Tak fordi du besøgte Nature.com. Den browserversion, du bruger, har begrænset understøttelse af CSS. For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller slår kompatibilitetstilstand fra i Internet Explorer). I mellemtiden for at sikre fortsat support, vil vi vise siden uden stilarter og JavaScript.
Vigtigheden af at overvåge miljøprøver har været meget værdsat siden begyndelsen af COVID-19-pandemien, og nogle overvågningsindsatser udføres ved hjælp af guldstandarden, selvom qPCR-baserede teknikker er dyre. Elektrokemiske DNA-biosensorer kunne give en potentielt omkostningseffektiv løsning til overvågning af miljømæssige vandprøver i lav- og mellemindkomstlande. I dette arbejde demonstrerer vi den elektrokemiske detektion af amplikoner opnået fra Phi6-fag isoleret fra søvandsprøver med spidser (et populært surrogat for SARS-CoV-2) ved hjælp af ENIG at færdiggøre PCB-elektroder uden overflademodifikation.sex. Den elektrokemiske sensorrespons blev grundigt karakteriseret for to DNA-fragmenter af forskellig længde (\({117}\,\hbox {bp}\) og \({503}\,\hbox {bp}\)), og effekt af salte i PCR-masterblandinger på methylenblåt (MB)-DNA-interaktioner. Vores resultater viser, at længden af DNA-fragmenter signifikant bestemmer den elektrokemiske følsomhed og viser i dette arbejde, at evnen til at påvise lange amplikoner uden gelrensning af PCR-produkter er vigtig for in situ måling af vandprøver.En fuldautomatisk løsning til viral belastning lover godt.
Vandbåren virusoverførsel har været kendt som en folkesundhedsfare siden 1940'erne, med det første bevis på vandbåren overførsel af polio og hepatitis E1. Verdenssundhedsorganisationen (WHO) har klassificeret adskillige vandbårne virale patogener af moderat til høj sundhedsmæssig betydning2.Traditionel virus Detektionsmetoder er afhængige af guldstandard qPCR-baserede teknikker, som er meget følsomme og specifikke, men kræver kvalificeret personale til at teste i laboratoriet ved hjælp af dyre instrumenter. Men i lav- og mellemindkomstlande (LMIC'er) med begrænsede ressourcer, prøvetestning vil sandsynligvis have forrang frem for miljømæssig vandprøveovervågning. Derfor er der behov for alternative billige metoder til bæredygtig realtidsovervågning af vand- og spildevandsprøver i lav- og mellemindkomstlande som tidlige advarsler om nye sygdomsudbrud, derved beskyttes dem mod de alvorlige socioøkonomiske virkninger af viruspandemien.Billige elektrokemiske biosensorer til nukleinsyrer kunne give en lovende potentiel løsning på dette udækkede behov.Mange af disse DNA-biosensorer fungerer ved, at komplementære DNA-strenge er immobiliserede på elektroden overflade og hybridiserer, når en matchende sekvens er til stede i prøven. Dette kan derefter omdannes til et signal ved hjælp af forskellige elektrokemiske teknikker ved hjælp af redoxmediatorer såsom kaliumjern/ferrocyanid. Methylenblåt (MB) er et sådant redoxaktivt molekyle, som har blevet rapporteret at interkalere til dobbeltstrenget DNA (dsDNA) ud over dets mere uspecifikke binding til enkeltstrenget DNA5,6. MBs interkalerende natur til at danne MB-DNA-komplekser gør dem til et populært valg som redoxmediatorer i flere elektrokemiske DNA sensorkonfigurationer5,6,7,8,9. Selvom interkalationen af MB til DNA er uspecifik, og specificiteten af denne elektrokemiske sensor i høj grad afhænger af renheden af de primere, der bruges til PCR eller isotermisk amplifikation, er den velegnet til implementering af ægte -tid elektrokemisk-baseret qPCR eller fluorescens isotermisk amplifikation som et alternativ til DNA-koncentrationsmåling 9. I en sådan implementering blev Won et al. Overfladen af guldelektroder modificeret med 6-mercapto-1-hexanol (MCH) i realtid måling af PCR-amplikoner med MB ved hjælp af differentiel pulsvoltammetri (DPV)9.I andre tilfælde har Ramirez et al. Detektion af SARS-CoV-2 i spildevand ved RT-LAMP-reaktion ved brug af MB med screentrykte elektroder.Platinelektroder er også blevet anvendes som in situ-elektroder i en mikrofluidisk PCR-platform designet til elektrokemisk at detektere amplikoner under reaktioner 8. Alle disse undersøgelser kræver overflademodifikation af elektroderne, hvilket indebærer øgede produktions- og driftsomkostninger på grund af særlige opbevaringskrav til stabiliteten af disse funktionaliserede elektroder.
Skematisk over arbejdsgangen for elektrokemisk påvisning af amplikoner opnået fra koncentrerede virale partikler i søvandsprøver.
Vi har for nylig demonstreret elektrokemisk sensing af SARS-CoV-2-amplikoner med billige printkort (PCB)-elektroder baseret på DPV og cyklisk voltammetri (CV) induceret af adsorption af MB-DNA-komplekser på overfladen af umodificerede elektroder) ændringer i peak nuværende11.Vi rapporterer, at længere DNA-fragmenter (N1-N2, \({943}\, \hbox) dannet ved hjælp af de CDC-anbefalede N1-forlæns- og N2-reverse-primere sammenlignet med kortere fragmenter {bp}\)) viste bedre linearitet i sensorresponsen ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) dannet ved brug af N1 fremadgående og N1 reverse primersæt. Disse undersøgelser er rapporteret ved brug af DNA-fortyndinger fremstillet i nukleasefrit vand. Platformen blev også brugt til at detektere SARS-CoV -2 amplikoner i simulerede spildevandsprøver (opnået ved at spike samlede RNA-prøver med SARS-CoV-2 RNA). Da RNA er modtagelig for forskydning under isolering og nedstrømsbehandling,12,13 er det vanskeligt at amplificere længere fragmenter med denne heterogene prøve. Derfor er demonstrationen af elektrokemisk sensing af SARS-CoV-2 amplikon i spildevand begrænset til det kortere \(72\,\hbox {bp}\) N1-fragment.
I dette arbejde undersøgte vi gennemførligheden af ENIG PCB-baseret elektrokemisk sensing af fag Phi6 koncentreret og isoleret fra søvandsprøver (fig. 1). Phi6-fager er sammenlignelige i størrelse (80-100 nm) med SARS-CoV-2 og har også en lipidmembran og et spidsprotein. Af disse grunde er bakteriofag Phi6 et populært surrogat for SARS-CoV-2 og andre indkapslede patogene RNA-vira14,15. RNA isoleret fra fagpartikler blev brugt som skabelon for cDNA-syntese efterfulgt af PCR for at opnå to DNA-fragmenter på 117 og 503 basepar i længden. I betragtning af udfordringen med at amplificere \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2-fragmenter i vores tidligere arbejde, målretter vi mod fragmenter med mellemlængde (\(117) \,\hbox {bp}\) og \(503 \,\hbox {bp}\)), baseret på tilgængelige primere. Den elektrokemiske sensorrespons blev systematisk undersøgt over et bredt koncentrationsområde (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) til \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\))) For begge fragmenter i tilstedeværelsen af MB, saltets effekt på sensorresponsen er blevet karakteriseret og krydsvalideret ved spektrofotometriske målinger. De vigtigste bidrag fra dette arbejde er som følger:
DNA-fragmentlængde og tilstedeværelsen af salt i prøven påvirker i høj grad følsomheden.Vores resultater viser, at elektrokemisk aktivitet afhænger af forskellige mekanismer for interaktionen mellem MB, DNA og sensoren i den voltammetriske respons, afhængig af DNA-koncentration og længde, med længere Fragmenter viser højere følsomhed, selvom salt har en negativ effekt på elektrostatiske interaktioner mellem MB og DNA.
DNA-koncentration bestemmer mekanismen for MB-DNA-interaktion i umodificerede elektroder. Vi demonstrerer, at forskellige mekanismer for MB-DNA-interaktion afhænger af DNA-koncentration. Ved DNA-koncentrationer under en lille mængde \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox) {l}}}\), observerede vi, at det elektrokemiske strømrespons hovedsageligt blev bestemt af adsorptionen af MB-DNA på elektroden, mens ved lavere koncentrationer Ved høje DNA-koncentrationer blev det elektrokemiske strømrespons bestemt af den steriske inhibering af redox aktivitet på grund af MB-insertion mellem DNA-basepar.
ENIG PCB-baseret elektrokemisk sensing af virale nukleinsyrer i søvandsprøver Observationerne blev valideret ved elektrokemisk påvisning af Phi6-tilsat \(503\,\hbox {bp}\) DNA-fragmenter opnået fra vandprøver fra Powai Lake, IIT Mumbai Campus Resultat fag.
Lave omkostninger ved implementering og potentiale for integration i fuldt automatiserede overvågningssystemer, oligonukleotider eller aptamerer på elektroder med længere holdbarhed.
Phage Phi6 er et indkapslet dsRNA-virus af Cytoviridae-familien, der inficerer Pseudomonas syringae. Genomet af Phi6-fag eksisterer i form af 3 fragmenter: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) og L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Da Phi6-fagen inficerer en ikke-patogen BSL-1 Pseudomonas-stamme, er den sikker at bruge og kan nemt dyrkes i laboratoriet.Phage Phi6 og dens vært Pseudomonas syringae blev købt fra Felix d'Herelle Reference Center for Bacterial Viruses, Laval University, Canada (referencecenterets katalognumre er henholdsvis HER-102 og HER-1102) .Phi6-fag og dens vært blev genoplivet som anvist af referencecentret.Phage Phi6 blev oprenset ved pladelyse og eluering for at opnå endelige titere med \(\ca. 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (plaquedannende enheder/milliliter).RNA blev isoleret fra oprensede fagpartikler ved brug af GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) i henhold til producentens instruktioner. Kort fortalt en oprenset fag Phi6-suspension\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) blev lyseret, og lysatet blev sat på en spin-søjle for at tillade RNA at binde til harpikskolonnen. RNA'et elueres derefter i elueringsopløsningen \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) leveret af sættet. Estimer koncentrationen af RNA ved absorbans ved \(260\,\hbox {nm}\).RNA blev opbevaret i aliquoter i \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) indtil videre brug.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA Synthesis Kit (Bio -Rad Laboratories) blev brugt som skabelon til cDNA-syntese efter producentens instruktioner. Kort fortalt består en cDNA-syntesereaktion af 3 trin: priming ved \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , omvendt transskription af \({20}\,{\hbox {min}}\) ved \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), og omvendt Optageren er i \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) i \({1}\,{\hbox {min. }}\).Når det blev kørt på en 1% agarosegel, viste cDNA'et tre bånd svarende til de forventede tre RNA-fragmenter (data ikke vist). Følgende primere blev brugt til at amplificere to DNA-fragmenter med en længde på 117 og 503 bp, ved at bruge cDNA som skabelon til PCR i en miniPCR® mini8 termisk cykler:
Primerne for \(117\,\hbox {bp}\) og \(503\,\hbox {bp}\) svarer til henholdsvis 1476-1575 nukleotider af M-segmentet og 458-943 nukleotider af L-segmentet syre Alle amplificerede PCR-produkter blev underkastet elektroforese på 1 % agarosegeler, og amplificeret mål-DNA blev oprenset ved anvendelse af GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
En sø på IIT Mumbai campus (Powai Lake, Powai, Mumbai) blev brugt til at tilføje fagpartikler. Søvandet blev filtreret gennem en \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) membran for at fjerne suspenderede partikler, og derefter blev Phi6-fagen tilføjet. Tilføj \({1}\,{\hbox {ml}}\) af \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) til \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) filtreret søvand, i \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). En lille alikvot blev forbeholdt viral belastningsmåling ved plakassay. Vi testede to forskellige metoder til at koncentrere spidsede Phi6-viruspartikler: (1) aluminiumhydroxidadsorptions-udfældningsmetoden19, som er blevet valideret for koncentrationen af adskillige indkapslede RNA-vira fra miljøprøver, og (2) ) Den polyethylenglycol (PEG)-baserede viruskoncentrationsmetode blev tilpasset fra Flood et al.20. Da genvindingseffektiviteten af den PEG-baserede metode viste sig at være bedre end den for aluminiumhydroxidmetoden, blev den PEG-baserede metode brugt til at koncentrere Phi6-partikler fra søvandsprøver.
Den anvendte PEG-metode var som følger: PEG 8000 og \(\hbox {NaCl}\) blev tilsat til Phi6-piggede søvandsprøver for at opnå 8 % PEG 8000 og \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\). Prøver blev inkuberet på en shaker\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), derefter centrifugeret ved \(4700 \,\hbox {g}\) er \({45}\,{\hbox {min}}\). Kassér supernatanten og resuspender pelleten i \({1}\, {\hbox {ml}}\) i den samme supernatant. Alle spiking- og viruskoncentrationseksperimenter blev udført i tre eksemplarer. Efter koncentration blev en lille aliquot reserveret til måling af genvindingseffektivitet ved plakassay. RNA blev isoleret som tidligere beskrevet og elueret i kit-leveret elueringsbuffer\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Da RNA-koncentrationen vil variere fra prøve til prøve i tre eksemplarer, vil \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) af RNA bruges til alle tre uanset dets koncentration cDNA-syntese af prøver.cDNA-syntese blev udført som tidligere beskrevet.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA blev brugt som skabelon for \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR i 35 cyklusser for at forstærke \ (117\,\hbox {bp}\) og \(503\,\hbox { bp}\) fragmenter. Disse prøver er repræsenteret som "1:1", dvs. uden fortynding. En no-template kontrol (NTC) blev sat op som en negativ kontrol, mens et cDNA syntetiseret ved hjælp af RNA isoleret fra oprenset fag blev sat op som skabelon for en positiv kontrol (PC). Kvantitativ PCR (qPCR) blev udført i et Stratagene Mx3000P RT-PCR instrument under anvendelse af Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Reaktioner blev sat op i tre eksemplarer som tidligere beskrevet. Cyklustærsklen (Ct) blev registreret for alle prøver. Derudover var de fortyndede prøver \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) under anvendelse af cDNA fortyndet 1:100 i filtreret søvand som \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR i 35 cyklusser. Disse prøver er repræsenteret som “1:100″.
PCB-elektroderne er fremstillet ved hjælp af en kommercielt tilgængelig lavpris Electroless Nickel Immersion Gold-proces (ENIG) uden behov for yderligere guldbelægning.ENIG PCB-elektrodespecifikationer er detaljerede i vores tidligere arbejde11.For ENIG PCB-elektroder, traditionelle elektroderensningsmetoder som f.eks. piranha opløsning eller svovlsyre cyklisk voltammetri anbefales ikke, da de kan forårsage afskalning af det tynde guldlag (tykkelse \(\ca.\) \(100\,\hbox {nm }\)) og blotlægge de underliggende kobberlag, der er tilbøjelige til korrosion 21, 22, 23, 24, 25. Rengør derfor elektroderne med en fnugfri klud fugtet med IPA. Prøven, der skulle testes, blev inkuberet med \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB i \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) for nem indsættelse. I vores tidligere arbejde , observerede vi, at sensorens følsomhed og linearitet blev forbedret ved at øge MB-koncentrationen 11 . Baseret på optimeringer rapporteret i vores tidligere arbejde brugte vi \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB koncentrationer for at indlejre DNA i denne undersøgelse. Elektrokemisk påvisning af dobbeltstrenget DNA (ds-DNA) kan opnås ved hjælp af anioniske eller kationiske interkalatorer. Selvom anioniske interkalatorer detekterer DNA med bedre selektivitet, kræver de inkubation natten over, hvilket resulterer i længere detektionstider. på den anden side kræver kationiske interkalatorer såsom MB kortere inkubationstider, ca. \({1}\,{\hbox {h}}\) til elektrokemisk påvisning af ds-DNA6. Hver måling involverer dispensering af prøven, der skal testes på elektrode\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), derefter rengøres med en IPA-fugtet klud, før du fortsætter med endnu en prøve.én måling.Hver prøve blev testet på 5 forskellige elektroder, medmindre andet er angivet.DPV- og CV-målinger blev udført ved hjælp af en PalmSens Sensit Smart potentiostat, og PSTrace-software blev brugt til potentiostatkonfiguration og dataopsamling, inklusive spidsstrømberegninger. Følgende indstillinger er brugt. for DPV- og CV-målinger:
DPV: Ligevægtstid = \(8\,\hbox {s}\), Spændingstrin = \(3\,\hbox {mV}\), Pulsspænding = \(25\,\hbox {mV}\) , pulsvarighed = \(50\,\hbox {ms}\), scanningshastighed = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Ligevægtstid = \(8\,\hbox {s}\), Spændingstrin = \(3\,\hbox {mV}\), Sweep Rate = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Spidsstrømme opnået fra voltammogrammer af DNA kompleksbundet med \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV- og CV-voltammogrammer blev opnået på ENIG PCB-elektroder \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB kompleksbundet med DNA (i koncentrationer på 10–\({20}\,{\ hbox {ng) }/{\upmu \hbox {l}}}\) dvs. 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) for \(117\,\hbox {bp}\ ) og 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) for \(503\,\hbox {bp}\)).Repræsentative voltammogrammer er vist i figur S1 i Supplerende information.Figur 2 viser resultaterne af DPV- og CV-målinger (spidsstrøm) ved brug af gelrensede PCR-produkter.Sammenlignet med CV-målinger viser DPV-målinger højere følsomhed (strøm som funktion af DNA-koncentration), fordi de kapacitive baggrundsstrømme i CV-målinger skjuler faradaiske strømme 26. Dataene for hver boks i boxplotten indeholder målinger fra 5 elektroder. Alle målinger bruger det samme sæt elektroder for at undgå målefejl på grund af elektrode-til-elektrode variation. Vi observerede en stigende tendens i DPV og CV målte spidsstrømme for lavere koncentrationer af DNA , længere (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ sammenlignet med \(117) ) fragment. Dette er i overensstemmelse med den forventede tendens til elektrodeadsorption rapporteret i vores tidligere arbejde. adsorption af MB-DNA-komplekset letter ladningsoverførslen på elektroden, hvilket bidrager til stigningen af spidsstrømmen. Andre undersøgelser har vist effekten af oligonukleotidstørrelse og -sekvens på MB-DNA-interkalation27,28,29,30.Guaninen -cytosin (GC) indholdet af de to amplikoner (\(117\,\hbox {bp}\) og \(503\,\hbox {bp}\))) var ca. 50%, hvilket indikerer, at observationen. Forskellen skyldes til amplikonlængde.Men for højere DNA-koncentrationer (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), for \(503\,\hbox {bp} \) og \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) for \(117\,\hbox {bp}\)), observerer vi to forstærkninger. spidsstrømme af subs reduceres i både DPV- og CV-målinger. Dette skyldes, at MB mætter og interkalerer mellem basepar af DNA, hvilket resulterer i sterisk inhibering af redoxaktiviteten af den reducerbare gruppe i MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Salte til stede i PCR-masterblandinger interfererer med elektrostatiske interaktioner mellem MB og DNA, så ved at tilføje \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) med \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB gel-oprenset produkt for at studere effekten af salt på MB-DNA-interaktion. Som vist i figur 3 observerede vi, at for højere DNA-koncentrationer (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) og \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) for \(117\,\hbox {bp} \)), i DPV og CV Tilsætningen af salt påvirkede ikke målingerne signifikant (se figur S2 i Supplerende information for repræsentative voltammogrammer). lavere DNA-koncentrationer, reducerer tilsætningen af salt følsomheden i høj grad, hvilket ikke resulterer i nogen signifikant ændring i strøm med DNA-koncentrationen. Lignende negative effekter af salt på MB-DNA-interaktioner og interkalation er tidligere blevet rapporteret af andre forskere33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\)-kationer binder til DNA'ets negative fosfatrygrad og hindrer derved den elektrostatiske interaktion mellem MB og DNA. Ved højere DNA-koncentrationer resulterer sterisk inhibering af redoxaktive MB'er i lavere spidsstrømme, så elektrostatiske interaktioner påvirker ikke sensorresponsen væsentligt. Det centrale er, at denne biosensor er bedre egnet til at detektere højere DNA-koncentrationer (sjældent \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) eller højere), til fuldautomatisk behandling af miljømæssige vandprøver, hvor gelrensning af PCR-produkter muligvis ikke er mulig.
Areal under absorptionskurven for bølgelængdeområdet 600–700 \(\hbox {nm}\) for forskellige koncentrationer af DNA kompleksbundet med \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) med og uden salt (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) med og uden salt (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) DNA-koncentrationer svarende til \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB-prøver Ingen DNA.
For yderligere at verificere ovenstående resultater udførte vi optiske målinger ved hjælp af et UV/Vis spektrofotometer (Thermo Scientific Multiskan GO), prøverne \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) blev brugt til hver Måling.Absorptionssignaturen falder med stigende DNA-koncentration, som det kan ses af tendensen i området under absorptionskurven for bølgelængdeområdet \(600\,\hbox {nm}\) til \(700\,\hbox { nm}\), som vist i fig. 4 (absorptionsspektrum vist i fig. S3 i Supplerende information). For prøver med DNA-koncentrationer mindre end \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), var der ingen signifikant forskel i optagelse mellem DNA-holdige og MB-only prøver (for \(503\,\hbox {bp}\) og \(117\,\hbox {bp}\ ) længdefragmenter), hvilket indikerer fraværet af sterisk inhibering af redoxaktivt MB. Ved højere DNA-koncentrationer observerede vi et gradvist fald i absorbanssignalet og noterede et mindre fald i absorbans i nærvær af salt. Disse resultater blev tilskrevet molekylært interaktioner og sterisk hæmning med basestabling i DNA-hybrider. Vores resultater stemmer overens med rapporter i litteraturen om spektroskopiske undersøgelser af MB-DNA-interkalation, der forbinder hypokromaticitet med reducerede energiniveauer i \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) elektroniske overgange på grund af interkalation Lag 36, 37, 38.
Agarosegelelektroforese af fag Phi6: PCR-produkter med længden \(117\,\hbox {bp}\) og \(503\,\hbox {bp}\) fra søvandsprøver.M-DNA-markør;NTC-no-template kontrol, primere indeholdende tilsvarende amplikoner;PC positiv kontrol;1, 2, 3-ufortyndede (1:1) tilsatte søvandsprøver i tre eksemplarer. Et bånd er synligt ved \(\ca. 50\,\hbox {bp}\) på grund af ubrugte oligonukleotider i \(503\,\ hbox {bp}\) bane.
Vi evaluerede anvendeligheden af sensoren ved hjælp af Powai Lake-vandprøver tilsat Phi6-fag. RNA-koncentrationerne isoleret fra fag-spikede vandprøver varierede fra 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), mens dem, der er isoleret fra oprensede fagsuspensioner. RNA'et blev estimeret til at være \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) med en genvindingseffektivitet på ca. %.RNA blev omvendt transskriberet til cDNA og brugt som skabelon for PCR og qPCR. Produktstørrelse blev bekræftet ved agarosegelelektroforese (figur 5) før testning med sensoren. Disse prøver er ikke gelrensede og indeholder derfor alle PCR-komponenter som samt amplikonerne af interesse. Ct-værdierne registreret under qPCR (tabel 1) viste sig at korrelere med koncentrationen af RNA isoleret fra de tilsvarende spikede vandprøver. Ct-værdien afslører antallet af cyklusser, der kræves for at det fluorescerende signal skal overskrider tærsklen eller baggrundssignalet. Højere Ct-værdier indikerer lavere skabelonkoncentrationer og omvendt. Ct-værdierne for NTC-prøverne var så høje som forventet. Forskellen i \(\ca. 3\) Ct-værdier mellem den positive kontrol og testprøven indikerer yderligere, at hver testprøve har ca. 1 % skabelon sammenlignet med den positive kontrol. Vi har tidligere diskuteret, at længere amplikoner fører til bedre følsomhed. Amplifikation af længere fragmenter isoleret fra heterogene miljøprøver er udfordrende i betragtning af ulemperne af lav viral koncentration og RNA-nedbrydning. Men med vores virusberigelse og PCR-amplifikationsprotokol var vi i stand til at amplificere \(503\,\hbox {bp}\)-fragmentet til elektrokemisk sensing.
Figur 6 viser de elektrokemiske sensorresultater af \(503\,\hbox {bp}\) fragmentamplikonet, både ved anvendelse af ufortyndet cDNA som skabelon (1:1) og 100 gange fortyndet cDNA som skabelon (1:100 ) udført PCR , sammenlignet med NTC og PC (se figur S4 i Supplerende information for repræsentative voltammogrammer). Hver boks i boxplotten i figur 6 indeholder målinger fra tre prøver ved 5 elektroder. De samme elektroder blev brugt til at måle alle prøver for at undgå fejl på grund af elektrode -til-elektrode variation. Sammenlignet med CV-målinger viser DPV-målinger bedre opløsning for at skelne test- og PC-prøver fra NTC'er, fordi Faradaic-strømme som tidligere nævnt er skjult på grund af kapacitive baggrundsstrømme i sidstnævnte. For længere amplikoner observerede vi, at den negative kontrol (NTC) resulterede i højere CV- og DPV-spidsstrømme i forhold til den positive kontrol, hvorimod positive og ufortyndede testprøver viste lignende tophøjder af DPV-spidsstrømme. De målte middelværdier og medianværdier for hver ufortyndet (1:1) ) testprøve og pc kan tydeligt opløses fra sensoroutputtet for NTC-prøven, mens opløsningen for den 1:100 fortyndede prøve er mindre udtalt. For en 100 gange fortynding af cDNA observerede vi ingen bånd under gelelektroforese (baner ikke vist i figur 5), og de tilsvarende DPV- og CV-spidsstrømme svarede til dem, der forventedes for NTC. Resultaterne for \(117\,\hbox {bp}\)-fragmentet er vist i Supplerende Information. Det negative kontrol inducerede en elektrokemisk respons fra PCB-sensoren på grund af adsorptionen af frit MB på elektroden og interaktionen af MB med det enkeltstrengede primer-oligonukleotid. Hver gang en prøve testes, skal der derfor køres en negativ kontrol og spidsstrøm af testprøven sammenlignet med spidsstrøm opnået af den negative kontrol for at opnå en differentiel (relativ) måling39,40 for at klassificere testprøven som positiv eller negativ.
(a) DPV og (b) CV-spidsstrøm til elektrokemisk påvisning af \(503\,\hbox {bp}\) fragmenter i søvandsprøver. Testprøver blev målt i tre eksemplarer og sammenlignet med ingen skabelonkontroller (NTC) og positive kontroller (PC).
Vores resultater illustrerer forskellige mekanismer, der påvirker ydeevnen af elektrokemiske sensorer for amplikoner af forskellig længde for forskellige DNA'er, med koncentrationer verificeret ved optiske målinger ved hjælp af et UV/Vis-spektrofotometer. Vores observationer understreger indsigten i, at længere DNA-fragmenter op til \(\ca.\) \(500\,\hbox {bp}\) kan påvises med højere følsomhed, og at tilstedeværelsen af salt i prøven ikke betyder følsomhed DNA-koncentration, der påvirker højere følsomhed (sjældent \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) og derover). Derudover undersøgte vi effekten af forskellige typer prøver, herunder gelrensede amplikoner med og uden tilsat salt, og tilsætning af søvandsprøver i DPV- og CV-målinger.Vi observerede, at DPV gav bedre opløsning, da den kapacitive baggrundsstrøm også påvirker CV-målingen, hvilket gør den mindre følsom.
Amplifikation af længere fragmenter afhænger af integriteten af det virale genomiske RNA. Adskillige undersøgelser har vist, at amplifikation af længere fragmenter ikke altid er effektiv på grund af nedbrydning af RNA i miljøet og potentialet for splejsning under isolation11,41,42,43,44 .Vi observerede, at den PEG-baserede viruskoncentrationsmetode var mere effektiv til at koncentrere fag Phi-6 tilsat i søvandsprøver end den aluminiumhydroxidbaserede viruskoncentrationsmetode. Evnen til at påvise lange DNA-fragmenter viste sig at overvinde kravet om multipleks PCR at amplificere flere kortere længde skabeloner og reducere muligheden for krydsspecificitet.
Biologiske prøver er knappe, så der er behov for at designe en biosensor, der kræver minimale prøver til testning. ENIG PCB-elektroderne brugt i denne undersøgelse krævede kun \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) prøver til test for at dække det effektive område af elektroderne.Derudover kan den samme elektrode genbruges efter rengøring, før den næste prøve dispenseres.Forstærkede prøver kræver ikke tilsætning af andre kemikalier end methylenblåt, hvilket er en billig pris og almindeligt anvendt kemikalie. Da hver elektrode koster omkring $0,55 (eller INR 40) at fremstille, kan denne biosensor være et omkostningseffektivt alternativ til eksisterende detektionsteknologier.Tabel 2 viser en sammenligning af dette arbejde med andre sensorer, der er rapporteret i litteraturen i lang tid. DNA-fragmenter i heterogene prøver.
I betragtning af at MB-baserede elektrokemiske detektionsprotokoller er afhængige af PCR's specificitet, er en væsentlig begrænsning ved denne metode potentialet for ikke-specifik amplifikation i heterogene prøver såsom spildevand og søvand eller ved brug af lavrenhedsprimere. For at forbedre følsomheden af elektrokemiske detektionsmetoder til DNA-detektion af urensede PCR-produkter ved hjælp af umodificerede ENIG PCB-elektroder, er det nødvendigt at bedre forstå fejl introduceret af ubrugte dNTP'er og primere, og at optimere reaktionsbetingelser og assayprotokoller.Yderligere fysisk-kemiske parametre såsom pH, temperatur og biologiske iltbehovet (BOD) for vandprøven skal muligvis også måles for at forbedre målingens nøjagtighed.
Som konklusion foreslår vi en billig elektrokemisk ENIG PCB-sensor til virusdetektion i miljøprøver (søvand). I modsætning til immobiliserede oligonukleotidelektroder eller brugerdefinerede substrater til DNA-sensing, der kræver kryogen opbevaring for at opretholde følsomheden,53,54 bruger vores teknik umodificeret PCB elektroder med længere holdbarhed og ingen specifikke opbevaringskrav og derfor velegnet til udvikling af måleløsninger med automatiseret prøvebehandling indsat i LMIC'er. Biosensoren anvender billige DNA-interkalerende redoxfarvestoffer (MB) til hurtig detektion af målamplikoner. Den uspecifikke amplifikation almindelig i miljøprøver reducerer specificiteten af denne sensingmetode på grund af den uspecifikke binding af MB'er til enkelt- og dobbeltstrengede oligonukleotider. Derfor afhænger denne tests specificitet af optimeringen af primere og PCR-reaktionsbetingelser. og DPV-spidsstrømme opnået fra de testede prøver skal fortolkes i forhold til svarene opnået fra den negative kontrol (NTC) for hver test. De elektrokemiske sensordesign og metoder præsenteret i dette arbejde kan integreres med autosamplere for at udvikle en fuldautomatisk og lav -omkostningsløsning, der kan indsamle og analysere prøver og trådløst sende resultater tilbage til laboratoriet.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Metoder til initial koncentration af vira fra vandprøver: en gennemgang og meta-analyse af nyere undersøgelser.J.Application.microorganism.115, s. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Vandbårne vira: Barrierer for sikkert drikkevand. PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Spildevandsepidemiologi til omkostningseffektiv storstilet overvågning af COVID-19 i lav- og mellemindkomstlande: udfordringer og muligheder. Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427-3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylenblåt som en elektrokemisk diskriminator af enkelt- og dobbeltstrengede oligonukleotider immobiliseret på guldsubstrater.Analyst 126, 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Sammenligning af kation- og anioninterkalatorer til elektrokemisk transduktion af DNA-hybridisering ved langrækkende elektronoverførsel.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Ladningsoverførsel gennem DNA: en selektiv elektrokemisk DNA-biosensor.anus.Chemical.78, 2138-2144 (2006).
Fang, TH et al. Realtids PCR-mikrofluidisk enhed med samtidig elektrokemisk detektion.biologisk sensor.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. Signalmekanismeundersøgelse og ydeevneverifikation af et elektrokemisk real-time PCR-system baseret på interaktionen af methylenblåt med DNA.Analyst 136, 1573-1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al. Loop-medieret isotermisk amplifikationsbaseret elektrokemisk sensor til påvisning af sars-cov-2 i spildevandsprøver.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al. Elektrokemisk sensing af SARS-CoV-2-amplikoner med PCB-elektroder. Sensoren er aktiveret.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Effektiv påvisning af SARS-CoV-2 RNA i den faste fraktion af spildevand.videnskab.generelt miljø.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Analytical Methods for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Overlevelse af den indkapslede bakteriofag Phi6 (et surrogat for SARS-CoV-2) i fordampede spytdråber aflejret på glasoverflader.videnskab.Rep.10, 1-10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Miljømæssig persistens af et SARS-CoV-2-surrogat (Phi6) i fritlevende amøber.J.Vandsundhed 20, 83 (2021).
Mindich, L. Præcis pakning af tre genomiske fragmenter af dobbeltstrenget RNA-bakteriofag\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149-160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Sekundær struktur af DH RNA-fagen\(\varphi\)6-pakningsregionen.RNA 6, 880-889 (2000).
Bonilla, N. et al. Phages on the Tap – En hurtig og effektiv protokol til fremstilling af laboratoriebestande af bakteriofager. PeerJ 4, e2261 (2016).
Indlægstid: 27. maj 2022