Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат. Сиз колдонуп жаткан серепчинин версиясы CSS үчүн чектелген колдоого ээ. Мыкты тажрыйба үчүн, жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorer'де шайкештик режимин өчүрүү). Ошол эле учурда, камсыз кылуу үчүн колдоо үзгүлтүксүз болсо, биз сайтты стилсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Курчап турган чөйрөнүн үлгүлөрүн мониторингдөөнүн маанилүүлүгү COVID-19 пандемиясынын башталышынан бери абдан бааланган жана qPCR негизиндеги ыкмалар кымбат болсо да, кээ бир мониторинг аракеттери алтын стандартын колдонуу менен аткарылууда. Электрохимиялык ДНК биосенсорлору потенциалдуу үнөмдүү үнөмдөөнү камсыздай алат. төмөн жана орто кирешелүү өлкөлөрдө экологиялык суунун үлгүлөрүн мониторингдөө үчүн чечим. Бул иште биз ENIG жардамы менен көлдүн суу үлгүлөрүнүн (SARS-CoV-2 үчүн популярдуу суррогат) бөлүнүп алынган Phi6 фагынан алынган ампликондорду электрохимиялык аныктоону көрсөтөбүз. беттик өзгөртүүсүз PCB электроддорун аягына чыгаруу үчүн.секс. Электрохимиялык сенсордун жообу ар түрдүү узундуктагы эки ДНК фрагменттери үчүн кылдат мүнөздөлгөн (\({117}\,\hbox {bp}\) жана \({503}\,\hbox {bp}\)) жана ПЦР мастер аралашмаларындагы туздардын метилен көк (МБ)-ДНК өз ара аракеттенүүсүнө тийгизген таасири. Биздин натыйжалар ДНК фрагменттеринин узундугу электрохимиялык сезгичтикти олуттуу түрдө аныктай турганын жана ПТР продуктуларын гель менен тазалоосуз узун ампликондорду аныктоо жөндөмдүүлүгүн бул иште көрсөттү. суунун үлгүлөрүн жеринде өлчөө үчүн маанилүү.Вирустук жүктөө үчүн толук автоматташтырылган чечим жакшы натыйжа берет.
Суу аркылуу вирустун жугушу 1940-жылдардан бери коомдук ден соолук үчүн коркунуч катары белгилүү, муну менен полиомиелит жана гепатит E1 суу аркылуу жугуучу биринчи далилдер пайда болгон. Бүткүл дүйнөлүк саламаттыкты сактоо уюму (ДСУ) ден соолук үчүн орточо жана жогорку ден-соолук үчүн маанилүү болгон бир нече суу аркылуу жуккан вирустук патогендерди классификациялаган2.Салттуу вирус аныктоо ыкмалары алтын стандарттуу qPCR негизиндеги методдорго таянат, алар өтө сезгич жана спецификалык, бирок квалификациялуу кызматкерлерди лабораторияда кымбат аспаптарды колдонуу менен текшерүүнү талап кылат. Бирок ресурстары чектелүү төмөн жана орто кирешелүү өлкөлөрдө (LMICs) адам үлгүлөрдү тестирлөө, кыязы, экологиялык суунун үлгүсүнө мониторинг жүргүзүүгө караганда артыкчылыкка ээ болот. Ошондуктан, төмөн жана орто кирешелүү өлкөлөрдө суунун жана саркынды суулардын үлгүлөрүнө туруктуу, реалдуу убакыт режиминде мониторинг жүргүзүү үчүн альтернативалуу арзан ыкмалар керек болуп, жаңы пайда болгон оорулардын алдын алуу үчүн, ошону менен аларды вирустун пандемиясынын оор социалдык-экономикалык таасиринен коргойт. Нуклеиндик кислоталар үчүн арзан баадагы электрохимиялык биосенсорлор бул канааттандырылбаган муктаждыкка келечектүү потенциалдуу чечимди камсыздай алат. Бул ДНК биосенсорлорунун көбү кошумча ДНК тилкелери электроддо иммобилизациялангандыктан иштейт. үлгүдө дал келген ырааттуулук болгондо бети жана гибриддешти. Бул андан кийин калий темир/ферроцианид сыяктуу редокс-медиаторлорду колдонуу менен ар кандай электрохимиялык ыкмалар менен сигналга айландырылат. Метилен көк (МБ) мындай редокс-активдүү молекулалардын бири МБ-ДНК комплекстерин түзүү үчүн МБнын интеркалациялуу табияты аларды бир катар электрохимиялык ДНКда редокс-медиаторлор катары популярдуу тандоого айлантат5,6. МБлардын бир катарлуу ДНКга өзгөчө эмес байланышынан тышкары, эки тизмектүү ДНКга (dsDNA) айланат. сенсор конфигурациялары5,6,7,8,9. МБнын ДНКга интеркалациясы спецификалык эмес жана бул электрохимиялык сенсордун өзгөчөлүгү негизинен ПТР же изотермикалык күчөтүү үчүн колдонулган праймерлердин тазалыгынан көз каранды болгонуна карабастан, ал реалдуу процессти ишке ашыруу үчүн абдан ылайыктуу. -убакыт электрохимиялык негизделген qPCR же флуоресценттик изотермикалык күчөтүү ДНК концентрациясын өлчөө үчүн альтернатива катары 9 .Мындай ишке ашыруунун биринде Won et al.The алтын электроддорунун бети реалдуу убакытта 6-mercapto-1-hexanol (MCH) менен өзгөртүлгөн. Дифференциалдык импульстук вольтметриянын (DPV) жардамы менен МБ менен ПТР ампликондорун өлчөө 9. Башка учурларда, Рамирес жана башкалар. Экранда басылган электроддор менен МБны колдонуу менен RT-LAMP реакциясы аркылуу саркынды сууларда SARS-CoV-2ди аныктоо. Платиналык электроддор да колдонулган. реакциялар учурунда amplicons electrochemically аныктоо үчүн арналган microfluidic ПТР аянтчада in situ электроддор катары колдонулат 8 .Бул изилдөөлөрдүн баары электроддордун беттик өзгөртүүнү талап кылат, улам бул functionalized электроддор туруктуулугу үчүн атайын сактоо талаптарын жогорулатуу өндүрүштүк жана операциялык чыгымдарды билдирет.
Көл сууларынын үлгүлөрүндөгү концентрацияланган вирустук бөлүкчөлөрдөн алынган ампликондорду электрохимиялык аныктоо боюнча иш процессинин схемасы.
Жакында биз SARS-CoV-2 ампликондорун DPV жана циклдик вольтметрияга (CV) негизделген арзан басма схемалуу электроддор менен электрохимиялык сезүүнү көрсөттүк. учурдагы11.Кыска фрагменттерге салыштырмалуу CDC тарабынан сунушталган N1 алдыга жана N2 тескери праймерлердин жардамы менен түзүлгөн ДНКнын узунураак фрагменттери (N1-N2, \({943}\, \hbox)) сенсордун реакциясында жакшы сызыктуулукту көрсөткөнүн кабарлайбыз. ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) N1 алдыга жана N1 тескери праймер топтомдорун колдонуу менен түзүлдү. Бул изилдөөлөр нуклеазасыз сууда даярдалган ДНК эритмелерин колдонуу менен билдирилди. Платформа ошондой эле SARS-CoV аныктоо үчүн колдонулган. Агынды суунун үлгүсүндөгү үлгүлөрдөгү -2 ампликондор (SARS-CoV-2 РНКсы менен жалпы РНК үлгүлөрүн көбөйтүү жолу менен алынган). РНК изоляциялоодо жана ылдый иштетүүдө кыркууга кабылгандыктан,12,13 бул гетерогендүү үлгү менен узунураак фрагменттерди күчөтүү кыйын. Ошондуктан, саркынды суулардагы SARS-CoV-2 ампликонунун электрохимиялык сезилүүсүн көрсөтүү кыскараак \(72\,\hbox {bp}\) N1 фрагменти менен чектелген.
Бул иште биз көл суусунун үлгүлөрүнөн концентрацияланган жана бөлүнүп алынган Phi6 фагын ENIG PCB негизинде электрохимиялык сезүүнүн максатка ылайыктуулугун изилдедик (1-сүрөт). Phi6 фагдары өлчөмү боюнча (80-100 нм) SARS-CoV-2 менен салыштырууга болот жана ошондой эле липиддик кабыкчасы жана протеинге ээ. Ушул себептерден улам Phi6 бактериофагы SARS-CoV-2 жана башка капталган патогендик РНК вирустары үчүн популярдуу суррогат болуп саналат14,15. Фаг бөлүкчөлөрүнөн бөлүнүп алынган РНК кДНК синтези үчүн шаблон катары колдонулган. Узундугу 117 жана 503 жуп ДНКнын эки фрагменттерин алуу үчүн ПТР. Мурунку ишибизде \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 фрагменттерин күчөтүү кыйынчылыгын эске алып, биз ортоңку узундуктагы фрагменттерди (\(117) көздөйбүз. \,\hbox {bp}\) жана \(503 \,\hbox {bp}\)), жеткиликтүү праймерлердин негизинде. Электрохимиялык сенсордун реакциясы кеңири концентрация диапазонунда системалуу түрдө изилденген (\({10}\,{) \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) чейин \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Эки фрагмент үчүн тең МБ болушу, туздун сенсордун реакциясына тийгизген таасири спектрофотометриялык өлчөөлөр менен мүнөздөлгөн жана кайчылаш тастыкталган. Бул иштин негизги салымдары төмөнкүлөр:
ДНК фрагментинин узундугу жана үлгүдөгү туздун болушу сезгичтикке катуу таасир этет.Биздин натыйжалар электрохимиялык активдүүлүк ДНКнын концентрациясына жана узундугуна жараша вольтметрикалык жоопто МБ, ДНК жана сенсордун өз ара аракеттенүүсүнүн ар кандай механизмдеринен көз каранды экенин көрсөтүп турат. МБ жана ДНК.
ДНК концентрациясы модификацияланбаган электроддордо МБ-ДНКнын өз ара аракеттенүү механизмин аныктайт. Биз МБ-ДНКнын өз ара аракеттенүүсүнүн ар кандай механизмдери ДНК концентрациясынан көз каранды экенин көрсөтөбүз. {l}}}\), биз электрохимиялык токтун реакциясы негизинен МБ-ДНКнын электроддогу адсорбциясы менен аныкталганын байкадык, ал эми төмөнкү концентрацияларда ДНКнын жогорку концентрацияларында электрохимиялык токтун реакциясы редокстун стерикалык бөгөт коюусу менен аныкталган. ДНКнын база жуптарынын ортосундагы МБ кирүүсү менен шартталган активдүүлүк.
ENIG PCB негизиндеги Көлдүн суусунун үлгүлөрүндөгү вирустук нуклеиндик кислоталарды электрохимиялык сезүү Байкоолор Повай көлүндөгү суунун үлгүлөрүнөн алынган Phi6 кошулган \(503\,\hbox {bp}\) ДНК фрагменттерин электрохимиялык аныктоо жолу менен тастыкталды, IIT Мумбай кампусунда Натыйжа фаг.
Ишке ашыруунун төмөн баасы жана толук автоматташтырылган мониторинг системаларына, олигонуклеотиддерге же электроддорго аптамерлерге интеграциялоо мүмкүнчүлүгү.
Phage Phi6 — Cytoviridae тукумундагы капталган dsRNA вирусу, ал Pseudomonas syringae инфекциясын козгойт. Phi6 фагынын геному 3 фрагмент түрүндө болот: S (\(2,95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4,07) \,\hbox {Kb}\)) жана L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Phi6 фаг патогендүү эмес BSL-1 Pseudomonas штамын жуктургандыктан, аны колдонуу коопсуз. жана лабораторияда оңой өстүрсө болот. Phage Phi6 жана анын ээси Pseudomonas syringae Феликс d'Herelle Бактериялык вирустар боюнча маалымдама борборунан, Лавал университетинен, Канададан сатылып алынган (маалымдама борбордун каталогу HER-102 жана HER-1102, тиешелүүлүгүнө жараша) .Phi6 фаги жана анын ээси маалымдама борборунун көрсөтмөсү боюнча кайра жандантылды. Phi6 Phi6 пластина лизиси жана элюциясы аркылуу тазаланып, акыркы титрлерди \(\болжол менен 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (бляшка түзүүчү бирдиктер/ миллилитр). РНК GenElute™ Universal Total RNA Puurification Kit (Sigma-Oldrich) аркылуу тазаланган фаг бөлүкчөлөрүнөн бөлүнүп алынган. Кыскача айтканда, тазаланган фаг Phi6 суспензиясы\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) лизденди жана лизат РНКны чайыр мамычасына байланыштыруу үчүн спиндик колонкага жүктөлдү. Андан кийин РНК элюция эритмесинде элюцияланат \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) комплект тарабынан берилген. \(260\,\hbox {nm}\ боюнча абсорбенция аркылуу РНКнын концентрациясын баалаңыз. РНК \ ичинде аликвоттордо сакталган. ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) андан ары колдонууга чейин.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA синтези комплекти (Bio) -Rad Laboratories) өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык cDNA синтези үчүн шаблон катары колдонулган. Кыскача айтканда, cDNA синтези реакциясы 3 кадамдан турат: \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {мин} }\) , \({20}\,{\hbox {мин}}\) боюнча \({46}\,{^{\circ) тескери транскрипциясы }\hbox {C}}\), жана тескери Жазгыч \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) ичинде \({1}\,{\hbox {мин. }}\).1% агароздук гелде иштеткенде, cDNA күтүлгөн үч РНК фрагменттерине туура келген үч тилкени көрсөттү (маалыматтар көрсөтүлгөн эмес). Төмөнкү праймерлер узундугу 117 жана 503 bp болгон эки ДНК фрагменттерин күчөтүү үчүн колдонулган, miniPCR® mini8 термикалык циклинде ПТР үчүн шаблон катары cDNAны колдонуу:
\(117\,\hbox {bp}\) жана \(503\,\hbox {bp}\) үчүн праймерлер M сегментинин 1476-1575 нуклеотиддерине жана L сегментинин 458-943 нуклеотиддерине, тиешелүүлүгүнө жараша кислотага туура келет. .Бардык күчөтүлгөн ПТР өнүмдөрү 1% агароздук гелдерде электрофорездешти, ал эми күчөтүлгөн максаттуу ДНК GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific) аркылуу тазаланды.
Мумбайдагы IIT кампусындагы көл (Поваи көлү, Повай, Мумбай) фаг бөлүкчөлөрүн кошуу үчүн колдонулган. Көлдүн суусу \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) мембрана аркылуу чыпкаланган. токтотулган бөлүкчөлөр, андан кийин Phi6 фаг кошулду. \({1}\,{\hbox {ml}}\) ичинен \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} кошуңуз \) \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) чыпкаланган көл суусуна, \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Кичинекей аликвот болгон бляшка анализи менен вирустук жүктөмдү өлчөө үчүн сакталган. Биз Phi6 вирус бөлүкчөлөрүн концентрациялоо үчүн эки башка ыкманы сынап көрдүк: (1) алюминий гидроксидин адсорбциялоо-чаңдоого ыкмасы,19 ал айлана-чөйрөнүн үлгүлөрүндөгү бир нече капталган РНК вирустарынын концентрациясы үчүн ырасталган жана (2) ) Полиэтиленгликол (PEG) негизиндеги вирустун концентрациялоо ыкмасы Flood et al.20 .ПЕГ негизиндеги методдун калыбына келтирүү эффективдүүлүгү алюминий гидроксиди ыкмасына караганда жакшыраак деп табылгандыктан, PEG негизиндеги ыкма көл суусунун үлгүлөрүндөгү Phi6 бөлүкчөлөрүн топтоо үчүн колдонулган.
PEG ыкмасы төмөнкүдөй колдонулган: PEG 8000 жана \(\hbox {NaCl}\) 8% PEG 8000 жана \(0,2\,\hbox {M} \) алуу үчүн Phi6-спиктүү көл суунун үлгүлөрүнө кошулган. \ hbox {NaCl}\).Үлгүлөр чайкагычта инкубацияланды\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), андан кийин \(4700 \,\hbox {g}\) центрифугада \({45}\,{\hbox {мин}}\ болот. Супернатантты ыргытып, гранулду \({1}\, {\hbox {ml}}\) ошол эле супернатантта. Бардык спик жана вирус концентрация эксперименттери үч нускада аткарылган. Концентрациялангандан кийин, кичинекей аликвот бляшка анализи менен калыбына келтирүү эффективдүүлүгүн өлчөө үчүн сакталган. РНК мурда сүрөттөлгөндөй бөлүнүп алынган жана элюталанган. комплект менен камсыздалган элюциялык буферде\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). РНК концентрациясы үлгүдөн үлгүгө үч нускада өзгөрүп тургандыктан, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) РНК үчөө үчүн тең анын концентрациясына карабастан колдонулат. cDNA синтези үлгүлөрдүн cDNA синтези мурда сүрөттөлгөндөй аткарылган.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) \ (117\,\hbox {bp}\) жана \(503\,\hbox { bp}\) фрагменттери. Бул үлгүлөр "1:1" түрүндө, башкача айтканда суюлтуусуз берилген. Терс контрол катары калыпсыз башкаруу (NTC) орнотулган, ал эми тазаланган фагдан бөлүнүп алынган РНКны колдонуу менен синтезделген кДНК орнотулган. оң башкаруу (PC) үчүн шаблон катары. Сандык ПТР (qPCR) Stratagene Mx3000P RT-PCR аспабында Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies) колдонуу менен аткарылган. Реакциялар мурункудай үч нускада орнотулган. сүрөттөлгөн. Цикл босогосу (Ct) бардык үлгүлөр үчүн жазылган. Мындан тышкары, суюлтулган үлгүлөр чыпкаланган көл суусунда 1:100 суюлтулган cDNA аркылуу \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) алынган. \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) 35 цикл үчүн ПТР. Бул үлгүлөр “1:100″ катары көрсөтүлгөн.
ПХБ электроддору коммерциялык жактан жеткиликтүү арзан баада Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) процессин колдонуу менен даярдалат. Кошумча алтын жалатуунун кереги жок. ENIG PCB электродунун мүнөздөмөлөрү биздин мурунку work11.For ENIG PCB электроддорубузда кеңири берилген, мисалы, электродду тазалоонун салттуу ыкмалары. пиранха эритмеси же күкүрт кислотасынын циклдик вольтметриясы сунушталбайт, анткени алар жука алтын катмарынын кабыгын (калыңдыгы \(\болжол\) \(100\,\hbox {nm }\)) алып келиши мүмкүн жана жездин астындагы жез катмарларын ачыкка чыгарышы мүмкүн. коррозияга 21, 22, 23, 24, 25. Ошондуктан, электроддорду IPA менен нымдалган түксүз чүпүрөк менен тазалаңыз. Сыналуучу үлгү \({50}\,{\upmu \hbox {M} менен инкубацияланган. }\) Оңой киргизүү үчүн \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) ичинде МБ. Мурунку ишибизде , биз сенсордун сезгичтиги жана сызыктуулугу МБ концентрациясын жогорулатуу менен жакшырганын байкадык 11 . Мурунку ишибизде айтылган оптималдаштыруунун негизинде биз \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) МБ колдондук. Бул изилдөөдө ДНКны киргизүү үчүн концентрациялар. Кош саптуу ДНКны (ds-ДНК) электрохимиялык аныктоого аниондук же катиондук интеркалаторлорду колдонуу менен жетишүүгө болот. Аниондук интеркалаторлор ДНКны жакшыраак тандоо менен аныктаса да, алар түн ичинде инкубациялоону талап кылат, натыйжада аныктоо убакыттары узарат. экинчи жагынан, МБ сыяктуу катиондук интеркалаторлор ds-DNA6 электрохимиялык аныктоо үчүн болжол менен \({1}\,{\hbox {h}}\) кыска инкубация убакыттарын талап кылат. электрод\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), андан кийин башка үлгү менен улантуудан мурун IPA менен нымдалган чүпүрөк менен тазалаңыз.бир өлчөө. Ар бир үлгү 5 башка электроддо сыналган, эгерде башкасы айтылбаса.DPV жана CV өлчөөлөрү PalmSens Sensit Smart потенциостатын колдонуу менен аткарылган жана PSTrace программасы потенциостатты конфигурациялоо жана маалыматтарды алуу, анын ичинде эң жогорку учурдагы эсептөөлөр үчүн колдонулган. Төмөнкү орнотуулар колдонулат. DPV жана CV өлчөө үчүн:
DPV: салмактуулук убактысы = \(8\,\hbox {s}\), чыңалуу кадамы = \(3\,\hbox {mV}\), импульстук чыңалуу = \(25\,\hbox {mV}\), импульстун узактыгы = \(50\,\hbox {ms}\), скандоо ылдамдыгы = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: салмактуулук убактысы = \(8\,\hbox {s}\), чыңалуу кадамы = \(3\,\hbox {mV}\), тазалоо ылдамдыгы = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) МБ менен комплекстештирилген ДНКнын вольтаммограммаларынан алынган чоку токтар: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV жана CV вольтаммограммалары ENIG PCB электроддорунда алынган \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) МБ ДНК менен комплекстүү (10-\({20}\,{\ hbox {ng концентрацияларында) }/{\upmu \hbox {l}}}\) башкача айтканда, \(117\,\hbox {bp}\) жана 0,03 үчүн 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) for \(503\,\hbox {bp}\)). Өкүл вольтаммограммалар S1-сүрөттө Кошумча маалыматта көрсөтүлгөн. 2-сүрөт натыйжаларды көрсөтөт. гел-тазаланган ПТР продуктуларын колдонуу менен DPV жана CV өлчөөлөрүнүн (чоку ток). CV өлчөөлөрү менен салыштырганда, DPV өлчөөлөрү жогорку сезгичтикти (ДНК концентрациясынын функциясы катары) көрсөтөт, анткени CV өлчөөлөрүндө фон сыйымдуулук агымдары Фарадалык агымдарды жашырат 26 .Маалыматтар кутучадагы ар бир куту үчүн 5 электроддун өлчөөлөрү камтылган. Бардык өлчөөлөр электроддон электроддун өзгөрүшүнө байланыштуу өлчөө каталарын болтурбоо үчүн бир эле электроддор топтомун колдонушат. Биз ДНКнын төмөнкү концентрациялары үчүн DPV жана CV ченелген чоку агымдардын өсүү тенденциясын байкадык. , узунураак (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ салыштырганда \(117) ) фрагмент.Бул биздин мурунку ишибизде билдирилген электрод адсорбциясынын күтүлгөн тенденциясына шайкеш келет. МБ-ДНК комплексинин адсорбциясы электроддогу заряддын өтүшүн шарттайт, бул эң жогорку токтун көбөйүшүнө өбөлгө түзөт. Башка изилдөөлөр МБ-ДНКнын интеркалациясына олигонуклеотиддердин өлчөмү жана ырааттуулугунун таасирин көрсөттү27,28,29,30. Гуанин Эки ампликондун (\(117\,\hbox {bp}\) жана \(503\,\hbox {bp}\)) -цитозиндин (GC) мазмуну болжол менен 50%ды түздү, бул байкоонун айырмачылыкка байланыштуу экенин көрсөтүп турат. ампликон узундугуна чейин. Бирок, жогорку ДНК концентрациялары үчүн (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), \(503\,\hbox {bp}) \) жана \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) \(117\,\hbox {bp}\)), биз эки күчөтүүнү байкайбыз субстанциялардын эң жогорку агымдары DPV да, CV өлчөөлөрүндө да азаят. Мунун себеби МБ ДНКнын базалык жуптарынын ортосунда каныккан жана интеркалацияланган, натыйжада MB31,32де кыскартылуучу топтун редокс активдүүлүгүнүн стерикалык бөгөт коюусуна алып келет.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503) \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
ПЦР мастер аралашмаларында болгон туздар МБ менен ДНКнын ортосундагы электростатикалык өз ара аракеттенүүгө тоскоолдук кылат, ошондуктан \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) менен \({50} \,{\) кошуу менен upmu \hbox {M}}\) МБ-ДНКнын өз ара аракеттенүүсүнө туздун таасирин изилдөө үчүн МБ гел менен тазаланган продукт. 3-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, биз ДНКнын жогорку концентрациялары үчүн (\(>{2}\,{\) hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) жана \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) үчүн \(117\,\hbox {bp} \)), DPV жана CV менен Туздун кошулушу өлчөөлөргө олуттуу таасир эткен жок (Өкүлчүлүктүү вольтаммограммалар үчүн Кошумча маалыматтагы S2 сүрөтүн караңыз). Бирок, төмөн ДНК концентрациясы, туз кошуу абдан сезимталдыкты төмөндөтөт, натыйжада ДНК концентрациясы менен токтун эч кандай олуттуу өзгөрүү. Туздун МБ-ДНК өз ара жана интеркалацияга окшош терс таасирлери мурда башка изилдөөчүлөр тарабынан билдирилген33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) катиондору ДНКнын терс фосфат омурткасы менен байланышат, ошону менен МБ менен ДНКнын ортосундагы электростатикалык өз ара аракеттенүүгө тоскоол болот. ДНКнын жогорку концентрациясында, редокс-активдүү МБлардын стерикалык ингибирөөсү төмөнкү чоку агымдарга алып келет, ошондуктан электростатикалык өз ара аракеттенишүүлөр сенсордун жообуна олуттуу таасир этпейт. Негизгиси бул биосенсор ДНКнын жогорку концентрацияларын аныктоого жакшыраак ылайыктуу (сейрек \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) же андан жогору), ПЦР продуктуларын гель менен тазалоо мүмкүн эмес болушу мүмкүн болгон экологиялык суунун үлгүлөрүн толук автоматташтырылган иштетүү үчүн.
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) менен комплекстештирилген ДНКнын ар кандай концентрациялары үчүн 600–700 толкун узундуктарынын диапазону үчүн жутуу ийри сызыгынын астындагы аянт: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) туздуу жана тузсуз (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) туздуу жана тузсуз (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) МБ үлгүлөрүнө туура келген ДНК концентрациясы ДНК жок.
Жогорудагы натыйжаларды андан ары текшерүү үчүн биз UV/Vis спектрофотометрин (Thermo Scientific Multiskan GO) колдонуп оптикалык өлчөөлөрдү жүргүздүк, ар бири үчүн \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) үлгүлөрү колдонулду. Өлчөө. Абсорбция белгиси ДНК концентрациясынын жогорулашы менен төмөндөйт, муну \(600\,\hbox {nm}\) толкун узундуктарынын диапазонундагы жутуу ийри сызыгынын тенденциясынан көрүнүп тургандай, \(700\,\hbox { nm}\) , 4-сүрөттө көрсөтүлгөндөй (кошумча маалыматта S3-сүрөттө көрсөтүлгөн абсорбция спектри). \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox) төмөн ДНК концентрациясы бар үлгүлөр үчүн. {l}}}\), ДНК камтыган жана МБ гана үлгүлөрдүн ортосунда кабыл алууда олуттуу айырма болгон эмес (\(503\,\hbox {bp}\) жана \(117\,\hbox {bp}\ үчүн ) узундугу фрагменттери), редокс-активдүү МБнын стерикалык ингибициясынын жоктугун көрсөтүп турат. Жогорку ДНК концентрациясында биз абсорбенция сигналынын акырындык менен төмөндөшүн байкадык жана туздун катышуусунда абсорбенциянын азыраак төмөндөшүн байкадык. Бул жыйынтыктар молекулярдык ДНК гибриддериндеги базалык стектирлөө менен өз ара аракеттенүү жана стерикалык бөгөт коюу. Биздин натыйжалар \(\pi\)–\(\pi ^*\ ичинде гипохроматтуулукту энергиянын төмөндөшү менен байланыштырган МБ-ДНКнын интеркалациясынын спектроскопиялык изилдөөлөрү боюнча адабияттардагы отчетторго шайкеш келет. ) 36, 37, 38 катмарлары интеркалациядан улам электрондук өтүүлөр.
Phi6 фагынын агароз гелинин электрофорези: Көл суусунун үлгүлөрүнүн узундугу \(117\,\hbox {bp}\) жана \(503\,\hbox {bp}\) болгон ПТР продуктулары. M-ДНК маркери;NTC-но-шаблондуу башкаруу, тиешелүү ампликондорду камтыган праймерлер;PC оң башкаруу;1, 2, 3-суюлтулган (1:1) көлөмдөгү суунун үлгүлөрү үч нускада. \(503\,\) колдонулбаган олигонуклеотиддерден улам \(\болжол менен 50\,\hbox {bp}\) тилке көрүнүп турат. hbox {bp}\) тилкеси.
Биз сенсордун пайдалуулугуна Phi6 фаг кошулган Повай көлүндөгү суунун үлгүлөрүн колдонуп бааладык. Фагдуу суунун үлгүлөрүнөн бөлүнүп алынган РНК концентрациясы 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), ал эми тазаланган фаг суспензияларынан бөлүнгөн РНК болжол менен 1 калыбына келтирүү эффективдүүлүгү менен \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) деп бааланган. %.РНК cDNAга тескери транскрипцияланган жана ПТР жана qPCR үчүн шаблон катары колдонулган. Продукттун өлчөмү сенсор менен сынаганга чейин агароз гелдик электрофорез менен тастыкталган (5-сүрөт). ошондой эле кызыкчылыктын ампликондору. qPCR учурунда жазылган Ct маанилери (1-таблица) тиешелүү суунун үлгүлөрүнөн бөлүнүп алынган РНКнын концентрациясы менен байланышта экени көрсөтүлгөн. Ct мааниси флуоресценттик сигнал үчүн керектүү циклдердин санын көрсөтөт босогодон же фондо сигналдан ашат. Жогорку Ct маанилери шаблондун төмөнкү концентрациясын көрсөтөт жана тескерисинче. NTC үлгүлөрүнүн Ct маанилери күтүлгөндөй эле жогору болгон. \(\болжол менен 3\) Ct маанилеринин ортосундагы айырма оң башкаруу жана тест үлгүсү андан ары ар бир сыноо үлгүсү оң контролго салыштырмалуу болжол менен 1% шаблонго ээ экенин көрсөтүп турат. Биз мурда узунураак ампликондор жакшы сезгичтикке алып келерин талкуулаганбыз. Гетерогендүү экологиялык үлгүлөрдөн бөлүнүп алынган узунураак фрагменттерди күчөтүү кемчиликтерди эске алуу менен кыйынга турат. вирустун концентрациясы төмөн жана РНК деградациясы. Бирок, биздин вирусту байытуу жана ПТР күчөтүү протоколу менен биз электрохимиялык сезүү үчүн \(503\,\hbox {bp}\) фрагментин ийгиликтүү күчөтө алдык.
6-сүрөттө суюлтулган кДНКны калып катары (1:1) жана 100 эсе суюлтулган cDNAны калып катары (1:100) аткарган ПТР колдонгон \(503\,\hbox {bp}\) фрагмент ампликонунун электрохимиялык сенсор натыйжалары көрсөтүлгөн. , NTC жана PC менен салыштырганда (Өкүл voltammograms үчүн Кошумча маалымат боюнча S4 сүрөттү карагыла). 6-сүрөттөгү кутучадагы ар бир кутуда 5 электроддогу үч үлгүдөгү өлчөөлөр бар. Ошол эле электроддор электроддон улам каталарды болтурбоо үчүн бардык үлгүлөрдү өлчөө үчүн колдонулган. -to-electrode variation.CV өлчөөлөрү менен салыштырганда, DPV өлчөөлөрү тесттик жана PC үлгүлөрүн NTCлерден айырмалоо үчүн жакшыраак чечкиндүүлүктү көрсөтөт, анткени, мурда айтылгандай, Фарадалык токтар акыркылардагы фон сыйымдуулук агымдарынан улам жашырылган. Узун ампликондор үчүн, биз байкадык терс башкаруу (NTC) оң башкарууга салыштырмалуу жогорку CV жана DPV чоку агымдарына алып келди, ал эми оң жана суюлтулган тест үлгүлөрү DPV чоку агымдарынын окшош чоку бийиктиктерин көрсөттү. Ар бир суюлтулган эмес үчүн өлчөнгөн орточо жана медианалык маанилер (1:1) ) тест үлгүсү жана PC NTC үлгүсү үчүн сенсордун чыгышынан так чечилиши мүмкүн, ал эми 1:100 суюлтулган үлгү үчүн чечим азыраак. (5-сүрөттө көрсөтүлгөн эмес тилкелер) жана тиешелүү DPV жана CV чоку агымдары NTC үчүн күтүлгөнгө окшош болгон. \(117\,\hbox {bp}\) фрагментинин натыйжалары Кошумча маалыматта көрсөтүлгөн. Терс башкаруу электроддогу бош МБнын адсорбциясы жана МБнын бир жиптүү праймер олигонуклеотид менен өз ара аракеттешүүсүнүн натыйжасында ПХБ сенсорунан электрохимиялык реакцияны пайда кылды. Ошондуктан, үлгү сыналган сайын терс башкарууну иштетүү керек жана Сыноо үлгүсүн оң же терс деп классификациялоо үчүн дифференциалдык (салыштырмалуу) өлчөөгө39,40 жетишүү үчүн терс башкаруу тарабынан алынган эң жогорку ток менен салыштырылган сыноо үлгүсүнүн чоку агымы.
(a) DPV, жана (б) Көл суусунун үлгүлөрүндөгү \(503\,\hbox {bp}\) фрагменттерин электрохимиялык аныктоо үчүн CV чокусу ток. Сыноо үлгүлөрү үч нускада өлчөнгөн жана шаблондуу башкаруу элементтери (NTC) менен салыштырылган жана оң башкаруу (PC).
Биздин табылгаларыбыз ар кандай ДНКлар үчүн ар кандай узундуктагы ампликондор үчүн электрохимиялык сенсорлордун иштешине таасир этүүчү ар кандай механизмдерди көрсөтөт, концентрациялары UV/Vis спектрофотометрин колдонуу менен оптикалык өлчөөлөр менен текшерилген. Биздин байкоолорубуз ДНК фрагменттери \(\болжол менен\) чейин узунураак экенин түшүнүүнү баса белгилейт. \(500\,\hbox {bp}\) жогорку сезгичтик менен аныкталышы мүмкүн жана үлгүдөгү туздун болушу сезгичтик ДНК концентрациясы жогору сезгичтикке таасирин тийгизет (сейрек \({\hbox {ng}/{\upmu) \hbox {l}}}\) жана андан жогору).Мындан тышкары, биз үлгүлөрдүн ар кандай түрлөрүнүн таасирин, анын ичинде туз кошулган жана кошулбаган гел менен тазаланган ампликондорду, ошондой эле DPV жана CV өлчөөлөрүндө көл суунун үлгүлөрүн кошууну изилдедик.Биз DPV жакшыраак чечүүнү камсыз кылганын байкадык, анткени фон сыйымдуулугу агым CV өлчөөсүнө да таасирин тийгизип, аны сезгичтигин азайтат.
Узун фрагменттердин күчөшү вирустук геномдук РНКнын бүтүндүгүнөн көз каранды. Бир нече изилдөөлөр чөйрөдө РНКнын деградацияланышынан жана изоляция учурунда сплайсингдин потенциалынан улам узунураак фрагменттерди күчөтүү дайыма эле эффективдүү боло бербестигин көрсөттү11,41,42,43,44 .Биз PEG негизиндеги вирус концентрациялоо ыкмасы алюминий гидроксидинин негизиндеги вирустун концентрациясынын методуна караганда көлдүн суусунун үлгүлөрүндө Phi-6 чачылган фагды концентрациялоодо кыйла натыйжалуу болгонун байкадык. Узун ДНК фрагменттерин аныктоо мүмкүнчүлүгү мультиплекстик ПТРдин талабын жеңип чыкты. бир нече кыска узундуктагы шаблондорду күчөтүү жана кайчылаш өзгөчөлүк мүмкүнчүлүгүн азайтуу.
Биологиялык үлгүлөр аз, ошондуктан тестирлөө үчүн минималдуу үлгүлөрдү талап кылган биосенсорду долбоорлоо зарылчылыгы бар. Бул изилдөөдө колдонулган ENIG PCB электроддор үчүн \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ гана талап кылынат. ) электроддордун эффективдүү аймагын жабуу үчүн тестирлөө үчүн үлгүлөр. Мындан тышкары, ошол эле электрод кийинки үлгүнү берүүдөн мурун тазалоодон кийин кайра колдонулушу мүмкүн. Күчөтүлгөн үлгүлөр метилен көкүнөн башка химикаттарды кошууну талап кылбайт, бул арзан. жана жалпы колдонулган химиялык. Ар бир электроддун баасы болжол менен $0,55 (же INR 40) болгондуктан, бул биосенсор учурдагы аныктоо технологияларына үнөмдүү альтернатива боло алат. 2-таблица бул иштин адабиятта узак убакыт бою айтылган башка сенсорлор менен салыштырууну көрсөтөт. Гетерогендүү үлгүлөрдөгү ДНК фрагменттери.
МБ негизиндеги электрохимиялык аныктоо протоколдору ПТРдин өзгөчөлүгүнө таянарын эске алып, бул ыкманын негизги чектөөсү саркынды суулар жана көл суулары сыяктуу гетерогендүү үлгүлөрдөгү спецификалык эмес күчөтүү потенциалы же тазалыгы төмөн праймерлерди колдонуу мүмкүнчүлүгү болуп саналат. өзгөртүлбөгөн ENIG PCB электроддорунун жардамы менен тазаланбаган ПЦР продуктуларын ДНКны аныктоо үчүн электрохимиялык аныктоо ыкмалары, пайдаланылбаган dNTPs жана праймерлер тарабынан киргизилген каталарды жакшыраак түшүнүү жана реакция шарттарын жана анализ протоколдорун оптималдаштыруу керек. Кошумча физикалык-химиялык параметрлер, мисалы, рН, температура жана биологиялык Суу үлгүсүндөгү кычкылтек керектөөсүн (BOD) өлчөөнүн тактыгын жогорулатуу үчүн өлчөө керек болушу мүмкүн.
Жыйынтыктап айтканда, биз экологиялык (көлдүн суусу) үлгүлөрүндө вирустарды аныктоо үчүн арзан баадагы электрохимиялык ENIG PCB сенсорун сунуштайбыз. Иммобилизацияланган олигонуклеотиддик электроддордон же ДНКны сезүү үчүн атайын субстраттардан айырмаланып, сезимталдыкты сактоо үчүн криогендик сактоону талап кылабыз,53,54 биздин техника модификацияланбаган PCB колдонот. жарактуулук мөөнөтү узун жана атайын сактоо талаптары жок электроддор, ошондуктан LMICтерде орнотулган үлгүлөрдү автоматташтырылган иштетүү менен өлчөө чечимдерин иштеп чыгуу үчүн ылайыктуу. Биосенсор максаттуу ампликондорду тез аныктоо үчүн арзан ДНК-интеркалациялоочу редокс боёкторду (МБ) колдонот. Спецификалык эмес күчөтүү айлана-чөйрөнү коргоо үлгүлөрүндө жалпы МБнын бир жана эки тилкелүү олигонуклеотиддерге спецификалык эмес байланышынан улам бул сезүү ыкмасынын өзгөчөлүгүн төмөндөтөт.Ошондуктан, бул тесттин өзгөчөлүгү праймерлердин жана ПТР реакциясынын шарттарын оптималдаштыруудан көз каранды. Мындан тышкары, CV жана сыналган үлгүлөрдөн алынган DPV чокусу токтун ар бир test.The электрохимиялык сенсор долбоорлору жана ыкмалары үчүн терс башкаруу (NTC) алынган жооп салыштырмалуу чечмелениши керек, бул жумушта көрсөтүлгөн толугу менен автоматташтырылган жана төмөн иштеп чыгуу үчүн autosamplers менен бириктирилиши мүмкүн. - үлгүлөрдү чогултуп, анализдеп, натыйжаларды лабораторияга зымсыз жөнөтө турган нарк чечими.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Суу үлгүлөрүндөгү вирустардын баштапкы концентрациясынын методдору: акыркы изилдөөлөрдү карап чыгуу жана мета-анализ.Колдонмо.микроорганизм.115, 1-11-бет (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Суудагы вирустар: коопсуз ичүүчү суунун тоскоолдору. PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Төмөн жана орто кирешелүү өлкөлөрдө COVID-19га үнөмдүү масштабдуу байкоо жүргүзүү үчүн саркынды суулардын эпидемиологиясы: кыйынчылыктар жана мүмкүнчүлүктөр.Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nuclein acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Метилен көк алтын субстраттарда иммобилизацияланган бир жана эки тилкелүү олигонуклеотиддердин электрохимиялык дискриминатору катары. Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparison of Cation and Anion Intercalators for electrochemical Transduction of DNA Hybridization by Long-Range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ ДНК аркылуу заряд өткөрүү: тандалма электрохимиялык ДНК biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Real-time PCR microfluidic аппарат менен бир убакта электрохимиялык аныктоо.biological sensor.Bioelectronics.24, 2131-2136 (2009).
Win, BY et al.Signaling механизми изилдөө жана DNA.Analyst 136, 1573-1579 (2011) менен метилен көк өз ара негизинде электрохимиялык реалдуу убакыт ПТР системасынын аткаруу текшерүү.
Ramirez-Chavarria, RG et al. Loop ортомчулугу менен изотермикалык күчөтүү негизделген электрохимиялык сенсор саркынды суу үлгүлөрүндө sars-cov-2 аныктоо үчүн.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al. SARS-CoV-2 ампликондорун ПХБ электроддору менен электрохимиялык сезүү. Сенсор иштетилди. B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. SARS-CoV-2 РНКсынын агынды суулардын катуу бөлүгүндө эффективдүү аныктоо.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al. Агын сууларда SARS-CoV-2 аныктоонун аналитикалык ыкмалары: Протокол жана келечектеги перспективалар. TraC тренддик анал.Chemical.134, 116125 (2020).
Федоренко, А., Гринберг, М., Ореви, Т. & Каштан, Н. Айнек беттерге салынган бууланган шилекей тамчыларынын капталган Phi6 бактериофагынын (SARS-CoV-2 үчүн суррогат) аман калышы.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Эркин жашаган амебадагы SARS-CoV-2 суррогатынын (Phi6) экологиялык туруктуулугу.Суу ден соолук 20, 83 (2021).
Миндич, Л. Кош тилкелүү РНК бактериофагынын үч геномдук фрагменттеринин так таңгагы\(\varphi\)6.микроорганизм.Мур.биология.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, DH РНК фагынын экинчилик структурасы \ (\ varphi \) 6 таңгактоо аймагы. RNA 6, 880-889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap - Bacteriophages.PeerJ 4, e2261 (2016) лабораториялык запастарын даярдоо үчүн тез жана натыйжалуу протокол.
Посттун убактысы: 27-май-2022