תודה שביקרת ב-Nature.com. לגרסת הדפדפן שבה אתה משתמש יש תמיכה מוגבלת ב-CSS. לחוויה הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או לכבות את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בינתיים, כדי להבטיח המשך תמיכה, נציג את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
החשיבות של ניטור דגימות סביבתיות זכתה להערכה רבה מאז תחילת מגיפת ה-COVID-19, וכמה מאמצי הניטור מתבצעים באמצעות תקן הזהב, אם כי טכניקות מבוססות qPCR הן יקרות. חיישני DNA אלקטרוכימיים יכולים לספק פוטנציאל חסכוני פתרון לניטור דגימות מים סביבתיים במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית. בעבודה זו, אנו מדגימים את הגילוי האלקטרוכימי של אמפליקונים המתקבלים מפאג' Phi6 שבודדו מדגימות מי אגם משובצות (פונדקאית פופולרית ל-SARS-CoV-2), באמצעות ENIG להשלמת אלקטרודות PCB ללא שינוי פני השטח.מין. תגובת החיישן האלקטרוכימי אופיינה ביסודיות עבור שני שברי DNA באורכים שונים (\({117}\,\hbox {bp}\) ו-\({503}\,\hbox {bp}\)), וה- ההשפעה של מלחים בתערובות מאסטר PCR על אינטראקציות מתילן כחול (MB)-DNA. התוצאות שלנו מראות שאורך שברי ה-DNA קובע באופן משמעותי את הרגישות האלקטרוכימית ומוכיחות בעבודה זו שהיכולת לזהות אמפליקונים ארוכים ללא טיהור ג'ל של מוצרי PCR היא חשוב למדידה במקום של דגימות מים.פתרון אוטומטי לחלוטין לעומס ויראלי מבשר טובות.
העברת וירוסים על ידי מים ידועה כמפגע לבריאות הציבור מאז שנות ה-40, עם העדות הראשונה להעברה במים של פוליו והפטיטיס E1. ארגון הבריאות העולמי (WHO) סיווג מספר פתוגנים ויראליים הנישאים במים בעלי משמעות בריאותית בינונית עד גבוהה2. וירוס מסורתי שיטות זיהוי מסתמכות על טכניקות מבוססות qPCR בתקן זהב, שהן רגישות וספציפיות ביותר, אך דורשות צוות מיומן לבדוק במעבדה באמצעות מכשירים יקרים. עם זאת, במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית (LMICs) עם משאבים מוגבלים, אנושיים בדיקות מדגמיות צפויות לקבל עדיפות על פני ניטור דגימות מים סביבתיות. לכן, יש צורך בשיטות חלופיות בעלות נמוכה לניטור בר-קיימא בזמן אמת של דגימות מים ושפכים במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית כאזהרה מוקדמת להתפרצויות מחלות. ובכך להגן עליהם מפני ההשפעות החברתיות-כלכליות החמורות של מגיפת הנגיף. חיישנים ביולוגיים אלקטרוכימיים בעלות נמוכה לחומצות גרעין יכולים לספק פתרון פוטנציאלי מבטיח לצורך בלתי מסופק זה. רבים מהחיישנים הביולוגיים של DNA אלה פועלים על ידי העובדה שגדילי DNA משלימים משותקים על האלקטרודה פני השטח והכלאה כאשר קיים רצף תואם בדגימה. לאחר מכן ניתן להמיר אותו לאות על ידי טכניקות אלקטרוכימיות שונות באמצעות מתווכי חיזור כגון ברזל אשלגן/פרוציאניד. מתילן כחול (MB) הוא מולקולה פעילה חיזור כזו, שיש לה דווח כי הוא משתלב ל-DNA דו-גדילי (dsDNA) בנוסף לקשירתו הבלתי-ספציפית יותר ל-DNA5,6. האופי השילוב של MBs ליצירת קומפלקסים MB-DNA הופך אותם לבחירה פופולרית כמתווכים חיזור בכמה DNA אלקטרוכימיים תצורות חיישנים5,6,7,8,9.למרות שהאינטרקלציה של MB ל-DNA אינה ספציפית, והספציפיות של חיישן אלקטרוכימי זה תלויה במידה רבה בטוהר הפריימרים המשמשים ל-PCR או להגברה איזותרמית, הוא מתאים היטב ליישום אמיתי qPCR מבוסס אלקטרוכימי זמן או הגברה איזותרמית פלואורסצנטית כחלופה למדידת ריכוז DNA 9. ביישום אחד כזה, Won et al. פני השטח של אלקטרודות זהב שונו עם 6-mercapto-1-hexanol (MCH) בזמן אמת מדידה של אמפליקונים PCR עם MB באמצעות וולטמטריית דופק דיפרנציאלית (DPV)9.במקרים אחרים, Ramirez וחב'. זיהוי של SARS-CoV-2 בשפכים על ידי תגובת RT-LAMP באמצעות MB עם אלקטרודות מודפסות על מסך. אלקטרודות פלטינה היו גם משמש כמו אלקטרודות באתרו בפלטפורמת PCR מיקרופלואידית שנועדה לזהות אמפליקונים אלקטרוכימית במהלך תגובות 8. כל המחקרים הללו דורשים שינוי פני השטח של האלקטרודות, מה שמרמז על עלויות ייצור ותפעול מוגברות עקב דרישות אחסון מיוחדות ליציבותן של אלקטרודות פונקציונליות אלה.
סכימה של זרימת העבודה לזיהוי אלקטרוכימי של אמפליקונים המתקבלים מחלקיקים ויראליים מרוכזים בדגימות מי אגם.
לאחרונה הדגמנו חישה אלקטרוכימית של אמפליקונים של SARS-CoV-2 עם אלקטרודות מעגלים מודפסים בעלות נמוכה (PCB) המבוססת על DPV וולטמטריה מחזורית (CV) המושרה על ידי ספיחה של קומפלקסים MB-DNA על פני השטח של אלקטרודות ללא שינוי) שינויים בשיא. נוכחי11.אנו מדווחים כי שברי DNA ארוכים יותר (N1-N2, \({943}\, \hbox) שנוצרו באמצעות הפריימרים N1 קדימה ו-N2 הפוכה המומלצים על ידי CDC בהשוואה לשברים קצרים יותר {bp}\)) הראו לינאריות טובה יותר בתגובת החיישן ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) שנוצרו באמצעות ערכות פריימר N1 קדימה ו-N1 לאחור. מחקרים אלה מדווחים באמצעות דילול DNA שהוכן במים נטולי נוקלאז. הפלטפורמה שימשה גם לזיהוי SARS-CoV -2 אמפליקונים בדגימות שפכים מדומות (שמתקבלות על ידי ספייק של דגימות RNA הכוללות עם SARS-CoV-2 RNA). מאחר ש-RNA רגיש לגזירה במהלך בידוד ועיבוד במורד הזרם,12,13 קשה להגביר שברים ארוכים יותר עם דגימה הטרוגנית זו. לכן, ההדגמה של חישה אלקטרוכימית של אמפליקון SARS-CoV-2 במי שפכים מוגבלת למקטע N1 הקצר יותר \(72\,\hbox {bp}\).
בעבודה זו, חקרנו את ההיתכנות של חישה אלקטרוכימית מבוססת ENIG PCB של פאג Phi6 מרוכז ומבודד מדגימות מי אגמים (איור 1). פאג'ים Phi6 דומים בגודלם (80-100 ננומטר) ל-SARS-CoV-2 ו יש להם גם קרום שומנים וחלבון ספייק. מסיבות אלה, בקטריופאג Phi6 הוא פונדקאי פופולרי עבור SARS-CoV-2 ונגיפי RNA פתוגניים אחרים במעטפת14,15. RNA שבודד מחלקיקי פאג שימש כתבנית לסינתזת cDNA ואחריו PCR להשגת שני שברי DNA באורך 117 ו-503 זוגות בסיסים. לאור האתגר של הגברה של שברי \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 בעבודתנו הקודמת, אנו מכוונים למקטעים באורך בינוני (\(117 \,\hbox {bp}\) ו-\(503 \,\hbox {bp}\)), בהתבסס על פריימרים זמינים. תגובת החיישן האלקטרוכימי נחקרה באופן שיטתי על פני טווח ריכוזים רחב (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) ל-\({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) עבור שני הפרגמנטים ב נוכחות MB, השפעת המלח על תגובת החיישן אופיינה ואומתה על ידי מדידות ספקטרופוטומטריות. התרומות העיקריות של עבודה זו הן כדלקמן:
אורך שברי ה-DNA והנוכחות של מלח בדגימה משפיעים מאוד על הרגישות.התוצאות שלנו מראות שפעילות אלקטרוכימית תלויה במנגנונים שונים של האינטראקציה של MB, DNA והחיישן בתגובה הוולטמטרית, בהתאם לריכוז ה-DNA ואורך, כאשר שברים ארוכים יותר מראים רגישות גבוהה יותר, למרות שלמלח יש השפעה שלילית על אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין MB ו-DNA.
ריכוז ה-DNA קובע את המנגנון של אינטראקציה MB-DNA באלקטרודות ללא שינוי. אנו מדגימים שמנגנונים שונים של אינטראקציה MB-DNA תלויים בריכוז ה-DNA. בריכוזי DNA מתחת לכמות קטנה של \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), ראינו שתגובת הזרם האלקטרוכימי נקבעה בעיקר על ידי ספיחה של MB-DNA על האלקטרודה, בעוד שבריכוזים נמוכים יותר בריכוזי DNA גבוהים, תגובת הזרם האלקטרוכימי נקבעה על ידי עיכוב סטרי של חיזור פעילות עקב החדרת MB בין זוגות בסיסים של DNA.
חישה אלקטרוכימית מבוססת ENIG PCB של חומצות גרעין ויראליות בדגימות מי אגם התצפיות אומתו על ידי זיהוי אלקטרוכימי של שברי DNA שנוספו ל- Phi6 \(503\,\hbox {bp}\) שהתקבלו מדגימות מים מאגם Powai, IIT Mumbai Campus פאג תוצאה.
עלות נמוכה של יישום ופוטנציאל לשילוב במערכות ניטור אוטומטיות לחלוטין, אוליגונוקלאוטידים או aptamers על אלקטרודות עם חיי מדף ארוכים יותר.
Phage Phi6 הוא וירוס dsRNA עטוף ממשפחת Cytoviridae שמדביק את Pseudomonas syringae. הגנום של הפאג Phi6 קיים בצורה של 3 שברים: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07 \,\hbox {Kb}\)) ו-L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. היות והפאג Phi6 מדביק זן BSL-1 Pseudomonas לא פתוגניים, זה בטוח לשימוש וניתן לגדל אותו בקלות במעבדה.Phage Phi6 והמארח שלו Pseudomonas syringae נרכשו ממרכז ההתייחסות של פליקס ד'הרל לווירוסים חיידקיים, אוניברסיטת לאבל, קנדה (המספרים הקטלוגיים של מרכז ההתייחסות הם HER-102 ו- HER-1102, בהתאמה) .Phi6 phage והמארח שלו הוחזרו לתחייה לפי הנחיות מרכז ההתייחסות. Phage Phi6 טוהר על ידי תמוגה צלחת ואלוציה כדי להשיג טיטר סופי עם \(\בערך 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (יחידות יוצרות פלאק/מיליליטר).RNA בודד מחלקיקי פאג מטוהרים באמצעות GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) לפי הוראות היצרן. בקצרה, תרחיף פאג' מטוהר Phi6\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) הועלה והליסאט הוטען על עמודת ספין כדי לאפשר ל-RNA להיקשר לעמודת השרף. לאחר מכן ה-RNA נפלט בתמיסת האלוציה \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) שסופק על ידי הערכה. הערך את ריכוז ה-RNA לפי ספיגה ב-\(260\,\hbox {nm}\).RNA אוחסן במנות ב-\ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) עד לשימוש נוסף.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) ערכת iScript cDNA Synthesis (Bio -Rad Laboratories) שימשה כתבנית לסינתזת cDNA בהתאם להוראות היצרן. בקצרה, תגובת סינתזת cDNA מורכבת משלושה שלבים: התחלה ב-\({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , תעתיק הפוך של \({20}\,{\hbox {min}}\) ב-\({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), והפוך המקליט נמצא ב-\({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) עבור \({1}\,{\hbox {דקה) }}\).כשהריצו על ג'ל אגרוז 1%, ה-cDNA הראה שלוש פסים התואמים לשלושת שברי ה-RNA הצפויים (לא מוצגים נתונים). הפריימרים הבאים שימשו להגברת שני שברי DNA באורך של 117 ו-503 bp, שימוש ב-cDNA כתבנית עבור PCR ב-miniPCR® mini8 מחזור תרמי:
הפריימרים של \(117\,\hbox {bp}\) ו-\(503\,\hbox {bp}\) תואמים 1476-1575 נוקלאוטידים של מקטע M ו-458-943 נוקלאוטידים של מקטע L, בהתאמה חומצה כל מוצרי ה-PCR המוגברים עברו אלקטרופורזה על ג'לים של 1% אגרוז, ו-DNA מטרה מוגבר טוהר באמצעות ערכת מיצוי ג'ל GeneJET (Thermo Fisher Scientific).
אגם בקמפוס IIT Mumbai (Powai Lake, Powai, Mumbai) שימש להוספת חלקיקי פאג'. מי האגם סוננו דרך ממברנה \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) כדי להסיר חלקיקים מרחפים, ולאחר מכן נוספו פאג Phi6. הוסף \({1}\,{\hbox {ml}}\) של \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) אל \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) מי אגם מסוננים, ב-\({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). מנה קטנה הייתה שמור למדידת עומס נגיפי על ידי בדיקת פלאק. בדקנו שתי שיטות שונות לריכוז חלקיקי נגיף Phi6 עם נקודות: (1) שיטת ספיחה-משקעים של אלומיניום הידרוקסיד,19 אשר אומתה לריכוז של מספר נגיפי RNA עטופים מדגימות סביבתיות, וכן (2) ) שיטת ריכוז הנגיפים המבוססת על פוליאתילן גליקול (PEG) הותאמה מ-Flood et al.20 .מאחר שנמצאה יעילות ההחלמה של השיטה מבוססת PEG טובה יותר מזו של שיטת האלומיניום הידרוקסיד, נעשה שימוש בשיטה מבוססת PEG לריכוז חלקיקי Phi6 מדגימות מי אגמים.
שיטת ה-PEG שבה נעשה שימוש הייתה כדלקמן: PEG 8000 ו-\(\hbox {NaCl}\) נוספו לדגימות מי אגם עם קוצים של Phi6 כדי לקבל 8% PEG 8000 ו-\(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\). דגימות הודגרו על שייקר\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), לאחר מכן בצנטריפוגה ב-\(4700 \,\hbox {g}\) הוא \({45}\,{\hbox {min}}\). השליך את הסופרנטנט והשהה מחדש את הכדור ב-\({1}\, {\hbox {ml}}\) באותו סופרנטנט. כל ניסויי הספייק וריכוז הנגיפים בוצעו בשלושה עותקים. לאחר הריכוז, נשמר מנה קטנה למדידת יעילות ההתאוששות על ידי בדיקת פלאק. RNA בודד כמתואר קודם ונפלט במאגר elution שסופק על ידי ערכה\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). מאחר שריכוז ה-RNA ישתנה מדגימה לדגימה בשלושה עותקים, ה-\({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) של RNA משמש עבור שלושתם ללא קשר לריכוזו סינתזת cDNA של דגימות. סינתזת cDNA בוצעה כפי שתואר קודם.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA שימש כתבנית עבור \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR למשך 35 מחזורים להגברת \ (117\,\hbox {bp}\) ו-\(503\,\hbox { bp}\) fragments. דגימות אלה מיוצגות כ"1:1", כלומר ללא דילול. בקרת ללא תבנית (NTC) הוגדרה כבקרה שלילית, בעוד ש-cDNA שסונתז באמצעות RNA מבודד מפאג' מטוהר הוגדר כתבנית לבקרה חיובית (PC). PCR כמותי (qPCR) בוצע במכשיר Stratagene Mx3000P RT-PCR באמצעות Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). התגובות הוגדרו בשלושה עותקים כמו קודם לכן. מתואר. סף המחזור (Ct) נרשם עבור כל הדגימות. בנוסף, הדגימות המדוללות היו \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) באמצעות cDNA מדולל 1:100 במי אגם מסוננים כמו \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR עבור 35 מחזורים. דוגמאות אלה מיוצגות כ-"1:100".
אלקטרודות ה-PCB מיוצרות באמצעות תהליך זמין מסחרית בעלות נמוכה Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) ללא צורך בציפוי זהב נוסף. מפרטי אלקטרודות ENIG PCB מפורטים בעבודה הקודמת שלנו.11 עבור אלקטרודות PCB ENIG, שיטות ניקוי אלקטרודות מסורתיות כגון תמיסת פיראנה או וולטמטריה מחזורית של חומצה גופרתית אינם מומלצים מכיוון שהם עלולים לגרום לקילוף של שכבת הזהב הדקה (עובי \(\בערך\) \(100\,\hbox {nm }\)) ולחשוף את שכבות הנחושת הבסיסיות המועדות לקורוזיה 21, 22, 23, 24, 25. לפיכך, נקו את האלקטרודות עם מטלית נטולת מוך שהורטבה ב-IPA. הדגימה שתיבדק הודגרה עם \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB ב-\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) להכנסה קלה. בעבודה הקודמת שלנו , ראינו שהרגישות והלינאריות של החיישן שופרו על ידי הגדלת ריכוז MB 11. בהתבסס על אופטימיזציות שדווחו בעבודה הקודמת שלנו, השתמשנו ב-\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB ריכוזים להטמעת DNA במחקר זה. ניתן להשיג זיהוי אלקטרוכימי של דנ"א דו-גדילי (ds-DNA) באמצעות אינטרקלטורים אנוניים או קטיוניים. למרות שאינטרקלטורים אנוניים מזהים DNA עם סלקטיביות טובה יותר, הם דורשים דגירה למשך לילה, וכתוצאה מכך זמני זיהוי ארוכים יותר. מצד שני, אינטרקלטורים קטיוניים כגון MB דורשים זמני דגירה קצרים יותר, בקירוב \({1}\,{\hbox {h}}\) לזיהוי אלקטרוכימי של ds-DNA6. כל מדידה כרוכה בחלוקת הדגימה לבדיקה על אלקטרודה\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), לאחר מכן ניקוי עם סמרטוט לח ב-IPA, לפני שתמשיך עם דגימה נוספת.מדידה אחת. כל דגימה נבדקה על 5 אלקטרודות שונות אלא אם צוין אחרת. מדידות DPV ו-CV בוצעו באמצעות פוטנטיוסטט PalmSens Sensit Smart, ותוכנת PSTrace שימשה לתצורת פוטנציוסטטים ורכישת נתונים, כולל חישובי זרם שיא. נעשה שימוש בהגדרות הבאות עבור מדידות DPV ו-CV:
DPV: זמן שיווי משקל = \(8\,\hbox {s}\), שלב מתח = \(3\,\hbox {mV}\), מתח דופק = \(25\,\hbox {mV}\) , משך דופק = \(50\,\hbox {ms}\), קצב סריקה = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
קורות חיים: זמן שיווי משקל = \(8\,\hbox {s}\), שלב מתח = \(3\,\hbox {mV}\), קצב סריקה = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
זרמי שיא המתקבלים מ-voltammograms של DNA מורכב עם \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV ו- CV voltammograms התקבלו על אלקטרודות PCB ENIG \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB מורכבים עם DNA (בריכוזים של 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) כלומר 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) עבור \(117\,\hbox {bp}\ ) ו-0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) עבור \(503\,\hbox {bp}\)). וולטמוגרפיות מייצגות מוצגות באיור S1 במידע משלים. איור 2 מציג את התוצאות של מדידות DPV ו-CV (שיא זרם) באמצעות מוצרי PCR מטוהרים בג'ל. בהשוואה למדידות CV, מדידות DPV מראות רגישות גבוהה יותר (זרם כפונקציה של ריכוז ה-DNA) מכיוון שהזרמים הקיבוליים ברקע במדידות CV מסתירים זרמים פאראדיים 26 .הנתונים עבור כל תיבה בתרשים הקופסה מכילה מדידות מ-5 אלקטרודות. כל המדידות משתמשות באותה סט של אלקטרודות כדי למנוע שגיאות מדידה עקב שונות אלקטרודה לאלקטרודה. ראינו מגמת עלייה בזרמי שיא שנמדדו ב-DPV וב-CV עבור ריכוזים נמוכים יותר של DNA , ארוך יותר (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ בהשוואה ל-\(117) ) fragment. זה תואם את המגמה הצפויה של ספיחת אלקטרודות שדווחה בעבודה הקודמת שלנו. ספיחה של קומפלקס MB-DNA מקלה על העברת המטען על האלקטרודה, מה שתורם להגדלת זרם השיא. מחקרים אחרים הראו את ההשפעה של גודל ורצף האוליגונוקלאוטידים על אינטרקלציה של MB-DNA27,28,29,30. הגואנין תוכן -ציטוזין (GC) של שני האמפליקונים (\(117\,\hbox {bp}\) ו-\(503\,\hbox {bp}\)) היה כ-50%, מה שמצביע על כך שההתבוננות ההבדל נובע לאורך האמפליקון. עם זאת, עבור ריכוזי DNA גבוהים יותר (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), עבור \(503\,\hbox {bp} \) ו-\( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) עבור \(117\,\hbox {bp}\)), אנו רואים שתי הגברות זרמי השיא של ה-subs מופחתים הן במדידות DPV והן במדידות CV. הסיבה לכך היא ש-MB רווי ומשתלב בין זוגות בסיסים של DNA, וכתוצאה מכך עיכוב סטרי של פעילות החיזור של הקבוצה הניתנת להפחתה ב-MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
מלחים הקיימים בתערובות מאסטר PCR מפריעים לאינטראקציות אלקטרוסטטיות בין MB ל-DNA, לכן על ידי הוספת \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) עם \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) מוצר מטוהר בג'ל של MB כדי לחקור את ההשפעה של מלח על אינטראקציה MB-DNA. כפי שמוצג באיור 3, ראינו שעבור ריכוזי DNA גבוהים יותר (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) ו-\(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) עבור \(117\,\hbox {bp} \)), ב-DPV וב-CV הוספת מלח לא השפיעה באופן משמעותי על המדידות (ראה איור S2 במידע משלים עבור וולטמוגרפיות מייצגות). עם זאת, ב- ריכוזי DNA נמוכים יותר, הוספת מלח מפחיתה מאוד את הרגישות, וכתוצאה מכך אין שינוי משמעותי בזרם עם ריכוז ה-DNA. השפעות שליליות דומות של מלח על אינטראקציות MB-DNA ואינטרקלציה דווחו בעבר על ידי חוקרים אחרים33,34.\(\hbox { קטיונים Mg}^{2+}\) נקשרים לחוט השדרה הפוספט השלילי של ה-DNA, ובכך מעכבים את האינטראקציה האלקטרוסטטית בין MB ל-DNA. בריכוזי DNA גבוהים יותר, עיכוב סטרי של MBs פעילי חיזור מביא לזרמי שיא נמוכים יותר, ולכן אינטראקציות אלקטרוסטטיות אינם משפיעים באופן משמעותי על תגובת החיישן. נקודת המפתח היא שהחיישן הביולוגי הזה מתאים יותר לזיהוי ריכוזי DNA גבוהים יותר (לעתים נדירות \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ומעלה), לעיבוד אוטומטי לחלוטין של דגימות מים סביבתיות, כאשר טיהור ג'ל של מוצרי PCR עשוי שלא להיות אפשרי.
שטח מתחת לעקומת הספיגה עבור טווח אורך הגל 600–700 \(\hbox {nm}\) עבור ריכוזים שונים של DNA מורכב עם \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) עם ובלי מלח (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) עם ובלי מלח (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) ריכוזי DNA התואמים ל-\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) דגימות MB ללא DNA.
כדי לאמת עוד יותר את התוצאות לעיל, ביצענו מדידות אופטיות באמצעות ספקטרופוטומטר UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), הדגימות \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) שימשו עבור כל מדידה.חתימת הספיגה יורדת עם עליית ריכוז ה-DNA, כפי שניתן לראות ממגמת השטח מתחת לעקומת הספיגה עבור טווח אורך הגל \(600\,\hbox {nm}\) עד \(700\,\hbox { nm}\), כפי שמוצג באיור. 4 (ספקטרום ספיגה מוצג באיור. S3 במידע משלים). עבור דגימות עם ריכוזי DNA הנמוכים מ-\({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), לא היה הבדל משמעותי בספיגה בין דגימות המכילות DNA ודגימות MB בלבד (עבור \(503\,\hbox {bp}\) ו-\(117\,\hbox {bp}\ ) שברי אורך), המעידים על היעדר עיכוב סטרי של MB-פעיל חיזור. בריכוזי DNA גבוהים יותר, ראינו ירידה הדרגתית באות הספיגה וציינו ירידה פחותה בספיגה בנוכחות מלח. תוצאות אלו יוחסו למולקולריות אינטראקציות ועיכוב סטרי עם ערימת בסיס בהכלאות DNA. התוצאות שלנו עולות בקנה אחד עם דיווחים בספרות על מחקרים ספקטרוסקופיים של אינטרקלציה של MB-DNA המקשרים היפוכרומטיות עם רמות אנרגיה מופחתות ב-\(\pi ^*\ ) מעברים אלקטרוניים עקב אינטרקלציה שכבות 36, 37, 38.
אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז של פאג Phi6: תוצרי PCR באורך \(117\,\hbox {bp}\) ו-\(503\,\hbox {bp}\) מדגימות מי אגם. סמן M-DNA;בקרת NTC-no-template, פריימרים המכילים אמפליקונים מתאימים;בקרה חיובית למחשב;דגימות מי אגם 1, 2, 3-לא מדוללות (1:1) עם ספיצים בשלושה עותקים. פס נראית ב-\(\about 50\,\hbox {bp}\) עקב אוליגונוקלאוטידים שאינם בשימוש ב-\(503\,\ hbox {bp}\) ליין.
הערכנו את התועלת של החיישן באמצעות דגימות מים של אגם Powai עם ספיקים של Phi6 phage. ריכוזי ה-RNA שבודדו מדגימות מים ספיצי פאג' נעו בין 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), בעוד אלו שבודדו מתרחפי פאג'ים מטוהרים. ה-RNA הוערך כ-\({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) עם יעילות התאוששות של כ-1 %.RNA הועתק לאחור ל-cDNA ושימשה כתבנית עבור PCR ו-qPCR. גודל המוצר אושר על ידי אלקטרופורזה של ג'ל agarose (איור 5) לפני בדיקה עם החיישן. דגימות אלו אינן מטוהרות ג'ל ולכן מכילות את כל מרכיבי ה-PCR כמו כמו גם האמפליקונים המעניינים. ערכי ה-Ct שנרשמו במהלך qPCR (טבלה 1) הראו מתואמים עם ריכוז ה-RNA שבודד מדגימות המים המתואם. ערך ה-Ct חושף את מספר המחזורים הנדרשים לאות הפלורסנט ל חורגים מהסף או אות הרקע. ערכי Ct גבוהים יותר מציינים ריכוזי תבנית נמוכים יותר ולהיפך. ערכי Ct של דגימות ה-NTC היו גבוהים כצפוי. ההבדל בערכי \(\בערך 3\) Ct בין הבקרה החיובית ודגימת הבדיקה מצביעות עוד יותר על כך שלכל דגימת בדיקה יש תבנית של כ-1% בהשוואה לבקרה החיובית. דנו בעבר שאמפליקונים ארוכים יותר מובילים לרגישות טובה יותר. הגברה של שברים ארוכים יותר מבודדים מדגימות סביבתיות הטרוגניות היא מאתגרת בהתחשב בחסרונות עם ריכוז נגיפי נמוך ופירוק RNA. עם זאת, עם הפרוטוקול של העשרת הווירוסים ופרוטוקול הגברה של PCR, הצלחנו להגביר בהצלחה את מקטע \(503\,\hbox {bp}\) לחישה אלקטרוכימית.
איור 6 מציג את תוצאות החיישן האלקטרוכימי של אמפליקון המקטע \(503\,\hbox {bp}\), הן באמצעות cDNA לא מדולל כתבנית (1:1) והן cDNA מדולל פי 100 כתבנית (1:100 ) שבוצעה PCR , בהשוואה ל-NTC ו-PC (ראה איור S4 במידע משלים עבור וולטאמוגרפיות מייצגות). כל קופסה בתרשים הקופסה באיור 6 מכילה מדידות משלוש דגימות ב-5 אלקטרודות. אותן אלקטרודות שימשו למדידת כל הדגימות כדי למנוע שגיאות עקב אלקטרודה בהשוואה למדידות קורות חיים, מדידות DPV מראות רזולוציה טובה יותר כדי להבחין בין דגימות בדיקה ו-PC לבין NTCs, מכיוון שכפי שצוין קודם לכן, זרמים פאראדיים מוסתרים עקב זרמים קיבוליים ברקע באחרונים. עבור אמפליקונים ארוכים יותר, ראינו ש הבקרה השלילית (NTC) הביאה לזרמי שיא CV ו-DPV גבוהים יותר ביחס לבקרה החיובית, בעוד שדגימות בדיקה חיוביות ובלתי מדוללות הראו גבהי שיא דומים של זרמי שיא DPV. הערכים הממוצעים והחציוניים הנמדדים עבור כל אחד לא מדולל (1:1 ) ניתן לפתור בבירור את דגימת הבדיקה והמחשב מפלט החיישן עבור דגימת ה-NTC, בעוד שהרזולוציה עבור המדגם המדולל ב-1:100 פחות בולטת. עבור דילול פי 100 של cDNA, לא ראינו פסים כלשהם במהלך אלקטרופורזה של ג'ל (נתיבים לא מוצגים באיור 5), וזרמי שיא ה-DPV וה-CV התואמים היו דומים לאלו הצפויים עבור NTC. התוצאות עבור הפרגמנט \(117\,\hbox {bp}\) מוצגות במידע משלים. הבקרה גרמה לתגובה אלקטרוכימית מחיישן ה-PCB עקב ספיחה של MB חופשי על האלקטרודה והאינטראקציה של MB עם אוליגונוקלאוטיד פריימר חד-גדילי. לכן, בכל פעם שדגימה נבדקת, יש להפעיל בקרה שלילית ולהפעיל את זרם שיא של דגימת הבדיקה בהשוואה לשיא זרם המתקבל על ידי הבקרה השלילית כדי להשיג מדידה דיפרנציאלית (יחסית)39,40 כדי לסווג את דגימת הבדיקה כחיובית או שלילית.
(א) DPV, ו-(ב) זרם שיא CV לזיהוי אלקטרוכימי של שברי \(503\,\hbox {bp}\) בדגימות מי אגם. דגימות הבדיקה נמדדו בשלושה עותקים והשוו ללא תבנית בקרות (NTC) ו בקרות חיוביות (PC).
הממצאים שלנו ממחישים מנגנונים שונים המשפיעים על הביצועים של חיישנים אלקטרוכימיים עבור אמפליקונים באורכים שונים עבור DNA שונים, עם ריכוזים מאומתים על ידי מדידות אופטיות באמצעות ספקטרופוטומטר UV/Vis. התצפיות שלנו מדגישות את התובנה כי שברי DNA ארוכים יותר עד \(\בערך\) ניתן לזהות \(500\,\hbox {bp}\) ברגישות גבוהה יותר ושנוכחות של מלח בדגימה אינה משפיעה על ריכוז DNA שמשפיע על רגישות גבוהה יותר (לעתים נדירות \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ומעלה). בנוסף, חקרנו את ההשפעה של סוגים שונים של דגימות, כולל אמפליקונים מטוהרים בג'ל עם וללא תוספת מלח, והוספת דגימות מי אגם במדידות DPV ו-CV.ראינו ש-DPV סיפק רזולוציה טובה יותר, מכיוון שהזרם הקיבולי ברקע משפיע גם על מדידת ה-CV, מה שהופך אותו לפחות רגיש.
הגברה של מקטעים ארוכים יותר תלויה בשלמות ה-RNA הגנומי הנגיפי. מספר מחקרים הראו שהגברה של מקטעים ארוכים יותר אינה תמיד יעילה עקב פירוק ה-RNA בסביבה ופוטנציאל השחבור במהלך הבידוד11,41,42,43,44 ראינו ששיטת ריכוז הנגיפים מבוססת PEG הייתה יעילה יותר בריכוז הפאג Phi-6 עם ספיצים בדגימות מי האגם מאשר שיטת ריכוז הווירוסים המבוססת על אלומיניום הידרוקסיד. היכולת לזהות שברי DNA ארוכים הוכחה כמתגברת על הדרישה ל-Multiplex PCR כדי להגביר מספר תבניות באורך קצר יותר ולהפחית את האפשרות לספציפיות צולבת.
דגימות ביולוגיות נדירות, ולכן יש צורך בתכנון ביו-חיישן הדורש דגימות מינימליות לבדיקה. אלקטרודות ה-ENIG PCB ששימשו במחקר זה דרשו רק \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) דגימות לבדיקה כדי לכסות את השטח היעיל של האלקטרודות. בנוסף, ניתן לעשות שימוש חוזר באותה אלקטרודה לאחר ניקוי לפני חלוקת הדגימה הבאה. דגימות מוגברות אינן מצריכות תוספת של כימיקלים כלשהם מלבד מתילן כחול, שהוא לא יקר וכימיקלים בשימוש נפוץ. מאחר וכל אלקטרודה עולה בערך $0.55 (או INR 40) לייצור, חיישן ביולוגי זה יכול להוות חלופה חסכונית לטכנולוגיות זיהוי קיימות. טבלה 2 מציגה השוואה של עבודה זו עם חיישנים אחרים שדווחו בספרות לאורך זמן שברי DNA בדגימות הטרוגניות.
בהתחשב בכך שפרוטוקולי זיהוי אלקטרוכימיים מבוססי MB מסתמכים על הספציפיות של PCR, מגבלה עיקרית של שיטה זו היא הפוטנציאל להגברה לא ספציפית בדגימות הטרוגניות כגון מי שפכים ומי אגם או שימוש בפריימרים בעלי טוהר נמוך. כדי לשפר את הרגישות של שיטות זיהוי אלקטרוכימיות לזיהוי DNA של מוצרי PCR לא מטוהרים באמצעות אלקטרודות ENIG PCB ללא שינוי, יש צורך להבין טוב יותר שגיאות שהוכנסו על ידי dNTPs ו-primers שאינם בשימוש, ולמטב את תנאי התגובה ופרוטוקולי הבדיקה. פרמטרים פיזיקוכימיים נוספים כגון pH, טמפרטורה וביולוגיים ייתכן שיהיה צורך למדוד את דרישת החמצן (BOD) של דגימת המים על מנת לשפר את דיוק המדידה.
לסיכום, אנו מציעים חיישן PCB אלקטרוכימי ENIG בעלות נמוכה לזיהוי וירוסים בדגימות סביבתיות (מי אגם). שלא כמו אלקטרודות אוליגונוקלאוטידים מקובעות או מצעים מותאמים אישית לחישת DNA הדורשים אחסון קריוגני כדי לשמור על רגישות,53,54 הטכניקה שלנו משתמשת ב-PCB ללא שינוי. אלקטרודות עם חיי מדף ארוכים יותר וללא דרישות אחסון ספציפיות ולכן מתאימות לפיתוח פתרונות מדידה עם עיבוד דגימות אוטומטי הפרוסות ב-LMICs. החיישן הביולוגי משתמש בצבעי חיזור (MB) לא יקרים לזיהוי מהיר של אמפליקוני מטרה. ההגברה הלא ספציפית נפוץ בדגימות סביבתיות מפחית את הספציפיות של שיטת חישה זו עקב הקישור הלא ספציפי של MBs לאוליגונוקלאוטידים חד ודו-גדיליים. לכן, הספציפיות של בדיקה זו תלויה באופטימיזציה של פריימרים ותנאי תגובת PCR. בנוסף, ה- CV וזרמי שיא DPV שהתקבלו מהדגימות שנבדקו צריכים להתפרש ביחס לתגובות המתקבלות מהבקרה השלילית (NTC) עבור כל בדיקה. ניתן לשלב את העיצובים והשיטות של החיישנים האלקטרוכימיים המוצגים בעבודה זו עם דגימות אוטומטיות כדי לפתח אוטומטי לחלוטין ונמוך פתרון בעלויות שיכול לאסוף ולנתח דגימות ולשדר תוצאות באופן אלחוטי בחזרה למעבדה.
Cashdollar, J. & Wymer, L. שיטות לריכוז ראשוני של וירוסים מדגימות מים: סקירה ומטה-אנליזה של מחקרים עדכניים.J.Application.microorganism.115, עמ' 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Waterborne viruses: Barriers to בטוחה למי שתייה. PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.Wastewater epidemiology עבור מעקב חסכוני בקנה מידה גדול של COVID-19 במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית: אתגרים והזדמנויות. Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. חומצת גרעין electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylene blue כמבחין אלקטרוכימי של אוליגונוקלאוטידים חד ודו-גדיליים המשובשים על מצעי זהב. Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ השוואה של אינטרקלטורים של קטונים ואניונים עבור התמרה אלקטרוכימית של הכלאה של DNA על ידי העברת אלקטרונים ארוכת טווח.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ העברת מטען דרך DNA: biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006) סלקטיבי של DNA.
Fang, TH וחב'. מכשיר מיקרו-נוזל PCR בזמן אמת עם זיהוי אלקטרוכימי במקביל.חיישן ביולוגי.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al.מחקר מנגנון איתות ואימות ביצועים של מערכת PCR אלקטרוכימית בזמן אמת המבוססת על האינטראקציה של מתילן כחול עם DNA.Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al. חיישן אלקטרוכימי מבוסס הגברה איזותרמית בתיווך לולאה לזיהוי sars-cov-2 בדגימות שפכים.J.סביבה.כימיה.בריטניה.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al. חישה אלקטרוכימית של אמפליקונים של SARS-CoV-2 עם אלקטרודות PCB. החיישן מופעל.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. זיהוי יעיל של SARS-CoV-2 RNA בחלק המוצק של wastewater.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al. שיטות אנליטיות לזיהוי SARS-CoV-2 בשפכים: פרוטוקול ונקודות מבט עתידיות. TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. הישרדות של הבקטריופאג העטוף Phi6 (פונדקאית ל-SARS-CoV-2) בטיפות רוק מתאדות המופקדות על משטחי זכוכית.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ התמדה סביבתית של סרוגייט SARS-CoV-2 (Phi6) באמבה חיה חופשית.J.בריאות המים 20, 83 (2021).
Mindich, L. אריזה מדויקת של שלושה שברים גנומיים של בקטריופאג RNA דו-גדילי\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, מבנה משני של DH RNA phage\(\varphi\)6 packaging region.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – פרוטוקול מהיר ויעיל להכנת מלאי מעבדה של בקטריופאג'ים.PeerJ 4, e2261 (2016).
זמן פרסום: 27 במאי 2022