Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili isključite način rada kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako biste osigurali nastavak podrške, web mjesto ćemo prikazati bez stilova i JavaScripta.
Važnost praćenja uzoraka iz okoliša uvelike se cijeni od početka pandemije COVID-19, a neki napori u praćenju provode se pomoću zlatnog standarda, iako su tehnike temeljene na qPCR-u skupe. Elektrokemijski DNA biosenzori mogli bi pružiti potencijalno isplativo rješenje za praćenje uzoraka vode iz okoliša u zemljama s niskim i srednjim prihodima. U ovom radu demonstriramo elektrokemijsku detekciju amplikona dobivenih iz faga Phi6 izoliranog iz uzoraka jezerske vode s šiljcima (popularni surogat za SARS-CoV-2), koristeći ENIG dovršiti PCB elektrode bez modifikacije površine.spol. Odgovor elektrokemijskog senzora temeljito je karakteriziran za dva fragmenta DNK različitih duljina (\({117}\,\hbox {bp}\) i \({503}\,\hbox {bp}\)), a učinak soli u glavnim mješavinama za PCR na interakcije metilensko plavo (MB)-DNA. Naši rezultati pokazuju da duljina fragmenata DNA značajno određuje elektrokemijsku osjetljivost i u ovom radu pokazuju da je sposobnost otkrivanja dugih umnožaka bez pročišćavanja PCR proizvoda gelom važno za in situ mjerenje uzoraka vode.Potpuno automatizirano rješenje za virusno opterećenje dobro je.
Prijenos virusa putem vode poznat je kao opasnost za javno zdravlje od 1940-ih, s prvim dokazima o prijenosu dječje paralize i hepatitisa E1 putem vode. Svjetska zdravstvena organizacija (WHO) klasificirala je nekoliko virusnih patogena koji se prenose vodom od umjerene do visoke zdravstvene važnosti2. Tradicionalni virus Metode detekcije oslanjaju se na tehnike temeljene na zlatnom standardu qPCR, koje su vrlo osjetljive i specifične, ali zahtijevaju kvalificirano osoblje za testiranje u laboratoriju pomoću skupih instrumenata. Međutim, u zemljama s niskim i srednjim dohotkom (LMIC) s ograničenim resursima, ljudski ispitivanje uzoraka vjerojatno će imati prednost nad praćenjem uzoraka vode iz okoliša. Stoga su potrebne alternativne jeftine metode za održivo praćenje uzoraka vode i otpadnih voda u stvarnom vremenu u zemljama s niskim i srednjim dohotkom kao rana upozorenja o izbijanju bolesti, štiteći ih na taj način od teških socioekonomskih utjecaja pandemije virusa. Jeftini elektrokemijski biosenzori za nukleinske kiseline mogli bi pružiti obećavajuće potencijalno rješenje za ovu nezadovoljenu potrebu. Mnogi od ovih DNA biosenzora rade na temelju činjenice da su komplementarni DNA lanci imobilizirani na elektrodi površine i hibridizirati kada je odgovarajući niz prisutan u uzorku. To se zatim može pretvoriti u signal različitim elektrokemijskim tehnikama upotrebom redoks medijatora kao što je kalij željezo/ferocijanid. Metilen plavo (MB) je jedna takva redoks-aktivna molekula, koja ima Zabilježeno je da se interkalira u dvolančanu DNA (dsDNA) uz svoje nespecifičnije vezanje na jednolančanu DNA5,6. Interkalirajuća priroda MB-ova da tvore MB-DNA komplekse čini ih popularnim izborom kao redoks posrednika u nekoliko elektrokemijskih DNA konfiguracije senzora5,6,7,8,9. Iako je interkalacija MB u DNA nespecifična, a specifičnost ovog elektrokemijskog senzora uvelike ovisi o čistoći početnica korištenih za PCR ili izotermno pojačanje, on je vrlo prikladan za provedbu stvarnih -vremenska elektrokemijska qPCR ili fluorescentna izotermna amplifikacija kao alternativa mjerenju koncentracije DNA 9 . U jednoj takvoj implementaciji, Won et al. Površina zlatnih elektroda modificirana je 6-merkapto-1-heksanolom (MCH) za stvarno vrijeme mjerenje PCR amplikona s MB pomoću diferencijalne pulsne voltametrije (DPV)9. U drugim slučajevima, Ramirez et al.Detekcija SARS-CoV-2 u otpadnoj vodi reakcijom RT-LAMP uporabom MB s elektrodama tiskanim sitotiskom. Platinaste elektrode su također bile koriste se kao in situ elektrode u mikrofluidnoj PCR platformi dizajniranoj za elektrokemijsko otkrivanje amplikona tijekom reakcija 8. Sve ove studije zahtijevaju modifikaciju površine elektroda, što implicira povećane troškove proizvodnje i rada zbog posebnih zahtjeva za skladištenje za stabilnost ovih funkcionaliziranih elektroda.
Shema tijeka rada za elektrokemijsku detekciju amplikona dobivenih iz koncentriranih virusnih čestica u uzorcima jezerske vode.
Nedavno smo demonstrirali elektrokemijski senzor SARS-CoV-2 amplikona s jeftinim elektrodama tiskanih ploča (PCB) na temelju DPV i cikličke voltametrije (CV) inducirane adsorpcijom MB-DNA kompleksa na površini nemodificiranih elektroda) promjene u vrhu struja11.Izvještavamo da su duži fragmenti DNK (N1-N2, \({943}\, \hbox) formirani korištenjem N1 naprijed i N2 reverznih početnica koje preporučuje CDC u usporedbi s kraćim fragmentima {bp}\)) pokazali bolju linearnost u odgovoru senzora ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) formiran korištenjem N1 prednjih i N1 obrnutih setova početnica. Ova su istraživanja objavljena korištenjem razrjeđenja DNK pripremljenih u vodi bez nukleaze. Platforma je također korištena za otkrivanje SARS-CoV -2 amplikona u simuliranim uzorcima otpadnih voda (dobivenih dodavanjem ukupnih uzoraka RNA SARS-CoV-2 RNA). Budući da je RNA osjetljiva na smicanje tijekom izolacije i obrade nizvodno,12,13 teško je pojačati dulje fragmente s ovim heterogenim uzorkom. Stoga je demonstracija elektrokemijskog očitavanja umnoška SARS-CoV-2 u otpadnoj vodi ograničena na kraći \(72\,\hbox {bp}\) N1 fragment.
U ovom smo radu istražili izvedivost elektrokemijskog očitavanja baziranog na ENIG PCB-u faga Phi6 koncentriranog i izoliranog iz uzoraka jezerske vode (Slika 1). Phi6 fagi usporedivi su po veličini (80-100 nm) sa SARS-CoV-2 i također imaju lipidnu membranu i šiljasti protein. Iz tih je razloga bakteriofag Phi6 popularan surogat za SARS-CoV-2 i druge patogene RNK viruse s ovojnicom14,15. RNK izolirana iz čestica faga korištena je kao predložak za sintezu cDNA, a zatim PCR-om za dobivanje dva fragmenta DNA duljine 117 i 503 para baza. S obzirom na izazov umnožavanja \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 fragmenata u našem prethodnom radu, ciljamo na fragmente srednje duljine (\(117 \,\hbox {bp}\) i \(503 \,\hbox {bp}\)), na temelju dostupnih početnica. Odaziv elektrokemijskog senzora sustavno je proučavan u širokom rasponu koncentracija (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) do \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Za oba fragmenta u prisustvo MB, učinak soli na odziv senzora karakteriziran je i unakrsno potvrđen spektrofotometrijskim mjerenjima. Glavni doprinosi ovog rada su sljedeći:
Duljina fragmenta DNA i prisutnost soli u uzorku snažno utječu na osjetljivost.Naši rezultati pokazuju da elektrokemijska aktivnost ovisi o različitim mehanizmima interakcije MB, DNA i senzora u voltametrijskom odgovoru, ovisno o koncentraciji i duljini DNA, pri čemu dulji fragmenti pokazuju veću osjetljivost, iako sol ima negativan učinak na elektrostatske interakcije između MB i DNK.
Koncentracija DNA određuje mehanizam interakcije MB-DNA u nemodificiranim elektrodama. Pokazali smo da različiti mehanizmi interakcije MB-DNA ovise o koncentraciji DNA. Pri koncentracijama DNA ispod male količine \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), primijetili smo da je odgovor elektrokemijske struje uglavnom određen adsorpcijom MB-DNA na elektrodi, dok je pri nižim koncentracijama. Pri visokim koncentracijama DNA, odgovor elektrokemijske struje određen je steričkom inhibicijom redoks aktivnost zbog umetanja MB između parova baza DNA.
ENIG PCB-baziran elektrokemijski senzor virusnih nukleinskih kiselina u uzorcima jezerske vode Opažanja su potvrđena elektrokemijskom detekcijom Phi6-dodanih \(503\,\hbox {bp}\) fragmenata DNA dobivenih iz uzoraka vode iz jezera Powai, IIT Mumbai Campus Rezultat fag.
Niska cijena implementacije i potencijal za integraciju u potpuno automatizirane sustave praćenja, oligonukleotidi ili aptameri na elektrodama s duljim vijekom trajanja.
Fag Phi6 je dsRNA virus s ovojnicom iz porodice Cytoviridae koji inficira Pseudomonas syringae. Genom faga Phi6 postoji u obliku 3 fragmenta: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07 \,\hbox {Kb}\)) i L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Budući da fag Phi6 inficira nepatogeni soj BSL-1 Pseudomonas, siguran je za upotrebu i može se lako uzgajati u laboratoriju. Phage Phi6 i njegov domaćin Pseudomonas syringae kupljeni su od Referentnog centra za bakterijske viruse Felix d'Herelle, Sveučilište Laval, Kanada (kataloški brojevi referentnog centra su HER-102 odnosno HER-1102) .Phi6 fag i njegov domaćin oživljeni su prema uputama referentnog centra. Fag Phi6 je pročišćen lizom ploče i elucijom da bi se dobili konačni titri s \(\oko 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (jedinice koje stvaraju plak/ mililitar).RNA je izolirana iz pročišćenih fagnih čestica pomoću GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) u skladu s uputama proizvođača. Ukratko, pročišćena suspenzija faga Phi6\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) je lizirana i lizat je napunjen na kolonu za centrifugiranje kako bi se omogućilo da se RNA veže na kolonu smole. RNA se zatim eluira u otopini za eluiranje \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) isporučeno u kompletu. Procijenite koncentraciju RNA apsorbancijom na \(260\,\hbox {nm}\). RNA je pohranjena u alikvotima u \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) do daljnje upotrebe.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA Synthesis Kit (Bio -Rad Laboratories) korišten je kao predložak za sintezu cDNA prema uputama proizvođača. Ukratko, reakcija sinteze cDNA sastoji se od 3 koraka: priming na \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , obrnuta transkripcija \({20}\,{\hbox {min}}\) na \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), i obrnuto Snimač je u \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) za \({1}\,{\hbox {min }}\). Kada se izvodi na 1% agaroznom gelu, cDNA je pokazala tri trake koje odgovaraju očekivana tri fragmenta RNA (podaci nisu prikazani). Sljedeći primeri korišteni su za umnožavanje dva fragmenta DNA duljine 117 i 503 bp, koristeći cDNA kao predložak za PCR u miniPCR® mini8 termalnom cikleru:
Primeri za \(117\,\hbox {bp}\) i \(503\,\hbox {bp}\) odgovaraju 1476-1575 nukleotida M segmenta i 458-943 nukleotida L segmenta, odnosno kiseline Svi amplificirani PCR produkti su podvrgnuti elektroforezi na 1% agaroznom gelu, a amplificirana ciljna DNA je pročišćena korištenjem GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
Jezero u kampusu IIT Mumbai (Jezero Powai, Powai, Mumbai) korišteno je za dodavanje čestica faga. Jezerska voda je filtrirana kroz \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) membranu kako bi se uklonile suspendirane čestice, a zatim je dodan fag Phi6. Dodajte \({1}\,{\hbox {ml}}\) od \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) u \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) filtriranu jezersku vodu, u \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Mali alikvot je rezervirano za mjerenje količine virusa testom plaka. Testirali smo dvije različite metode za koncentriranje čestica Phi6 virusa s šiljcima: (1) metodu adsorpcije-precipitacije aluminijevim hidroksidom,19 koja je validirana za koncentraciju nekoliko RNA virusa s ovojnicom iz uzoraka iz okoliša, i (2) ) Metoda koncentracije virusa na bazi polietilen glikola (PEG) prilagođena je od Flood et al.20. Budući da je utvrđeno da je učinkovitost oporabe metode temeljene na PEG-u bolja od one metode s aluminijevim hidroksidom, metoda temeljena na PEG-u korištena je za koncentriranje čestica Phi6 iz uzoraka jezerske vode.
Upotrijebljena je PEG metoda kako slijedi: PEG 8000 i \(\hbox {NaCl}\) dodani su u uzorke jezerske vode obogaćene Phi6 kako bi se dobilo 8 % PEG 8000 i \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Uzorci su inkubirani na mućkalici\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), zatim centrifugirano na \(4700 \,\hbox {g}\) je \({45}\,{\hbox {min}}\). Odbacite supernatant i resuspendirajte talog u \({1}\, {\hbox {ml}}\) u istom supernatantu. Svi eksperimenti dodavanja i koncentracije virusa izvedeni su u triplikatu. Nakon koncentracije, mali alikvot je rezerviran za mjerenje učinkovitosti oporavka testom plaka. RNA je izolirana kao što je prethodno opisano i eluirana u puferu za ispiranje isporučenom u kompletu\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Budući da će koncentracija RNK varirati od uzorka do uzorka u triplikatu, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) RNA koristi se za sva tri bez obzira na njegovu koncentraciju cDNA sinteza uzoraka. cDNA sinteza je izvedena kao što je prethodno opisano.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA korišten je kao predložak za \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR za 35 ciklusa za pojačavanje \ (117\,\hbox {bp}\) i \(503\,\hbox { bp}\) fragmenti. Ovi su uzorci predstavljeni kao “1:1″, tj. bez razrjeđenja. Kao negativna kontrola postavljena je kontrola bez uzorka (NTC), dok je postavljena cDNA sintetizirana pomoću RNA izolirane iz pročišćenog faga kao predložak za pozitivnu kontrolu (PC). Kvantitativni PCR (qPCR) izveden je u Stratagene Mx3000P RT-PCR instrumentu koristeći Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Reakcije su postavljene u triplikatu kao i ranije opisan. Prag ciklusa (Ct) zabilježen je za sve uzorke. Osim toga, razrijeđeni uzorci su \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) upotrebom cDNA razrijeđene 1:100 u filtriranoj jezerskoj vodi kao \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR za 35 ciklusa. Ovi su uzorci predstavljeni kao “1:100″.
PCB elektrode proizvedene su korištenjem komercijalno dostupnog jeftinog procesa Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) bez potrebe za dodatnim pozlaćivanjem. Specifikacije ENIG PCB elektroda detaljno su opisane u našem prethodnom radu11. Za ENIG PCB elektrode, tradicionalne metode čišćenja elektroda kao što su ne preporuča se ciklička voltametrija s otopinom piranha ili sumpornom kiselinom jer mogu uzrokovati ljuštenje tankog sloja zlata (debljine \(\približno\) \(100\,\hbox {nm }\)) i izložiti bakrene slojeve koji su podložni na koroziju 21, 22, 23, 24, 25. Stoga, očistite elektrode krpom koja ne ostavlja dlačice navlaženom IPA-om. Uzorak za testiranje inkubiran je s \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB u \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) za jednostavno umetanje. U našem prethodnom radu primijetili smo da su osjetljivost i linearnost senzora poboljšani povećanjem koncentracije MB 11. Na temelju optimizacija navedenih u našem ranijem radu, koristili smo \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB koncentracije za ugradnju DNK u ovu studiju. Elektrokemijsko otkrivanje dvolančane DNK (ds-DNK) može se postići pomoću anionskih ili kationskih interkalatora. Iako anionski interkalatori detektiraju DNK s boljom selektivnošću, potrebna im je inkubacija preko noći, što rezultira duljim vremenima detekcije. s druge strane, kationski interkalatori kao što je MB zahtijevaju kraća vremena inkubacije, približno \({1}\,{\hbox {h}}\) za elektrokemijsku detekciju ds-DNA6. Svako mjerenje uključuje raspršivanje uzorka koji se testira na elektroda\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), zatim čišćenje krpom navlaženom IPA prije nego što nastavite s drugim uzorkom.jedno mjerenje. Svaki uzorak testiran je na 5 različitih elektroda osim ako nije drugačije navedeno. Mjerenja DPV i CV izvedena su pomoću potenciostata PalmSens Sensit Smart, a softver PSTrace korišten je za konfiguraciju potenciostata i prikupljanje podataka, uključujući izračune vršne struje. Koriste se sljedeće postavke za DPV i CV mjerenja:
DPV: Vrijeme ravnoteže = \(8\,\hbox {s}\), Korak napona = \(3\,\hbox {mV}\), Pulsni napon = \(25\,\hbox {mV}\) , trajanje pulsa = \(50\,\hbox {ms}\), brzina skeniranja = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Vrijeme ravnoteže = \(8\,\hbox {s}\), Korak napona = \(3\,\hbox {mV}\), Brzina prelaska = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Vršne struje dobivene iz voltamograma DNA u kompleksu s \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) životopis, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) životopis.
DPV i CV voltamogrami dobiveni su na ENIG PCB elektrodama \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB u kompleksu s DNA (u koncentracijama od 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) tj. 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) za \(117\,\hbox {bp}\ ) i 0,03 –\({0,06}\,{\upmu \hbox {M}}\) za \(503\,\hbox {bp}\)). Reprezentativni voltamogrami prikazani su na slici S1 u dodatnim informacijama. Slika 2 prikazuje rezultate DPV i CV mjerenja (vršna struja) korištenjem gelom pročišćenih PCR proizvoda. U usporedbi s CV mjerenjima, DPV mjerenja pokazuju veću osjetljivost (struja kao funkcija koncentracije DNA) jer pozadinske kapacitivne struje u CV mjerenjima skrivaju Faradaicove struje 26. Podaci za svaki okvir u dijagramu okvira sadrži mjerenja s 5 elektroda. Sva mjerenja koriste isti set elektroda kako bi se izbjegle pogreške mjerenja zbog varijacija od elektrode do elektrode. Uočili smo rastući trend u DPV i CV izmjerenim vršnim strujama za niže koncentracije DNA , dulji (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ u usporedbi s \(117) ) fragmentom. Ovo je u skladu s očekivanim trendom adsorpcije elektrode navedenim u našem prethodnom radu. adsorpcija MB-DNA kompleksa olakšava prijenos naboja na elektrodi, što doprinosi povećanju vršne struje. Druge studije su pokazale učinak veličine i sekvence oligonukleotida na MB-DNA interkalaciju 27,28,29,30. Gvanin -sadržaj citozina (GC) u dva amplikona (\(117\,\hbox {bp}\) i \(503\,\hbox {bp}\)) bio je približno 50%, što ukazuje da je opažanje Razlika je na duljinu amplikona. Međutim, za veće koncentracije DNA (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), za \(503\,\hbox {bp} \) i \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) za \(117\,\hbox {bp}\)), opažamo dva pojačanja vršne struje podvodnika smanjene su iu DPV i u CV mjerenjima. To je zato što se MB zasićuje i interkalira između parova baza DNK, što rezultira prostornom inhibicijom redoks aktivnosti reducibilne skupine u MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Soli prisutne u PCR glavnim mješavinama ometaju elektrostatske interakcije između MB i DNK, pa dodavanjem \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) s \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB gel-pročišćen proizvod za proučavanje učinka soli na interakciju MB-DNA. Kao što je prikazano na slici 3, primijetili smo da za veće koncentracije DNA (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) i \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) za \(117\,\hbox {bp} \)), u DPV i CV Dodavanje soli nije značajno utjecalo na mjerenja (pogledajte sliku S2 u Dodatnim informacijama za reprezentativne voltamograme). Međutim, na nižim koncentracijama DNA, dodavanje soli uvelike smanjuje osjetljivost, što rezultira bez značajne promjene u struji s koncentracijom DNA. Slični negativni učinci soli na MB-DNA interakcije i interkalaciju prethodno su izvijestili drugi istraživači33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) kationi vežu se na negativnu fosfatnu okosnicu DNA, čime se ometa elektrostatska interakcija između MB i DNA. Pri višim koncentracijama DNA, prostorna inhibicija redoks-aktivnih MB rezultira nižim vršnim strujama, pa elektrostatske interakcije ne utječu značajno na odgovor senzora. Ključna točka je da je ovaj biosenzor prikladniji za otkrivanje viših koncentracija DNK (rijetko \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ili više), za potpuno automatiziranu obradu uzoraka vode iz okoliša, gdje pročišćavanje PCR proizvoda gelom možda nije izvedivo.
Područje ispod apsorpcijske krivulje za raspon valnih duljina 600–700 \(\hbox {nm}\) za različite koncentracije DNA u kompleksu s \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) sa i bez soli (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) sa i bez soli (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Koncentracije DNK koje odgovaraju \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB uzorcima Bez DNK.
Kako bismo dodatno provjerili gore navedene rezultate, izvršili smo optička mjerenja pomoću UV/Vis spektrofotometra (Thermo Scientific Multiskan GO), uzorci \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) korišteni su za svaki Mjerenje. Signatura apsorpcije opada s povećanjem koncentracije DNA, kao što se može vidjeti iz trenda površine ispod krivulje apsorpcije za raspon valnih duljina \(600\,\hbox {nm}\) do \(700\,\hbox { nm}\), kao što je prikazano na slici 4 (apsorpcijski spektar prikazan na slici S3 u Dodatnim informacijama). Za uzorke s koncentracijama DNK manjim od \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), nije bilo značajne razlike u unosu između uzoraka koji sadrže DNK i samo MB (za \(503\,\hbox {bp}\) i \(117\,\hbox {bp}\ ) dužinskih fragmenata), što ukazuje na odsutnost steričke inhibicije redoks-aktivnog MB. Pri višim koncentracijama DNA primijetili smo postupno smanjenje signala apsorbancije i primijetili manje smanjenje apsorbancije u prisutnosti soli. Ovi rezultati pripisani su molekularnom interakcije i sterička inhibicija sa slaganjem baza u DNA hibridima. Naši su rezultati u skladu s izvješćima u literaturi o spektroskopskim studijama interkalacije MB-DNA koja povezuju hipokromatičnost sa smanjenim razinama energije u \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) elektronički prijelazi zbog interkalacije Slojevi 36, 37, 38.
Elektroforeza faga Phi6 u agaroznom gelu: PCR produkti duljine \(117\,\hbox {bp}\) i \(503\,\hbox {bp}\) iz uzoraka jezerske vode. M-DNA marker;NTC-no-template kontrola, početnice koje sadrže odgovarajuće amplikone;PC pozitivna kontrola;1, 2, 3-nerazrijeđeni (1:1) uzorci jezerske vode u triplikatu. Traka je vidljiva na \(\oko 50\,\hbox {bp}\) zbog neiskorištenih oligonukleotida u \(503\,\ hbox {bp}\) traka.
Procijenili smo korisnost senzora korištenjem uzoraka vode jezera Powai obogaćenih Phi6 fagom. Koncentracije RNA izolirane iz uzoraka vode obogaćenih fagom kretale su se od 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), dok je za one izolirane iz pročišćenih suspenzija faga procijenjeno da je RNA \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) s učinkovitošću oporavka od približno 1 %.RNA je obrnuto prepisana u cDNA i upotrijebljena kao predložak za PCR i qPCR. Veličina proizvoda je potvrđena elektroforezom u agaroznom gelu (Slika 5) prije testiranja sa senzorom. Ovi uzorci nisu pročišćeni gelom i stoga sadrže sve komponente PCR-a kao kao i amplikone od interesa. Vrijednosti Ct zabilježene tijekom qPCR-a (tablica 1) pokazale su korelaciju s koncentracijom RNA izolirane iz odgovarajućih uzoraka vode s dodacima. Ct vrijednost otkriva broj ciklusa potrebnih za fluorescentni signal premašuju prag ili pozadinski signal. Više vrijednosti Ct upućuju na niže koncentracije uzorka i obrnuto. Vrijednosti Ct NTC uzoraka bile su očekivano visoke. Razlika u \(\približno 3\) Ct vrijednosti između pozitivna kontrola i testni uzorak dalje pokazuju da svaki testni uzorak ima približno 1% predloška u usporedbi s pozitivnom kontrolom. Prethodno smo raspravljali o tome da duži amplikoni dovode do bolje osjetljivosti. Amplifikacija dužih fragmenata izoliranih iz heterogenih uzoraka iz okoliša izazovna je s obzirom na nedostatke niske koncentracije virusa i razgradnje RNA. Međutim, s našim protokolom za obogaćivanje virusa i PCR pojačanje, uspjeli smo uspješno pojačati \(503\,\hbox {bp}\) fragment za elektrokemijski senzor.
Slika 6 prikazuje rezultate elektrokemijskog senzora \(503\,\hbox {bp}\) umnožaka fragmenta, oba koristeći nerazrijeđenu cDNA kao predložak (1:1) i 100 puta razrijeđenu cDNA kao predložak (1:100) izvedenu PCR , u usporedbi s NTC i PC (pogledajte sliku S4 u Dodatnim informacijama za reprezentativne voltamograme). Svaki okvir u dijagramu na slici 6 sadrži mjerenja iz tri uzorka na 5 elektroda. Iste elektrode korištene su za mjerenje svih uzoraka kako bi se izbjegle pogreške zbog elektrode varijacija od elektrode. U usporedbi s CV mjerenjima, DPV mjerenja pokazuju bolju rezoluciju za razlikovanje testnih i PC uzoraka od NTC jer su, kao što je prethodno spomenuto, Faradaicove struje skrivene zbog pozadinskih kapacitivnih struja u potonjima. Za dulje amplikone primijetili smo da negativna kontrola (NTC) rezultirala je većim CV i DPV vršnim strujama u odnosu na pozitivnu kontrolu, dok su pozitivni i nerazrijeđeni ispitni uzorci pokazali slične vršne visine DPV vršnih struja. Izmjerene srednje i srednje vrijednosti za svaki nerazrijeđeni (1:1) ) ispitni uzorak i PC mogu se jasno razlučiti iz izlaza senzora za NTC uzorak, dok je razlučivost za 1:100 razrijeđeni uzorak manje izražena. Za 100-struko razrjeđenje cDNA, nismo primijetili nikakve trake tijekom gel elektroforeze (trake nisu prikazane na slici 5), a odgovarajuće vršne struje DPV i CV bile su slične onima očekivanim za NTC. Rezultati za \(117\,\hbox {bp}\) fragment prikazani su u Dodatnim informacijama. Negativni kontrola je izazvala elektrokemijski odgovor PCB senzora zbog adsorpcije slobodnog MB na elektrodu i interakcije MB s jednolančanim početnim oligonukleotidom. Stoga, svaki put kada se uzorak testira, mora se pokrenuti negativna kontrola i vršna struja ispitivanog uzorka u usporedbi s vršnom strujom dobivenom negativnom kontrolom kako bi se postiglo diferencijalno (relativno) mjerenje39,40 za klasificiranje ispitnog uzorka kao pozitivnog ili negativnog.
(a) DPV, i (b) CV vršna struja za elektrokemijsku detekciju \(503\,\hbox {bp}\) fragmenata u uzorcima jezerske vode. Testni uzorci izmjereni su u tri primjerka i uspoređeni s kontrolama bez šablona (NTC) i pozitivne kontrole (PC).
Naša otkrića ilustriraju različite mehanizme koji utječu na rad elektrokemijskih senzora za amplikone različitih duljina za različite DNA, s koncentracijama potvrđenim optičkim mjerenjima pomoću UV/Vis spektrofotometra. Naša opažanja naglašavaju uvid da se dulji fragmenti DNA do \(\približno\) \(500\,\hbox {bp}\) može se otkriti s većom osjetljivošću i da prisutnost soli u uzorku ne Osjetljivost Koncentracija DNK koja utječe na veću osjetljivost (rijetko \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) i iznad). Osim toga, istražili smo učinak različitih tipova uzoraka, uključujući gelom pročišćene amplikone sa i bez dodane soli, te dodavanje uzoraka jezerske vode u DPV i CV mjerenjima.Primijetili smo da DPV daje bolju rezoluciju, budući da pozadinska kapacitivna struja također utječe na mjerenje CV-a, čineći ga manje osjetljivim.
Amplifikacija duljih fragmenata ovisi o integritetu virusne genomske RNA. Nekoliko je studija pokazalo da amplifikacija duljih fragmenata nije uvijek učinkovita zbog degradacije RNA u okolišu i mogućnosti spajanja tijekom izolacije11,41,42,43,44 .Primijetili smo da je metoda koncentriranja virusa temeljena na PEG-u bila učinkovitija u koncentriranju faga Phi-6 obogaćenog uzorcima jezerske vode od metode koncentracije virusa temeljene na aluminijevom hidroksidu. Sposobnost otkrivanja dugih fragmenata DNA dokazala je da prevladava zahtjev za multipleks PCR za pojačavanje više predložaka kraće duljine i smanjenje mogućnosti unakrsne specifičnosti.
Biološki uzorci su rijetki, pa postoji potreba za dizajnom biosenzora koji zahtijeva minimalan broj uzoraka za testiranje. ENIG PCB elektrode korištene u ovoj studiji zahtijevaju samo \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) uzorci za testiranje kako bi se pokrila efektivna površina elektroda. Osim toga, ista se elektroda može ponovno upotrijebiti nakon čišćenja prije ispuštanja sljedećeg uzorka. Pojačani uzorci ne zahtijevaju dodavanje kemikalija osim metilenskog plavog, koje je jeftino i često korištene kemikalije. Budući da svaka elektroda košta oko 0,55 USD (ili 40 INR) za proizvodnju, ovaj biosenzor može biti isplativa alternativa postojećim tehnologijama detekcije. Tablica 2 prikazuje usporedbu ovog rada s drugim senzorima o kojima se već dugo govori u literaturi Fragmenti DNA u heterogenim uzorcima.
S obzirom na to da se protokoli elektrokemijske detekcije temeljeni na MB-u oslanjaju na specifičnost PCR-a, veliko ograničenje ove metode je potencijal za nespecifično pojačanje u heterogenim uzorcima kao što su otpadna voda i jezerska voda ili korištenje početnica niske čistoće. Kako bi se poboljšala osjetljivost metode elektrokemijske detekcije za DNA detekciju nepročišćenih PCR produkata korištenjem nemodificiranih ENIG PCB elektroda, potrebno je bolje razumjeti pogreške koje unose neiskorišteni dNTP-ovi i primeri te optimizirati reakcijske uvjete i testne protokole. Dodatni fizikalno-kemijski parametri kao što su pH, temperatura i biološki možda će također biti potrebno izmjeriti potrošnju kisika (BPK) uzorka vode kako bi se poboljšala točnost mjerenja.
Zaključno, predlažemo jeftini elektrokemijski ENIG PCB senzor za detekciju virusa u uzorcima iz okoliša (jezerska voda). Za razliku od imobiliziranih oligonukleotidnih elektroda ili prilagođenih supstrata za DNA senzor koji zahtijevaju kriogeno skladištenje za održavanje osjetljivosti,53,54 naša tehnika koristi nemodificirani PCB elektrode s duljim vijekom trajanja i bez posebnih zahtjeva za skladištenje te su stoga prikladne za razvoj mjernih rješenja s automatiziranom obradom uzoraka postavljenom u LMIC-ovima. Biosenzor koristi jeftine DNA-interkalirajuće redoks boje (MB) za brzo otkrivanje ciljnih amplikona. Nespecifično pojačanje uobičajeno u uzorcima iz okoliša smanjuje specifičnost ove senzorske metode zbog nespecifičnog vezanja MB na jednolančane i dvolančane oligonukleotide. Stoga specifičnost ovog testa ovisi o optimizaciji početnica i uvjetima PCR reakcije. Osim toga, CV i DPV vršne struje dobivene iz testiranih uzoraka treba tumačiti u odnosu na odgovore dobivene od negativne kontrole (NTC) za svaki test. Dizajni elektrokemijskih senzora i metode predstavljene u ovom radu mogu se integrirati s automatskim uzorkovačima kako bi se razvili potpuno automatizirani i niski -cjenovno rješenje koje može prikupljati i analizirati uzorke i bežično prenositi rezultate natrag u laboratorij.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Metode početne koncentracije virusa iz uzoraka vode: pregled i meta-analiza nedavnih studija.J.Application.microorganism.115, pp. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Virusi koji se prenose vodom: Prepreke sigurnoj vodi za piće. PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Epidemiologija otpadnih voda za isplativ veliki nadzor COVID-19 u zemljama s niskim i srednjim dohotkom: izazovi i prilike. Voda 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Metilen plavo kao elektrokemijski diskriminator jednolančanih i dvolančanih oligonukleotida imobiliziranih na zlatnim supstratima. Analyst 126, 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Usporedba kationskih i anionskih interkalatora za elektrokemijsku transdukciju DNA hibridizacije prijenosom elektrona dugog dometa.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Prijenos naboja kroz DNA: selektivni elektrokemijski DNA biosensor.anus.Chemical.78, 2138-2144 (2006).
Fang, TH et al. Mikrofluidni uređaj za PCR u stvarnom vremenu s istovremenom elektrokemijskom detekcijom. biološki senzor. Bioelektronika. 24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. Studija signalnog mehanizma i verifikacija performansi elektrokemijskog PCR sustava u stvarnom vremenu temeljenog na interakciji metilen plavog s DNA. Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al. Elektrokemijski senzor za detekciju sars-cov-2 u uzorcima otpadnih voda posredovan izotermnim pojačanjem.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al. Elektrokemijsko očitavanje amplikona SARS-CoV-2 s PCB elektrodama. Senzor je aktiviran. B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Učinkovito otkrivanje SARS-CoV-2 RNA u čvrstoj frakciji otpadne vode.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al. Analitičke metode za otkrivanje SARS-CoV-2 u otpadnoj vodi: Protokol i buduće perspektive. TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Preživljavanje bakteriofaga s ovojnicom Phi6 (zamjena za SARS-CoV-2) u isparenim kapljicama sline taloženim na staklenim površinama.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Postojanost surogata SARS-CoV-2 (Phi6) u okolišu kod slobodnoživućih ameba.J.Zdravlje vode 20, 83 (2021).
Mindich, L. Precizno pakiranje tri genomska fragmenta dvolančane RNA bakteriofaga\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Sekundarna struktura regije pakiranja faga\(\varphi\)6 DH RNA.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al. Fage na dodir – brz i učinkovit protokol za pripremu laboratorijskih zaliha bakteriofaga. PeerJ 4, e2261 (2016).
Vrijeme objave: 27. svibnja 2022