Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com webhelyet. Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott mértékben támogatja a CSS-t. A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon frissített böngészőt (vagy kapcsolja ki a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Addig is, hogy biztosítsa folyamatos támogatás, stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
A környezeti minták monitorozásának fontosságát a COVID-19 világjárvány kezdete óta nagyra értékelték, és bizonyos megfigyelési erőfeszítéseket az aranystandard használatával végeznek, bár a qPCR-alapú technikák drágák. Az elektrokémiai DNS-bioszenzorok potenciálisan költséghatékony megoldást jelenthetnek. megoldás a környezeti vízminták monitorozására alacsony és közepes jövedelmű országokban. Ebben a munkában a tüskés tóvízmintákból (a SARS-CoV-2 népszerű helyettesítője) izolált Phi6 fágból nyert amplikonok elektrokémiai kimutatását mutatjuk be az ENIG segítségével. a PCB elektródák befejezéséhez felületmódosítás nélkül.Az elektrokémiai szenzorválaszt alaposan jellemezték két különböző hosszúságú DNS-fragmensre (\({117}\,\hbox {bp}\) és \({503}\,\hbox {bp}\)), és a A PCR mesterkeverékekben lévő sók hatása a metilénkék (MB)-DNS kölcsönhatásokra. Eredményeink azt mutatják, hogy a DNS-fragmensek hossza jelentősen meghatározza az elektrokémiai érzékenységet, és ezzel a munkával azt mutatják be, hogy a hosszú amplikonok kimutatásának képessége a PCR-termékek géltisztítása nélkül fontos a vízminták in situ mérésénél.Egy teljesen automatizált megoldás a vírusterhelésre jót ígér.
A vízen keresztüli vírusfertőzés az 1940-es évek óta közegészségügyi veszélyként ismert, a gyermekbénulás és a hepatitis E1 víz útján történő átvitelének első bizonyítékaival. Az Egészségügyi Világszervezet (WHO) több vízi úton terjedő vírusos kórokozót osztályozott, amelyek mérsékelten vagy magas egészségügyi jelentőséggel bírnak2. Hagyományos vírus a kimutatási módszerek aranystandard qPCR-alapú technikákon alapulnak, amelyek rendkívül érzékenyek és specifikusak, de szakképzett személyzetre van szükség a laboratóriumi, drága műszerekkel végzett teszteléshez.A korlátozott erőforrásokkal rendelkező alacsony és közepes jövedelmű országokban azonban az emberiség a mintavizsgálat valószínűleg elsőbbséget élvez a környezeti vízminta-ellenőrzéssel szemben. Ezért alternatív, alacsony költségű módszerekre van szükség a víz- és szennyvízminták fenntartható, valós idejű monitorozására az alacsony és közepes jövedelmű országokban, amelyek korai figyelmeztetéseket jelentenek a kialakuló járványkitörésekre, ezáltal megóvja őket a vírusvilágjárvány súlyos társadalmi-gazdasági hatásaitól. A nukleinsavak alacsony költségű elektrokémiai bioszenzorai ígéretes megoldást jelenthetnek erre a kielégítetlen szükségletre. Sok ilyen DNS-bioszenzor úgy működik, hogy a komplementer DNS-szálak rögzítve vannak az elektródán felületén, és hibridizálódnak, ha egy megfelelő szekvencia jelen van a mintában. Ezt azután különböző elektrokémiai technikákkal jellé alakíthatják át redox mediátorok, például kálium-vas/ferrocianid segítségével. A metilénkék (MB) az egyik ilyen redox-aktív molekula, amely a jelentések szerint kettős szálú DNS-sé (dsDNS) interkalálódik, amellett, hogy nem specifikusan kötődik az egyszálú DNS-hez5,6. Az MB-k interkaláló jellege miatt MB-DNS komplexeket képeznek, népszerű választás redox közvetítőként számos elektrokémiai DNS-ben. érzékelő konfigurációk5,6,7,8,9. Bár az MB interkalációja a DNS-be nem specifikus, és ennek az elektrokémiai érzékelőnek a specifitása nagymértékben függ a PCR-hez vagy izoterm amplifikációhoz használt primerek tisztaságától, kiválóan alkalmas valós megvalósításra. -time elektrokémiai alapú qPCR vagy fluoreszcens izoterm amplifikáció a DNS-koncentráció mérés alternatívájaként 9 .Egy ilyen megvalósításban Won és mtsai.Az aranyelektródák felületét 6-merkapto-1-hexanollal (MCH) módosították valós időben PCR-amplikonok mérése MB-vel differenciálimpulzus voltammetriával (DPV)9.Más esetekben Ramirez és munkatársai.SARS-CoV-2 detektálása szennyvízben RT-LAMP reakcióval MB segítségével szitanyomott elektródákkal.Platina elektródákat is készítettek in situ elektródákként használják egy mikrofluidikus PCR-platformban, amelyet arra terveztek, hogy elektrokémiailag detektálja az amplikonokat a reakciók során. 8 Mindezek a vizsgálatok megkövetelik az elektródák felületének módosítását, ami megnövekedett gyártási és üzemeltetési költségeket jelent a funkcionalizált elektródák stabilitásának különleges tárolási követelményei miatt.
A tóvízmintákban található koncentrált vírusrészecskékből nyert amplikonok elektrokémiai kimutatásának munkafolyamatának vázlata.
Nemrég demonstráltuk a SARS-CoV-2 amplikonok elektrokémiai érzékelését olcsó nyomtatott áramköri (PCB) elektródákkal DPV és ciklikus voltammetria (CV) alapján, amelyet MB-DNS komplexek adszorpciója indukált a módosítatlan elektródák felületén. jelenlegi11.Beszámolunk arról, hogy a hosszabb DNS-fragmensek (N1-N2, \({943}\, \hbox) a CDC által javasolt N1 forward és N2 reverz primerekkel, összehasonlítva a rövidebb fragmensekkel {bp}\)) jobb linearitást mutattak a szenzorválaszban (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) N1 forward és N1 reverz primer készletek felhasználásával készült. Ezeket a vizsgálatokat nukleázmentes vízben készített DNS-hígítások felhasználásával számolták be. A platformot a SARS-CoV kimutatására is használták. -2 amplikon szimulált szennyvízmintákban (a teljes RNS-minták SARS-CoV-2 RNS-sel történő feltüzelésével nyert). Mivel az RNS érzékeny az izolálás és a későbbi feldolgozás során a nyírásra,12,13 nehéz hosszabb fragmentumokat amplifikálni ezzel a heterogén mintával. Ezért a SARS-CoV-2 amplikon szennyvízben való elektrokémiai érzékelésének demonstrálása a rövidebb \(72\,\hbox {bp}\) N1 fragmentumra korlátozódik.
Ebben a munkában a tóvízmintákból koncentrált és izolált Phi6 fág ENIG PCB alapú elektrokémiai érzékelésének megvalósíthatóságát vizsgáltuk (1. ábra). A Phi6 fágok mérete (80-100 nm) összehasonlítható a SARS-CoV-2 ill. lipidmembránnal és tüskefehérjével is rendelkeznek. Ezen okok miatt a Phi6 bakteriofág a SARS-CoV-2 és más burokkal rendelkező patogén RNS-vírusok népszerű helyettesítője14,15. A fágrészecskékből izolált RNS-t templátként használták a cDNS-szintézishez, majd PCR két, 117 és 503 bázispár hosszúságú DNS-fragmens előállításához. Tekintettel a \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 fragmentumok amplifikálására korábbi munkánk során, a közepes hosszúságú fragmentumokat célozzuk meg (\(117). \,\hbox {bp}\) és \(503 \,\hbox {bp}\)), a rendelkezésre álló primerek alapján. Az elektrokémiai szenzorválaszt szisztematikusan tanulmányozták széles koncentráció-tartományban (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) - \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Mindkét töredékhez az MB jelenlétét, a só hatását a szenzorválaszra spektrofotometriás mérésekkel jellemezték és kereszthitelesítették. E munka fő hozzájárulásai a következők:
A DNS fragmentum hossza és a só jelenléte a mintában erősen befolyásolja az érzékenységet.Eredményeink azt mutatják, hogy az elektrokémiai aktivitás a voltammetriás válaszban az MB, a DNS és a szenzor kölcsönhatásának különböző mechanizmusaitól függ, a DNS koncentrációjától és hosszától függően, hosszabb A fragmentumok nagyobb érzékenységet mutatnak, bár a só negatív hatással van az elektrosztatikus kölcsönhatásokra MB és DNS.
A DNS-koncentráció határozza meg az MB-DNS kölcsönhatás mechanizmusát módosítatlan elektródákban Kimutattuk, hogy az MB-DNS kölcsönhatás különböző mechanizmusai a DNS-koncentrációtól függenek. Kis mennyiségű \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox) DNS-koncentrációnál {l}}}\), megfigyeltük, hogy az elektrokémiai áramválaszt főként az MB-DNS elektródán történő adszorpciója, míg alacsonyabb koncentrációknál Magas DNS-koncentrációknál az elektrokémiai áramválaszt a redox sztérikus gátlása határozta meg. aktivitás a DNS bázispárok közötti MB inszerció miatt.
Vírusos nukleinsavak ENIG PCB-alapú elektrokémiai érzékelése tóvízmintákban A megfigyeléseket a Phi6-hoz hozzáadott \(503\,\hbox {bp}\) DNS-fragmensek elektrokémiai kimutatásával validálták, amelyeket a Powai Lake, IIT Mumbai Campus vízmintáiból nyertünk Eredmény fág.
Alacsony megvalósítási költség és lehetőség a teljesen automatizált megfigyelőrendszerekbe való integrációra, oligonukleotidokra vagy aptamerekre az elektródákon, hosszabb eltarthatósággal.
A Phi6 fág a Cytoviridae családba tartozó burkos dsRNS vírus, amely a Pseudomonas syringae-t fertőzi meg. A Phi6 fág genomja 3 fragmentum formájában létezik: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) és L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17.Mivel a Phi6 fág egy nem patogén BSL-1 Pseudomonas törzset fertőz meg, használata biztonságos és könnyen termeszthető a laboratóriumban.Phage Phi6 és gazdaszervezete Pseudomonas syringae a Felix d'Herelle Reference Center for Bakteriális Vírusoktól, Laval University, Kanada (a referenciaközpont katalógusszáma: HER-102, illetve HER-1102) vásárolt. A Phi6 fágot és gazdáját a referenciaközpont utasításai szerint újraélesztettük. A Phi6 fágot lemez lízissel és elúcióval tisztítottuk, hogy megkapjuk a végső titereket \(\about 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (plakkképző egységek/ milliliter). Az RNS-t a GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) segítségével izoláltuk a tisztított fágrészecskékből a gyártó utasításai szerint. Röviden egy tisztított Phi6 fág szuszpenzió\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) lizáltuk, és a lizátumot egy spin oszlopra töltöttük, hogy az RNS a gyantaoszlophoz kötődhessen. Az RNS ezután eluálódik az elúciós oldatban \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) a kit által biztosított. Becsülje meg az RNS koncentrációját abszorbancia alapján \(260\,\hbox {nm}\). Az RNS-t aliquotokban tároltuk \-ben ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) a további felhasználásig.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Az iScript cDNS szintézis készlet (Bio -Rad Laboratories) cDNS-szintézis templátjaként használták a gyártó utasításait követve. Röviden, a cDNS-szintézis reakciója 3 lépésből áll: priming itt: \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , \({20}\,{\hbox {min}}\) fordított átírása itt: \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), és fordítva A felvevő a \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) mappában van \({1}\,{\hbox {min }}\). 1%-os agaróz gélen futtatva a cDNS három sávot mutatott, amelyek megfelelnek a várt három RNS-fragmensnek (az adatok nem láthatók). A következő primereket használtuk két, 117 és 503 bp hosszúságú DNS-fragmens amplifikálására. cDNS használata templátként a PCR-hez miniPCR® mini8 thermocyclerben:
A \(117\,\hbox {bp}\) és \(503\,\hbox {bp}\) primerek az M szegmens 1476-1575 nukleotidjának és az L szegmens 458-943 nukleotidjának, illetve savnak felelnek meg. Minden amplifikált PCR-terméket 1%-os agarózgélen elektroforetizáltunk, és az amplifikált cél-DNS-t a GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific) segítségével tisztítottuk.
Az IIT Mumbai kampuszon található tavat (Powai Lake, Powai, Mumbai) fágrészecskék hozzáadására használtak. A tó vizét \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) membránon szűrték, hogy eltávolítsák. szuszpendált részecskéket, majd hozzáadták a Phi6 fágot. Adja hozzá a \({1}\,{\hbox {ml}}\)/\(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) a \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) szűrt tóvízbe, itt: \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Egy kis alikvot vírusterhelés mérésére van fenntartva plakk assay segítségével. Két különböző módszert teszteltünk a tüskés Phi6 vírusrészecskék koncentrálására: (1) az alumínium-hidroxid adszorpciós-kicsapási módszert19, amelyet számos burkos RNS vírus környezeti mintákból történő koncentrációjára validáltak, és (2) ) A polietilénglikol (PEG) alapú víruskoncentrációs módszert Flood et al.20 .Mivel a PEG alapú módszer kinyerési hatékonysága jobbnak bizonyult, mint az alumínium-hidroxid módszeré, ezért a PEG alapú módszert alkalmaztuk a tóvízmintákból származó Phi6 részecskék koncentrálására.
Az alkalmazott PEG-módszer a következő volt: PEG 8000-et és \(\hbox {NaCl}\)-t adtunk a Phi6-kal teli tóvízmintákhoz, így 8% PEG 8000 és \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).A mintákat rázógépen inkubáltuk\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), majd \(4700 \,\hbox {g}\) centrifugálással \({45}\,{\hbox {min}}\). Dobja ki a felülúszót, és szuszpendálja újra a pelletet a \({1}\, {\hbox {ml}}\) ugyanabban a felülúszóban. Az összes tüske- és víruskoncentráció-kísérletet három párhuzamosban végeztük. Koncentráció után egy kis alikvot részt foglaltunk le a kinyerési hatékonyság mérésére plakk vizsgálattal. Az RNS-t a korábban leírtak szerint izoláltuk, és eluáltuk. készlettel szállított elúciós pufferben\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Mivel az RNS-koncentráció három példányban mintánként változik, a \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) RNS-t használnak mindháromhoz, függetlenül annak koncentrációjától. A minták cDNS-szintézise. A cDNS-szintézist a korábban leírtak szerint végeztük.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNS sablonként használták a \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR-hez 35 cikluson keresztül a \ (117\,\hbox {bp}\) és \(503\,\hbox {) erősítésére bp}\) fragmensek. Ezek a minták „1:1”-ként vannak ábrázolva, azaz hígítás nélkül. Negatív kontrollként templát nélküli kontrollt (NTC), míg tisztított fágból izolált RNS-sel szintetizált cDNS-t állítottunk be. templátként pozitív kontrollhoz (PC). A kvantitatív PCR-t (qPCR) Stratagene Mx3000P RT-PCR készülékben végeztük, Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies) segítségével. A reakciókat három párhuzamosban állítottuk be, mint korábban. A ciklusküszöböt (Ct) minden mintára rögzítettük. Ezenkívül a hígított mintákat \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) szűrt tóvízben 1:100 arányban hígított cDNS felhasználásával végeztük. \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR 35 cikluson keresztül. Ezek a minták „1:100”-ként vannak ábrázolva.
A PCB elektródák a kereskedelemben kapható olcsó elektromentes nikkelbemerítési arany (ENIG) eljárással készülnek anélkül, hogy további aranyozásra lenne szükség.Az ENIG PCB elektródák specifikációit korábbi munkánk részletezi11.Az ENIG PCB elektródák esetében a hagyományos elektródák tisztítási módszerei, mint pl. piranha oldat vagy kénsav ciklikus voltammetria nem ajánlott, mivel a vékony aranyréteg leválását okozhatja (vastagság \(\kb.\) \(100\,\hbox {nm }\)), és szabaddá teheti az alatta lévő, hajlamos rézrétegeket. korrózióhoz 21, 22, 23, 24, 25. Ezért az elektródákat IPA-val megnedvesített, szöszmentes ruhával tisztítsa meg. A vizsgálandó mintát \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB a \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) mappában az egyszerű beillesztés érdekében. Korábbi munkánkban , megfigyeltük, hogy a szenzor érzékenysége és linearitása javult az MB koncentráció növelésével 11 . Korábbi munkáink során közölt optimalizálások alapján \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB A kettős szálú DNS (ds-DNS) elektrokémiai kimutatása anionos vagy kationos interkalátorok segítségével érhető el. Bár az anionos interkalátorok jobb szelektivitással detektálják a DNS-t, egy éjszakán át tartó inkubációt igényelnek, ami hosszabb észlelési időt eredményez. másrészt a kationos interkalátorok, például az MB, rövidebb inkubációs időt igényelnek, körülbelül \({1}\,{\hbox {h}}\) a ds-DNS6 elektrokémiai kimutatásához. Minden mérés magában foglalja a vizsgálandó minta kijuttatását a electrode\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), majd tisztítsa meg egy IPA-val megnedvesített ronggyal, mielőtt folytatná a másik mintát.egy mérés.Minden mintát 5 különböző elektródán teszteltünk, hacsak másképp nem jelezzük.A DPV- és CV-méréseket PalmSens Sensit Smart potenciosztáttal végeztük, a PSTrace szoftvert pedig a potenciosztát konfigurálásához és adatgyűjtéshez, beleértve a csúcsáram számításait is.A következő beállításokat használjuk. DPV és CV mérésekhez:
DPV: egyensúlyi idő = \(8\,\hbox {s}\), feszültséglépés = \(3\,\hbox {mV}\), impulzusfeszültség = \(25\,\hbox {mV}\) , impulzus időtartama = \(50\,\hbox {ms}\), pásztázási sebesség = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Egyensúlyi idő = \(8\,\hbox {s}\), Feszültséglépés = \(3\,\hbox {mV}\), Sweep Rate = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
A \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB-vel komplexált DNS voltammogramjaiból kapott csúcsáramok: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) önéletrajz, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) önéletrajz.
A DPV és CV voltammogramokat a DNS-sel komplexált ENIG PCB elektródákon \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB (10–\({20}\,{\ hbox {ng) }/{\upmu \hbox {l}}}\) azaz 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(117\,\hbox {bp}\ ) és 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) for \(503\,\hbox {bp}\)). A reprezentatív voltammogramok az S1 ábrán láthatók a Kiegészítő Információban. A 2. ábra mutatja az eredményeket a DPV és CV mérések (csúcsáram) géllel tisztított PCR termékekkel.A CV mérésekhez képest a DPV mérések nagyobb érzékenységet mutatnak (áram a DNS-koncentráció függvényében), mivel a CV méréseknél a háttér kapacitív áramok Faradaic áramokat rejtenek 26 .Az adatok A boxplot minden egyes doboza 5 elektród mérését tartalmazza.Minden méréshez ugyanazt az elektródakészletet használják, hogy elkerüljék az elektródák közötti eltérések miatti mérési hibákat. Növekvő tendenciát figyeltünk meg a DPV és CV mért csúcsáramokban alacsonyabb DNS-koncentráció esetén , hosszabb (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ a \(117) ) töredékhez képest. Ez összhangban van az elektróda adszorpciójának korábbi munkánk során közölt várható trendjével. az MB-DNS komplex adszorpciója megkönnyíti az elektródán történő töltésátvitelt, ami hozzájárul a csúcsáram növekedéséhez.Más vizsgálatok kimutatták az oligonukleotid méretének és szekvenciájának hatását az MB-DNS interkalációjára27,28,29,30.A guanin A két amplikon (\(117\,\hbox {bp}\) és \(503\,\hbox {bp}\)) -citozin (GC) tartalma megközelítőleg 50% volt, ami azt jelzi, hogy a megfigyelés A különbség oka Az amplikon hosszára azonban magasabb DNS-koncentrációk esetén (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), \(503\,\hbox {bp}) \) és \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) a \(117\,\hbox {bp}\) esetén), két erősítést figyelünk meg. A subs csúcsáramok mind a DPV, mind a CV méréseknél csökkennek. Ennek az az oka, hogy az MB telítődik és interkalálódik a DNS bázispárjai között, ami az MB31,32 redukálható csoport redox aktivitásának sztérikus gátlását eredményezi.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) önéletrajz, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) önéletrajz.
A PCR-főkeverékekben jelenlévő sók zavarják az MB és a DNS közötti elektrosztatikus kölcsönhatásokat, ezért a \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) és \({50} \,{\) hozzáadásával upmu \hbox {M}}\) MB géllel tisztított termék a só MB-DNS kölcsönhatásra gyakorolt hatásának tanulmányozására. A 3. ábrán látható módon megfigyeltük, hogy magasabb DNS-koncentrációk esetén (\(>{2}\,{\) hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) és \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) \(117\,\hbox {bp} \)), DPV-ben és CV-ben A só hozzáadása nem befolyásolta szignifikánsan a méréseket (lásd a Kiegészítő információk S2 ábráját a reprezentatív voltammogramokhoz). Alacsonyabb DNS-koncentráció esetén a só hozzáadása nagymértékben csökkenti az érzékenységet, aminek következtében az áramerősség nem változik jelentős mértékben a DNS-koncentrációval. A sónak az MB-DNS kölcsönhatásokra és interkalációra gyakorolt hasonló negatív hatásairól korábban más kutatók is beszámoltak33,34.\(\hbox { A Mg}^{2+}\) kationok a DNS negatív foszfátvázához kötődnek, ezáltal akadályozzák az MB és a DNS közötti elektrosztatikus kölcsönhatást. Magasabb DNS-koncentrációknál a redox-aktív MB-k sztérikus gátlása alacsonyabb csúcsáramokat eredményez, így elektrosztatikus kölcsönhatások lépnek fel. nem befolyásolják jelentősen az érzékelő reakcióját. A legfontosabb szempont az, hogy ez a bioszenzor jobban alkalmas magasabb DNS-koncentrációk kimutatására (ritkán \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) vagy magasabb), Környezeti vízminták teljesen automatizált feldolgozásához, ahol a PCR termékek géltisztítása esetleg nem kivitelezhető.
Az abszorpciós görbe alatti terület a 600–700 \(\hbox {nm}\) hullámhossz-tartományban a \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) komplexet képező DNS különböző koncentrációinál MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) sóval és anélkül (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) sóval és anélkül (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB mintáknak megfelelő DNS-koncentrációk Nincs DNS.
A fenti eredmények további igazolására optikai méréseket végeztünk UV/Vis spektrofotométerrel (Thermo Scientific Multiskan GO), mindegyikhez a \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) mintákat használtuk. Mérés. Az abszorpciós szignatúra a DNS-koncentráció növekedésével csökken, amint az az abszorpciós görbe alatti terület trendjéből látható a \(600\,\hbox {nm}\) és \(700\,\hbox {) hullámhossz-tartományban nm}\) , amint az a 4. ábrán látható (az abszorpciós spektrum az S3. ábrán látható a Kiegészítő Információban). \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox) DNS-koncentrációnál kisebb minták esetén {l}}}\), nem volt szignifikáns különbség a DNS-tartalmú és a csak MB-t tartalmazó minták felvételében (\(503\,\hbox {bp}\) és \(117\,\hbox {bp}\) ) hosszúságú fragmensek), ami a redox-aktív MB sztérikus gátlásának hiányát jelzi. Magasabb DNS-koncentrációknál az abszorbanciajel fokozatos csökkenését figyeltük meg, és az abszorbancia kisebb mértékű csökkenését észleltük só jelenlétében. Ezeket az eredményeket a molekuláris hatásnak tulajdonították. kölcsönhatások és sztérikus gátlás a bázis halmozódásával DNS-hibridekben. Eredményeink összhangban vannak az MB-DNS interkalációjának spektroszkópiai vizsgálatairól szóló szakirodalmi jelentésekkel, amelyek a hipokromatikusságot a \(\pi\)–\(\pi ^*\) csökkent energiaszintekkel társítják. ) interkaláció miatti elektronikus átmenetek 36., 37., 38. réteg.
Phi6 fág agaróz gél elektroforézise: \(117\,\hbox {bp}\) és \(503\,\hbox {bp}\) hosszúságú PCR termékek tóvízmintákból.M-DNS marker;NTC-templát nélküli kontroll, megfelelő amplikonokat tartalmazó primerek;PC pozitív kontroll;1, 2, 3 hígítatlan (1:1) tüskés tóvízminták három példányban. Egy sáv látható a \(\körülbelül 50\,\hbox {bp}\) helyen a \(503\,\) fel nem használt oligonukleotidok miatt. hbox {bp}\) sáv.
A szenzor használhatóságát a Phi6 fággal megtámadott Powai-tó vízminták segítségével értékeltük ki. A fággal kiegészített vízmintákból izolált RNS-koncentrációk 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), míg a tisztított fágszuszpenziókból izolált RNS a becslések szerint \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\), a visszanyerési hatékonyság körülbelül 1 A %-os RNS-t fordítottan átírtuk cDNS-vé, és templátként használták a PCR-hez és a qPCR-hez. A termék méretét agaróz gélelektroforézissel igazoltuk (5. ábra) az érzékelővel végzett tesztelés előtt. Ezek a minták nem gélen tisztítottak, ezért tartalmazzák a PCR összes komponensét, valamint az érdeklődésre számot tartó amplikonokat. A qPCR során rögzített Ct értékek (1. táblázat) korrelálnak a megfelelő tüskés vízmintákból izolált RNS koncentrációjával. A Ct érték megmutatja a fluoreszcens jelhez szükséges ciklusok számát. meghaladják a küszöbértéket vagy a háttérjelet. A magasabb Ct értékek alacsonyabb templátkoncentrációt jeleznek, és fordítva. Az NTC minták Ct értékei a vártnak megfelelőek voltak. A \(\körülbelül 3\) Ct értékek különbsége a pozitív kontroll és a tesztminta továbbá azt jelzi, hogy minden tesztminta körülbelül 1% templáttal rendelkezik a pozitív kontrollhoz képest. Korábban már tárgyaltuk, hogy a hosszabb amplikonok jobb érzékenységet eredményeznek. A heterogén környezeti mintákból izolált hosszabb fragmentumok amplifikálása kihívást jelent a hátrányok miatt. Az alacsony víruskoncentráció és az RNS lebomlása. Vírusdúsítási és PCR-amplifikációs protokollunkkal azonban sikeresen amplifikáltuk a \(503\,\hbox {bp}\) fragmentumot elektrokémiai érzékelés céljából.
A 6. ábra a \(503\,\hbox {bp}\) fragmens amplikon elektrokémiai szenzoros eredményeit mutatja, mindkettő hígítatlan cDNS-t használ templátként (1:1) és 100-szor hígított cDNS-t templátként (1:100) végzett PCR-rel. , összehasonlítva az NTC-vel és a PC-vel (lásd az S4 ábrát a Kiegészítő információkban a reprezentatív voltammogramokhoz). A 6. ábrán látható boxplot minden egyes mezője három, 5 elektródán lévő minta mérését tartalmazza. Ugyanazokat az elektródákat használtuk az összes minta mérésére, hogy elkerüljük az elektródák okozta hibákat. -elektródák közötti eltérés.A CV-méréshez képest a DPV-mérések jobb felbontást mutatnak a teszt- és PC-minták megkülönböztetésére az NTC-ktől, mivel amint azt korábban említettük, a Faradaic-áramok rejtve vannak az utóbbiban lévő háttér kapacitív áramai miatt.Hosszabb amplikonok esetében megfigyeltük, hogy a negatív kontroll (NTC) magasabb CV és DPV csúcsáramokat eredményezett a pozitív kontrollhoz képest, míg a pozitív és hígítatlan tesztminták hasonló csúcsmagasságokat mutattak a DPV csúcsáramokhoz. A mért átlag és medián értékek mindegyik hígítatlanra (1:1) ) a tesztminta és a PC egyértelműen felbontható az NTC minta szenzorkimenetéből, míg az 1:100 arányban hígított minta felbontása kevésbé hangsúlyos. A cDNS 100-szoros hígításánál nem észleltünk sávokat a gélelektroforézis során (az 5. ábrán nem látható sávok), és a megfelelő DPV és CV csúcsáramok hasonlóak voltak az NTC esetében várthoz. A \(117\,\hbox {bp}\) fragmens eredményei a Kiegészítő információkban láthatók. A negatív kontroll elektrokémiai választ indukált a PCB érzékelőtől az elektródán lévő szabad MB adszorpciója és az MB és az egyszálú primer oligonukleotid kölcsönhatása miatt. Ezért minden alkalommal, amikor egy mintát tesztelnek, negatív kontrollt kell futtatni, és a a vizsgálati minta csúcsáramát a negatív kontroll által kapott csúcsáramhoz viszonyítva differenciális (relatív) mérés eléréséhez39,40 a vizsgálati minta pozitív vagy negatív besorolásához.
(a) DPV és (b) CV csúcsáram a \(503\,\hbox {bp}\) fragmentumok elektrokémiai kimutatására tóvízmintákban. A tesztmintákat három párhuzamosban mértük, és összehasonlítottuk a template nélküli kontrollokkal (NTC) és pozitív kontrollok (PC).
Eredményeink különböző mechanizmusokat mutatnak be, amelyek különböző hosszúságú amplikonok elektrokémiai érzékelőinek teljesítményét befolyásolják különböző DNS-ek esetén, és a koncentrációkat optikai mérésekkel ellenőrizték UV/Vis spektrofotométerrel. Megfigyeléseink alátámasztják azt a belátást, hogy a hosszabb DNS-fragmensek \(\kb.\) \(500\,\hbox {bp}\) nagyobb érzékenységgel detektálható, és hogy a só jelenléte a mintában nem Érzékenység DNS-koncentráció, amely a nagyobb érzékenységet befolyásolja (ritkán \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) és a fentiek). Ezenkívül különböző típusú minták hatását vizsgáltuk, beleértve a géllel tisztított amplikonokat hozzáadott sóval és anélkül, valamint tóvízminták hozzáadását a DPV és CV mérésekben.Megfigyeltük, hogy a DPV jobb felbontást nyújtott, mivel a háttér kapacitív árama is befolyásolja a CV mérést, így kevésbé érzékeny.
A hosszabb fragmentumok amplifikációja a vírus genomiális RNS-ének integritásától függ. Számos tanulmány kimutatta, hogy a hosszabb fragmentumok amplifikációja nem mindig hatékony az RNS környezeti lebomlása és az izolálás során előforduló splicing miatt11,41,42,43,44. .Megfigyeltük, hogy a PEG-alapú víruskoncentrációs módszer hatékonyabb volt a tóvízmintákban tüskés Phi-6 fág koncentrálásában, mint az alumínium-hidroxid alapú víruskoncentrációs módszer. A hosszú DNS-fragmensek kimutatásának képessége felülmúlja a multiplex PCR-re vonatkozó követelményeket. több rövidebb hosszúságú sablon felerősítésére és a keresztspecifikusság lehetőségének csökkentésére.
A biológiai minták alig állnak rendelkezésre, ezért olyan bioszenzor tervezésére van szükség, amely minimális mintát igényel a teszteléshez. A tanulmányban használt ENIG PCB elektródákhoz csak \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) minták a teszteléshez, hogy lefedjék az elektródák hatásos területét. Ezenkívül ugyanaz az elektróda újra felhasználható tisztítás után a következő minta adagolása előtt. Az amplifikált mintákhoz nincs szükség a metilénkéken kívül semmilyen más vegyszer hozzáadására, ami olcsó és általánosan használt vegyszer.Mivel minden elektróda gyártása körülbelül 0,55 dollárba (vagy 40 INR) kerül, ez a bioszenzor költséghatékony alternatívája lehet a meglévő detektálási technológiáknak. A 2. táblázat összehasonlítja ezt a munkát más, az irodalomban már régóta közölt érzékelőkkel. DNS-fragmensek heterogén mintákban.
Tekintettel arra, hogy az MB-alapú elektrokémiai detektálási protokollok a PCR specifikusságán alapulnak, ennek a módszernek a fő korlátja a nem specifikus amplifikáció lehetősége heterogén mintákban, például szennyvízben és tóvízben, vagy alacsony tisztaságú primerek használatával. A tisztítatlan PCR-termékek DNS-detektálására szolgáló elektrokémiai kimutatási módszerek módosítatlan ENIG PCB elektródák használatával, szükséges a fel nem használt dNTP-k és primerek által okozott hibák jobb megértése, valamint a reakciókörülmények és a vizsgálati protokollok optimalizálása. További fizikai-kémiai paraméterek, például pH, hőmérséklet és biológiai a vízminta oxigénigényét (BOD) is meg kell mérni a mérés pontosságának javítása érdekében.
Összefoglalva, egy olcsó elektrokémiai ENIG PCB érzékelőt javasolunk a környezeti (tóvíz) mintákban lévő vírusok kimutatására. Ellentétben az immobilizált oligonukleotid elektródákkal vagy a DNS-érzékeléshez használt egyedi szubsztrátokkal, amelyek kriogén tárolást igényelnek az érzékenység fenntartása érdekében53,54, technikánk módosítatlan PCB-t használ. Hosszabb eltarthatóságú és különleges tárolási követelmények nélküli elektródák, ezért alkalmasak az LMIC-kben alkalmazott automatizált mintafeldolgozással rendelkező mérési megoldások fejlesztésére. A bioszenzor olcsó DNS-interkaláló redox festékeket (MB) használ a célamplikonok gyors kimutatására. A nem specifikus amplifikáció a környezeti mintákban gyakori, csökkenti ennek az érzékelési módszernek a specificitását, mivel az MB-k nem specifikusan kötődnek egy- és kétszálú oligonukleotidokhoz.Ezért ennek a tesztnek a specificitása a primerek optimalizálásától és a PCR-reakció körülményeitől függ.Ezenkívül a CV és a vizsgált mintákból kapott DPV-csúcsáramokat a negatív kontroll (NTC) válaszaihoz viszonyítva kell értelmezni az egyes teszteknél. Az ebben a munkában bemutatott elektrokémiai szenzortervek és -módszerek integrálhatók automatikus mintavevőkkel, hogy teljesen automatizált és alacsony szinteket fejlesszenek ki. - költséges megoldás, amely képes mintákat gyűjteni és elemezni, és vezeték nélkül továbbítani az eredményeket a laboratóriumba.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Módszerek a vírusok kezdeti koncentrációjára vízmintákból: a legújabb tanulmányok áttekintése és metaanalízise.J.Application.microorganism.115, pp. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Waterborne viruses: Barriers to safe drinking water.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.Szennyvíz-epidemiológia a COVID-19 költséghatékony nagyléptékű megfigyeléséhez alacsony és közepes jövedelmű országokban: kihívások és lehetőségek.Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid elektrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN. A metilénkék mint az arany szubsztrátumokon rögzített egy- és kétszálú oligonukleotidok elektrokémiai megkülönböztetője. Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Kation- és anioninterkalátorok összehasonlítása DNS-hibridizáció hosszú távú elektrontranszferrel történő elektrokémiai átviteléhez.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Töltésátvitel DNS-en keresztül: szelektív elektrokémiai DNS-bioszenzor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Valós idejű PCR mikrofluidikus eszköz egyidejű elektrokémiai kimutatással.biológiai érzékelő.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. Jelátviteli mechanizmus vizsgálata és elektrokémiai valós idejű PCR-rendszer teljesítményének ellenőrzése a metilénkék és a DNS közötti kölcsönhatáson alapulóan. Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Loop-mediated izoterm amplifikáción alapuló elektrokémiai érzékelő a sars-cov-2 detektálására szennyvízmintákban.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.SARS-CoV-2 amplikonok elektrokémiai érzékelése PCB elektródákkal.Az érzékelő aktiválva van.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. A SARS-CoV-2 RNS hatékony kimutatása szennyvíz szilárd frakciójában.tudomány.általános környezet.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al. Analytical Methods for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Survival of the Enveloped bacteriophage Phi6 (a surrogate for SARS-CoV-2) in evaporated saliva droplets deposed on glass surfaces.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ SARS-CoV-2 surrogate (Phi6) környezeti perzisztenciája szabadon élő amőbában.J.Water Health 20, 83 (2021).
Mindich, L. Precise package of three genomic fragments of double-stranded RNA bacteriophage\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ és Bamford, A DH RNS fág\(\varphi\)6 csomagolási régió másodlagos szerkezete.RNA 6, 880-889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – Gyors és hatékony protokoll bakteriofágok laboratóriumi törzsanyagainak elkészítéséhez.PeerJ 4, e2261 (2016).
Feladás időpontja: 2022. május 27