पीसीबी इलेक्ट्रोड का उपयोग कर पानी के नमूनों में वायरल न्यूक्लिक एसिड की इलेक्ट्रोकेमिकल सेंसिंग के लिए लंबे एम्पलीकॉन्स बेहतर संवेदनशीलता प्रदान करते हैं

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COVID-19 महामारी की शुरुआत के बाद से पर्यावरणीय नमूनों की निगरानी के महत्व की बहुत सराहना की गई है, और सोने के मानक का उपयोग करते हुए कुछ निगरानी के प्रयास किए जा रहे हैं, हालांकि qPCR- आधारित तकनीकें महंगी हैं। इलेक्ट्रोकेमिकल डीएनए बायोसेंसर एक संभावित लागत प्रभावी प्रदान कर सकते हैं। निम्न और मध्यम आय वाले देशों में पर्यावरणीय पानी के नमूनों की निगरानी के लिए समाधान। इस काम में, हम नुकीले झील के पानी के नमूनों (SARS-CoV-2 के लिए एक लोकप्रिय सरोगेट) से अलग किए गए Phi6 फेज से प्राप्त एम्पलीकॉन्स की इलेक्ट्रोकेमिकल पहचान का प्रदर्शन करते हैं। सतह संशोधन के बिना पीसीबी इलेक्ट्रोड को पूरा करने के लिए।सेक्स। इलेक्ट्रोकेमिकल सेंसर प्रतिक्रिया को अलग-अलग लंबाई के दो डीएनए टुकड़ों (\ ({117} \, \ hbox {bp} \) और \ ({503} \, \ hbox {bp} \)) के दो डीएनए टुकड़ों के लिए पूरी तरह से चित्रित किया गया था। पीसीआर मास्टर में लवण का प्रभाव मेथिलीन ब्लू (एमबी) -डीएनए इंटरैक्शन पर मिलाता है। हमारे परिणाम बताते हैं कि डीएनए के टुकड़ों की लंबाई विद्युत रासायनिक संवेदनशीलता को महत्वपूर्ण रूप से निर्धारित करती है और इस काम में प्रदर्शित करती है कि पीसीआर उत्पादों के जेल शुद्धिकरण के बिना लंबे एम्पलीकॉन का पता लगाने की क्षमता है पानी के नमूनों के सीटू माप के लिए महत्वपूर्ण है।वायरल लोड के लिए एक पूरी तरह से स्वचालित समाधान अच्छा है।
पोलियो और हेपेटाइटिस ई 1 के जलजनित संचरण के पहले साक्ष्य के साथ, 1940 के दशक से जलजनित वायरस संचरण को एक सार्वजनिक स्वास्थ्य खतरे के रूप में जाना जाता है। विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) ने मध्यम से उच्च स्वास्थ्य महत्व के कई जलजनित वायरल रोगजनकों को वर्गीकृत किया है। पारंपरिक वायरस पता लगाने के तरीके स्वर्ण-मानक qPCR-आधारित तकनीकों पर निर्भर करते हैं, जो अत्यधिक संवेदनशील और विशिष्ट हैं, लेकिन महंगे उपकरणों का उपयोग करके प्रयोगशाला में परीक्षण करने के लिए कुशल कर्मियों की आवश्यकता होती है। हालांकि, सीमित संसाधनों वाले निम्न और मध्यम-आय वाले देशों (LMIC) में, मानव पर्यावरणीय पानी के नमूने की निगरानी पर नमूना परीक्षण को प्राथमिकता मिलने की संभावना है। इसलिए, कम और मध्यम आय वाले देशों में पानी और अपशिष्ट जल के नमूनों की स्थायी, वास्तविक समय की निगरानी के लिए वैकल्पिक कम लागत वाली विधियों की आवश्यकता है, जो उभरती हुई बीमारी के प्रकोप की प्रारंभिक चेतावनी के रूप में हैं। जिससे उन्हें वायरस महामारी के गंभीर सामाजिक आर्थिक प्रभावों से बचाया जा सके। न्यूक्लिक एसिड के लिए कम लागत वाले इलेक्ट्रोकेमिकल बायोसेंसर इस अपूर्ण आवश्यकता के लिए एक आशाजनक संभावित समाधान प्रदान कर सकते हैं। इनमें से कई डीएनए बायोसेंसर इस तथ्य से काम करते हैं कि पूरक डीएनए स्ट्रैंड इलेक्ट्रोड पर स्थिर होते हैं। नमूना में एक मिलान अनुक्रम मौजूद होने पर सतह और संकरण करें। इसके बाद इसे विभिन्न इलेक्ट्रोकेमिकल तकनीकों द्वारा सिग्नल में परिवर्तित किया जा सकता है जैसे कि पोटेशियम आयरन / फेरोसाइनाइड जैसे रेडॉक्स मध्यस्थों का उपयोग करना। मिथाइलीन ब्लू (एमबी) एक ऐसा रेडॉक्स-सक्रिय अणु है, जिसमें है सिंगल-स्ट्रैंडेड डीएनए 5,6 के लिए इसके अधिक गैर-बाध्यकारी बंधन के अलावा डबल-फंसे डीएनए (डीएसडीएनए) में हस्तक्षेप करने की सूचना दी गई है। एमबी-डीएनए कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए एमबी की अंतःक्रियात्मक प्रकृति उन्हें कई इलेक्ट्रोकेमिकल डीएनए में रेडॉक्स मध्यस्थों के रूप में एक लोकप्रिय विकल्प बनाती है। सेंसर कॉन्फ़िगरेशन 5,6,7,8,9। हालांकि डीएनए के लिए एमबी का इंटरकलेशन गैर-विशिष्ट है, और इस इलेक्ट्रोकेमिकल सेंसर की विशिष्टता काफी हद तक पीसीआर या इज़ोटेर्मल प्रवर्धन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों की शुद्धता पर निर्भर करती है, यह वास्तविक को लागू करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है -टाइम इलेक्ट्रोकेमिकल-आधारित qPCR या प्रतिदीप्ति इज़ोटेर्मल प्रवर्धन डीएनए एकाग्रता माप 9 के विकल्प के रूप में। ऐसे ही एक कार्यान्वयन में, वोन एट अल। सोने के इलेक्ट्रोड की सतह को वास्तविक समय के लिए 6-मर्कैप्टो-1-हेक्सानॉल (एमसीएच) के साथ संशोधित किया गया था। विभेदक पल्स वोल्टामेट्री (डीपीवी)9 का उपयोग करके एमबी के साथ पीसीआर एम्पलीकॉन्स का मापन। अन्य मामलों में, रामिरेज़ एट अल। स्क्रीन-मुद्रित इलेक्ट्रोड के साथ एमबी का उपयोग करके आरटी-एलएएमपी प्रतिक्रिया द्वारा अपशिष्ट जल में सार्स-सीओवी-2 का पता लगाना। प्लेटिनम इलेक्ट्रोड भी किया गया है। प्रतिक्रिया 8 के दौरान विद्युत रासायनिक रूप से एम्पलीकॉन्स का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किए गए एक माइक्रोफ्लुइडिक पीसीआर प्लेटफॉर्म में सीटू इलेक्ट्रोड के रूप में उपयोग किया जाता है। इन सभी अध्ययनों में इलेक्ट्रोड की सतह संशोधन की आवश्यकता होती है, इन कार्यात्मक इलेक्ट्रोड की स्थिरता के लिए विशेष भंडारण आवश्यकताओं के कारण उत्पादन और परिचालन लागत में वृद्धि होती है।
झील के पानी के नमूनों में केंद्रित वायरल कणों से प्राप्त एम्पलीकॉन्स के विद्युत रासायनिक पता लगाने के लिए कार्यप्रवाह की योजना।
हमने हाल ही में डीपीवी पर आधारित कम लागत वाले मुद्रित सर्किट बोर्ड (पीसीबी) इलेक्ट्रोड के साथ सार्स-सीओवी-2 एम्पलीकॉन्स की इलेक्ट्रोकेमिकल सेंसिंग का प्रदर्शन किया और असंशोधित इलेक्ट्रोड की सतह पर एमबी-डीएनए परिसरों के सोखने से प्रेरित चक्रीय वोल्टामेट्री (सीवी)) शिखर में परिवर्तन वर्तमान11।हम रिपोर्ट करते हैं कि लंबे समय तक डीएनए के टुकड़े (N1-N2, \ ({943} \, \ hbox) सीडीसी-अनुशंसित N1 फॉरवर्ड और N2 रिवर्स प्राइमरों की तुलना में छोटे टुकड़ों {bp} \) के साथ बनते हैं) सेंसर प्रतिक्रिया में बेहतर रैखिकता दिखाते हैं। (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) N1 फॉरवर्ड और N1 रिवर्स प्राइमर सेट का उपयोग करके बनाया गया है। इन अध्ययनों की रिपोर्ट न्यूक्लियर-मुक्त पानी में तैयार किए गए डीएनए कमजोर पड़ने का उपयोग करके की गई है। SARS-CoV का पता लगाने के लिए भी प्लेटफॉर्म का उपयोग किया गया था। सिम्युलेटेड अपशिष्ट जल के नमूनों में -2 एम्पलीकॉन्स (सार्स-सीओवी-2 आरएनए के साथ कुल आरएनए नमूनों को स्पाइक करके प्राप्त)। चूंकि आरएनए अलगाव और डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण के दौरान कतरन के लिए अतिसंवेदनशील है, 12,13 इस विषम नमूने के साथ लंबे टुकड़ों को बढ़ाना मुश्किल है। इसलिए, अपशिष्ट जल में SARS-CoV-2 एम्प्लिकॉन की इलेक्ट्रोकेमिकल सेंसिंग का प्रदर्शन छोटे \(72\,\hbox {bp}\) N1 अंश तक सीमित है।
इस कार्य में, हमने फेज Phi6 की ENIG PCB-आधारित इलेक्ट्रोकेमिकल सेंसिंग की व्यवहार्यता की जांच की और झील के पानी के नमूनों (चित्र 1) से पृथक किया। Phi6 फेज SARS-CoV-2 के आकार (80-100 एनएम) में तुलनीय हैं। एक लिपिड झिल्ली और एक स्पाइक प्रोटीन भी होता है। इन कारणों से, बैक्टीरियोफेज Phi6 SARS-CoV-2 और अन्य लिफाफा रोगजनक आरएनए वायरस 14,15 के लिए एक लोकप्रिय सरोगेट है। फेज कणों से पृथक आरएनए को सीडीएनए संश्लेषण के लिए एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था और उसके बाद लंबाई में 117 और 503 आधार जोड़े के दो डीएनए टुकड़े प्राप्त करने के लिए पीसीआर। हमारे पिछले काम में \ (943 \, \ hbox {bp} \) N1-N2 अंशों को बढ़ाने की चुनौती को देखते हुए, हम मध्यवर्ती लंबाई के टुकड़ों को लक्षित करते हैं (\ (117) उपलब्ध प्राइमरों के आधार पर \, \ hbox {bp} \) और \ (503 \, \ hbox {bp} \)), इलेक्ट्रोकेमिकल सेंसर प्रतिक्रिया का व्यवस्थित रूप से एक विस्तृत सांद्रता रेंज (\ ({10} \, {) पर अध्ययन किया गया था। \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) से \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) दोनों अंशों के लिए एमबी की उपस्थिति, सेंसर प्रतिक्रिया पर नमक के प्रभाव की विशेषता और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक माप द्वारा क्रॉस-वैलिडेट किया गया है। इस कार्य के मुख्य योगदान इस प्रकार हैं:
डीएनए के टुकड़े की लंबाई और नमूने में नमक की उपस्थिति संवेदनशीलता को बहुत प्रभावित करती है।हमारे परिणाम बताते हैं कि इलेक्ट्रोकेमिकल गतिविधि एमबी, डीएनए और वोल्टामेट्रिक प्रतिक्रिया में सेंसर के विभिन्न तंत्रों पर निर्भर करती है, डीएनए एकाग्रता और लंबाई के आधार पर, लंबे समय तक टुकड़े उच्च संवेदनशीलता दिखाते हैं, हालांकि नमक का इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है। एमबी और डीएनए।
डीएनए सांद्रता असंशोधित इलेक्ट्रोड में एमबी-डीएनए इंटरैक्शन के तंत्र को निर्धारित करती है। हम प्रदर्शित करते हैं कि एमबी-डीएनए इंटरैक्शन के विभिन्न तंत्र डीएनए एकाग्रता पर निर्भर करते हैं। डीएनए सांद्रता की थोड़ी मात्रा के नीचे \ ({\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox) {l}}}}), हमने देखा कि इलेक्ट्रोकेमिकल वर्तमान प्रतिक्रिया मुख्य रूप से इलेक्ट्रोड पर एमबी-डीएनए के सोखने से निर्धारित होती है, जबकि कम सांद्रता पर उच्च डीएनए सांद्रता पर, इलेक्ट्रोकेमिकल वर्तमान प्रतिक्रिया रेडॉक्स के स्टेरिक निषेध द्वारा निर्धारित की जाती है। डीएनए बेस जोड़े के बीच एमबी सम्मिलन के कारण गतिविधि।
झील के पानी के नमूनों में वायरल न्यूक्लिक एसिड की ENIG PCB-आधारित इलेक्ट्रोकेमिकल सेंसिंग Phi6-added \(503\,\hbox {bp}\) के इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्शन द्वारा पवई झील, IIT मुंबई कैंपस से पानी के नमूनों से प्राप्त डीएनए अंशों को मान्य किया गया था। परिणाम फेज।
लंबे शेल्फ जीवन के साथ इलेक्ट्रोड पर पूरी तरह से स्वचालित निगरानी प्रणाली, ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स या एप्टामर्स में एकीकरण की कम लागत और एकीकरण की क्षमता।
Phage Phi6 Cytoviridae परिवार का एक खुला dsRNA वायरस है जो Pseudomonas syringae को संक्रमित करता है। Phi6 फेज का जीनोम 3 टुकड़ों के रूप में मौजूद है: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) और L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17। चूँकि Phi6 फेज एक गैर-रोगजनक BSL-1 स्यूडोमोनास स्ट्रेन को संक्रमित करता है, इसका उपयोग करना सुरक्षित है और इसे प्रयोगशाला में आसानी से उगाया जा सकता है। फेज Phi6 और इसके मेजबान स्यूडोमोनास सिरिंज को फेलिक्स डी'हेरेले रेफरेंस सेंटर फॉर बैक्टीरियल वायरस, लावल यूनिवर्सिटी, कनाडा से खरीदा गया था (संदर्भ केंद्र कैटलॉग संख्या क्रमशः HER-102 और HER-1102 हैं) .Phi6 फेज और इसके मेजबान को संदर्भ केंद्र द्वारा निर्देशित के रूप में पुनर्जीवित किया गया था। फेज Phi6 को प्लेट लिसिस और क्षालन द्वारा शुद्ध किया गया था ताकि अंतिम टाइटर्स को \ (\ लगभग 10 ^ {12} \, {\ hbox {PFU} / \ hbox {) के साथ प्राप्त किया जा सके। ml}}\) (पट्टिका बनाने वाली इकाइयां/मिलीलीटर)। RNA को निर्माता के निर्देशों के अनुसार GenElute™ यूनिवर्सल टोटल RNA प्यूरिफिकेशन किट (सिग्मा-एल्ड्रिच) का उपयोग करके शुद्ध फेज कणों से अलग किया गया था। संक्षेप में, एक शुद्ध फेज Phi6 सस्पेंशन\({ 100}\,{{upmu \hbox {l}}}\) को लाइस किया गया था और आरएनए को रेज़िन कॉलम से बाइंड करने की अनुमति देने के लिए लाइसेट को एक स्पिन कॉलम पर लोड किया गया था। फिर आरएनए को एल्युशन सॉल्यूशन \({ 50}\,{{upmu \hbox {l}}}\) किट द्वारा प्रदान किया गया। \(260\,\hbox {nm}\) पर अवशोषण द्वारा RNA की सांद्रता का अनुमान लगाएं। RNA को एलिकोट्स में \(260\,\hbox {nm}\). ({-80}\,{^{\circ}\hbox {C}}\) आगे के उपयोग तक।\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA सिंथेसिस किट (बायो -रेड लेबोरेटरीज) का उपयोग निर्माता के निर्देशों के बाद सीडीएनए संश्लेषण के लिए एक टेम्पलेट के रूप में किया गया था। संक्षेप में, एक सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया में 3 चरण होते हैं: प्राइमिंग एट \ ({25} \, {^ {\ circ} \ hbox {C}} \)। )\({5}\,{\hbox {min}}\), \({20}\,{\hbox {min}}\) का रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन \({46}\,{^{\circ) पर }\hbox {C}}\), और रिवर्स रिकॉर्डर \({95}\,{^{\circ}\hbox {C}}\) में \({1}\,{\hbox {मिनट) के लिए है }}\). जब एक 1% agarose जेल पर चलाया जाता है, तो सीडीएनए ने अपेक्षित तीन आरएनए अंशों के अनुरूप तीन बैंड दिखाए (डेटा नहीं दिखाया गया)। निम्नलिखित प्राइमरों का उपयोग लंबाई में 117 और 503 बीपी के दो डीएनए अंशों को बढ़ाने के लिए किया गया था, मिनीपीसीआर® मिनी8 थर्मल साइक्लर में पीसीआर के लिए टेम्पलेट के रूप में सीडीएनए का उपयोग करना:
\(117\,\hbox {bp}\) और \(503\,\hbox {bp}\) के लिए प्राइमर एम सेगमेंट के 1476-1575 न्यूक्लियोटाइड्स और L सेगमेंट के 458-943 न्यूक्लियोटाइड्स के अनुरूप हैं, क्रमशः एसिड .सभी प्रवर्धित PCR उत्पादों को 1% agarose जैल पर इलेक्ट्रोफोरेस किया गया था, और प्रवर्धित लक्ष्य डीएनए को GeneJET जेल एक्सट्रैक्शन किट (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके शुद्ध किया गया था।
IIT मुंबई परिसर में एक झील (पवई झील, पवई, मुंबई) का उपयोग फेज कणों को जोड़ने के लिए किया गया था। झील के पानी को हटाने के लिए \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था। निलंबित कण, और फिर Phi6 फेज जोड़ा गया था। जोड़ें \ ({1} \, {\ hbox {ml}} \) का \ (10 ​​^ {6} \, {\ hbox {PFU} / \ hbox {ml}} \) से \({100}\, {\hbox {ml}}\) फ़िल्टर्ड झील का पानी, \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\) में। एक छोटा विभाज्य था पट्टिका परख द्वारा वायरल लोड माप के लिए आरक्षित। हमने नुकीले Phi6 वायरस कणों को केंद्रित करने के लिए दो अलग-अलग तरीकों का परीक्षण किया: (1) एल्यूमीनियम हाइड्रॉक्साइड सोखना-वर्षा विधि, 19 जिसे पर्यावरणीय नमूनों से कई लिफाफे वाले आरएनए वायरस की एकाग्रता के लिए मान्य किया गया है, और (2) ) पॉलीइथाइलीन ग्लाइकॉल (पीईजी) आधारित वायरस एकाग्रता विधि फ्लड एट अल से अनुकूलित की गई थी।20. चूँकि PEG-आधारित विधि की पुनर्प्राप्ति दक्षता एल्यूमीनियम हाइड्रॉक्साइड विधि की तुलना में बेहतर पाई गई थी, PEG- आधारित विधि का उपयोग झील के पानी के नमूनों से Phi6 कणों को केंद्रित करने के लिए किया गया था।
PEG विधि का उपयोग इस प्रकार था: PEG 8000 और \ (\ hbox {NaCl} \) को Phi6- नुकीले झील के पानी के नमूनों में 8% PEG 8000 और \ (0.2 \, \ hbox {M} \) प्राप्त करने के लिए जोड़ा गया था। \ hbox {NaCl}\). नमूने एक शेकर\({4}\,{^{\circ}\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\) पर इनक्यूबेट किए गए थे। ), फिर \ (4700 \, \ hbox {g} \) पर अपकेंद्रित्र \ ({45} \, {\ hbox {min}}}) है। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और \ ({1} \) में गोली को फिर से निलंबित करें। {\ hbox {ml}}} एक ही सतह पर तैरनेवाला में। सभी स्पाइकिंग और वायरस एकाग्रता प्रयोगों को तीन प्रतियों में किया गया था। एकाग्रता के बाद, पट्टिका परख द्वारा पुनर्प्राप्ति दक्षता के मापन के लिए एक छोटा सा विभाज्य आरक्षित किया गया था। आरएनए को पहले वर्णित और eluted के रूप में अलग किया गया था। किट-आपूर्ति वाले रेफरेंस बफर में\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\)। चूँकि RNA की सघनता एक नमूने से दूसरे नमूने में तीन प्रतियों में भिन्न होगी, \({2}\,{\upmu \ आरएनए के hbox {l}}\) का उपयोग नमूनों के cDNA संश्लेषण की परवाह किए बिना तीनों के लिए किया जाता है। cDNA संश्लेषण पहले वर्णित रूप में किया गया था। \ ({1} \, {\ upmu \ hbox {l}} \) cDNA \ ({20} \, {\ upmu \ hbox {l}}\) के लिए 35 चक्रों के लिए PCR के लिए टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया गया था \ (117 \, \ hbox {bp} \) और \ (503 \, \ hbox { bp}\) टुकड़े। इन नमूनों को "1: 1" के रूप में दर्शाया गया है, यानी बिना कमजोर पड़ने के। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक नो-टेम्प्लेट नियंत्रण (एनटीसी) स्थापित किया गया था, जबकि शुद्ध फेज से पृथक आरएनए का उपयोग करके एक सीडीएनए संश्लेषित किया गया था। एक सकारात्मक नियंत्रण (पीसी) के लिए एक टेम्पलेट के रूप में। क्वांटिटेटिव पीसीआर (क्यूपीसीआर) को स्ट्रैटेजीन एमएक्स3000पी आरटी-पीसीआर इंस्ट्रूमेंट में ब्रिलियंट III अल्ट्रा-फास्ट एसवाईबीआर ग्रीन क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज) का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया था। पहले की तरह तीन प्रतियों में प्रतिक्रियाएं स्थापित की गईं। वर्णन किया गया है। सभी नमूनों के लिए चक्र सीमा (Ct) दर्ज की गई थी। इसके अलावा, पतला नमूने \ ({1} \, {\ upmu \ hbox {l}}}) सीडीएनए का उपयोग करके फ़िल्टर्ड झील के पानी में 1: 100 के रूप में पतला किया गया था। \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) 35 चक्रों के लिए पीसीआर। इन नमूनों को "1:100" के रूप में दर्शाया गया है।
पीसीबी इलेक्ट्रोड को अतिरिक्त गोल्ड प्लेटिंग की आवश्यकता के बिना व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कम लागत वाली इलेक्ट्रोलेस निकेल इमर्शन गोल्ड (ENIG) प्रक्रिया का उपयोग करके बनाया गया है। ENIG PCB इलेक्ट्रोड विनिर्देशों को हमारे पिछले काम11 में विस्तृत किया गया है। ENIG PCB इलेक्ट्रोड के लिए, पारंपरिक इलेक्ट्रोड सफाई के तरीके जैसे कि पिरान्हा समाधान या सल्फ्यूरिक एसिड चक्रीय वोल्टामेट्री की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि वे सोने की पतली परत (मोटाई \(\लगभग \) \(100\,\hbox {nm }\)) को छील सकते हैं और अंतर्निहित तांबे की परतों को उजागर कर सकते हैं जो प्रवण हैं जंग 21, 22, 23, 24, 25 के लिए। इसलिए, इलेक्ट्रोड को आईपीए के साथ सिक्त लिंट-फ्री कपड़े से साफ करें। परीक्षण किए जाने वाले नमूने को \({50}\,{\upmu \hbox {M} के साथ इनक्यूबेट किया गया था। }\) MB in \({4}\,{^{\circ}\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) आसान प्रविष्टि के लिए। हमारे पिछले काम में , हमने देखा कि एमबी एकाग्रता 11 को बढ़ाकर सेंसर की संवेदनशीलता और रैखिकता में सुधार किया गया था। हमारे पहले के काम में बताए गए अनुकूलन के आधार पर, हमने \ ({50} \, {\ upmu \ hbox {M}} \) MB का उपयोग किया इस अध्ययन में डीएनए को एम्बेड करने के लिए सांद्रता। डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए (डीएस-डीएनए) का इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्शन एनीओनिक या कैटेनिक इंटरकेलेटर्स का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। दूसरी ओर, एमबी जैसे cationic intercalators को ds-DNA6 के इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्शन के लिए कम ऊष्मायन समय की आवश्यकता होती है, लगभग \ ({1} \, {\ hbox {h}} \)। प्रत्येक माप में परीक्षण किए जाने वाले नमूने को वितरित करना शामिल है। इलेक्ट्रोड\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), फिर दूसरे नमूने के साथ आगे बढ़ने से पहले, IPA-नम कपड़े से सफाई करें।एक माप। प्रत्येक नमूने को 5 अलग-अलग इलेक्ट्रोड पर परीक्षण किया गया था जब तक कि अन्यथा न कहा गया हो। डीपीवी और सीवी माप पामसेन्स सेंसिट स्मार्ट पोटेंशियोस्टैट का उपयोग करके किए गए थे, और पीएसटीआरएस सॉफ्टवेयर का उपयोग पोटेंशियोस्टेट कॉन्फ़िगरेशन और डेटा अधिग्रहण के लिए किया गया था, जिसमें पीक करंट कैलकुलेशन भी शामिल है। निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग किया जाता है। डीपीवी और सीवी माप के लिए:
DPV: संतुलन समय = \(8\,\hbox {s}\), वोल्टेज चरण = \(3\,\hbox {mV}\), पल्स वोल्टेज = \(25\,\hbox {mV}\) , पल्स अवधि = \(50\,\hbox {ms}\), स्कैन दर = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: संतुलन समय = \(8\,\hbox {s}\), वोल्टेज चरण = \(3\,\hbox {mV}\), स्वीप दर = \({300}\,\hbox {mV/ s) }\)
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB के साथ जटिल डीएनए के वोल्टमोग्राम से प्राप्त पीक धाराएं: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) सीवी।
DPV और CV वोल्टमोग्राम ENIG PCB इलेक्ट्रोड्स \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) पर प्राप्त किए गए थे, जो डीएनए के साथ जटिल थे (10–\({20}\,{\ hbox {ng) की सांद्रता पर }/{\upmu \hbox {l}}}\) यानी 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) के लिए \(117\,\hbox {bp}\ ) और 0.03 -\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(503\,\hbox {bp}\) के लिए)। प्रतिनिधि वोल्टामोग्राम चित्र S1 में पूरक सूचना में दिखाए गए हैं। चित्र 2 परिणाम दिखाता है जेल-शुद्ध पीसीआर उत्पादों का उपयोग करके डीपीवी और सीवी माप (पीक करंट) की। सीवी माप की तुलना में, डीपीवी माप उच्च संवेदनशीलता (डीएनए एकाग्रता के एक समारोह के रूप में वर्तमान) दिखाते हैं क्योंकि सीवी माप में पृष्ठभूमि कैपेसिटिव धाराएं फैराडिक धाराओं को छिपाती हैं। डेटा बॉक्सप्लॉट में प्रत्येक बॉक्स के लिए 5 इलेक्ट्रोड से माप शामिल हैं। इलेक्ट्रोड-टू-इलेक्ट्रोड भिन्नता के कारण माप त्रुटियों से बचने के लिए सभी माप इलेक्ट्रोड के एक ही सेट का उपयोग करते हैं। हमने डीएनए की कम सांद्रता के लिए डीपीवी और सीवी मापा शिखर धाराओं में बढ़ती प्रवृत्ति देखी , लंबा (\ (503 \, \ hbox {bp} \)) \, \ hbox {bp} \ (117) की तुलना में) टुकड़ा। यह हमारे पिछले काम में बताए गए इलेक्ट्रोड सोखने की अपेक्षित प्रवृत्ति के अनुरूप है। एमबी-डीएनए कॉम्प्लेक्स का सोखना इलेक्ट्रोड पर चार्ज ट्रांसफर की सुविधा देता है, जो पीक करंट को बढ़ाने में योगदान देता है। अन्य अध्ययनों ने एमबी-डीएनए इंटरकलेशन27,28,29,30 पर ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड आकार और अनुक्रम के प्रभाव को दिखाया है। ग्वानिन -cytosine (GC) दो एम्पलीकॉन्स की सामग्री (\ (117 \, \ hbox {bp} \) और \ (503 \, \ hbox {bp} \)) लगभग 50% थी, यह दर्शाता है कि अवलोकन अंतर के कारण है एम्प्लिकॉन लंबाई के लिए। हालांकि, उच्च डीएनए सांद्रता के लिए (\ (> {2} \, {\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox {l}}} \), \ (503 \, \ hbox {bp} के लिए) \) और \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) \(117\,\hbox {bp}\) के लिए, हम दो प्रवर्धन देखते हैं डीपीवी और सीवी दोनों मापों में उप की चोटी की धाराएं कम हो जाती हैं। ऐसा इसलिए है क्योंकि एमबी डीएनए के आधार जोड़े के बीच संतृप्त और अंतःस्थापित होता है, जिसके परिणामस्वरूप एमबी 31,32 में रिड्यूसबल समूह की रेडॉक्स गतिविधि का स्टेरिक अवरोध होता है।
अब \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl} _2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503) \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV,(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
पीसीआर मास्टर मिक्स में मौजूद लवण एमबी और डीएनए के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन में हस्तक्षेप करते हैं, इसलिए \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl} _2\) को \({50} \,{\) के साथ जोड़कर upmu \hbox {M}}\) एमबी जेल-शुद्ध उत्पाद एमबी-डीएनए इंटरैक्शन पर नमक के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए। जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है, हमने देखा कि उच्च डीएनए सांद्रता के लिए (\(>{2}\, {\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) और \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) for \ (117 \, \ hbox {bp} \)), DPV और CV में नमक के योग ने माप को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं किया (प्रतिनिधि वोल्टमोग्राम के लिए पूरक सूचना में चित्र S2 देखें)। हालांकि, पर कम डीएनए सांद्रता, नमक के अतिरिक्त संवेदनशीलता को बहुत कम कर देता है, जिसके परिणामस्वरूप डीएनए एकाग्रता के साथ वर्तमान में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं होता है। एमबी-डीएनए इंटरैक्शन और अंतराल पर नमक के इसी तरह के नकारात्मक प्रभाव पहले अन्य शोधकर्ताओं द्वारा 33,34.\(\hbox {) द्वारा रिपोर्ट किए गए हैं। Mg}^{2+}\) धनायन डीएनए के नेगेटिव फॉस्फेट बैकबोन से बंधते हैं, जिससे एमबी और डीएनए के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन में बाधा आती है। उच्च डीएनए सांद्रता पर, रेडॉक्स-सक्रिय एमबी के स्टेरिक निषेध के परिणामस्वरूप निचले शिखर धाराएं होती हैं, इसलिए इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन सेंसर प्रतिक्रिया को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं करता है। मुख्य बिंदु यह है कि यह बायोसेंसर उच्च डीएनए सांद्रता (शायद ही कभी \ ({\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox {l}}}}) या उच्चतर) का पता लगाने के लिए बेहतर है। पूरी तरह से पर्यावरण के पानी के नमूनों की स्वचालित प्रसंस्करण के लिए, जहां पीसीआर उत्पादों का जेल शुद्धिकरण संभव नहीं हो सकता है।
डीएनए के विभिन्न सांद्रणों के लिए तरंग दैर्ध्य रेंज 600–700 \(\hbox {nm}\) के लिए अवशोषण वक्र के तहत क्षेत्र \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) नमक के साथ और बिना (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl} _2\)), (b) \( 117\, \ hbox {bp} \) नमक के साथ और बिना (\ (2 \, \ hbox {mM} \) \ (\ hbox {MgCl} _2 \))। \ ({0} \, {\ hbox {pg} / {\upmu \hbox {l}}}\) डीएनए सांद्रता \({50}\, {\upmu \hbox {M}}\) के अनुरूप एमबी नमूने कोई डीएनए नहीं।
उपरोक्त परिणामों को और सत्यापित करने के लिए, हमने एक यूवी / विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (थर्मो साइंटिफिक मल्टीस्कैन गो) का उपयोग करके ऑप्टिकल माप का प्रदर्शन किया, प्रत्येक के लिए नमूने \ ({50} \, {{upmu \ hbox {l}}}}) का उपयोग किया गया। माप। अवशोषण हस्ताक्षर बढ़ती डीएनए एकाग्रता के साथ घटता है, जैसा कि तरंग दैर्ध्य रेंज \ (600 \, \ hbox {nm} \) से \ (700 \, \ hbox {) के लिए अवशोषण वक्र के तहत क्षेत्र की प्रवृत्ति से देखा जा सकता है। nm}\), जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है (अवशोषण स्पेक्ट्रम चित्र में दिखाया गया है। पूरक सूचना में S3)। \ ({1} \, {\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox से कम डीएनए सांद्रता वाले नमूनों के लिए। {l}}}}, डीएनए युक्त और एमबी-ओनली सैंपल (\ (503 \, \ hbox {bp} \) और \ (117 \, \ hbox {bp} \) के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। ) लंबाई के टुकड़े), रेडॉक्स-सक्रिय एमबी के स्टेरिक निषेध की अनुपस्थिति का संकेत देते हैं। उच्च डीएनए सांद्रता में, हमने अवशोषण संकेत में धीरे-धीरे कमी देखी और नमक की उपस्थिति में अवशोषण में कम कमी देखी। इन परिणामों को आणविक के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था। डीएनए हाइब्रिड में बेस स्टैकिंग के साथ बातचीत और स्टेरिक अवरोध। हमारे परिणाम एमबी-डीएनए इंटरकलेशन के स्पेक्ट्रोस्कोपिक अध्ययन पर साहित्य में रिपोर्ट के अनुरूप हैं जो हाइपोक्रोमैटिकिटी को कम ऊर्जा स्तरों के साथ \ (\ pi \) - \ (\ pi ^ * \) में जोड़ते हैं। ) इंटरकलेशन लेयर्स 36, 37, 38 के कारण इलेक्ट्रॉनिक ट्रांजिशन।
फेज Phi6 के एग्रोस जेल वैद्युतकणसंचलन: झील के पानी के नमूनों से लंबाई \ (117 \, \ hbox {bp} \) और \ (503 \, \ hbox {bp} \) के पीसीआर उत्पाद। एम-डीएनए मार्कर;एनटीसी-नो-टेम्प्लेट नियंत्रण, संबंधित एम्पलीकॉन युक्त प्राइमर;पीसी सकारात्मक नियंत्रण;1, 2, 3-अनडाइल्यूटेड (1: 1) तीन प्रतियों में नुकीला झील के पानी के नमूने। एक बैंड \ (\ लगभग 50 \, \ hbox {bp} \) में अप्रयुक्त ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के कारण \ (503 \, \) में दिखाई देता है। hbox {bp}\) लेन।
हमने Phi6 फेज के साथ नुकीले पवई झील के पानी के नमूनों का उपयोग करके सेंसर की उपयोगिता का मूल्यांकन किया। फेज-नुकीले पानी के नमूनों से पृथक आरएनए सांद्रता 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { एमएल}}}), जबकि शुद्ध फेज निलंबन से अलग किए गए आरएनए का अनुमान लगाया गया था ({1945} \, {\ upmu \ hbox {g} / \ hbox {ml}} \) लगभग 1 की रिकवरी दक्षता के साथ %.RNA को cDNA में रिवर्स ट्रांसक्राइब किया गया था और PCR और qPCR के लिए टेम्प्लेट के रूप में उपयोग किया गया था। सेंसर के साथ परीक्षण करने से पहले agarose जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्र 5) द्वारा उत्पाद के आकार की पुष्टि की गई थी। ये नमूने जेल शुद्ध नहीं होते हैं और इसलिए इसमें PCR के सभी घटक होते हैं। साथ ही ब्याज के एम्पलीकॉन्स। क्यूपीसीआर (तालिका 1) के दौरान दर्ज किए गए सीटी मूल्यों को संबंधित नुकीले पानी के नमूनों से पृथक आरएनए की एकाग्रता के साथ सहसंबंधित दिखाया गया था। सीटी मूल्य से फ्लोरोसेंट सिग्नल के लिए आवश्यक चक्रों की संख्या का पता चलता है दहलीज या पृष्ठभूमि संकेत से अधिक। उच्च सीटी मान कम टेम्पलेट सांद्रता और इसके विपरीत इंगित करते हैं। एनटीसी नमूने के सीटी मान अपेक्षा के अनुरूप उच्च थे। \ (\ लगभग 3 \) सीटी मूल्यों के बीच अंतर सकारात्मक नियंत्रण और परीक्षण नमूना आगे इंगित करता है कि प्रत्येक परीक्षण नमूने में सकारात्मक नियंत्रण की तुलना में लगभग 1% टेम्पलेट है। हमने पहले चर्चा की है कि लंबे एम्पलीकॉन्स बेहतर संवेदनशीलता की ओर ले जाते हैं। विषम पर्यावरणीय नमूनों से अलग किए गए लंबे टुकड़ों का प्रवर्धन चुनौतीपूर्ण है। कम वायरल एकाग्रता और आरएनए गिरावट। हालांकि, हमारे वायरस संवर्धन और पीसीआर प्रवर्धन प्रोटोकॉल के साथ, हम इलेक्ट्रोकेमिकल सेंसिंग के लिए \ (503 \, \ hbox {bp} \) टुकड़े को सफलतापूर्वक बढ़ाने में सक्षम थे।
चित्र 6 \(503\,\hbox {bp}\) फ्रैगमेंट एम्प्लिकॉन के इलेक्ट्रोकेमिकल सेंसर परिणामों को दिखाता है, दोनों में टेम्‍पलेट (1:1) के रूप में undiluted cDNA का उपयोग किया जाता है और टेम्‍पलेट (1:100 ) के रूप में 100-गुना पतला सीडीएनए का उपयोग पीसीआर द्वारा किया जाता है। , एनटीसी और पीसी की तुलना में (प्रतिनिधि वोल्टमोग्राम के लिए पूरक सूचना में चित्रा एस 4 देखें)। चित्रा 6 में बॉक्सप्लॉट में प्रत्येक बॉक्स में 5 इलेक्ट्रोड पर तीन नमूनों से माप शामिल हैं। इलेक्ट्रोड के कारण त्रुटियों से बचने के लिए सभी नमूनों को मापने के लिए एक ही इलेक्ट्रोड का उपयोग किया गया था। -से-इलेक्ट्रोड भिन्नता। सीवी माप की तुलना में, डीपीवी माप एनटीसी से परीक्षण और पीसी नमूनों को अलग करने के लिए बेहतर रिज़ॉल्यूशन दिखाते हैं, क्योंकि जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, बाद में पृष्ठभूमि कैपेसिटिव धाराओं के कारण फैराडिक धाराएं छिपी हुई हैं। लंबे एम्पलीकॉन्स के लिए, हमने देखा कि नकारात्मक नियंत्रण (NTC) के परिणामस्वरूप उच्च CV और DPV शिखर धाराएँ सकारात्मक नियंत्रण के सापेक्ष होती हैं, जबकि सकारात्मक और undiluted परीक्षण के नमूनों में DPV शिखर धाराओं की समान चरम ऊँचाई दिखाई देती है। प्रत्येक undiluted (1: 1) के लिए मापा माध्य और माध्य मान ) परीक्षण नमूना और पीसी को एनटीसी नमूने के लिए सेंसर आउटपुट से स्पष्ट रूप से हल किया जा सकता है, जबकि 1:100 पतला नमूना के लिए संकल्प कम स्पष्ट है। सीडीएनए के 100 गुना कमजोर पड़ने के लिए, हमने जेल वैद्युतकणसंचलन के दौरान कोई बैंड नहीं देखा (चित्र 5 में गलियाँ नहीं दिखाई गई हैं), और संबंधित DPV और CV शिखर धाराएँ NTC के लिए अपेक्षित थीं। पूरक सूचना में \ (117 \, \ hbox {bp} \) के परिणाम दिखाए गए हैं। नकारात्मक नियंत्रण ने इलेक्ट्रोड पर मुक्त एमबी के सोखने और एकल-फंसे हुए प्राइमर ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के साथ एमबी की बातचीत के कारण पीसीबी सेंसर से एक विद्युत रासायनिक प्रतिक्रिया को प्रेरित किया। इसलिए, हर बार एक नमूने का परीक्षण किया जाता है, एक नकारात्मक नियंत्रण चलाया जाना चाहिए और सकारात्मक या नकारात्मक के रूप में परीक्षण नमूने को वर्गीकृत करने के लिए एक अंतर (सापेक्ष) माप39,40 प्राप्त करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण द्वारा प्राप्त शिखर वर्तमान की तुलना में परीक्षण नमूने का शिखर वर्तमान।
(ए) डीपीवी, और (बी) झील के पानी के नमूनों में \ (503 \, \ एचबॉक्स {बीपी} \) के विद्युत रासायनिक पता लगाने के लिए सीवी पीक करंट। टेस्ट के नमूनों को तीन प्रतियों में मापा गया और बिना किसी टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) की तुलना में। सकारात्मक नियंत्रण (पीसी)।
हमारे निष्कर्ष अलग-अलग डीएनए के लिए अलग-अलग लंबाई के एम्पलीकॉन्स के लिए इलेक्ट्रोकेमिकल सेंसर के प्रदर्शन को प्रभावित करने वाले विभिन्न तंत्रों का वर्णन करते हैं, एक यूवी / विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके ऑप्टिकल माप द्वारा सत्यापित सांद्रता के साथ। हमारे अवलोकन इस अंतर्दृष्टि को रेखांकित करते हैं कि लंबे समय तक डीएनए के टुकड़े \ (\ लगभग \) तक होते हैं। \ (500 \, \ hbox {bp} \) उच्च संवेदनशीलता के साथ पता लगाया जा सकता है और नमूने में नमक की उपस्थिति संवेदनशीलता डीएनए एकाग्रता को प्रभावित नहीं करती है जो उच्च संवेदनशीलता को प्रभावित करती है (शायद ही कभी \ ({\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox {l}}} \) और ऊपर)। इसके अलावा, हमने विभिन्न प्रकार के नमूनों के प्रभाव की जांच की, जिसमें जेल-शुद्ध एम्पलीकॉन्स के साथ और बिना नमक मिलाए, और DPV और CV मापों में झील के पानी के नमूनों को शामिल किया गया।हमने देखा कि DPV ने बेहतर रिज़ॉल्यूशन प्रदान किया, क्योंकि बैकग्राउंड कैपेसिटिव करंट भी CV माप को प्रभावित करता है, जिससे यह कम संवेदनशील हो जाता है।
लंबे टुकड़ों का प्रवर्धन वायरल जीनोमिक आरएनए की अखंडता पर निर्भर करता है। कई अध्ययनों से पता चला है कि पर्यावरण में आरएनए के क्षरण और अलगाव के दौरान विभाजन की संभावना के कारण लंबे टुकड़ों का प्रवर्धन हमेशा कुशल नहीं होता है।11,41,42,43,44 हमने देखा कि एल्युमीनियम हाइड्रॉक्साइड-आधारित वायरस सांद्रण विधि की तुलना में झील के पानी के नमूनों में नुकीले फेज फी-6 को केंद्रित करने में पीईजी-आधारित वायरस एकाग्रता विधि अधिक प्रभावी थी। लंबे डीएनए अंशों का पता लगाने की क्षमता मल्टीप्लेक्स पीसीआर की आवश्यकता को दूर करने में सिद्ध हुई। कई छोटे लंबाई के टेम्प्लेट को बढ़ाना और क्रॉस-स्पेसिफिकिटी की संभावना को कम करना।
जैविक नमूने दुर्लभ हैं, इसलिए एक बायोसेंसर डिजाइन करने की आवश्यकता है जिसके लिए परीक्षण के लिए न्यूनतम नमूनों की आवश्यकता होती है। इस अध्ययन में उपयोग किए गए ENIG PCB इलेक्ट्रोड के लिए केवल \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}} की आवश्यकता होती है। ) इलेक्ट्रोड के प्रभावी क्षेत्र को कवर करने के लिए परीक्षण के लिए नमूने। इसके अतिरिक्त, अगले नमूने के वितरण से पहले सफाई के बाद उसी इलेक्ट्रोड का पुन: उपयोग किया जा सकता है। प्रवर्धित नमूनों में मिथाइलीन ब्लू के अलावा किसी भी रसायन को जोड़ने की आवश्यकता नहीं होती है, जो एक सस्ती है और आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले रसायन। चूंकि प्रत्येक इलेक्ट्रोड के निर्माण में लगभग $0.55 (या INR 40) की लागत आती है, इसलिए यह बायोसेंसर मौजूदा पता लगाने वाली तकनीकों का एक लागत प्रभावी विकल्प हो सकता है। तालिका 2 इस काम की तुलना लंबे समय तक साहित्य में रिपोर्ट किए गए अन्य सेंसर के साथ करती है। विषम नमूनों में डीएनए के टुकड़े।
यह देखते हुए कि एमबी-आधारित इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्शन प्रोटोकॉल पीसीआर की विशिष्टता पर भरोसा करते हैं, इस पद्धति की एक प्रमुख सीमा विषम नमूनों जैसे कि अपशिष्ट जल और झील के पानी या कम शुद्धता वाले प्राइमरों का उपयोग करने में गैर-विशिष्ट प्रवर्धन की क्षमता है। की संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए असंशोधित एनआईजी पीसीबी इलेक्ट्रोड का उपयोग करके अशुद्ध पीसीआर उत्पादों के डीएनए का पता लगाने के लिए विद्युत रासायनिक पहचान विधियां, अप्रयुक्त डीएनटीपी और प्राइमरों द्वारा शुरू की गई त्रुटियों को बेहतर ढंग से समझना और प्रतिक्रिया की स्थिति और परख प्रोटोकॉल का अनुकूलन करना आवश्यक है। अतिरिक्त भौतिक रासायनिक पैरामीटर जैसे पीएच, तापमान और जैविक माप की सटीकता में सुधार के लिए पानी के नमूने की ऑक्सीजन की मांग (बीओडी) को भी मापने की आवश्यकता हो सकती है।
अंत में, हम पर्यावरण (झील के पानी) के नमूनों में वायरस का पता लगाने के लिए एक कम लागत वाले इलेक्ट्रोकेमिकल ईएनआईजी पीसीबी सेंसर का प्रस्ताव करते हैं। डीएनए सेंसिंग के लिए इमोबिलाइज्ड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड इलेक्ट्रोड या कस्टम सबस्ट्रेट्स के विपरीत, जिसे संवेदनशीलता बनाए रखने के लिए क्रायोजेनिक स्टोरेज की आवश्यकता होती है, 53,54 हमारी तकनीक अनमॉडिफाइड पीसीबी का उपयोग करती है। लंबी शैल्फ लाइफ और कोई विशिष्ट भंडारण आवश्यकताओं के साथ इलेक्ट्रोड और इसलिए LMIC में तैनात स्वचालित नमूना प्रसंस्करण के साथ माप समाधान के विकास के लिए उपयुक्त है। बायोसेंसर लक्ष्य एम्पलीकॉन्स का तेजी से पता लगाने के लिए सस्ती डीएनए-इंटरकेलेटिंग रेडॉक्स डाई (एमबी) का उपयोग करता है। गैर-विशिष्ट प्रवर्धन पर्यावरणीय नमूनों में सामान्य इस संवेदन विधि की विशिष्टता को एमबी के एकल और दोहरे फंसे हुए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के गैर-बाध्यकारी के कारण कम कर देता है। इसलिए, इस परीक्षण की विशिष्टता प्राइमरों और पीसीआर प्रतिक्रिया स्थितियों के अनुकूलन पर निर्भर करती है। इसके अलावा, सीवी और परीक्षण किए गए नमूनों से प्राप्त डीपीवी शिखर धाराओं को प्रत्येक परीक्षण के लिए नकारात्मक नियंत्रण (एनटीसी) से प्राप्त प्रतिक्रियाओं के सापेक्ष व्याख्या की जानी चाहिए। इस काम में प्रस्तुत इलेक्ट्रोकेमिकल सेंसर डिजाइन और विधियों को पूरी तरह से स्वचालित और कम विकसित करने के लिए ऑटोसैंपलर के साथ एकीकृत किया जा सकता है। लागत समाधान जो नमूनों को एकत्र और विश्लेषण कर सकता है और वायरलेस रूप से परिणामों को प्रयोगशाला में वापस भेज सकता है।
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