia namboarina avy amin'ny Flood et al.20 . Koa satria ny fahombiazan'ny fanarenana ny fomba mifototra amin'ny PEG dia hita fa tsara kokoa noho ny an'ny fomba aluminium hydroxide, ny fomba mifototra amin'ny PEG dia nampiasaina mba hampifantohana ny singa Phi6 avy amin'ny santionan'ny rano amin'ny farihy.
Ny fomba PEG nampiasaina dia toy izao manaraka izao: PEG 8000 sy \(\hbox {NaCl}\) dia nampiana santionan'ny rano amin'ny farihy Phi6-spiked mba hahazoana 8 % PEG 8000 sy \ (0.2 \, \ hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Ny santionany dia natsipy tao anaty shaker\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), avy eo atao centrifuge ao amin'ny \(4700 \,\hbox {g}\) dia \({45}\,{\hbox {min}}\).Ariana ny supernatant ary avereno averina ny pellet ao amin'ny \({1}\, {\hbox {ml}}\) ao anatin'ny supernatant iray ihany.Ny andrana rehetra momba ny spiking sy viriosy dia natao tamin'ny triplicate. Taorian'ny fifantohana dia nisy aliquot kely natokana ho an'ny fandrefesana ny fahombiazan'ny fanarenana amin'ny alàlan'ny assay plaque. ao amin'ny buffer elution omen'ny kitapo\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\).Satria miovaova ny fifantohan'ny RNA isaky ny santionany amin'ny santionany amin'ny triplicate, ny \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) an'ny RNA dia ampiasaina ho an'ny telo na inona na inona fifantohana ny cDNA synthesis ny santionany.cDNA synthesis dia natao araka ny voalaza teo aloha.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA nampiasaina ho maodely ho an'ny \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR ho an'ny tsingerina 35 mba hanamafisana ny \ (117\,\hbox {bp}\) sy \(503\,\hbox { bp}\) sombintsombiny. Ireo santionany ireo dia aseho ho "1: 1", izany hoe tsy misy dilution. Nisy fanaraha-maso tsy misy template (NTC) napetraka ho fanaraha-maso ratsy, raha ny cDNA novolavolaina tamin'ny alàlan'ny ARN natokana tamin'ny phage voadio dia napetraka. ho modely ho an'ny fanaraha-maso tsara (PC). Quantitative PCR (qPCR) dia natao tamin'ny fitaovana Stratagene Mx3000P RT-PCR tamin'ny fampiasana Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Nosoratana ho an'ny santionany rehetra ny fetran'ny tsingerina (Ct). Ankoatra izany, ny santionany voadio dia \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) amin'ny fampiasana cDNA voadio 1: 100 amin'ny rano farihy voasivana toy ny \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR ho an'ny tsingerina 35. Ireo santionany ireo dia aseho ho “1:100″.
Ny electrodes PCB dia noforonina amin'ny fampiasana ny vidin'ny vidiny ambany Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) dingana tsy mila fanampiny plating volamena. ENIG PCB electrode specifications dia amin'ny antsipiriany ao amin'ny asa teo aloha11.Ho an'ny ENIG PCB electrodes, nentim-paharazana electrode fomba fanadiovana toy ny Tsy soso-kevitra ny vahaolana piranha na asidra sulfuric cyclic voltammetry satria mety hiteraka fanonganana ny sosona volamena manify (haavony \(\approx\) \(100\,\hbox {nm }\)) ary hampiharihary ny sosona varahina ambanin'ny tany izay mora simba. amin'ny harafesina 21, 22, 23, 24, 25. Noho izany, diovy ny electrodes amin'ny lamba tsy misy lint nohamasinina tamin'ny IPA. Ny santionany hotsapaina dia natsipy tamin'ny \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB amin'ny \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) ho mora ampidirina. Ao amin'ny asantsika teo aloha , dia nahatsikaritra fa ny fahatsapana sy ny linearity ny sensor dia nohatsaraina tamin'ny fampitomboana ny MB concentration 11 . Miorina amin'ny optimizations notaterina tamin'ny asa teo aloha, dia nampiasa \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB Ny fifantohana amin'ny fampidirana ADN amin'ity fandalinana ity.Ny fitiliana electrochemical ny ADN miendrika roa (ds-DNA) dia azo atao amin'ny alàlan'ny intercalator anionika na kationika. Amin'ny lafiny iray, ny intercalators cationic toy ny MB dia mitaky fotoana fohy kokoa, eo amin'ny \({1}\,{\hbox {h}}\) ho an'ny fitiliana electrochemical ny ds-DNA6. Ny fandrefesana tsirairay dia misy ny famoahana ny santionany hotsapaina amin'ny electrode\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), dia diovy amin'ny lamba mando IPA, alohan'ny hirosoana amin'ny santionany hafa.fandrefesana iray. Ny santionany tsirairay dia nosedraina tamin'ny electrodes 5 samy hafa raha tsy misy filazana hafa. Ny fandrefesana DPV sy CV dia natao tamin'ny fampiasana PalmSens Sensit Smart potentiostat, ary ny rindrambaiko PSTrace dia nampiasaina ho an'ny fikirakirana potentiostat sy ny fahazoana angon-drakitra, anisan'izany ny kajy amin'izao fotoana izao. ho an'ny fandrefesana DPV sy CV:
DPV: Fotoan'ny equilibrium = \(8\,\hbox {s}\), Dingana Volavotra = \(3\,\hbox {mV}\), Volavolan'ny Pulse = \(25\,\hbox {mV}\) , faharetan'ny pulse = \(50\,\hbox {ms}\), tahan'ny scan = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Ora equilibrium = \(8\,\hbox {s}\), Voltage Step = \(3\,\hbox {mV}\), Hafafafa = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
Ny rivo-mahery azo avy amin'ny voltammograms amin'ny ADN complexed amin'ny \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV sy CV voltammograms dia azo tamin'ny ENIG PCB electrodes \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB complexed amin'ny ADN (amin'ny concentrations ny 10-\({20}\,{\ hbox {ng). }/{\upmu \hbox {l}}}\) izany hoe 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) ho an'ny \(117\,\hbox {bp}\ ) sy 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) ho an'ny \(503\,\hbox {bp}\)).Ny voltammograms solontena dia aseho amin'ny sary S1 amin'ny fampahalalana fanampiny.Ny sary 2 dia mampiseho ny valiny ny fandrefesana DPV sy CV (current peak) mampiasa vokatra PCR voadio gel. Raha oharina amin'ny fandrefesana CV, ny fandrefesana DPV dia mampiseho fahatsapan-tena ambony kokoa (ankehitriny ho asan'ny fifantohana ADN) satria manafina ny korianan'ny Faradaic ny tondra-drano amin'ny fandrefesana CV. ho an'ny boaty tsirairay ao amin'ny boxplot dia misy fandrefesana avy amin'ny electrodes 5. Ny fandrefesana rehetra dia mampiasa elektrôda mitovy amin'izany mba hisorohana ny fahadisoana fandrefesana noho ny fiovaovan'ny electrode-to-electrode. Hitanay ny fitomboan'ny fironana amin'ny DPV sy ny CV refesina ny tampon'isa avo kokoa noho ny fihenan'ny ADN. , lava kokoa (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ raha ampitahaina amin'ny \(117) ) sombiny. Izany dia mifanaraka amin'ny fironana andrasana amin'ny electrode adsorption voalaza ao amin'ny asantsika teo aloha. Ny adsorption ny MB-DNA complex dia manamora ny famindrana fiampangana eo amin'ny electrode, izay manampy amin'ny fitomboan'ny tampon'izao fotoana izao.Ny fikarohana hafa dia naneho ny fiantraikan'ny haben'ny oligonucleotide sy ny filaharan'ny MB-DNA intercalation27,28,29,30. Ny guanine -cytosine (GC) afa-po amin'ny amplicons roa (\(117\,\hbox {bp}\) sy \(503\,\hbox {bp}\)) dia eo amin'ny 50% eo ho eo, izay manondro fa ny fandinihana dia noho ny tsy fitoviana. amin'ny halavan'ny amplicon.Na izany aza, ho an'ny fatran'ny ADN ambony kokoa (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), ho an'ny \(503\,\hbox {bp} \) ary \( >{10}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ho an'ny \(117\,\hbox {bp}\)), dia mahita fanamafisam-peo roa isika. Ny tampon'ny rivotry ny subs dia mihena amin'ny fandrefesana DPV sy CV. Izany dia satria ny MB dia mahavoky sy mifamatotra eo amin'ny mpivady fototra amin'ny ADN, ka miteraka fanakanana ny asan'ny redox amin'ny vondrona reducible ao amin'ny MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Ny sira misy ao amin'ny PCR master mixes dia manelingelina ny fifandraisan'ny elektrôstatika eo amin'ny MB sy ny ADN, ka amin'ny fampidirana \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) amin'ny \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB vokatra voadio amin'ny gel mba hianarana ny fiantraikan'ny sira amin'ny fifandraisana MB-ADN.Araka ny aseho amin'ny sary 3, dia hitanay fa ho an'ny fifantohana ADN ambony kokoa (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) ary \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) ho an'ny \(117\,\hbox {bp} \)), ao amin'ny DPV sy CV Ny fanampiana sira dia tsy nisy fiantraikany lehibe tamin'ny fandrefesana (jereo ny sary S2 amin'ny fampahalalana fanampiny ho an'ny voltammograms solontena). ambany kokoa ny tahan'ny ADN, ny fanampiana sira dia mampihena be ny fahatsapana, ka tsy miteraka fiovana lehibe amin'izao fotoana izao miaraka amin'ny ADN. Ny fiantraikany ratsy amin'ny sira amin'ny fifandraisana MB-DNA sy ny intercalation dia efa notaterin'ny mpikaroka hafa taloha33,34.\(\hbox { Ny kation Mg}^{2+}\) dia mifamatotra amin'ny hazondamosin'ny phosphate négatif an'ny ADN, ka manakana ny fifandraisan'ny elektrôstatika eo amin'ny MB sy ny ADN. Amin'ny fatran'ny ADN ambony kokoa, ny fanakanana sterika amin'ny MB redox-active dia miteraka riaka ambany kokoa, noho izany ny fifandraisana elektrostatika. Tsy misy fiantraikany lehibe amin'ny valin'ny sensor. Ny teboka manan-danja dia ity biosensor ity dia mety tsara kokoa hamantarana ny fatran'ny ADN ambony kokoa (mahalana \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) na ambony kokoa), ho an'ny fanodinana tanteraka ny santionan'ny rano amin'ny tontolo iainana, izay mety tsy ho azo atao ny fanadiovana gel ny vokatra PCR.
Faritra eo ambanin'ny curve absorption ho an'ny halavan'ny onjam-peo 600–700 \(\hbox {nm}\) ho an'ny fifantohana isan-karazany amin'ny ADN mitambatra amin'ny \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) misy sira sy tsy misy sira (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) misy sira sy tsy misy sira (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) ADN mifanitsy amin'ny \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB santionany Tsy misy ADN.
Mba hanamarinana bebe kokoa ny valiny etsy ambony, dia nanao fandrefesana optika tamin'ny alàlan'ny spectrophotometer UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), ny santionany \({50}\, {{\upmu \hbox {l}}}\) dia nampiasaina ho an'ny tsirairay. Fandrefesana.Mihena ny sonian'ny absorption miaraka amin'ny fitomboan'ny ADN, araka ny hita amin'ny fironan'ny faritra eo ambanin'ny curve absorption ho an'ny halavan'ny onjam-peo \(600\,\hbox {nm}\) mankany \(700\,\hbox { nm}\) , araka ny aseho amin'ny sary 4 (spectum absorption aseho amin'ny sary S3 amin'ny fampahalalana fanampiny). {l}}}\), tsy nisy fahasamihafana lehibe teo amin'ny fandraisana ny santionany misy ADN sy MB ihany (ho an'ny \(503\,\hbox {bp}\) sy \(117\,\hbox {bp}\ ) sombintsombin'ny halavany), izay manondro ny tsy fisian'ny steric inhibition ny redox-active MB.Amin'ny ADN avo lenta kokoa, dia nahita ny fihenan'ny tsikelikely ny absorbance famantarana ary nanamarika ny fihenan'ny kely kokoa ny absorbance eo anatrehan'ny sira. Ny valiny dia mifanaraka amin'ny tatitra ao amin'ny literatiora momba ny fandalinana spectroscopy momba ny intercalation MB-DNA izay mampifandray ny hypochromaticity amin'ny fihenan'ny angovo ao amin'ny \(\pi\)-\(\pi ^*\ ) fifindrana elektronika noho ny fifanelanelanana Layers 36, 37, 38.
Electrophoresis gel agarose amin'ny phage Phi6: vokatra PCR amin'ny halavany \(117\,\hbox {bp}\) sy \(503\,\hbox {bp}\) avy amin'ny santionan'ny rano amin'ny farihy.M-DNA marika;NTC-tsy misy-template fanaraha-maso, primers misy mifanaraka amplicons;PC fanaraha-maso tsara;1, 2, 3-tsy voadio (1: 1) santionany rano amin'ny farihy telo sosona. Misy tarika hita ao amin'ny \(\eo amin'ny 50\,\hbox {bp}\) noho ny oligonucleotides tsy ampiasaina ao amin'ny \(503\,\ hbox {bp}\) lalana.
Nodinihinay ny fampiasana ny sensor amin'ny alàlan'ny santionan'ny rano ao amin'ny Farihin'i Powai mipetaka amin'ny Phi6 phage. ml}}\), raha mitoka-monina amin'ny fampiatoana ny phage voadio Ny RNA dia tombanana ho \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) miaraka amin'ny fahombiazan'ny fanarenana eo amin'ny 1 eo ho eo. %RNA dia navadika ho cDNA ary nampiasaina ho lasitra ho an'ny PCR sy qPCR. Ny haben'ny vokatra dia nohamafisin'ny electrophoresis gel agarose (sary 5) alohan'ny hanaovana fitiliana amin'ny sensor. Ireo santionany ireo dia tsy voadio gel ary noho izany dia misy ny singa PCR rehetra Ny sanda Ct voarakitra nandritra ny qPCR (Table 1) dia hita fa mifandray amin'ny fifantohan'ny RNA mitoka-monina avy amin'ireo santionan'ny rano mipoitra mifanaraka amin'izany. mihoatra ny tokonam-baravarana. Ny fanaraha-maso tsara sy ny santionan'ny fitsapana dia manondro fa ny santionan'ny fitsapana tsirairay dia manana môdely 1% eo ho eo raha oharina amin'ny fanaraha-maso tsara. Efa niresaka teo aloha izahay fa ny amplicons lava kokoa dia mitarika ho amin'ny fahatsapana tsara kokoa. ny fatran'ny viriosy ambany sy ny fahasimban'ny RNA. Na izany aza, tamin'ny fampitomboana ny viriosy sy ny protocol amplification PCR, dia afaka nanamafy tamim-pahombiazana ny sombiny \(503\,\hbox {bp}\) izahay ho an'ny fahatsapana electrochemical.
Ny sary 6 dia mampiseho ny valin'ny sensor electrochemical amin'ny amplicon fragment \(503\,\hbox {bp}\), izay samy mampiasa cDNA tsy misy fangarony ho lasitra (1:1) sy cDNA mivalona 100 ho lasitra (1:100) manao PCR , raha oharina amin'ny NTC sy ny PC (jereo ny sary S4 amin'ny fampahalalana fanampiny ho an'ny voltammograms solontena). -to-electrode variation. Raha ampitahaina amin'ny fandrefesana CV, ny fandrefesana DPV dia mampiseho vahaolana tsara kokoa hanavahana ny fitsapana sy ny santionany amin'ny PC amin'ny NTC satria, araka ny voalaza teo aloha, dia miafina ny onjan'ny Faradaic noho ny tondra-drano capacitive any aoriana. Ho an'ny amplicons lava kokoa, dia hitanay fa Ny fanaraha-maso ratsy (NTC) dia nahatonga ny fiakaran'ny CV sy ny DPV avo kokoa raha oharina amin'ny fanaraha-maso tsara, fa ny santionan'ny fitsapana tsara sy tsy misy dikany dia mampiseho ny haavon'ny tampon'ny DPV avo indrindra. ) Ny santionan'ny fitsapana sy ny PC dia azo alaina mazava tsara amin'ny famoahana sensor ho an'ny santionan'ny NTC, raha toa kosa ny fanapahan-kevitra ho an'ny santionany 1: 100 voadio dia tsy dia voatonona loatra. (lalana tsy hita ao amin'ny sary 5), ary ny DPV sy ny CV tampon'isan'ny tondra-drano dia mitovy amin'ny andrasana ho an'ny NTC. Ny fanaraha-maso dia nahatonga valiny electrochemical avy amin'ny sensor PCB noho ny adsorption ny MB maimaim-poana amin'ny electrode sy ny fifandraisan'ny MB amin'ny oligonucleotide primer tokana tokana. tampon'isan'ny santionany fitsapana raha oharina amin'ny tampon'isan'ny azo avy amin'ny fanaraha-maso ratsy mba hanatrarana differential (havana) refy39,40 hanasokajiana ny fitsapana santionany ho tsara na ratsy.
(a) DPV, ary (b) CV tampon'isa ankehitriny ho an'ny electrochemical detection ny \(503\,\hbox {bp}\) sombiny ao amin'ny farihy santionany rano. fanaraha-maso tsara (PC).
Ny fikarohanay dia mampiseho mekanika isan-karazany misy fiantraikany amin'ny fahombiazan'ny sensor electrochemical ho an'ny amplicons amin'ny halavany samihafa ho an'ny ADN samihafa, miaraka amin'ny fifantohana voamarina amin'ny fandrefesana optika amin'ny fampiasana spectrophotometer UV/Vis. \(500\,\hbox {bp}\) dia azo tsikaritra amin'ny fahatsapana ambony kokoa ary ny fisian'ny sira ao amin'ny santionany dia tsy misy fiantraikany amin'ny fahatsapan'ny ADN izay misy fiantraikany amin'ny fahatsapana avo kokoa (mahalana \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) sy ambony). Fanampin'izany, dia nanadihady ny vokatry ny karazana santionany izahay, anisan'izany ny amplicons voadio amin'ny gel miaraka amin'ny sira sy tsy misy sira, ary ny fanampin'ny santionan'ny rano amin'ny farihy amin'ny fandrefesana DPV sy CV.Hitanay fa nanome vahaolana tsara kokoa ny DPV, satria misy fiantraikany amin'ny fandrefesana CV ihany koa ny capacitive capacitive background, ka mahatonga azy tsy ho saro-pady.
Ny fampitomboana ny sombintsombiny lava kokoa dia miankina amin'ny fahamendrehan'ny RNA génomika viriosy. Maro ny fanadihadiana no naneho fa tsy mahomby foana ny fanamafisana ny sombintsombiny lava kokoa noho ny fahasimban'ny RNA ao amin'ny tontolo iainana sy ny mety hisian'ny splicing mandritra ny fitokana-monina11,41,42,43,44 .Hitanay fa ny fomba fifantohana viriosy mifototra amin'ny PEG dia mahomby kokoa amin'ny fifantohana ny phage Phi-6 mipoitra amin'ny santionan'ny rano amin'ny farihy noho ny fomba fametahana viriosy miorina amin'ny hydroxide aluminium. mba hanamafisana ireo maodely lava fohy kokoa sy hampihenana ny mety hisian'ny cross-specific.
Vitsy ny santionany biolojika, noho izany dia ilaina ny mamolavola biosensor izay mitaky santionany kely indrindra amin'ny fitsapana. Ny electrodes ENIG PCB ampiasaina amin'ity fandalinana ity dia tsy mila \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) santionany ho an'ny fitsapana mba handrakotra ny faritra mahomby amin'ny electrodes. Fanampin'izany, ny electrode mitovy dia azo ampiasaina indray aorian'ny fanadiovana alohan'ny famoahana ny santionany manaraka. Ny santionany amplified dia tsy mitaky ny fanampiana simika hafa ankoatra ny methylene manga, izay tsy lafo. Satria ny electrode tsirairay dia mitentina eo amin'ny $0.55 (na INR 40) hanamboarana azy, ity biosensor ity dia mety ho safidy lafo vidy amin'ny teknolojia fitiliana efa misy. Ny tabilao 2 dia mampiseho fampitahana ity asa ity amin'ny sensor hafa voalaza ao amin'ny literatiora nandritra ny fotoana ela. ADN amin'ny santionany heterogène.
Raha jerena fa ny protocole fitiliana electrochemical mifototra amin'ny MB dia miankina amin'ny maha-tokana ny PCR, ny fetra lehibe amin'ity fomba ity dia ny mety hisian'ny fanamafisana tsy voafaritra amin'ny santionany heterogène toy ny rano maloto sy ny rano amin'ny farihy na ny fampiasana primers madio. fomba fitiliana elektrokimia ho an'ny fitiliana ADN ny vokatra PCR tsy voadio amin'ny alàlan'ny electrodes ENIG PCB tsy voaova, ilaina ny mahatakatra tsara kokoa ny lesoka nampidirin'ny dNTP sy ny primer tsy ampiasaina, ary ny fanatsarana ny toetry ny fanehoan-kevitra sy ny protocols assay. Ny fangatahana oksizenina (BOD) amin'ny santionan'ny rano dia mety mila refesina koa mba hanatsarana ny fahamarinan'ny fandrefesana.
Ho fehin-kevitra, manolotra sensor elektronika ENIG PCB mora vidy izahay ho an'ny fitiliana otrikaretina amin'ny santionany (rano farihy). electrodes manana fiainana talantalana lava kokoa ary tsy misy fepetra fitahirizana manokana ary noho izany dia mety amin'ny famolavolana vahaolana fandrefesana miaraka amin'ny fanodinana santionany mandeha ho azy napetraka ao amin'ny LMIC. mahazatra amin'ny santionany amin'ny tontolo iainana dia mampihena ny maha-tokana an'ity fomba fahatsapana ity noho ny fatoran'ny MB tsy voafaritra amin'ny oligonucleotides tokana sy roa. ary ny tondra-drano avoakan'ny DPV azo avy amin'ireo santionany voasedra dia tokony hadika raha oharina amin'ny valiny azo avy amin'ny fanaraha-maso ratsy (NTC) ho an'ny fitsapana tsirairay. - Vahaolana afaka manangona sy manadihady santionany ary mampita ny valiny any amin'ny laboratoara an-tariby.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Fomba ho an'ny fifantohana voalohany amin'ny viriosy avy amin'ny santionan'ny rano: famerenana sy meta-fanadihadiana momba ny fandalinana vao haingana.J.Application.microorganism.115, pp. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Waterborne viruses: Sakana amin'ny rano fisotro madio.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Epidemiolojia momba ny rano maloto ho an'ny fanaraha-maso lehibe amin'ny vidiny mirary ny COVID-19 any amin'ny firenena ambany sy antonony: fanamby sy fahafahana. Rano 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylene manga ho toy ny fanavakavahana elektrokimia amin'ny oligonucleotides tokana sy indroa tsy mihetsika amin'ny substrate volamena. Analyst 126, 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparison of Cation and Anion Intercalators for Electrochemical Transduction of DNA Hybridization by Long-Range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Famindrana fiampangana amin'ny alàlan'ny ADN: biosensor.anus.Chemical.78, 2138-2144 (2006).
Fang, TH et al.Fitaovana microfluidic PCR amin'ny fotoana tena misy miaraka amin'ny detection electrochemical.biological sensor.Bioelectronics.24, 2131-2136 (2009).
Win, BY et al. Fandalinana mekanika famantarana sy fanamarinana ny fahombiazan'ny rafitra PCR elektronika amin'ny fotoana tena izy mifototra amin'ny fifandraisan'ny manga methylene miaraka amin'ny ADN. Analyst 136, 1573-1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al. Loop-mediated isothermal amplification-based electrochemical sensor for detection of sars-cov-2 in wastewater samples.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al. Fandrefesana elektronika amin'ny amplicons SARS-CoV-2 miaraka amin'ny electrodes PCB. Ny sensor dia mavitrika.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Famantarana mahomby ny SARS-CoV-2 RNA ao amin'ny ampahany mafy amin'ny rano maloto.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al. Fomba famakafakana ho an'ny fitiliana SARS-CoV-2 amin'ny rano maloto: Protocol sy ny fomba fijery ho avy.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Fiainana amin'ny bacteriophage voafono Phi6 (solon'ny SARS-CoV-2) amin'ny vongan-drora etona apetraka amin'ny vera.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Ny faharetan'ny tontolo iainana amin'ny solon'ny SARS-CoV-2 (Phi6) amin'ny amoeba.J.Fahasalamana amin'ny rano 20, 83 (2021).
Mindich, L. Fonosana mazava tsara amin'ny sombintsombin'ny génomika telo amin'ny bacteriophage RNA mipetaka roa \(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Firafitra faharoan'ny DH RNA phage\(\varphi\)6 faritra fonosana.RNA 6, 880-889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap - Protokol haingana sy mahomby amin'ny fanomanana ny tahiry laboratoara amin'ny bacteriophages.PeerJ 4, e2261 (2016).
Fotoana fandefasana: May-27-2022