Terima kasih telah mengunjungi Nature.com.Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan terbatas untuk CSS.Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau matikan mode kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan lanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Pentingnya pemantauan sampel lingkungan telah sangat diapresiasi sejak awal pandemi COVID-19, dan beberapa upaya pemantauan dilakukan dengan menggunakan standar emas, meskipun teknik berbasis qPCR mahal. Biosensor DNA elektrokimia dapat memberikan potensi penghematan biaya solusi untuk memantau sampel air lingkungan di negara berpenghasilan rendah dan menengah. Dalam karya ini, kami mendemonstrasikan deteksi elektrokimia amplikon yang diperoleh dari fag Phi6 yang diisolasi dari sampel air danau berduri (pengganti populer untuk SARS-CoV-2), menggunakan ENIG untuk menyelesaikan elektroda PCB tanpa modifikasi permukaan.jenis kelamin. Respons sensor elektrokimia dicirikan secara menyeluruh untuk dua fragmen DNA dengan panjang berbeda (\({117}\,\hbox {bp}\) dan \({503}\,\hbox {bp}\)), dan efek garam dalam campuran master PCR pada interaksi methylene blue (MB)-DNA. Hasil kami menunjukkan bahwa panjang fragmen DNA secara signifikan menentukan sensitivitas elektrokimia dan menunjukkan dalam pekerjaan ini bahwa kemampuan untuk mendeteksi amplikon panjang tanpa pemurnian gel produk PCR adalah penting untuk pengukuran sampel air secara in situ.Solusi yang sepenuhnya otomatis untuk viral load menjadi pertanda baik.
Penularan virus yang ditularkan melalui air telah dikenal sebagai bahaya kesehatan masyarakat sejak tahun 1940-an, dengan bukti pertama penularan polio dan hepatitis E1 yang ditularkan melalui air. Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) telah mengklasifikasikan beberapa patogen virus yang ditularkan melalui air dengan signifikansi kesehatan sedang hingga tinggi2. Virus tradisional metode deteksi bergantung pada teknik berbasis qPCR standar emas, yang sangat sensitif dan spesifik, tetapi membutuhkan personel terampil untuk menguji di laboratorium menggunakan instrumen mahal. Namun, di negara berpenghasilan rendah dan menengah (LMICs) dengan sumber daya terbatas, manusia pengujian sampel kemungkinan akan lebih diutamakan daripada pemantauan sampel air lingkungan. Oleh karena itu, metode alternatif berbiaya rendah diperlukan untuk pemantauan sampel air dan air limbah secara real-time dan berkelanjutan di negara berpenghasilan rendah dan menengah sebagai peringatan dini akan munculnya wabah penyakit, dengan demikian melindungi mereka dari dampak sosial ekonomi yang parah dari pandemi virus. Biosensor elektrokimia berbiaya rendah untuk asam nukleat dapat memberikan solusi potensial yang menjanjikan untuk kebutuhan yang tidak terpenuhi ini. Banyak dari biosensor DNA ini bekerja berdasarkan fakta bahwa untaian DNA komplementer tidak bergerak pada elektroda permukaan dan hibridisasi ketika urutan yang cocok hadir dalam sampel. Ini kemudian dapat diubah menjadi sinyal dengan berbagai teknik elektrokimia menggunakan mediator redoks seperti kalium besi/ferosianida. Biru metilen (MB) adalah salah satu molekul aktif redoks, yang memiliki telah dilaporkan menginterkalasi ke dalam DNA beruntai ganda (dsDNA) di samping ikatannya yang lebih spesifik dengan DNA beruntai tunggal5,6. Sifat interkalasi MB untuk membentuk kompleks MB-DNA menjadikannya pilihan populer sebagai mediator redoks dalam beberapa DNA elektrokimia konfigurasi sensor5,6,7,8,9. Meskipun interkalasi MB ke DNA tidak spesifik, dan spesifisitas sensor elektrokimia ini sangat tergantung pada kemurnian primer yang digunakan untuk PCR atau amplifikasi isotermal, sensor ini cocok untuk mengimplementasikan qPCR berbasis elektrokimia waktu atau amplifikasi isotermal fluoresensi sebagai alternatif untuk pengukuran konsentrasi DNA 9. Dalam salah satu implementasi tersebut, Won et al. pengukuran amplikon PCR dengan MB menggunakan differential pulse voltammetry (DPV). digunakan sebagai elektroda in situ dalam platform mikrofluida PCR yang dirancang untuk mendeteksi amplikon secara elektrokimia selama reaksi 8. Semua studi ini memerlukan modifikasi permukaan elektroda, menyiratkan peningkatan biaya produksi dan pengoperasian karena persyaratan penyimpanan khusus untuk stabilitas elektroda yang difungsikan ini.
Skema alur kerja untuk deteksi elektrokimia amplikon yang diperoleh dari partikel virus pekat dalam sampel air danau.
Kami baru-baru ini mendemonstrasikan penginderaan elektrokimia amplikon SARS-CoV-2 dengan elektroda papan sirkuit cetak (PCB) berbiaya rendah berdasarkan DPV dan voltametri siklik (CV) yang diinduksi oleh adsorpsi kompleks MB-DNA pada permukaan elektroda yang tidak dimodifikasi ) perubahan puncak saat ini11.Kami melaporkan bahwa fragmen DNA yang lebih panjang (N1-N2, \({943}\, \hbox) yang dibentuk menggunakan primer N1 forward dan N2 reverse yang direkomendasikan CDC dibandingkan dengan fragmen yang lebih pendek {bp}\)) menunjukkan linearitas yang lebih baik dalam respons sensor ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) dibentuk menggunakan set primer N1 maju dan mundur N1. Studi ini dilaporkan menggunakan pengenceran DNA yang disiapkan dalam air bebas nuklease. Platform ini juga digunakan untuk mendeteksi SARS-CoV -2 amplikon dalam sampel air limbah simulasi (diperoleh dengan menambahkan sampel RNA total dengan RNA SARS-CoV-2). Karena RNA rentan terhadap pemotongan selama isolasi dan pemrosesan hilir,12,13 sulit untuk memperkuat fragmen yang lebih panjang dengan sampel heterogen ini. Oleh karena itu, demonstrasi penginderaan elektrokimia amplikon SARS-CoV-2 dalam air limbah terbatas pada fragmen \(72\,\hbox {bp}\) N1 yang lebih pendek.
Dalam karya ini, kami menyelidiki kelayakan penginderaan elektrokimia berbasis ENIG PCB dari fag Phi6 yang terkonsentrasi dan diisolasi dari sampel air danau (Gbr. 1). Fag Phi6 memiliki ukuran yang sebanding (80-100 nm) dengan SARS-CoV-2 dan juga memiliki membran lipid dan protein lonjakan. Untuk alasan ini, bakteriofag Phi6 adalah pengganti yang populer untuk SARS-CoV-2 dan virus RNA patogen berselubung lainnya14,15.RNA yang diisolasi dari partikel fag digunakan sebagai templat untuk sintesis cDNA diikuti oleh PCR untuk mendapatkan dua fragmen DNA dengan panjang 117 dan 503 pasangan basa. Mengingat tantangan untuk memperkuat \(943\,\hbox {bp}\) fragmen N1-N2 dalam pekerjaan kami sebelumnya, kami menargetkan fragmen panjang menengah (\(117 \,\hbox {bp}\) dan \(503 \,\hbox {bp}\)), berdasarkan primer yang tersedia. Respons sensor elektrokimia dipelajari secara sistematis pada rentang konsentrasi yang luas (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) ke \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Untuk kedua fragmen di kehadiran MB, efek garam pada respon sensor telah dikarakterisasi dan divalidasi silang dengan pengukuran spektrofotometri. Kontribusi utama dari pekerjaan ini adalah sebagai berikut:
Panjang fragmen DNA dan adanya garam dalam sampel sangat mempengaruhi sensitivitas.Hasil kami menunjukkan bahwa aktivitas elektrokimia bergantung pada mekanisme interaksi MB, DNA, dan sensor yang berbeda dalam respons voltametri, bergantung pada konsentrasi dan panjang DNA, dengan fragmen yang lebih panjang menunjukkan sensitivitas yang lebih tinggi, meskipun garam memiliki efek negatif pada interaksi elektrostatik antara MB dan DNA.
Konsentrasi DNA menentukan mekanisme interaksi MB-DNA dalam elektroda yang tidak dimodifikasi Kami menunjukkan bahwa mekanisme interaksi MB-DNA yang berbeda bergantung pada konsentrasi DNA. Pada konsentrasi DNA di bawah sejumlah kecil \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), kami mengamati bahwa respons arus elektrokimia terutama ditentukan oleh adsorpsi MB-DNA pada elektroda, sedangkan pada konsentrasi yang lebih rendah Pada konsentrasi DNA yang tinggi, respons arus elektrokimia ditentukan oleh penghambatan sterik redoks aktivitas karena penyisipan MB antara pasangan basa DNA.
Penginderaan Elektrokimia Berbasis ENIG PCB dari Asam Nukleat Viral dalam Sampel Air Danau Pengamatan divalidasi dengan deteksi elektrokimia fragmen DNA \(503\,\hbox {bp}\) yang ditambahkan Phi6 yang diperoleh dari sampel air dari Danau Powai, Kampus IIT Mumbai Fag hasil.
Biaya implementasi yang rendah dan potensi integrasi ke dalam sistem pemantauan, oligonukleotida, atau aptamer yang sepenuhnya otomatis pada elektroda dengan umur simpan yang lebih lama.
Phage Phi6 adalah virus dsRNA berselubung dari famili Cytoviridae yang menginfeksi Pseudomonas syringae. Genom phage Phi6 ada dalam bentuk 3 fragmen: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07 \,\hbox {Kb}\)) dan L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Karena fag Phi6 menginfeksi strain Pseudomonas BSL-1 non-patogen, maka aman untuk digunakan dan dapat dengan mudah ditanam di laboratorium. Phage Phi6 dan inangnya Pseudomonas syringae dibeli dari Pusat Referensi Felix d'Herelle untuk Virus Bakteri, Universitas Laval, Kanada (nomor katalog pusat referensi masing-masing adalah HER-102 dan HER-1102) .Phi6 phage dan inangnya dihidupkan kembali seperti yang diarahkan oleh pusat referensi.Phage Phi6 dimurnikan dengan lisis pelat dan elusi untuk mendapatkan titer akhir dengan \(\sekitar 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (unit pembentuk plak/ mililiter).RNA diisolasi dari partikel fag yang dimurnikan menggunakan Kit Pemurnian RNA Total Universal GenElute™ (Sigma-Aldrich) sesuai dengan instruksi pabrik. Secara singkat, suspensi Phi6 fag yang dimurnikan\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) dilisiskan dan lisat dimuat ke kolom spin untuk memungkinkan RNA berikatan dengan kolom resin. RNA kemudian dielusi dalam larutan elusi \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) disediakan oleh kit. Perkirakan konsentrasi RNA dengan absorbansi pada \(260\,\hbox {nm}\).RNA disimpan dalam alikuot di \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) hingga digunakan lebih lanjut.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Kit Sintesis cDNA iScript (Bio -Rad Laboratories) digunakan sebagai template untuk sintesis cDNA mengikuti instruksi pabriknya. Singkatnya, reaksi sintesis cDNA terdiri dari 3 langkah: priming pada \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , membalikkan transkripsi \({20}\,{\hbox {min}}\) di \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), dan sebaliknya Perekam berada di \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) for \({1}\,{\hbox {min }}\). Ketika dijalankan pada gel agarosa 1%, cDNA menunjukkan tiga pita yang sesuai dengan tiga fragmen RNA yang diharapkan (data tidak ditampilkan). Primer berikut digunakan untuk memperkuat dua fragmen DNA dengan panjang 117 dan 503 bp, menggunakan cDNA sebagai template untuk PCR di miniPCR® mini8 thermal cycler:
Primer untuk \(117\,\hbox {bp}\) dan \(503\,\hbox {bp}\) sesuai dengan 1476-1575 nukleotida segmen M dan 458-943 nukleotida segmen L, masing-masing bersifat asam .Semua produk PCR yang diamplifikasi dielektroforesis pada gel agarosa 1%, dan DNA target yang diamplifikasi dimurnikan menggunakan Kit Ekstraksi Gel GeneJET (Thermo Fisher Scientific).
Sebuah danau di kampus IIT Mumbai (Danau Powai, Powai, Mumbai) digunakan untuk menambahkan partikel fag. Air danau disaring melalui membran \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) untuk menghilangkan partikel tersuspensi, dan kemudian fag Phi6 ditambahkan. Tambahkan \({1}\,{\hbox {ml}}\) dari \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) ke \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) menyaring air danau, di \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\).Alikuot kecil adalah dicadangkan untuk pengukuran viral load dengan uji plak. Kami menguji dua metode berbeda untuk memekatkan partikel virus Phi6 berduri: (1) metode pengendapan-adsorpsi aluminium hidroksida,19 yang telah divalidasi untuk konsentrasi beberapa virus RNA beramplop dari sampel lingkungan, dan (2) ) Metode konsentrasi virus berbasis polietilen glikol (PEG) diadaptasi dari Flood et al.20 .Karena efisiensi pemulihan metode berbasis PEG ditemukan lebih baik daripada metode aluminium hidroksida, metode berbasis PEG digunakan untuk memekatkan partikel Phi6 dari sampel air danau.
Metode PEG yang digunakan adalah sebagai berikut: PEG 8000 dan \(\hbox {NaCl}\) ditambahkan ke sampel air danau berduri Phi6 untuk mendapatkan 8 % PEG 8000 dan \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\). Sampel diinkubasi pada shaker\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), kemudian disentrifugasi pada \(4700 \,\hbox {g}\) adalah \({45}\,{\hbox {min}}\). Buang supernatan dan suspensikan kembali pelet di \({1}\, {\ hbox {ml}}\) dalam supernatan yang sama. Semua percobaan spiking dan konsentrasi virus dilakukan dalam rangkap tiga. Setelah konsentrasi, alikuot kecil dicadangkan untuk pengukuran efisiensi pemulihan dengan uji plak. RNA diisolasi seperti yang dijelaskan sebelumnya dan dielusi dalam buffer elusi yang disediakan kit\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Karena konsentrasi RNA akan bervariasi dari sampel ke sampel dalam rangkap tiga, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) dari RNA digunakan untuk ketiganya terlepas dari konsentrasinya sintesis cDNA sampel. Sintesis cDNA dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA digunakan sebagai template untuk \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR selama 35 siklus untuk memperkuat \ (117\,\hbox {bp}\) dan \(503\,\hbox { bp}\). sebagai template untuk kontrol positif (PC). PCR kuantitatif (qPCR) dilakukan dalam instrumen RT-PCR Stratagene Mx3000P menggunakan Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Reaksi diatur dalam rangkap tiga seperti sebelumnya dijelaskan. Ambang siklus (Ct) dicatat untuk semua sampel. Selain itu, sampel yang diencerkan adalah \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) menggunakan cDNA yang diencerkan 1:100 dalam air danau yang disaring sebagai \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR selama 35 siklus. Sampel ini direpresentasikan sebagai “1:100″.
Elektroda PCB dibuat menggunakan proses Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) murah yang tersedia secara komersial tanpa memerlukan pelapisan emas tambahan. Spesifikasi elektroda ENIG PCB dirinci dalam pekerjaan kami sebelumnya11.Untuk elektroda PCB ENIG, metode pembersihan elektroda tradisional seperti Larutan piranha atau voltametri siklik asam sulfat tidak disarankan karena dapat menyebabkan pengelupasan lapisan tipis emas (ketebalan \(\kira-kira\) \(100\,\hbox {nm }\)) dan mengekspos lapisan tembaga di bawahnya yang rentan terhadap korosi 21, 22, 23, 24, 25.Oleh karena itu, bersihkan elektroda dengan kain bebas serabut yang dibasahi IPA. Sampel yang akan diuji diinkubasi dengan \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB di \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) untuk penyisipan yang mudah. Dalam pekerjaan kami sebelumnya , kami mengamati bahwa sensitivitas dan linearitas sensor ditingkatkan dengan meningkatkan konsentrasi MB 11 . Berdasarkan pengoptimalan yang dilaporkan dalam pekerjaan kami sebelumnya, kami menggunakan \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB konsentrasi untuk menyematkan DNA dalam penelitian ini. Deteksi elektrokimia DNA beruntai ganda (ds-DNA) dapat dicapai dengan menggunakan interkalator anionik atau kationik. Meskipun interkalator anionik mendeteksi DNA dengan selektivitas yang lebih baik, interkalator anionik memerlukan inkubasi semalaman, menghasilkan waktu deteksi yang lebih lama. di sisi lain, interkalator kationik seperti MB membutuhkan waktu inkubasi yang lebih pendek, kira-kira \({1}\,{\hbox {h}}\) untuk deteksi elektrokimia ds-DNA6. Setiap pengukuran melibatkan pengeluaran sampel untuk diuji pada elektroda\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), lalu bersihkan dengan lap yang dibasahi IPA, sebelum melanjutkan dengan sampel lain.satu pengukuran. Setiap sampel diuji pada 5 elektroda yang berbeda kecuali dinyatakan lain. Pengukuran DPV dan CV dilakukan menggunakan potensiostat Smart PalmSens Sensit, dan perangkat lunak PSTrace digunakan untuk konfigurasi potensiostat dan akuisisi data, termasuk perhitungan arus puncak. Pengaturan berikut digunakan untuk pengukuran DPV dan CV:
DPV: Waktu Ekuilibrium = \(8\,\hbox {s}\), Langkah Tegangan = \(3\,\hbox {mV}\), Tegangan Pulsa = \(25\,\hbox {mV}\) , durasi pulsa = \(50\,\hbox {ms}\), laju pemindaian = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Waktu Kesetimbangan = \(8\,\hbox {s}\), Langkah Tegangan = \(3\,\hbox {mV}\), Laju Sapu = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Arus puncak diperoleh dari voltammogram DNA yang dikomplekskan dengan \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Voltammogram DPV dan CV diperoleh pada elektroda ENIG PCB \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB yang dikomplekskan dengan DNA (pada konsentrasi 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) yaitu 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) untuk \(117\,\hbox {bp}\ ) dan 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) untuk \(503\,\hbox {bp}\)). Voltammogram representatif ditunjukkan pada Gambar S1 di Informasi Tambahan. Gambar 2 menunjukkan hasilnya pengukuran DPV dan CV (arus puncak) menggunakan produk PCR yang dimurnikan gel. Dibandingkan dengan pengukuran CV, pengukuran DPV menunjukkan sensitivitas yang lebih tinggi (arus sebagai fungsi konsentrasi DNA) karena arus kapasitif latar belakang dalam pengukuran CV menyembunyikan arus Faradaic 26 .Data untuk setiap kotak di petak kotak berisi pengukuran dari 5 elektroda. Semua pengukuran menggunakan set elektroda yang sama untuk menghindari kesalahan pengukuran karena variasi elektroda-ke-elektroda. Kami mengamati tren peningkatan arus puncak terukur DPV dan CV untuk konsentrasi DNA yang lebih rendah , lebih lama (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ dibandingkan dengan fragmen \(117) ). Ini konsisten dengan tren yang diharapkan dari adsorpsi elektroda yang dilaporkan dalam pekerjaan kami sebelumnya. adsorpsi kompleks MB-DNA memfasilitasi transfer muatan pada elektroda, yang berkontribusi pada peningkatan arus puncak. Penelitian lain menunjukkan efek ukuran dan urutan oligonukleotida pada interkalasi MB-DNA27,28,29,30.Guanin Kandungan -cytosine (GC) dari dua amplikon (\(117\,\hbox {bp}\) dan \(503\,\hbox {bp}\)) kira-kira 50%, menunjukkan bahwa pengamatan Perbedaan disebabkan hingga panjang amplikon. Namun, untuk konsentrasi DNA yang lebih tinggi (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), untuk \(503\,\hbox {bp} \) dan \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) untuk \(117\,\hbox {bp}\)), kami mengamati dua amplifikasi arus puncak subs berkurang dalam pengukuran DPV dan CV. Hal ini karena MB menjenuhkan dan menyisipkan antara pasangan basa DNA, menghasilkan penghambatan sterik aktivitas redoks dari kelompok yang dapat direduksi dalam MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Garam yang ada dalam campuran master PCR mengganggu interaksi elektrostatik antara MB dan DNA, jadi dengan menambahkan \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) dengan \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) produk MB gel-purified untuk mempelajari efek garam pada interaksi MB-DNA. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3, kami mengamati bahwa untuk konsentrasi DNA yang lebih tinggi (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) dan \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) untuk \(117\,\hbox {bp} \)), dalam DPV dan CV Penambahan garam tidak mempengaruhi pengukuran secara signifikan (lihat Gambar S2 dalam Informasi Tambahan untuk voltammogram representatif). Namun, pada konsentrasi DNA yang lebih rendah, penambahan garam sangat mengurangi sensitivitas, sehingga tidak ada perubahan signifikan dalam konsentrasi DNA saat ini. Efek negatif yang serupa dari garam pada interaksi dan interkalasi MB-DNA telah dilaporkan sebelumnya oleh peneliti lain33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) kation berikatan dengan tulang punggung fosfat negatif DNA, sehingga menghambat interaksi elektrostatik antara MB dan DNA. Pada konsentrasi DNA yang lebih tinggi, penghambatan sterik MB redoks-aktif menghasilkan arus puncak yang lebih rendah, sehingga interaksi elektrostatik tidak secara signifikan memengaruhi respons sensor. Intinya adalah bahwa biosensor ini lebih cocok untuk mendeteksi konsentrasi DNA yang lebih tinggi (jarang \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) atau lebih tinggi), untuk pemrosesan sampel air lingkungan yang sepenuhnya otomatis, di mana pemurnian gel produk PCR mungkin tidak dapat dilakukan.
Area di bawah kurva serapan untuk rentang panjang gelombang 600–700 \(\hbox {nm}\) untuk berbagai konsentrasi DNA yang dikomplekskan dengan \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) dengan dan tanpa garam (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) dengan dan tanpa garam (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) konsentrasi DNA sesuai dengan \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) sampel MB Tidak ada DNA.
Untuk lebih memverifikasi hasil di atas, kami melakukan pengukuran optik menggunakan spektrofotometer UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), sampel \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) digunakan untuk setiap Pengukuran. Tanda serapan menurun dengan meningkatnya konsentrasi DNA, seperti yang terlihat dari kecenderungan area di bawah kurva serapan untuk rentang panjang gelombang \(600\,\hbox {nm}\) hingga \(700\,\hbox { nm}\), seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4 (spektrum serapan ditunjukkan pada Gambar. S3 dalam Informasi Tambahan). Untuk sampel dengan konsentrasi DNA kurang dari \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), tidak ada perbedaan signifikan dalam serapan antara sampel yang mengandung DNA dan hanya MB (untuk \(503\,\hbox {bp}\) dan \(117\,\hbox {bp}\ ) panjang fragmen), menunjukkan tidak adanya penghambatan sterik MB redoks-aktif. Pada konsentrasi DNA yang lebih tinggi, kami mengamati penurunan sinyal absorbansi secara bertahap dan mencatat penurunan absorbansi yang lebih rendah dengan adanya garam. Hasil ini dikaitkan dengan molekul interaksi dan penghambatan sterik dengan penumpukan basa dalam hibrida DNA. Hasil kami konsisten dengan laporan dalam literatur tentang studi spektroskopi interkalasi MB-DNA yang mengaitkan hipokromatisitas dengan penurunan tingkat energi dalam \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) transisi elektronik karena interkalasi Lapisan 36, 37, 38.
Elektroforesis gel agarose dari phage Phi6: Produk PCR dengan panjang \(117\,\hbox {bp}\) dan \(503\,\hbox {bp}\) dari sampel air danau. Penanda M-DNA;Kontrol NTC-tanpa-templat, primer berisi amplikon yang sesuai;kontrol positif PC;1, 2, 3-murni (1:1) sampel air danau berduri dalam rangkap tiga. Pita terlihat pada \(\sekitar 50\,\hbox {bp}\) karena oligonukleotida yang tidak terpakai di \(503\,\ jalur hbox {bp}\).
Kami mengevaluasi kegunaan sensor menggunakan sampel air Danau Powai yang dibubuhi fag Phi6. Konsentrasi RNA yang diisolasi dari sampel air berduri fag berkisar antara 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), sedangkan yang diisolasi dari suspensi fag murni RNA diperkirakan \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) dengan efisiensi pemulihan sekitar 1 %.RNA ditranskripsi terbalik menjadi cDNA dan digunakan sebagai templat untuk PCR dan qPCR. Ukuran produk dikonfirmasi oleh elektroforesis gel agarosa (Gambar 5) sebelum pengujian dengan sensor. Sampel ini tidak dimurnikan dengan gel dan oleh karena itu mengandung semua komponen PCR seperti serta amplikon yang menarik. Nilai Ct yang direkam selama qPCR (Tabel 1) terbukti berkorelasi dengan konsentrasi RNA yang diisolasi dari sampel air berduri yang sesuai. Nilai Ct mengungkapkan jumlah siklus yang diperlukan untuk sinyal fluoresen untuk melebihi ambang batas atau sinyal latar. Nilai Ct yang lebih tinggi menunjukkan konsentrasi template yang lebih rendah dan sebaliknya. Nilai Ct dari sampel NTC setinggi yang diharapkan. Perbedaan nilai \(\sekitar 3\) Ct antara kontrol positif dan sampel uji lebih lanjut menunjukkan bahwa setiap sampel uji memiliki sekitar 1% template dibandingkan dengan kontrol positif. Kami sebelumnya telah membahas bahwa amplikon yang lebih panjang menghasilkan sensitivitas yang lebih baik. Amplifikasi fragmen yang lebih panjang yang diisolasi dari sampel lingkungan yang heterogen menantang mengingat kerugiannya konsentrasi virus rendah dan degradasi RNA. Namun, dengan pengayaan virus dan protokol amplifikasi PCR, kami berhasil memperkuat fragmen \(503\,\hbox {bp}\) untuk penginderaan elektrokimia.
Gambar 6 menunjukkan hasil sensor elektrokimia dari amplikon fragmen \(503\,\hbox {bp}\), baik menggunakan cDNA murni sebagai template (1:1) maupun cDNA encer 100 kali lipat sebagai template (1:100 ) yang dilakukan PCR , dibandingkan dengan NTC dan PC (lihat Gambar S4 di Informasi Tambahan untuk voltammogram yang representatif). Setiap kotak di plot kotak pada Gambar 6 berisi pengukuran dari tiga sampel pada 5 elektroda. Elektroda yang sama digunakan untuk mengukur semua sampel untuk menghindari kesalahan akibat elektroda variasi -ke-elektroda. Dibandingkan dengan pengukuran CV, pengukuran DPV menunjukkan resolusi yang lebih baik untuk membedakan sampel uji dan PC dari NTC karena, seperti yang disebutkan sebelumnya, arus Faradaic disembunyikan karena arus kapasitif latar belakang pada yang terakhir. Untuk amplikon yang lebih panjang, kami mengamati bahwa kontrol negatif (NTC) menghasilkan arus puncak CV dan DPV yang lebih tinggi relatif terhadap kontrol positif, sedangkan sampel uji positif dan tidak diencerkan menunjukkan ketinggian puncak arus puncak DPV yang serupa. Nilai rata-rata dan median yang diukur untuk masing-masing tidak diencerkan (1:1 ) sampel uji dan PC dapat diselesaikan dengan jelas dari keluaran sensor untuk sampel NTC, sedangkan resolusi untuk sampel encer 1:100 kurang jelas. Untuk pengenceran cDNA 100 kali lipat, kami tidak mengamati pita apa pun selama elektroforesis gel (jalur tidak ditunjukkan pada Gambar 5), dan arus puncak DPV dan CV yang sesuai serupa dengan yang diharapkan untuk NTC. Hasil untuk fragmen \(117\,\hbox {bp}\) ditunjukkan dalam Informasi Tambahan. Negatif kontrol menginduksi respons elektrokimia dari sensor PCB karena adsorpsi MB bebas pada elektroda dan interaksi MB dengan oligonukleotida primer beruntai tunggal. Oleh karena itu, setiap kali sampel diuji, kontrol negatif harus dijalankan dan arus puncak sampel uji dibandingkan dengan arus puncak yang diperoleh oleh kontrol negatif untuk mencapai pengukuran diferensial (relatif)39,40 untuk mengklasifikasikan sampel uji sebagai positif atau negatif.
(a) DPV, dan (b) arus puncak CV untuk deteksi elektrokimia fragmen \(503\,\hbox {bp}\) dalam sampel air danau. Sampel uji diukur dalam rangkap tiga dan dibandingkan dengan tanpa kontrol templat (NTC) dan kontrol positif (PC).
Temuan kami mengilustrasikan mekanisme berbeda yang mempengaruhi kinerja sensor elektrokimia untuk amplikon dengan panjang berbeda untuk DNA berbeda, dengan konsentrasi diverifikasi oleh pengukuran optik menggunakan spektrofotometer UV/Vis. \(500\,\hbox {bp}\) dapat dideteksi dengan sensitivitas yang lebih tinggi dan keberadaan garam dalam sampel tidak Sensitivitas Konsentrasi DNA yang mempengaruhi sensitivitas yang lebih tinggi (jarang \({\hbox {ng}/{\upmu) \hbox {l}}}\) dan di atasnya). Selain itu, kami menyelidiki efek dari berbagai jenis sampel, termasuk amplikon yang dimurnikan gel dengan dan tanpa tambahan garam, dan penambahan sampel air danau dalam pengukuran DPV dan CV.Kami mengamati bahwa DPV memberikan resolusi yang lebih baik, karena arus kapasitif latar belakang juga memengaruhi pengukuran CV, membuatnya kurang sensitif.
Amplifikasi fragmen yang lebih panjang bergantung pada integritas RNA genomik virus. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa amplifikasi fragmen yang lebih panjang tidak selalu efisien karena degradasi RNA di lingkungan dan potensi splicing selama isolasi11,41,42,43,44 .Kami mengamati bahwa metode konsentrasi virus berbasis PEG lebih efektif dalam memekatkan fag Phi-6 yang dibubuhi sampel air danau daripada metode konsentrasi virus berbasis aluminium hidroksida. Kemampuan untuk mendeteksi fragmen DNA yang panjang terbukti mengatasi persyaratan PCR multipleks untuk memperkuat beberapa templat panjang yang lebih pendek dan mengurangi kemungkinan spesifisitas silang.
Sampel biologis langka, sehingga perlu dirancang biosensor yang membutuhkan sampel minimal untuk pengujian. Elektroda PCB ENIG yang digunakan dalam penelitian ini hanya membutuhkan \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) sampel untuk pengujian untuk menutupi area efektif elektroda. Selain itu, elektroda yang sama dapat digunakan kembali setelah dibersihkan sebelum mengeluarkan sampel berikutnya. Sampel yang diperkuat tidak memerlukan penambahan bahan kimia apa pun selain metilen biru, yang tidak mahal dan bahan kimia yang umum digunakan. Karena biaya pembuatan setiap elektroda sekitar $0,55 (atau INR 40), biosensor ini dapat menjadi alternatif hemat biaya untuk teknologi deteksi yang ada. Tabel 2 menunjukkan perbandingan pekerjaan ini dengan sensor lain yang dilaporkan dalam literatur untuk waktu yang lama. fragmen DNA dalam sampel heterogen.
Mengingat bahwa protokol deteksi elektrokimia berbasis MB mengandalkan spesifisitas PCR, batasan utama dari metode ini adalah potensi amplifikasi non-spesifik dalam sampel heterogen seperti air limbah dan air danau atau menggunakan primer dengan kemurnian rendah. metode deteksi elektrokimia untuk deteksi DNA produk PCR yang tidak dimurnikan menggunakan elektroda PCB ENIG yang tidak dimodifikasi, perlu untuk lebih memahami kesalahan yang diperkenalkan oleh dNTP dan primer yang tidak digunakan, dan untuk mengoptimalkan kondisi reaksi dan protokol pengujian. Parameter fisikokimia tambahan seperti pH, suhu, dan biologis permintaan oksigen (BOD) dari sampel air mungkin juga perlu diukur untuk meningkatkan akurasi pengukuran.
Sebagai kesimpulan, kami mengusulkan sensor ENIG PCB elektrokimia berbiaya rendah untuk deteksi virus dalam sampel lingkungan (air danau). Tidak seperti elektroda oligonukleotida amobil atau substrat khusus untuk penginderaan DNA yang memerlukan penyimpanan kriogenik untuk menjaga sensitivitas,53,54 teknik kami menggunakan PCB yang tidak dimodifikasi elektroda dengan umur simpan yang lebih lama dan tidak ada persyaratan penyimpanan khusus dan oleh karena itu cocok untuk pengembangan solusi pengukuran dengan pemrosesan sampel otomatis yang digunakan dalam LMICs. Biosensor menggunakan pewarna redoks interkalasi DNA (MB) yang murah untuk deteksi cepat amplikon target. Amplifikasi nonspesifik umum dalam sampel lingkungan mengurangi spesifisitas metode penginderaan ini karena pengikatan MB yang tidak spesifik ke oligonukleotida beruntai tunggal dan ganda. Oleh karena itu, spesifisitas tes ini tergantung pada optimalisasi primer dan kondisi reaksi PCR. Selain itu, CV dan arus puncak DPV yang diperoleh dari sampel yang diuji harus ditafsirkan relatif terhadap respons yang diperoleh dari kontrol negatif (NTC) untuk setiap pengujian. Desain dan metode sensor elektrokimia yang disajikan dalam pekerjaan ini dapat diintegrasikan dengan autosampler untuk mengembangkan sistem yang sepenuhnya otomatis dan rendah -solusi biaya yang dapat mengumpulkan dan menganalisis sampel dan mengirimkan hasilnya kembali ke laboratorium secara nirkabel.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Metode konsentrasi awal virus dari sampel air: review dan meta-analisis studi terbaru.J.Application.microorganism.115, hlm. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Virus yang ditularkan melalui air: Penghalang air minum yang aman. PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Epidemiologi air limbah untuk surveilans COVID-19 berskala besar yang hemat biaya di negara berpenghasilan rendah dan menengah: tantangan dan peluang. Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. elektrokimia asam nukleat.Kimia.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylene blue sebagai diskriminator elektrokimia oligonukleotida beruntai tunggal dan ganda yang dilumpuhkan pada substrat emas. Analis 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Perbandingan Interkalator Kation dan Anion untuk Transduksi Elektrokimia Hibridisasi DNA dengan Transfer Elektron Jarak Jauh.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Mengisi transfer melalui DNA: biosensor DNA elektrokimia selektif.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Perangkat mikofluida PCR real-time dengan deteksi elektrokimia bersamaan.sensor biologis.Bioelektronik.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al.Studi mekanisme pensinyalan dan verifikasi kinerja sistem PCR real-time elektrokimia berdasarkan interaksi biru metilen dengan DNA.Analis 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Sensor elektrokimia berbasis amplifikasi isotermal yang dimediasi loop untuk mendeteksi sars-cov-2 dalam sampel air limbah.J.Lingkungan.Kimia.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Penginderaan elektrokimia amplikon SARS-CoV-2 dengan elektroda PCB. Sensor diaktifkan.B Kimia.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Deteksi efisien RNA SARS-CoV-2 dalam fraksi padat air limbah.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Analytical Methods for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Kelangsungan hidup bakteriofag Phi6 yang diselimuti (pengganti SARS-CoV-2) dalam tetesan air liur yang menguap yang disimpan di permukaan kaca.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Kegigihan lingkungan dari pengganti SARS-CoV-2 (Phi6) dalam amuba yang hidup bebas.J.Kesehatan Air 20, 83 (2021).
Mindich, L. Pengemasan yang tepat dari tiga fragmen genom bakteriofag RNA beruntai ganda\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Struktur sekunder fag DH RNA\(\varphi\)6 wilayah pengemasan.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – Protokol yang cepat dan efisien untuk menyiapkan stok bakteriofag di laboratorium. PeerJ 4, e2261 (2016).
Waktu posting: Mei-27-2022