Kiitos vierailustasi Nature.com-sivustolla. Käyttämäsi selainversio tukee rajoitetusti CSS:ää. Parhaan kokemuksen saamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan yhteensopivuustilan Internet Explorerista). Sillä välin varmistaaksesi jatkuva tuki, näytämme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Ympäristönäytteiden seurannan tärkeyttä on arvostettu suuresti COVID-19-pandemian alusta lähtien, ja joitakin seurantatoimia tehdään kultastandardin avulla, vaikka qPCR-pohjaiset tekniikat ovat kalliita. Sähkökemialliset DNA-biosensorit voivat tarjota mahdollisesti kustannustehokkaan ratkaisu ympäristön vesinäytteiden seurantaan matala- ja keskituloisissa maissa. Tässä työssä esittelemme järvivesistä eristetyistä Phi6-faageista (suosittu SARS-CoV-2:n korvike) saatujen amplikonien sähkökemiallista havaitsemista käyttämällä ENIG-ohjelmaa. PCB-elektrodien viimeistelyyn ilman pintamuutoksia.Sähkökemiallinen anturin vaste karakterisoitiin perusteellisesti kahdelle eripituiselle DNA-fragmentille (\({117}\,\hbox {bp}\) ja \({503}\,\hbox {bp}\)) ja PCR-perusseoksissa olevien suolojen vaikutus metyleenisinisen (MB)-DNA-vuorovaikutuksiin. Tuloksemme osoittavat, että DNA-fragmenttien pituus määrää merkittävästi sähkökemiallisen herkkyyden ja osoittavat tässä työssä, että kyky havaita pitkiä amplikoneja ilman PCR-tuotteiden geelipuhdistusta on tärkeä vesinäytteiden in situ -mittauksessa.Täysin automatisoitu ratkaisu viruskuormitukseen lupaa hyvää.
Vesivälitteinen virustartunta on tunnettu kansanterveydellisenä vaarana 1940-luvulta lähtien, ja ensimmäiset todisteet polion ja hepatiitti E1:n vesiteitse tarttumisesta on saatu. Maailman terveysjärjestö (WHO) on luokitellut useita vesiteitse leviäviä viruksia aiheuttavia taudinaiheuttajia, joilla on kohtalainen tai suuri terveysvaikutus2. Perinteinen virus havaitsemismenetelmät perustuvat kultastandardiin qPCR-pohjaisiin tekniikoihin, jotka ovat erittäin herkkiä ja spesifisiä, mutta vaativat ammattitaitoista henkilökuntaa testaamaan laboratoriossa kalliilla instrumenteilla. Kuitenkin matalan ja keskitulotason maissa (LMIC), joissa on rajalliset resurssit näytteiden testaus menee todennäköisesti ympäristövesinäytteiden seurannan edelle. Siksi tarvitaan vaihtoehtoisia edullisia menetelmiä vesi- ja jätevesinäytteiden kestävään, reaaliaikaiseen seurantaan matalan ja keskitulotason maissa varhaisena varoituksena taudin puhkeamisesta, Näin suojellaan heitä viruspandemian vakavilta sosioekonomisilta vaikutuksilta.Halpahintaiset sähkökemialliset biosensorit nukleiinihappoille voisivat tarjota lupaavan potentiaalisen ratkaisun tähän tyydyttämättömään tarpeeseen. Monet näistä DNA-biosensoreista toimivat sillä tosiasialla, että komplementaariset DNA-säikeet on kiinnitetty elektrodille. pinta ja hybridisoituvat, kun näytteessä on vastaava sekvenssi. Tämä voidaan sitten muuntaa signaaliksi erilaisilla sähkökemiallisilla tekniikoilla käyttämällä redox-välittäjiä, kuten kaliumrautaa/ferrosyanidia. Metyleenisininen (MB) on yksi tällainen redox-aktiivinen molekyyli, jolla on on raportoitu interkaloituvan kaksijuosteiseksi DNA:ksi (dsDNA) sen lisäksi, että se sitoutuu epäspesifisempään yksijuosteiseen DNA:han5,6. MB:iden interkaloituva luonne MB-DNA-kompleksien muodostamiseksi tekee niistä suositun valinnan redox-välittäjiksi useissa sähkökemiallisissa DNA:issa. anturikonfiguraatiot5,6,7,8,9.Vaikka MB:n interkalaatio DNA:han on epäspesifistä ja tämän sähkökemiallisen anturin spesifisyys riippuu pitkälti PCR:ssä tai isotermisessä amplifikaatiossa käytettyjen alukkeiden puhtaudesta, se soveltuu hyvin todellisen -aikaiseen sähkökemialliseen qPCR- tai fluoresenssi-isoterminen monistus vaihtoehtona DNA-pitoisuuden mittaamiselle 9 .Yhdessä tällaisessa toteutuksessa Won et al. Kultaelektrodien pintaa modifioitiin 6-merkapto-1-heksanolilla (MCH) reaaliajassa PCR-amplikonien mittaus MB:llä käyttämällä differentiaalista pulssivoltametriaa (DPV)9. Muissa tapauksissa Ramirez et al. SARS-CoV-2:n havaitseminen jätevedestä RT-LAMP-reaktiolla käyttämällä MB:tä silkkipainetuilla elektrodeilla. Myös platinaelektrodeja on käytetään in situ -elektrodeina mikrofluidisessa PCR-alustassa, joka on suunniteltu havaitsemaan sähkökemiallisesti amplikoneja reaktioiden aikana. 8 Kaikki nämä tutkimukset vaativat elektrodien pinnan modifiointia, mikä merkitsee lisääntyneitä tuotanto- ja käyttökustannuksia, koska näiden funktionalisoitujen elektrodien stabiilisuutta koskevat erityiset säilytysvaatimukset.
Kaavio työnkulusta järvivesinäytteissä olevien väkevöityjen viruspartikkeleiden amplikonien sähkökemialliseen havaitsemiseen.
Osoitimme äskettäin SARS-CoV-2-amplikonien sähkökemiallisen tunnistamisen edullisilla painetun piirilevyn (PCB) elektrodeilla, jotka perustuvat DPV:hen ja sykliseen voltammetriaan (CV), joka on indusoitu MB-DNA-kompleksien adsorptiolla modifioimattomien elektrodien pinnalle) huipun muutoksilla. nykyinen 11.Raportoimme, että pidemmät DNA-fragmentit (N1-N2, \({943}\, \hbox), jotka muodostettiin käyttämällä CDC:n suosittelemia N1 forward- ja N2 reverse-alukkeita verrattuna lyhyempiin fragmentteihin {bp}\)) osoittivat parempaa lineaarisuutta sensorin vasteessa. (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) muodostettiin käyttämällä N1 forward- ja N1 reverse-alukesarjoja. Nämä tutkimukset on raportoitu käyttämällä DNA-laimennoksia, jotka on valmistettu nukleaasivapaassa vedessä. Alustaa käytettiin myös SARS-CoV:n havaitsemiseen. -2 amplikonia simuloiduissa jätevesinäytteissä (saatu lisäämällä kokonais-RNA-näytteitä SARS-CoV-2 RNA:lla). Koska RNA on herkkä leikkaukselle eristyksen ja jatkokäsittelyn aikana12,13, on vaikeaa monistaa pidempiä fragmentteja tällä heterogeenisellä näytteellä. Siksi SARS-CoV-2-amplikonin sähkökemiallisen havaitsemisen demonstraatio jätevedessä rajoittuu lyhyempään \(72\,\hbox {bp}\) N1-fragmenttiin.
Tässä työssä tutkimme järvivesinäytteistä konsentroidun ja eristetyn Phi6-faagien ENIG PCB -pohjaisen sähkökemiallisen tunnistamisen toteutettavuutta (kuva 1). Phi6-faagit ovat kooltaan (80-100 nm) verrattavissa SARS-CoV-2- ja Niissä on myös lipidikalvo ja piikkiproteiini. Näistä syistä bakteriofagi Phi6 on suosittu korvike SARS-CoV-2:lle ja muille vaipallisille patogeenisille RNA-viruksille14,15. Faagipartikkeleista eristettyä RNA:ta käytettiin templaattina cDNA-synteesiin ja sen jälkeen PCR kahden 117 ja 503 emäsparin pituisen DNA-fragmentin saamiseksi. Ottaen huomioon haasteen monistaa \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2-fragmentteja edellisessä työssämme, kohdistamme keskipituisiin fragmentteihin (\(117) \,\hbox {bp}\) ja \(503 \,\hbox {bp}\)) saatavilla olevien alukkeiden perusteella. Sähkökemiallista anturin vastetta tutkittiin systemaattisesti laajalla pitoisuusalueella (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Molemmille fragmenteille MB:n läsnäolo, suolan vaikutus anturin vasteeseen on karakterisoitu ja ristiinvalidoitu spektrofotometrisin mittauksin. Tämän työn tärkeimmät panokset ovat seuraavat:
DNA-fragmentin pituus ja suolan läsnäolo näytteessä vaikuttavat voimakkaasti herkkyyteen.Tuloksemme osoittavat, että sähkökemiallinen aktiivisuus riippuu MB:n, DNA:n ja anturin vuorovaikutuksen erilaisista mekanismeista voltammetrisessa vasteessa, riippuen DNA:n pitoisuudesta ja pituudesta. Pidemmät fragmentit osoittavat suurempaa herkkyyttä, vaikka suolalla on negatiivinen vaikutus sähköstaattisiin vuorovaikutuksiin MB ja DNA.
DNA-pitoisuus määrittää MB-DNA-vuorovaikutuksen mekanismin modifioimattomissa elektrodeissa Osoitamme, että MB-DNA-vuorovaikutuksen eri mekanismit riippuvat DNA-pitoisuudesta. DNA-pitoisuuksilla, jotka ovat alle pienen määrän \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), havaitsimme, että sähkökemiallisen virtavasteen määräytyi pääasiassa MB-DNA:n adsorptio elektrodilla, kun taas pienemmillä pitoisuuksilla Suurilla DNA-pitoisuuksilla sähkökemiallisen virtavasteen määritti redox-pelkistyksen steerinen esto. aktiivisuus johtuu MB:n insertiosta DNA-emäsparien välillä.
Virusnukleiinihappojen ENIG PCB-pohjainen sähkökemiallinen tunnistus järven vesinäytteistä Havainnot validoitiin sähkökemiallisesti havaitsemalla Phi6-lisätyt \(503\,\hbox {bp}\) DNA-fragmentit, jotka oli saatu vesinäytteistä Powai Lakesta, IIT Mumbai Campus Tulosfaagi.
Alhaiset käyttöönottokustannukset ja mahdollisuus integroida täysin automatisoituihin valvontajärjestelmiin, oligonukleotideihin tai aptameereihin elektrodeilla, joilla on pidempi säilyvyys.
Phi6-faagi on Cytoviridae-heimoon kuuluva vaipallinen dsRNA-virus, joka infektoi Pseudomonas syringae. Phi6-faagin genomi on olemassa kolmen fragmentin muodossa: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) ja L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Koska Phi6-faagi infektoi ei-patogeenisen BSL-1 Pseudomonas -kannan, sitä on turvallista käyttää ja sitä voidaan kasvattaa helposti laboratoriossa.Faagi Phi6 ja sen isäntä Pseudomonas syringae ostettiin Felix d'Herellen bakteerivirusten viitekeskuksesta, Laval University, Kanada (viitekeskuksen luettelonumerot ovat HER-102 ja HER-1102, vastaavasti) Phi6-faagi ja sen isäntä elvytettiin vertailukeskuksen ohjeiden mukaisesti. Phi6-faagi puhdistettiin levylyysillä ja eluoimalla, jotta saatiin lopulliset tiitterit \(\noin 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (plakkia muodostavia yksiköitä/ millilitraa). RNA eristettiin puhdistetuista faagipartikkeleista käyttämällä GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit -sarjaa (Sigma-Aldrich) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna puhdistettu faagi Phi6 -suspensio\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) lysoitiin ja lysaatti ladattiin spin-kolonniin, jotta RNA:n annettiin sitoutua hartsikolonniin. Sitten RNA eluoituu eluutioliuoksessa \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) pakkauksen toimittama. Arvioi RNA:n pitoisuus absorbanssilla \(260\,\hbox {nm}\). RNA:ta säilytettiin alikvooteissa \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) jatkokäyttöön asti.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA Synthesis Kit (Bio) -Rad Laboratories) käytettiin mallina cDNA-synteesiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna cDNA-synteesireaktio koostuu kolmesta vaiheesta: esikäsittely kohdassa \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , \({20}\,{\hbox {min}}\) käänteinen transkriptio osoitteessa \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), ja käänteinen Tallennin on paikassa \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) \({1}\,{\hbox {min }}\).Ajettaessa 1-prosenttisella agaroosigeelillä cDNA:ssa oli kolme vyöhykettä, jotka vastasivat odotettuja kolmea RNA-fragmenttia (tietoja ei esitetty). Seuraavia alukkeita käytettiin monistamaan kaksi DNA-fragmenttia, joiden pituus oli 117 ja 503 bp, cDNA:n käyttäminen templaattina PCR:lle miniPCR® mini8 -lämpösyklilaitteessa:
Alukkeet \(117\,\hbox {bp}\) ja \(503\,\hbox {bp}\) vastaavat 1476-1575 nukleotidia M-segmentistä ja 458-943 nukleotidia L-segmentistä, vastaavasti happoa. Kaikille monistetuille PCR-tuotteille suoritettiin elektroforeesi 1-prosenttisilla agaroosigeeleillä, ja monistettu kohde-DNA puhdistettiin käyttämällä GeneJET Gel Extraction Kit -sarjaa (Thermo Fisher Scientific).
IIT Mumbain kampuksella (Powai Lake, Powai, Mumbai) olevaa järveä käytettiin faagihiukkasten lisäämiseen. Järven vesi suodatettiin \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) kalvon läpi poistamiseksi. suspendoituneita hiukkasia, ja sitten Phi6-faagi lisättiin. Lisää \({1}\,{\hbox {ml}}\) / \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) suodatettuun järviveteen, paikkaan \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Pieni erä oli varattu viruskuormituksen mittaamiseen plakkimäärityksellä. Testasimme kahta eri menetelmää piikkimäisten Phi6-viruspartikkelien konsentroimiseksi: (1) alumiinihydroksidin adsorptio-saostusmenetelmä19, joka on validoitu useiden vaipallisten RNA-virusten konsentroimiseksi ympäristönäytteistä, ja (2) ) Polyetyleeniglykoliin (PEG) perustuva viruskonsentraatiomenetelmä on mukautettu julkaisusta Flood et ai.20. Koska PEG-pohjaisen menetelmän talteenottotehokkuuden todettiin olevan parempi kuin alumiinihydroksidimenetelmän, käytettiin PEG-pohjaista menetelmää Phi6-hiukkasten konsentroimiseen järvivesinäytteistä.
Käytetty PEG-menetelmä oli seuraava: PEG 8000 ja \(\hbox {NaCl}\) lisättiin Phi6-piikkisiin järvivesinäytteisiin, jolloin saatiin 8 % PEG 8000 ja \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Näytteitä inkuboitiin ravistelijassa\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), sitten sentrifugoidaan \(4700 \,\hbox {g}\) on \({45}\,{\hbox {min}}\). Hävitä supernatantti ja suspendoi pelletti uudelleen \({1}\, {\hbox {ml}}\) samassa supernatantissa. Kaikki lisäys- ja viruskonsentraatiokokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Väkevöinnin jälkeen varattiin pieni osa talteenottotehokkuuden mittaamista varten plakkimäärityksellä. RNA eristettiin aiemmin kuvatulla tavalla ja eluoitiin sarjan mukana toimitetussa eluointipuskurissa\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Koska RNA-pitoisuus vaihtelee näytteestä toiseen kolmena kappaleena, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) RNA:ta käytetään kaikkiin kolmeen sen pitoisuudesta riippumatta. Näytteiden cDNA-synteesi.cDNA-synteesi suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA käytettiin mallina \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR:lle 35 syklin ajan vahvistamaan \ (117\,\hbox {bp}\) ja \(503\,\hbox { bp}\) -fragmentteja. Nämä näytteet esitetään muodossa "1:1", eli ilman laimennusta. Negatiiviseksi kontrolliksi asetettiin ei-templaattikontrolli (NTC), kun taas puhdistetusta faagista eristettyä RNA:ta käyttäen syntetisoitu cDNA asetettiin. mallina positiiviselle kontrollille (PC). Kvantitatiivinen PCR (qPCR) suoritettiin Stratagene Mx3000P RT-PCR -laitteella käyttäen Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mixiä (Agilent Technologies). Reaktiot muodostettiin kolmena rinnakkaisena kuten aiemmin. Kaikille näytteille kirjattiin kiertokynnys (Ct). Lisäksi laimennetut näytteet \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) käyttäen cDNA:ta laimennettuna 1:100 suodatettuun järviveteen. \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR 35 syklille. Nämä näytteet esitetään muodossa "1:100".
PCB-elektrodit valmistetaan käyttämällä kaupallisesti saatavilla olevaa edullista Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) -prosessia ilman ylimääräistä kultapinnoitusta.ENIG-piirilevyelektrodien tekniset tiedot on kuvattu yksityiskohtaisesti aiemmassa työssämme11.ENIG-piirilevyelektrodeille perinteiset elektrodien puhdistusmenetelmät, kuten esim. piraijaliuosta tai syklistä rikkihappovoltametriaa ei suositella, koska ne voivat aiheuttaa ohuen kultakerroksen (paksuus \(\noin\) \(100\,\hbox {nm }\) irtoamista ja paljastaa alla olevat kuparikerrokset. korroosiolle 21, 22, 23, 24, 25. Puhdista elektrodit sen vuoksi nukkaamattomalla IPA:lla kostutetulla liinalla. Testattavaa näytettä inkuboitiin \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) Mt hakemistossa \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) helppoa lisäämistä varten.Edellisessä työssämme , havaitsimme, että anturin herkkyys ja lineaarisuus paranivat lisäämällä MB-pitoisuutta 11 . Aiemmassa työssämme raportoitujen optimointien perusteella käytimme \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB pitoisuudet DNA:n upottamiseksi tässä tutkimuksessa.Kaksijuosteisen DNA:n (ds-DNA) sähkökemiallinen havaitseminen voidaan saavuttaa käyttämällä anionisia tai kationisia interkalaattoreita.Vaikka anioniset interkalaattorit havaitsevat DNA:n selektiivisemmin, ne vaativat yön yli tapahtuvaa inkubaatiota, mikä johtaa pidempiin havaitsemisaikaan. toisaalta kationiset interkalaattorit, kuten MB, vaativat lyhyempiä inkubaatioaikoja, noin \({1}\,{\hbox {h}}\) ds-DNA6:n sähkökemialliseen havaitsemiseen. Jokainen mittaus sisältää testattavan näytteen annostelemisen elektrodi\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), puhdista sen jälkeen IPA:lla kostutetulla rievulla, ennen kuin jatkat uudella näytteellä.yksi mittaus.Jokainen näyte testattiin viidellä eri elektrodilla, ellei toisin mainita.DPV- ja CV-mittaukset suoritettiin PalmSens Sensit Smart -potentiostaatilla, ja PSTrace-ohjelmistoa käytettiin potentiostaatin konfigurointiin ja tietojen keräämiseen, mukaan lukien huippuvirran laskelmat. Käytetään seuraavia asetuksia. DPV- ja CV-mittauksia varten:
DPV: tasapainoaika = \(8\,\hbox {s}\), jänniteporras = \(3\,\hbox {mV}\), pulssijännite = \(25\,\hbox {mV}\) , pulssin kesto = \(50\,\hbox {ms}\), skannausnopeus = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: tasapainoaika = \(8\,\hbox {s}\), jänniteporras = \(3\,\hbox {mV}\), pyyhkäisynopeus = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
Huippuvirrat, jotka on saatu \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB:n kanssa kompleksoidun DNA:n voltammogrammeista: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV- ja CV voltammogrammit saatiin ENIG PCB-elektrodeista \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB, joka oli kompleksoitu DNA:n kanssa (pitoisuuksina 10–\({20}\,{\ hbox {ng) }/{\upmu \hbox {l}}}\) eli 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(117\,\hbox {bp}\ ) ja 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) for \(503\,\hbox {bp}\)). Edustavat voltammogrammit on esitetty lisätiedon kuvassa S1. Kuva 2 näyttää tulokset. DPV- ja CV-mittauksista (huippuvirta) geelipuhdistettuja PCR-tuotteita käyttäen. CV-mittauksiin verrattuna DPV-mittaukset osoittavat suurempaa herkkyyttä (virta DNA-konsentraation funktiona), koska CV-mittausten taustakapasitiiviset virrat piilottavat Faradaic-virrat 26 . jokaisessa boxplotin laatikossa on mittauksia viideltä elektrodilta.Kaikissa mittauksissa käytetään samaa elektrodisarjaa, jotta vältetään elektrodien välisestä vaihtelusta johtuvat mittausvirheet. Havaitsimme kasvavan trendin DPV- ja CV-mittaushuippuvirroissa pienemmillä DNA-pitoisuuksilla , pidempi (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ verrattuna \(117) ) fragmenttiin. Tämä on yhdenmukainen aiemmassa työssämme raportoitujen elektrodien adsorptiosuuntausten kanssa. MB-DNA-kompleksin adsorptio helpottaa varauksen siirtoa elektrodilla, mikä myötävaikuttaa huippuvirran kasvuun. Muut tutkimukset ovat osoittaneet oligonukleotidin koon ja sekvenssin vaikutuksen MB-DNA:n interkalaatioon27,28,29,30.Guaniini Kahden amplikonin (\(117\,\hbox {bp}\) ja \(503\,\hbox {bp}\)) -sytosiini (GC) -pitoisuus oli noin 50 %, mikä osoittaa, että havainto Ero johtuu amplikonin pituuteen. Kuitenkin korkeammille DNA-pitoisuuksille (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), \(503\,\hbox {bp} \) ja \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) kohteelle \(117\,\hbox {bp}\)), havaitsemme kaksi vahvistusta. subs-arvojen huippuvirrat pienenevät sekä DPV- että CV-mittauksissa. Tämä johtuu siitä, että MB kyllästyy ja interkaloituu DNA:n emäsparien välillä, mikä johtaa MB31,32:n pelkistettävän ryhmän redox-aktiivisuuden steeriseen estoon.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
PCR-pääseoksissa olevat suolat häiritsevät MB:n ja DNA:n välisiä sähköstaattisia vuorovaikutuksia, joten lisäämällä \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) ja \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB-geelipuhdistettu tuote suolan vaikutuksen tutkimiseen MB-DNA-vuorovaikutukseen. Kuten kuvasta 3, havaitsimme, että korkeammilla DNA-pitoisuuksilla (\(>{2}\,{\) hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) ja \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) \(117\,\hbox {bp} \)), DPV:ssä ja CV:ssä Suolan lisääminen ei vaikuttanut merkittävästi mittauksiin (katso kuva S2 lisätiedoista edustavia voltammogrammeja varten). pienemmät DNA-pitoisuudet, suolan lisääminen vähentää herkkyyttä suuresti, mikä ei aiheuta merkittävää muutosta virrassa DNA-pitoisuuden kanssa. Muut tutkijat ovat aiemmin raportoineet suolan samankaltaisista negatiivisista vaikutuksista MB-DNA-vuorovaikutuksiin ja interkalaatioon33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) kationit sitoutuvat DNA:n negatiiviseen fosfaattirunkoon ja estävät siten sähköstaattista vuorovaikutusta MB:n ja DNA:n välillä. Suuremmilla DNA-pitoisuuksilla redox-aktiivisten MB:iden steerinen esto johtaa alhaisempiin huippuvirtoihin, joten sähköstaattiset vuorovaikutukset eivät vaikuta merkittävästi anturin vasteeseen.Tärkeintä on, että tämä biosensori soveltuu paremmin havaitsemaan suurempia DNA-pitoisuuksia (harvoin \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) tai suurempi), Ympäristövesinäytteiden täysin automaattiseen käsittelyyn, jossa PCR-tuotteiden geelipuhdistus ei ehkä ole mahdollista.
Absorptiokäyrän alla oleva pinta-ala aallonpituusalueella 600–700 \(\hbox {nm}\) DNA:n eri konsentraatioille, jotka ovat kompleksoituneet \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) kanssa MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) suolalla ja ilman (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) suolalla ja ilman (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) DNA-pitoisuudet, jotka vastaavat \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB-näytteitä Ei DNA:ta.
Yllä olevien tulosten vahvistamiseksi suoritimme optisia mittauksia käyttämällä UV/Vis-spektrofotometriä (Thermo Scientific Multiskan GO), näytteitä \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) käytettiin jokaiseen. Mittaus. Absorptiosignatuuri pienenee DNA-pitoisuuden kasvaessa, kuten voidaan nähdä absorptiokäyrän alla olevan alueen trendistä aallonpituusalueella \(600\,\hbox {nm}\) - \(700\,\hbox { nm}\) , kuten on esitetty kuvassa 4 (absorptiospektri näkyy lisätiedon kuvassa S3). Näytteille, joiden DNA-pitoisuudet ovat alle \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), DNA:ta sisältävien ja vain MB-näytteiden välillä ei ollut merkittävää eroa (\(503\,\hbox {bp}\) ja \(117\,\hbox {bp}\) ) pituiset fragmentit), mikä osoittaa redox-aktiivisen MB:n steerisen inhibition puuttumisen. Suuremmilla DNA-pitoisuuksilla havaitsimme absorbanssisignaalin asteittaisen laskun ja havaitsimme pienemmän absorbanssin laskun suolan läsnä ollessa.Näiden tulosten katsottiin johtuvan molekyylistä. vuorovaikutukset ja steerinen esto emästen pinoamisen kanssa DNA-hybrideissä. Tuloksemme ovat yhdenmukaisia kirjallisuuden raporttien kanssa MB-DNA-interkalaation spektroskopisista tutkimuksista, jotka yhdistävät hypokromaattisuuden alentuneisiin energiatasoihin \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) interkalaatiokerrosten 36, 37, 38 aiheuttamat elektroniset siirtymät.
Faagin Phi6 agaroosigeelielektroforeesi: PCR-tuotteet, joiden pituus on \(117\,\hbox {bp}\) ja \(503\,\hbox {bp}\) järvivesinäytteistä.M-DNA-markkeri;NTC-ei-templaattikontrolli, alukkeet, jotka sisältävät vastaavia amplikoneja;PC positiivinen kontrolli;1, 2, 3-laimentamaton (1:1) piikkijärvivesinäytteet kolmena kappaleena. Vyöhyke näkyy kohdassa \(\noin 50\,\hbox {bp}\) johtuen \(503\,\) käyttämättömistä oligonukleotideista. hbox {bp}\) kaista.
Arvioimme anturin käyttökelpoisuuden käyttämällä Powai-järven vesinäytteitä, joihin oli lisätty Phi6-faagi. Faagipitoisista vesinäytteistä eristetyt RNA-pitoisuudet vaihtelivat välillä 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), kun taas puhdistetuista faagisuspensioista eristettyjen RNA:n arvioitiin olevan \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) talteenottotehokkuuden ollessa noin 1 %.RNA käänteiskopioitiin cDNA:ksi ja sitä käytettiin templaattina PCR:ssä ja qPCR:ssä. Tuotteen koko vahvistettiin agaroosigeelielektroforeesilla (kuva 5) ennen testausta anturin kanssa. Näitä näytteitä ei ole geelipuhdistettu, ja siksi ne sisältävät kaikki PCR:n komponentit. sekä mielenkiinnon kohteena olevat amplikonit.qPCR:n aikana kirjattujen Ct-arvojen (taulukko 1) osoitettiin korreloivan vastaavista vesinäytteistä eristetyn RNA:n pitoisuuden kanssa. Ct-arvo paljastaa jaksojen lukumäärän, joka tarvitaan fluoresoivan signaalin ylittää kynnyksen tai taustasignaalin. Suuremmat Ct-arvot osoittavat alhaisempia templaattipitoisuuksia ja päinvastoin. NTC-näytteiden Ct-arvot olivat odotetun korkeat. Ero \(\noin 3\) Ct-arvoissa positiivinen kontrolli ja testinäyte osoittavat lisäksi, että jokaisessa testinäytteessä on noin 1 % templaattia verrattuna positiiviseen kontrolliin. Olemme aiemmin keskustelleet siitä, että pidemmät amplikonit johtavat parempaan herkkyyteen. Heterogeenisista ympäristönäytteistä eristettyjen pidempien fragmenttien monistaminen on haastavaa ottaen huomioon haitat alhainen viruspitoisuus ja RNA:n hajoaminen. Virusrikastus- ja PCR-monistusprotokollamme avulla pystyimme kuitenkin monistamaan \(503\,\hbox {bp}\) -fragmentin sähkökemiallista tunnistusta varten.
Kuva 6 esittää \(503\,\hbox {bp}\) -fragmenttiamplikonin sähkökemialliset anturitulokset, joissa molemmissa käytetään laimentamatonta cDNA:ta templaattina (1:1) ja 100-kertaisesti laimennettua cDNA:ta templaattina (1:100), suoritettu PCR , verrattuna NTC:hen ja PC:hen (katso kuva S4 lisätiedoissa edustavia voltammogrammeja varten). Kukin kuvan 6 boxplot-ruutu sisältää mittauksia kolmesta näytteestä viidellä elektrodilla. Samoja elektrodeja käytettiin mittaamaan kaikki näytteet elektrodista johtuvien virheiden välttämiseksi. -elektrodin välinen vaihtelu. CV-mittauksiin verrattuna DPV-mittaukset osoittavat parempaa erottelukykyä testi- ja PC-näytteiden erottamiseksi NTC:istä, koska, kuten aiemmin mainittiin, Faradaic-virrat ovat piilossa jälkimmäisten taustakapasitiivisten virtojen vuoksi. Pidemmille vahvistimille havaitsimme, että negatiivinen kontrolli (NTC) johti korkeampiin CV- ja DPV-huippuvirtoihin verrattuna positiiviseen kontrolliin, kun taas positiiviset ja laimentamattomat testinäytteet osoittivat samanlaisia DPV-huippuvirtojen huippukorkeuksia. Mitatut keski- ja mediaaniarvot kullekin laimentamattomalle (1:1) ) testinäyte ja PC voidaan selvästi erottaa NTC-näytteen anturin lähdöstä, kun taas 1:100 laimennetun näytteen resoluutio on vähemmän selvä. 100-kertaisella cDNA-laimennuksella emme havainneet juovia geelielektroforeesin aikana (kaistat eivät näy kuvassa 5), ja vastaavat DPV- ja CV-huippuvirrat olivat samanlaiset kuin NTC:lle odotetut. Tulokset \(117\,\hbox {bp}\) -fragmentille on esitetty lisätiedoissa. kontrolli aiheutti sähkökemiallisen vasteen PCB-anturista johtuen vapaan MB:n adsorptiosta elektrodille ja MB:n vuorovaikutuksesta yksijuosteisen alukeoligonukleotidin kanssa. Siksi joka kerta kun näyte testataan, on suoritettava negatiivinen kontrolli ja testinäytteen huippuvirta verrattuna negatiivisen kontrollin saamaan huippuvirtaan differentiaalisen (suhteellisen) mittauksen saavuttamiseksi39,40 testinäytteen luokittamiseksi positiiviseksi tai negatiiviseksi.
(a) DPV ja (b) CV-huippuvirta \(503\,\hbox {bp}\) -fragmenttien sähkökemialliseen havaitsemiseen järvivesinäytteistä. Testinäytteet mitattiin kolmena rinnakkaisena ja niitä verrattiin no-template-kontrolliin (NTC) ja positiiviset kontrollit (PC).
Havaintomme havainnollistavat erilaisia mekanismeja, jotka vaikuttavat sähkökemiallisten antureiden suorituskykyyn eripituisille amplikoneille eri DNA:ille, ja pitoisuudet on vahvistettu optisilla mittauksilla UV/Vis-spektrofotometrillä. Havaintomme korostavat näkemystä, että pidemmät DNA-fragmentit ovat jopa \(\noin\) \(500\,\hbox {bp}\) voidaan havaita suuremmalla herkkyydellä ja että suolan esiintyminen näytteessä ei aiheuta Herkkyys DNA-pitoisuus, joka vaikuttaa korkeampaan herkkyyteen (harvoin \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ja edellä). Lisäksi tutkimme erityyppisten näytteiden vaikutusta, mukaan lukien geelipuhdistettujen amplikonien sekä lisätyn suolan kanssa ja ilman sekä järvivesinäytteiden lisäystä DPV- ja CV-mittauksissa.Havaitsimme, että DPV tarjosi paremman resoluution, koska taustakapasitiivinen virta vaikuttaa myös CV-mittaukseen, mikä tekee siitä vähemmän herkkiä.
Pidempien fragmenttien monistuminen riippuu viruksen genomisen RNA:n eheydestä. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että pidempien fragmenttien monistus ei aina ole tehokasta johtuen RNA:n hajoamisesta ympäristössä ja mahdollisesta silmukoitumisesta eristyksen aikana11,41,42,43,44 .Havaitsimme, että PEG-pohjainen viruskonsentraatiomenetelmä oli tehokkaampi konsentroimaan järvivesinäytteissä piikittynyt faagi Phi-6 kuin alumiinihydroksidipohjainen viruskonsentraatiomenetelmä. Kyky havaita pitkiä DNA-fragmentteja osoittautui ylittävän moninkertaisen PCR:n vaatimuksen. vahvistaa useita lyhyempiä malleja ja vähentää ristiinspesifisyyden mahdollisuutta.
Biologisia näytteitä on vähän, joten on tarpeen suunnitella biosensori, joka vaatii mahdollisimman vähän näytteitä testaamiseen. Tässä tutkimuksessa käytetyt ENIG PCB-elektrodit vaativat vain \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) näytteitä testausta varten kattamaan elektrodien tehollinen alue. Lisäksi samaa elektrodia voidaan käyttää uudelleen puhdistuksen jälkeen ennen seuraavan näytteen annostelua. Monistetut näytteet eivät vaadi muita kemikaaleja kuin metyleenisinistä, joka on edullinen ja yleisesti käytetty kemikaali.Koska kunkin elektrodin valmistus maksaa noin 0,55 dollaria (tai INR 40), tämä biosensori voi olla kustannustehokas vaihtoehto olemassa oleville tunnistusteknologioille.Taulukko 2 esittää tämän työn vertailun muihin kirjallisuudessa raportoituihin antureisiin. DNA-fragmentit heterogeenisissä näytteissä.
Koska MB-pohjaiset sähkökemialliset havaitsemisprotokollat perustuvat PCR:n spesifisyyteen, tämän menetelmän suurin rajoitus on mahdollisuus epäspesifiseen monistukseen heterogeenisissä näytteissä, kuten jätevedessä ja järvivedessä, tai käyttämällä matalapuhtaisia alukkeita. sähkökemialliset detektiomenetelmät puhdistamattomien PCR-tuotteiden DNA:n havaitsemiseen modifioimattomia ENIG PCB-elektrodeja käyttäen, on tarpeen ymmärtää paremmin käyttämättömien dNTP:iden ja alukkeiden aiheuttamat virheet ja optimoida reaktio-olosuhteet ja määritysprotokollat.Lisä fysikaalis-kemialliset parametrit, kuten pH, lämpötila ja biologiset parametrit. Vesinäytteen hapenkulutus (BOD) saattaa myös olla tarpeen mitata mittauksen tarkkuuden parantamiseksi.
Lopuksi ehdotamme edullista sähkökemiallista ENIG PCB -anturia virusten havaitsemiseen ympäristönäytteistä (järvivesinäytteistä). Toisin kuin immobilisoidut oligonukleotidielektrodit tai mukautetut DNA-tunnistuksen substraatit, jotka vaativat kryogeenistä säilytystä herkkyyden ylläpitämiseksi53,54, tekniikkamme käyttää modifioimatonta PCB:tä. elektrodit, joiden säilyvyysaika on pidempi ja joilla ei ole erityisiä säilytysvaatimuksia, joten ne sopivat mittausratkaisujen kehittämiseen, joissa on automaattinen näytteenkäsittely LMIC:issä. Biosensorissa käytetään edullisia DNA-interkaloivia redox-värejä (MB) kohdeamplikonien nopeaan havaitsemiseen. Epäspesifinen monistus yleinen ympäristönäytteissä vähentää tämän tunnistusmenetelmän spesifisyyttä, koska MB:t sitoutuvat epäspesifisesti yksi- ja kaksijuosteisiin oligonukleotideihin. Tämän vuoksi tämän testin spesifisyys riippuu alukkeiden ja PCR-reaktio-olosuhteiden optimoinnista.Lisäksi CV ja testatuista näytteistä saadut DPV-huippuvirrat tulee tulkita suhteessa negatiivisesta kontrollista (NTC) saatuihin vasteisiin jokaisessa testissä. Tässä työssä esitellyt sähkökemialliset anturimallit ja menetelmät voidaan integroida automaattisiin näytteenottimiin täysin automatisoidun ja matalan -kustannusratkaisu, jolla voidaan kerätä ja analysoida näytteitä ja lähettää tulokset langattomasti takaisin laboratorioon.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Menetelmät virusten alkupitoisuuksiin vesinäytteistä: viimeaikaisten tutkimusten katsaus ja meta-analyysi. J.Application.microorganism.115, s. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Vesivälitteiset virukset: Esteet turvalliselle juomavedelle.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Jätevesiepidemiologia COVID-19:n kustannustehokkaaseen laajamittaiseen seurantaan matalan ja keskitulotason maissa: haasteita ja mahdollisuuksia. Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN. Metyleenisininen kultasubstraateille immobilisoitujen yksi- ja kaksijuosteisten oligonukleotidien sähkökemiallisena erottajana. Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Kationin ja anionin interkalaattorien vertailu DNA-hybridisaation sähkökemialliseen transduktioon pitkän kantaman elektroninsiirrolla.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Varauksen siirto DNA:n kautta: selektiivinen sähkökemiallinen DNA-biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Reaaliaikainen PCR-mikrofluidilaite, jossa on samanaikainen sähkökemiallinen havaitseminen.biologinen anturi.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al.Metyleeninsinisen ja DNA:n vuorovaikutukseen perustuvan sähkökemiallisen reaaliaikaisen PCR-järjestelmän signaalimekanismitutkimus ja suorituskyvyn todentaminen. Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et ai. Silmukkavälitteinen isoterminen vahvistuspohjainen sähkökemiallinen anturi sars-cov-2:n havaitsemiseen jätevesinäytteistä.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al. SARS-CoV-2-amplikonien sähkökemiallinen havaitseminen PCB-elektrodeilla. Anturi on aktivoitu.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Tehokas SARS-CoV-2 RNA:n havaitseminen jäteveden kiinteässä fraktiossa.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al. Analytical Methods for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Vaipallisen bakteriofagin Phi6 (SARS-CoV-2:n korvike) selviytyminen haihdutetuissa sylkipisaroissa, jotka on kerrostettu lasipinnoille.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ SARS-CoV-2-korvikkeen (Phi6) ympäristön pysyvyys vapaana elävässä amebassa.J.Water Health 20, 83 (2021).
Mindich, L. Kaksijuosteisen RNA-bakteriofagi\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev. kolmen genomisen fragmentin tarkka pakkaus.63, 149-160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, DH RNA -faagin\(\varphi\)6 pakkausalueen sekundaarinen rakenne.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – Nopea ja tehokas protokolla bakteriofagien laboratoriokokeiden valmistukseen. PeerJ 4, e2261 (2016).
Postitusaika: 27.5.2022