Tankewol foar it besykjen fan Nature.com.De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde stipe foar CSS. Foar de bêste ûnderfining riede wy oan dat jo in bywurke blêder brûke (of kompatibiliteitsmodus yn Internet Explorer útsette). Yn 'e tuskentiid, om te garandearjen trochgeande stipe, wy sille werjaan de side sûnder stilen en JavaScript.
It belang fan tafersjoch op miljeumonsters is tige wurdearre sûnt it begjin fan 'e COVID-19-pandemy, en guon monitoaring-ynspanningen wurde útfierd mei de gouden standert, hoewol qPCR-basearre techniken djoer binne. Yn dit wurk demonstrearje wy de elektrogemyske deteksje fan amplicons krigen fan Phi6-faag isolearre út spiked mar wettermonsters (in populêr surrogaat foar SARS-CoV-2), mei ENIG om PCB-elektroden te foltôgjen sûnder oerflakmodifikaasje.seks.De elektrogemyske sensorreaksje waard yngeand karakterisearre foar twa DNA-fragminten fan ferskillende lingten (\({117}\,\hbox {bp}\) en \({503}\,\hbox {bp}\)), en de effekt fan sâlten yn PCR-mastermixen op methyleenblau (MB)-DNA-ynteraksjes. Us resultaten litte sjen dat de lingte fan DNA-fragminten de elektrogemyske gefoelichheid signifikant bepaalt en demonstrearje yn dit wurk dat de mooglikheid om lange amplicons te ûntdekken sûnder gelreiniging fan PCR-produkten is wichtich foar in situ mjitting fan wettermonsters.In folslein automatisearre oplossing foar virale lading boet goed.
Oerdracht fan firus troch wetter is bekend as in gefaar foar folkssûnens sûnt de jierren 1940, mei it earste bewiis fan oerdracht fan polio en hepatitis E1 troch wetter. Deteksjemetoaden fertrouwe op gouden standert qPCR-basearre techniken, dy't heul gefoelich en spesifyk binne, mar bekwame personiel nedich binne om te testen yn it laboratoarium mei djoere ynstruminten. Sample testen sil nei alle gedachten foarrang krije boppe miljeu wetter sample monitoring.Dêrom binne alternative lege kosten metoaden nedich foar duorsume, real-time monitoring fan wetter en ôffalwetter monsters yn leech- en midden-ynkommen lannen as iere warskôgings fan opkommende sykte útbrekken, dêrmei beskermje se tsjin 'e swiere sosjaal-ekonomyske gefolgen fan' e firus pandemy.Lege-kosten elektrogemyske biosensors foar nucleic soeren koenen biede in kânsrike potinsjele oplossing foar dit net foldien need.In protte fan dizze DNA biosensors wurkje troch it feit dat komplementêre DNA stringen wurde ymmobilisearre op 'e elektrodes oerflak en hybridisearje as in oerienkommende folchoarder is oanwêzich yn de stekproef. Dit kin dan wurde omset yn in sinjaal troch ferskate elektrogemyske techniken mei help fan redox mediators lykas kalium izer / ferrocyanide. Methylene blau (MB) is ien sa'n redox-aktive molecule, dat hat is rapportearre om te ynterkalearjen yn dûbelstrengige DNA (dsDNA) neist syn mear net-spesifike bining oan ienstrengige DNA5,6.De ynterkalearjende aard fan MB's om MB-DNA-kompleksen te foarmjen makket har in populêre kar as redoxbemiddelers yn ferskate elektrogemyske DNA sensor konfiguraasjes5,6,7,8,9.Hoewol de ynterkalaasje fan MB nei DNA net-spesifyk is, en de spesifisiteit fan dizze elektrogemyske sensor foar in grut part hinget ôf fan 'e suverens fan' e primers dy't brûkt wurde foar PCR of isothermyske amplifikaasje, is it goed geskikt foar it útfieren fan echte -time electrochemical-basearre qPCR of fluorescence isothermyske amplification as alternatyf foar DNA konsintraasje mjitting 9. Yn ien sa'n útfiering, Won et al.It oerflak fan gouden elektroden waard feroare mei 6-mercapto-1-hexanol (MCH) foar real-time mjitting fan PCR amplicons mei MB mei help fan differinsjaal puls voltammetry (DPV) 9. Yn oare gefallen, Ramirez et al. Detection fan SARS-CoV-2 yn ôffalwetter troch RT-LAMP reaksje brûkend MB mei skerm-printe elektroden. Platina elektroden hawwe ek west brûkt as in situ elektroden yn in microfluidic PCR platfoarm ûntwurpen om electrochemically detect amplicons tidens reaksjes 8. Al dizze stúdzjes fereaskje oerflak modifikaasje fan de elektroden, wat betsjut ferhege produksje en eksploitaasjekosten fanwege spesjale opslach easken foar de stabiliteit fan dizze functionalized elektroden.
Skematysk fan 'e workflow foar elektrogemyske deteksje fan amplicons krigen fan konsintrearre virale dieltsjes yn marwettermonsters.
Wy hawwe koartlyn elektrogemyske sensing oantoand fan SARS-CoV-2 amplicons mei lege kosten printe circuit board (PCB) elektroden basearre op DPV en cyclic voltammetry (CV) feroarsake troch adsorpsje fan MB-DNA kompleksen op it oerflak fan net wizige elektroden) feroarings yn pyk hjoeddeiske11.Wy rapportearje dat langere DNA-fragminten (N1-N2, \({943}\, \hbox) foarme mei de CDC-oanbefelle N1-foar- en N2-reverse-primers yn fergeliking mei koartere fragminten {bp}\)) bettere lineariteit sjen litte yn 'e sensorantwurd (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) foarme mei N1 foarút en N1 reverse primer sets. Dizze stúdzjes wurde rapportearre mei DNA-dilutions taret yn nukleasefrij wetter. -2 amplicons yn simulearre ôffalwettermonsters (ferkrigen troch spiking fan totale RNA-monsters mei SARS-CoV-2 RNA). Om't RNA gefoelich is foar skjirre tidens isolaasje en streamôfwerts ferwurking,12,13 is it lestich om langere fragminten te fersterkjen mei dit heterogene monster. Dêrom is de demonstraasje fan elektrogemyske sensing fan SARS-CoV-2 amplicon yn ôffalwetter beheind ta it koartere \(72\,\hbox {bp}\) N1-fragmint.
Yn dit wurk ûndersochten wy de helberens fan ENIG PCB-basearre elektrogemyske sensing fan faag Phi6 konsintrearre en isolearre út marwettermonsters (fig. 1). Phi6-fagen binne fergelykber yn grutte (80-100 nm) mei SARS-CoV-2 en hawwe ek in lipidemembraan en in spikeprotein.Om dizze redenen is bakteriofaag Phi6 in populêr surrogaat foar SARS-CoV-2 en oare omhulde patogene RNA-firussen14,15.RNA isolearre út faagdieltsjes waard brûkt as sjabloan foar cDNA-synteze folge troch PCR om twa DNA-fragminten fan 117 en 503 basispearen yn 'e lingte te krijen. Sjoen de útdaging om \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2-fragminten yn ús foarige wurk te fersterkjen, rjochtsje wy fragminten fan tuskenlizzende lingte (\(117) \,\hbox {bp}\) en \(503 \,\hbox {bp}\)), basearre op beskikbere primers. \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) nei \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Foar beide fragminten yn de oanwêzigens fan MB, it effekt fan sâlt op 'e sensor antwurd is karakterisearre en cross-validearre troch spektrofotometryske mjittingen. De wichtichste bydragen fan dit wurk binne as folget:
DNA-fragmint lingte en de oanwêzigens fan sâlt yn 'e stekproef sterk beynfloedzje gefoelichheid.Us resultaten litte sjen dat elektrogemyske aktiviteit hinget ôf fan ferskate meganismen fan 'e ynteraksje fan MB, DNA, en de sensor yn' e voltammetryske reaksje, ôfhinklik fan DNA-konsintraasje en lingte, mei langere Fragminten litte hegere gefoelichheid sjen, hoewol sâlt in negatyf effekt hat op elektrostatyske ynteraksjes tusken MB en DNA.
DNA-konsintraasje bepaalt it meganisme fan MB-DNA-ynteraksje yn net wizige elektroden Wy litte sjen dat ferskate meganismen fan MB-DNA-ynteraksje ôfhinklik binne fan DNA-konsintraasje. {l}}}\), hawwe wy observearre dat de elektrogemyske aktuele reaksje benammen bepaald waard troch de adsorpsje fan MB-DNA op 'e elektrode, wylst by legere konsintraasjes By hege DNA-konsintraasjes de elektrogemyske stromreaksje bepaald waard troch de steryske remming fan redox aktiviteit troch MB-ynfoegje tusken DNA-basepearen.
ENIG PCB-basearre elektrogemyske sensing fan virale nukleïnesoeren yn wettermonsters fan mar. Resultaat fage.
Lege kosten fan ymplemintaasje en potinsjeel foar yntegraasje yn folslein automatisearre tafersjochsystemen, oligonukleotiden of aptamers op elektroden mei langere houdbaarheid.
Phage Phi6 is in omhulde dsRNA-firus fan 'e Cytoviridae-famylje dat Pseudomonas syringae ynfektearret. \,\hbox {Kb}\)) en L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Om't de Phi6-faag in net-pathogene BSL-1 Pseudomonas-stam ynfektearret, is it feilich te brûken Phage Phi6 en har gasthear Pseudomonas syringae waarden kocht fan it Felix d'Herelle Reference Centre for Bacterial Viruses, Laval University, Kanada (referinsjesintrum katalogus nûmers binne respektivelik HER-102 en HER-1102) .Phi6-faag en har gasthear waarden wer oplibbe lykas oanjûn troch it referinsjesintrum. Phage Phi6 waard suvere troch plaatlysis en eluaasje om definitive titers te krijen mei \(\oer 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (plaquefoarmjende ienheden/ milliliters).RNA waard isolearre út suvere faagdieltsjes mei de GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) neffens de ynstruksjes fan de fabrikant. Koartsein, in suvere faag Phi6-suspensie\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) waard lysed en it lysaat waard laden op in spinkolom om RNA te binen oan de harskolom. 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) levere troch de kit. Skatte de konsintraasje fan RNA troch absorption op \(260\,\hbox {nm}\).RNA waard opslein yn aliquots yn \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) oant fierder gebrûk.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) De iScript cDNA Synthesis Kit (Bio -Rad Laboratories) waard brûkt as sjabloan foar cDNA-synteze neffens de ynstruksjes fan de fabrikant. Koartsein, in cDNA-synteze-reaksje bestiet út 3 stappen: priming by \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min}}\) , omkearde transkripsje fan \({20}\,{\hbox {min}}\) by \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), en omkearde De recorder is yn \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) foar \({1}\,{\hbox {min. }}\). Wannear't útfierd op in 1% agarose gel, de cDNA toande trije bands oerienkommende mei de ferwachte trije RNA fragminten (gegevens net werjûn). cDNA brûke as sjabloan foar PCR yn in miniPCR® mini8 termyske fytser:
De primers foar \(117\,\hbox {bp}\) en \(503\,\hbox {bp}\) komme oerien mei respektivelik 1476-1575 nukleotiden fan it M-segment en 458-943 nukleotiden fan it L-segmint, resp. .Alle fersterke PCR-produkten waarden electrophoresed op 1% agarose gels, en amplified target DNA waard suvere mei help fan de GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
In mar by de IIT Mumbai kampus (Powai Lake, Powai, Mumbai) waard brûkt om faagdieltsjes ta te foegjen. suspended dieltsjes, en dan Phi6 faag waard tafoege. Add \({1}\,{\hbox {ml}}\) fan \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) nei \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) filtrearre marwetter, yn \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\).In lytse aliquot wie reservearre foar mjitting fan virale lading troch plaque-assay. Wy testen twa ferskillende metoaden om spiked Phi6-firusdieltsjes te konsintrearjen: (1) de aluminiumhydroxide-adsorpsje-neerslagmetoade,19 dy't falidearre is foar de konsintraasje fan ferskate omhulde RNA-firussen út miljeumonsters, en (2) ) De polyethylene glycol (PEG)-basearre firus konsintraasje metoade waard oanpast út Flood et al.20 .Sûnt de werhellingseffisjinsje fan 'e PEG-basearre metoade waard fûn om better te wêzen as dy fan' e aluminiumhydroxide-metoade, waard de PEG-basearre metoade brûkt om Phi6-dieltsjes te konsintrearjen fan mar wetterproblemen.
De brûkte PEG-metoade wie as folget: PEG 8000 en \(\hbox {NaCl}\) waarden tafoege oan Phi6-spiked mar wettermonsters om 8% PEG 8000 te krijen en \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\). Samples waarden ynkubeare op in shaker\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), dan sintrifuge op \(4700 \,\hbox {g}\) is \({45}\,{\hbox {min}}\). De supernatant fuortsmite en de pellet opnij yn \({1}\, {\hbox {ml}}\) yn deselde supernatant.Alle eksperiminten mei spiking en firuskonsintraasje waarden yn trijevoud útfierd. Nei konsintraasje waard in lyts aliquot reservearre foar mjitting fan wersteleffisjinsje troch plaque-assay.RNA waard isolearre lykas earder beskreaun en elutearre yn kit-levere elueringsbuffer\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\).Om't de RNA-konsintraasje sil fariearje fan stekproef ta stekproef yn trijefâld, de \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) fan RNA wurdt brûkt foar alle trije nettsjinsteande syn konsintraasje cDNA-synteze fan samples.cDNA-synteze waard útfierd lykas earder beskreaun.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA waard brûkt as sjabloan foar \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR foar 35 syklusen om \ (117\,\hbox {bp}\) en \(503\,\hbox { te fersterkjen) bp}\) fragminten. as sjabloan foar in positive kontrôle (PC) .Kwantitative PCR (qPCR) waard útfierd yn in Stratagene Mx3000P RT-PCR ynstrumint mei help fan Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Reaksjes waarden ynsteld yn triplicate lykas earder beskreaun.De syklusdrompel (Ct) waard opnommen foar alle samples.Dêrneist wiene de verdunde samples \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) mei cDNA verdund 1:100 yn filtrearre marwetter as \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR foar 35 syklusen. Dizze foarbylden wurde fertsjintwurdige as "1:100″.
De PCB-elektroden wurde makke mei in kommersjeel beskikber goedkeap Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) proses sûnder de needsaak foar ekstra gouden plating. piranha oplossing of sulfuric acid cyclic voltammetry wurde net oan te rieden as se kinne feroarsaakje peeling fan de tinne gouden laach (dikte \(\approx\) \(100\,\hbox {nm }\)) en bleatstelle de ûnderlizzende koperen lagen dy't gevoelig binne to corrosion 21, 22, 23, 24, 25. Reinigje de elektroden dêrom mei in pluisfrije doek befochtige mei IPA. }\) MB yn \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({1}\,{\hbox {h}}\) foar maklike ynfoegje. Yn ús foarige wurk , wy observearre dat de gefoelichheid en lineariteit fan de sensor waarden ferbettere troch it fergrutsjen fan de MB konsintraasje 11 .Based op optimizations rapportearre yn ús earder wurk, wy brûkten \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB konsintraasjes om DNA yn dizze stúdzje yn te lizzen. Elektrogemyske deteksje fan dûbelstrengs DNA (ds-DNA) kin berikt wurde mei anionyske of kationyske intercalators.Hoewol anionyske intercalators DNA mei bettere selektiviteit detectearje, fereaskje se inkubaasje fan 'e nacht, wat resulteart yn langere deteksjetiden.On de oare kant, kationyske intercalators lykas MB fereaskje koartere ynkubaasjetiden, likernôch \({1}\,{\hbox {h}}\) foar elektrogemyske deteksje fan ds-DNA6. elektrode\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), dan skjinmeitsje mei in IPA-fochtige doek, foardat jo trochgean mei in oare sample.ien mjitting.Elke stekproef waard hifke op 5 ferskillende elektroden, útsein as oars oanjûn. DPV- en CV-mjittingen waarden útfierd mei in PalmSens Sensit Smart potentiostat, en PSTrace-software waard brûkt foar potentiostatkonfiguraasje en gegevenswinning, ynklusyf pykstromberekkeningen. De folgjende ynstellings wurde brûkt. foar DPV- en CV-mjittingen:
DPV: lykwichtstiid = \(8\,\hbox {s}\), Spanningsstap = \(3\,\hbox {mV}\), Pulse Voltage = \(25\,\hbox {mV}\) , pulsduur = \(50\,\hbox {ms}\), scanrate = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Equilibrium Tiid = \(8\,\hbox {s}\), Spanningsstap = \(3\,\hbox {mV}\), Sweep Rate = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Pykstromen krigen fan voltammogrammen fan DNA kompleks mei \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV- en CV-voltammograms waarden krigen op ENIG PCB-elektroden \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB kompleks mei DNA (by konsintraasjes fan 10–\({20}\,{\ hbox {ng) }/{\upmu \hbox {l}}}\) ie 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) foar \(117\,\hbox {bp}\) en 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) foar \(503\,\hbox {bp}\)).Representative voltammograms wurde werjûn yn figuer S1 yn Supplementary Information.Figure 2 lit de resultaten sjen fan DPV- en CV-mjittingen (peakstream) mei help fan gel-suvere PCR-produkten. Yn ferliking mei CV-mjittingen litte DPV-mjittingen hegere gefoelichheid sjen (aktueel as funksje fan DNA-konsintraasje) om't de eftergrûnkapasityve streamingen yn CV-mjittingen Faradayske streamingen ferbergje 26 .De gegevens foar elke doaze yn 'e boxplot befettet mjittingen fan 5 elektroden. Alle mjittingen brûke deselde set elektroden om mjitflaters te foarkommen troch elektrode-nei-elektrode fariaasje. , langer (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ yn ferliking mei \(117) ) fragmint. adsorpsje fan it MB-DNA kompleks fasilitearret de lading oerdracht op 'e elektrodes, dy't bydraacht oan de ferheging fan' e peak current.Oare stúdzjes hawwe sjen litten it effekt fan oligonucleotide grutte en folchoarder op MB-DNA intercalation27,28,29,30.The guanine -cytosine (GC) ynhâld fan de twa amplicons (\(117\,\hbox {bp}\) en \(503\,\hbox {bp}\)) wie likernôch 50%, wat oanjout dat de observaasje It ferskil is te wijten foar hegere DNA-konsintraasjes (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), foar \(503\,\hbox {bp}) \) en \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) foar \(117\,\hbox {bp}\)), observearje wy twa amplifikaasjes. peakstreamen fan 'e subs wurde fermindere yn sawol DPV- as CV-mjittingen. Dit is om't MB saturearret en ynterkalearret tusken basispearen fan DNA, wat resulteart yn steryske ynhibysje fan' e redoxaktiviteit fan 'e ferminderbere groep yn MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Sâlten oanwêzich yn PCR-mastermixen interferearje mei elektrostatyske ynteraksjes tusken MB en DNA, dus troch \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) ta te foegjen mei \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB gel-suvere produkt om it effekt fan sâlt op MB-DNA-ynteraksje te studearjen. Lykas werjûn yn figuer 3, hawwe wy observearre dat foar hegere DNA-konsintraasjes (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp}\) en \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) foar \(117\,\hbox {bp} \)), yn DPV en CV. legere DNA konsintraasjes, de tafoeging fan sâlt sterk ferminderet gefoelichheid, resultearret yn gjin signifikante feroaring yn stroom mei DNA konsintraasje. Similar negative effekten fan sâlt op MB-DNA ynteraksjes en ynterkalaasje binne earder rapportearre troch oare ûndersikers33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) kationen bine oan de negative fosfaatrêchbonke fan DNA, dêrmei hinderjen fan de elektrostatyske ynteraksje tusken MB en DNA. It wichtichste punt is dat dizze biosensor better geskikt is om hegere DNA-konsintraasjes te detektearjen (selden \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) of heger), foar folslein Automatisearre ferwurking fan monsters foar miljeuwetter, wêr't gelreiniging fan PCR-produkten miskien net mooglik is.
Gebiet ûnder de absorptionskurve foar it golflingteberik 600–700 \(\hbox {nm}\) foar ferskate konsintraasjes fan DNA kompleks mei \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a ) \(503\,\hbox {bp}\) mei en sûnder sâlt (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) mei en sûnder sâlt (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) DNA-konsintraasjes dy't oerienkomme mei \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB-monsters Gjin DNA.
Om de boppesteande resultaten fierder te ferifiearjen, hawwe wy optyske mjittingen útfierd mei in UV/Vis spektrofotometer (Thermo Scientific Multiskan GO), de samples \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) waarden brûkt foar elk Meting.De absorpsjonssignatuer nimt ôf mei tanimmende DNA-konsintraasje, sa't te sjen is út de trend fan it gebiet ûnder de absorptionskurve foar it golflingteberik \(600\,\hbox {nm}\) oant \(700\,\hbox { nm}\), lykas werjûn yn Fig. 4 (absorptionspektrum werjûn yn Fig. S3 yn Oanfoljende ynformaasje). Foar samples mei DNA-konsintraasjes minder as \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), wie der gjin signifikant ferskil yn opname tusken DNA-befette en MB-allinich samples (foar \(503\,\hbox {bp}\) en \(117\,\hbox {bp}\ ) lingtefragminten), wat oanjout dat it ûntbrekken fan steryske ynhibysje fan redox-aktive MB is. By hegere DNA-konsintraasjes hawwe wy in stadichoan fermindere fan it absorbearjende sinjaal waarnommen en in mindere fermindering fan absorbinsje yn 'e oanwêzigens fan sâlt opmurken. Dizze resultaten waarden taskreaun oan molekulêre ynteraksjes en steryske ynhibysje mei basisstapeling yn DNA-hybriden. Us resultaten binne oerienstimming mei rapporten yn 'e literatuer oer spektroskopyske stúdzjes fan MB-DNA-ynterkalaasje dy't hypochromaticiteit assosjearje mei fermindere enerzjynivo's yn \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) elektroanyske oergongen troch ynterkalaasje lagen 36, 37, 38.
Agarosegelelektroforese fan faag Phi6: PCR-produkten fan lingte \(117\,\hbox {bp}\) en \(503\,\hbox {bp}\) út marwettermonsters.M-DNA-marker;NTC-no-sjabloankontrôle, primers dy't oerienkommende amplicons befetsje;PC positive kontrôle;1, 2, 3-ûnferdunde (1:1) spiked mar wettermonsters yn triplikaat. In band is sichtber by \(\oer 50\,\hbox {bp}\) fanwegen net brûkte oligonucleotides yn \(503\,\ hbox {bp}\) baan.
Wy evaluearren it nut fan 'e sensor mei help fan wettermonsters fan Powai Lake spiked mei Phi6-faag. ml}}\), wylst dy isolearre út suvere faag-suspensies. %.RNA waard omkearde transkribearre yn cDNA en brûkt as sjabloan foar PCR en qPCR. Product grutte waard befêstige troch agarose gel electrophoresis (figuer 5) foarôfgeand oan testen mei de sensor. Dizze samples binne net gel suvere en dêrom befetsje alle komponinten fan PCR as De Ct-wearden opnommen tidens qPCR (tabel 1) waarden sjen litten te korrelearjen mei de konsintraasje fan RNA isolearre fan 'e korrespondearjende spiked wettermonsters. hegere Ct-wearden jouwe legere sjabloankonsintraasjes oan en oarsom. De Ct-wearden fan 'e NTC-samples wiene sa heech as ferwachte. It ferskil yn \(\sawat 3\) Ct-wearden tusken de positive kontrôle en de test stekproef jout fierder oan dat elk test stekproef hat likernôch 1% sjabloan yn ferliking mei de positive kontrôle. Wy hawwe earder besprutsen dat langere amplicons liede ta bettere gefoelichheid. Amplification fan langere fragminten isolearre út heterogene miljeu samples is útdaagjend sjoen de neidielen fan lege virale konsintraasje en RNA-degradaasje. Mei ús firusferriking en PCR-amplifikaasjeprotokol koene wy lykwols it \(503\,\hbox {bp}\) fragmint foar elektrogemyske sensing mei súkses fersterkje.
Figuer 6 toant de elektrogemyske sensorresultaten fan it \(503\,\hbox {bp}\) fragmintamplikon, sawol mei ûnfertinne cDNA as sjabloan (1:1) en 100-fâldich verdund cDNA as sjabloan (1:100) útfierd PCR , fergelike mei NTC en PC (sjoch figuer S4 yn Oanfoljende ynformaasje foar represintative voltammograms). Elk fak yn 'e boxplot yn figuer 6 befettet mjittingen fan trije samples op 5 elektroden. Deselde elektroden waarden brûkt om alle samples te mjitten om flaters te foarkommen troch elektrodes Yn ferliking mei CV-mjittingen litte DPV-mjittingen bettere resolúsje sjen om test- en PC-samples te ûnderskieden fan NTC's, om't, lykas earder neamd, Faradayske streamingen ferburgen binne fanwege eftergrûnkapasitive streamingen yn 'e lêste. Foar langere amplicons hawwe wy observearre dat de negative kontrôle (NTC) resultearre yn hegere CV- en DPV-peakstreamen relatyf oan 'e positive kontrôle, wylst positive en ûnferdunde testmonsters ferlykbere peakhichten fan DPV-peakstreamen sjen litte. ) testmonster en PC kinne dúdlik oplost wurde fan 'e sensorútfier foar it NTC-monster, wylst de resolúsje foar it 1:100-fertinne sample minder útsprutsen is. (banen net werjûn yn figuer 5), en de oerienkommende DPV- en CV-peakstreamen wiene fergelykber mei dy ferwachte foar NTC. kontrôle feroarsake in elektrogemyske reaksje fan 'e PCB-sensor troch de adsorpsje fan frije MB op' e elektrode en de ynteraksje fan 'e MB mei it ienstrengige primeroligonucleotide. pykstroom fan it testmonster fergelike mei de pykstroom krigen troch de negative kontrôle om in differinsjaal (relatyf) mjitting te berikken39,40 om it testmonster te klassifisearjen as posityf as negatyf.
(a) DPV, en (b) CV-peakstream foar elektrogemyske deteksje fan \(503\,\hbox {bp}\) fragminten yn marwettermonsters. positive kontrôles (PC).
Us befinings yllustrearje ferskate meganismen dy't de prestaasjes fan elektrogemyske sensoren beynfloedzje foar amplicons fan ferskillende lingten foar ferskate DNA's, mei konsintraasjes ferifiearre troch optyske mjittingen mei in UV/Vis-spektrofotometer. \(500\,\hbox {bp}\) kin wurde ûntdutsen mei hegere gefoelichheid en dat de oanwêzigens fan sâlt yn 'e stekproef net Sensitivity DNA-konsintraasje dy't ynfloed op hegere gefoelichheid (selden \({\hbox {ng}/{\upmu) \hbox {l}}}\) en boppe).Dêrneist hawwe wy ûndersocht it effekt fan ferskate soarten samples, ynklusyf gel-suvere amplicons mei en sûnder tafoege sâlt, en tafoeging fan marwettermonsters yn DPV- en CV-mjittingen.Wy observearre dat DPV in bettere resolúsje levere, om't de kapasitive eftergrûnstroom ek de CV-mjitting beynfloedet, wêrtroch it minder gefoelich is.
Amplifikaasje fan langere fragminten hinget ôf fan de yntegriteit fan it virale genomyske RNA. Ferskate ûndersiken hawwe sjen litten dat amplifikaasje fan langere fragminten net altyd effisjint is troch degradaasje fan RNA yn 'e omjouwing en it potinsjeel foar splicing tidens isolaasje11,41,42,43,44 .Wy observearre dat de PEG-basearre firuskonsintraasjemetoade effektiver wie yn it konsintrearjen fan faag Phi-6 spiked yn marwettermonsters as de aluminiumhydroxide-basearre firuskonsintraasjemetoade. te fersterkjen meardere koartere lingte sjabloanen en ferminderje de mooglikheid fan cross-spesifisiteit.
Biologyske samples binne min, dus d'r is needsaak om in biosensor te ûntwerpen dy't minimale samples fereasket foar testen. ) samples foar testen om it effektive gebiet fan 'e elektroden te dekken. Derneist kin deselde elektrode opnij brûkt wurde nei it skjinmeitsjen foardat it folgjende sample útjûn wurdt. Om't elke elektrode sa'n $ 0,55 (of INR 40) kostet om te meitsjen, kin dizze biosensor in kosten-effektyf alternatyf wêze foar besteande deteksjetechnologyen. DNA-fragminten yn heterogene samples.
Mei it each op dat MB-basearre elektrogemyske deteksjeprotokollen betrouwe op 'e spesifisiteit fan PCR, is in wichtige beheining fan dizze metoade it potinsjeel foar net-spesifike amplifikaasje yn heterogene samples lykas ôffalwetter en marwetter of it brûken fan lege-suvere primers. elektrogemyske deteksjemetoaden foar DNA-deteksje fan net-suvere PCR-produkten mei net-modifisearre ENIG PCB-elektroden, is it needsaaklik om flaters yntrodusearre troch net brûkte dNTP's en primers better te begripen, en om reaksjebetingsten en assayprotokollen te optimalisearjen. Oanfoljende fysysk-gemyske parameters lykas pH, temperatuer en biologyske soerstof fraach (BOD) fan it wettermonster kin ek moatte wurde mjitten om de krektens fan 'e mjitting te ferbetterjen.
Ta beslút stelle wy in goedkeap elektrogemyske ENIG PCB-sensor foar foar firusdeteksje yn omjouwings (marwetter) samples.Unlike ymmobilisearre oligonucleotide-elektroden of oanpaste substraten foar DNA-sensing dy't kryogenyske opslach nedich binne om gefoelichheid te behâlden, 53,54 ús technyk brûkt unmodified PCB elektroden mei in langere hâldberens en gjin spesifike opslach easken en dêrom geskikt foar de ûntwikkeling fan mjitting oplossings mei automatisearre sample ferwurkjen ynset yn LMICs.The biosensor utilizes goedkeape DNA-yntercalating redox kleurstoffen (MB) foar flugge detectie fan doel amplicons.The nonspecific amplification. mienskiplik yn miljeu-samples ferminderet de spesifisiteit fan dizze sensing metoade troch de net-spesifike bining fan MBs oan ien- en dûbelstringed oligonucleotides.Dêrom hinget de spesifisiteit fan dizze test ôf fan de optimalisaasje fan primers en PCR reaksje betingsten.Dêrneist, de CV en DPV-peakstreamen krigen fan 'e hifke samples moatte wurde ynterpretearre relatyf oan' e antwurden dy't krigen binne fan 'e negative kontrôle (NTC) foar elke test. -kosten oplossing dy't samples kin sammelje en analysearje en resultaten draadloos weromjaan nei it laboratoarium.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Metoaden foar inisjele konsintraasje fan firussen út wettermonsters: in resinsje en meta-analyze fan resinte stúdzjes.J.Application.microorganism.115, s. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL. Waterborne viruses: Barriers to safe drinking water. PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Wastewater epidemiology foar kosten-effektyf grutskalige tafersjoch fan COVID-19 yn lannen mei leech- en middenynkommen: útdagings en kânsen. Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427-3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylene blau as in elektrogemyske diskriminator fan single- en dûbele-stranded oligonucleotides immobilized op gouden substrates.Analyst 126, 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Fergeliking fan kation- en anion-intercalators foar elektrochemyske transduksje fan DNA-hybridisaasje troch Long-Range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Charge transfer through DNA: a selective electrochemical DNA biosensor.anus.Chemical.78, 2138-2144 (2006).
Fang, TH et al. Real-time PCR microfluidic apparaat mei concurrent electrochemical detection. biological sensor. Bioelectronics.24, 2131-2136 (2009).
Win, BY et al.Sinjalearjen meganisme stúdzje en prestaasjes ferifikaasje fan in electrochemical real-time PCR systeem basearre op de ynteraksje fan methylene blau mei DNA.Analyst 136, 1573-1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al. Loop-bemiddelde isothermyske amplifikaasje-basearre elektrogemyske sensor foar deteksje fan sars-cov-2 yn ôffalwettermonsters.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Electrochemical sensing of SARS-CoV-2 amplicons with PCB electrodes.The sensor is activated.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Effisjinte deteksje fan SARS-CoV-2 RNA yn 'e fêste fraksje fan ôffalwetter.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al. Analytyske metoaden foar deteksje fan SARS-CoV-2 yn ôffalwetter: protokol en takomstperspektyf. TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Survival of the enveloped bacteriophage Phi6 (in surrogaat foar SARS-CoV-2) yn ferdampte speekseldruppels ôfset op glêzen oerflakken.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Miljeu-persistinsje fan in SARS-CoV-2 surrogaat (Phi6) yn frij-libjende amoeba.J.Wetter Health 20, 83 (2021).
Mindich, L. Sekuere ferpakking fan trije genomyske fragminten fan dûbele strâne RNA-bakteriofage\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Secondary structure of the DH RNA phage\(\varphi\)6 packaging region.RNA 6, 880-889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap - In fluch en effisjint protokol foar it tarieden fan laboratoariumfoardielen fan bakteriofagen.PeerJ 4, e2261 (2016).
Post tiid: mei-27-2022