Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка за CSS. За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да изключите режима на съвместимост в Internet Explorer). Междувременно, за да сте сигурни продължителна поддръжка, ние ще покажем сайта без стилове и JavaScript.
Значението на мониторинга на пробите от околната среда беше високо оценено от началото на пандемията от COVID-19 и някои усилия за мониторинг се извършват с помощта на златния стандарт, въпреки че базираните на qPCR техники са скъпи. Електрохимичните ДНК биосензори биха могли да осигурят потенциално рентабилен решение за мониторинг на водни проби от околната среда в страни с ниски и средни доходи. В тази работа ние демонстрираме електрохимичното откриване на ампликони, получени от фаг Phi6, изолиран от проби от езерна вода с шипове (популярен заместител на SARS-CoV-2), използвайки ENIG за завършване на електроди за печатни платки без модификация на повърхността.секс. Електрохимичният сензорен отговор беше подробно характеризиран за два ДНК фрагмента с различни дължини (\({117}\,\hbox {bp}\) и \({503}\,\hbox {bp}\)), и ефект на соли в PCR главни смеси върху метиленово синьо (MB)-ДНК взаимодействия. Нашите резултати показват, че дължината на ДНК фрагментите значително определя електрохимичната чувствителност и демонстрират в тази работа, че способността за откриване на дълги ампликони без пречистване с гел на PCR продукти е важно за измерване на място на водни проби.Напълно автоматизирано решение за вирусен товар предвещава добро.
Предаването на вируси по воден път е известно като опасност за общественото здраве от 40-те години на миналия век, с първите доказателства за предаване на полиомиелит и хепатит E1 по воден път. Световната здравна организация (СЗО) е класифицирала няколко вирусни патогена по воден път с умерено до високо значение за здравето2. Традиционен вирус методите за откриване разчитат на базирани на златен стандарт qPCR техники, които са силно чувствителни и специфични, но изискват квалифициран персонал за тестване в лабораторията с помощта на скъпи инструменти. Въпреки това, в страните с ниски и средни доходи (LMIC) с ограничени ресурси, човешки изпитването на проби вероятно ще има предимство пред мониторинга на водни проби в околната среда. Следователно са необходими алтернативни евтини методи за устойчиво наблюдение в реално време на проби от вода и отпадъчни води в страните с ниски и средни доходи като ранни предупреждения за възникващи епидемии от болести, като по този начин ги предпазва от тежките социално-икономически въздействия на вирусната пандемия. Евтините електрохимични биосензори за нуклеинови киселини биха могли да осигурят обещаващо потенциално решение на тази неудовлетворена нужда. Много от тези ДНК биосензори работят благодарение на факта, че комплементарните ДНК вериги са имобилизирани върху електрода повърхност и хибридизират, когато в пробата присъства съвпадаща последователност. След това това може да се преобразува в сигнал чрез различни електрохимични техники, използващи редокс медиатори като калиево желязо/фероцианид. Метиленовото синьо (MB) е една такава редокс-активна молекула, която има се съобщава, че се интеркалират в двойноверижна ДНК (dsDNA) в допълнение към по-неспецифичното си свързване с едноверижна ДНК5,6. Интеркалиращият характер на MBs за образуване на MB-DNA комплекси ги прави популярен избор като редокс медиатори в няколко електрохимични ДНК сензорни конфигурации 5,6,7,8,9. Въпреки че интеркалирането на MB към ДНК е неспецифично и специфичността на този електрохимичен сензор зависи до голяма степен от чистотата на праймерите, използвани за PCR или изотермична амплификация, той е много подходящ за прилагане на реални електрохимично базирана qPCR или флуоресцентна изотермична амплификация като алтернатива на измерването на концентрацията на ДНК 9. В едно такова изпълнение, Won et al. Повърхността на златните електроди беше модифицирана с 6-меркапто-1-хексанол (MCH) за реално време измерване на PCR ампликони с MB с помощта на диференциална импулсна волтаметрия (DPV)9. В други случаи Ramirez et al. Откриване на SARS-CoV-2 в отпадъчни води чрез реакция RT-LAMP с използване на MB със ситопечатни електроди. Платинените електроди също са били използвани като in situ електроди в микрофлуидна PCR платформа, предназначена за електрохимично откриване на ампликони по време на реакции 8. Всички тези изследвания изискват повърхностна модификация на електродите, което предполага повишени производствени и оперативни разходи поради специални изисквания за съхранение за стабилността на тези функционализирани електроди.
Схема на работния процес за електрохимично откриване на ампликони, получени от концентрирани вирусни частици в проби от езерна вода.
Наскоро демонстрирахме електрохимично отчитане на SARS-CoV-2 ампликони с евтини електроди за печатни платки (PCB) на базата на DPV и циклична волтаметрия (CV), индуцирани от адсорбция на MB-DNA комплекси върху повърхността на немодифицирани електроди) промени в пика ток11.Докладваме, че по-дългите ДНК фрагменти (N1-N2, \({943}\, \hbox), образувани с помощта на препоръчаните от CDC N1 предни и N2 обратни праймери в сравнение с по-късите фрагменти {bp}\)) показват по-добра линейност в реакцията на сензора ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)), образуван с помощта на комплекти праймери N1 напред и N1 обратен. Тези изследвания са докладвани с използване на разреждания на ДНК, приготвени във вода без нуклеаза. Платформата е използвана и за откриване на SARS-CoV -2 ампликона в симулирани проби от отпадъчни води (получени чрез добавяне на общи РНК проби с SARS-CoV-2 РНК). Тъй като РНК е податлива на срязване по време на изолиране и обработка надолу по веригата,12,13 е трудно да се усилят по-дълги фрагменти с тази хетерогенна проба. Следователно демонстрацията на електрохимично отчитане на ампликона SARS-CoV-2 в отпадъчни води е ограничена до по-късия \(72\,\hbox {bp}\) N1 фрагмент.
В тази работа изследвахме осъществимостта на базирано на ENIG PCB електрохимично отчитане на фаг Phi6, концентриран и изолиран от проби от езерна вода (фиг. 1). Фагите Phi6 са сравними по размер (80-100 nm) със SARS-CoV-2 и също имат липидна мембрана и шипов протеин. Поради тези причини бактериофагът Phi6 е популярен сурогат за SARS-CoV-2 и други патогенни РНК вируси с обвивка 14,15. РНК, изолирана от фагови частици, се използва като матрица за синтез на кДНК, последвана от PCR за получаване на два ДНК фрагмента с дължина 117 и 503 базови двойки. Предвид предизвикателството за амплифициране на \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 фрагменти в предишната ни работа, ние се насочваме към фрагменти с междинна дължина (\(117 \,\hbox {bp}\) и \(503 \,\hbox {bp}\)), въз основа на наличните праймери. Отговорът на електрохимичния сензор е систематично изследван в широк диапазон на концентрация (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) до \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) За двата фрагмента в присъствието на MB, ефектът на солта върху реакцията на сензора е характеризиран и кръстосано потвърден чрез спектрофотометрични измервания. Основните приноси на тази работа са както следва:
Дължината на ДНК фрагмента и наличието на сол в пробата оказват силно влияние върху чувствителността.Нашите резултати показват, че електрохимичната активност зависи от различни механизми на взаимодействие на MB, ДНК и сензора във волтаметричния отговор, в зависимост от концентрацията и дължината на ДНК, като по-дългите фрагменти показват по-висока чувствителност, въпреки че солта има отрицателен ефект върху електростатичните взаимодействия между MB и ДНК.
Концентрацията на ДНК определя механизма на взаимодействие МВ-ДНК в немодифицирани електроди Ние демонстрираме, че различните механизми на взаимодействие МВ-ДНК зависят от концентрацията на ДНК. При концентрации на ДНК под малко количество \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), наблюдавахме, че отговорът на електрохимичния ток се определя главно от адсорбцията на MB-ДНК върху електрода, докато при по-ниски концентрации При високи концентрации на ДНК, отговорът на електрохимичния ток се определя от пространственото инхибиране на редокс активност, дължаща се на вмъкване на MB между двойки ДНК бази.
ENIG PCB-базирано електрохимично отчитане на вирусни нуклеинови киселини в езерни водни проби Наблюденията бяха валидирани чрез електрохимично откриване на Phi6-добавени \(503\,\hbox {bp}\) ДНК фрагменти, получени от водни проби от Powai Lake, IIT Mumbai Campus Резултат фаг.
Ниска цена на внедряване и потенциал за интегриране в напълно автоматизирани системи за мониторинг, олигонуклеотиди или аптамери върху електроди с по-дълъг срок на годност.
Фаг Phi6 е dsRNA вирус с обвивка от семейство Cytoviridae, който инфектира Pseudomonas syringae. Геномът на фага Phi6 съществува под формата на 3 фрагмента: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07 \,\hbox {Kb}\)) и L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Тъй като Phi6 фагът заразява непатогенен щам BSL-1 Pseudomonas, той е безопасен за употреба и могат лесно да се отглеждат в лаборатория. Phage Phi6 и неговият гостоприемник Pseudomonas syringae са закупени от референтния център за бактериални вируси Felix d'Herelle, университета Laval, Канада (каталожните номера на референтния център са съответно HER-102 и HER-1102) Фагът .Phi6 и неговият гостоприемник бяха съживени, както е указано от референтния център. Фагът Phi6 беше пречистен чрез лизиране на плака и елуиране, за да се получат крайни титри с \(\около 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (плакообразуващи единици/милилитри). РНК се изолира от пречистени фагови частици с помощта на GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) съгласно инструкциите на производителя. Накратко, пречистена фагова Phi6 суспензия\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) се лизира и лизатът се зарежда в въртяща се колона, за да позволи на РНК да се свърже с колоната със смола. След това РНК се елуира в елуиращия разтвор \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), осигурен от комплекта. Оценете концентрацията на РНК чрез абсорбция при \(260\,\hbox {nm}\). РНК се съхранява на аликвотни части в \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) до по-нататъшна употреба.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA Synthesis Kit (Био -Rad Laboratories) се използва като матрица за синтез на cDNA, следвайки инструкциите на производителя. Накратко, реакцията на синтез на cDNA се състои от 3 стъпки: праймиране при \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\), обратна транскрипция на \({20}\,{\hbox {min}}\) в \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) и обратно Рекордерът е в \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) за \({1}\,{\hbox {min }}\). Когато се използва върху 1% агарозен гел, cDNA показа три ленти, съответстващи на очакваните три РНК фрагмента (данните не са показани). Следните праймери бяха използвани за амплифициране на два ДНК фрагмента с дължина 117 и 503 bp, използване на cDNA като шаблон за PCR в miniPCR® mini8 термичен цикъл:
Праймерите за \(117\,\hbox {bp}\) и \(503\,\hbox {bp}\) съответстват на 1476-1575 нуклеотида от М сегмента и 458-943 нуклеотида от L сегмента, съответно киселина Всички амплифицирани PCR продукти бяха подложени на електрофореза върху 1% агарозни гелове и амплифицираната целева ДНК беше пречистена с помощта на GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
Езеро в кампуса на IIT в Мумбай (Powai Lake, Powai, Mumbai) беше използвано за добавяне на фагови частици. Водата на езерото беше филтрирана през \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) мембрана за отстраняване суспендирани частици и след това беше добавен фаг Phi6. Добавете \({1}\,{\hbox {ml}}\) от \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) към \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) филтрирана езерна вода, в \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Малка аликвотна част беше запазени за измерване на вирусния товар чрез анализ на плака. Тествахме два различни метода за концентриране на частици от вирус Phi6 с шипове: (1) метод на адсорбция-утаяване на алуминиев хидроксид,19 който е валидиран за концентрацията на няколко обвити РНК вируси от проби от околната среда, и (2) ) Базираният на полиетилен гликол (PEG) метод за концентриране на вируса е адаптиран от Flood et al.20. Тъй като беше установено, че ефективността на възстановяване на метода, базиран на PEG, е по-добър от този на метода с алуминиев хидроксид, методът, базиран на PEG, беше използван за концентриране на частици Phi6 от проби от езерна вода.
Използваният PEG метод беше както следва: PEG 8000 и \(\hbox {NaCl}\) бяха добавени към проби от езерна вода с Phi6, за да се получи 8% PEG 8000 и \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\). Пробите се инкубират на шейкър\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), след което се центрофугира при \(4700 \,\hbox {g}\) е \({45}\,{\hbox {min}}\). Изхвърлете супернатантата и ресуспендирайте утайката в \({1}\, {\hbox {ml}}\) в същия супернатант. Всички експерименти за добавяне и концентрация на вируса бяха извършени в три екземпляра. След концентрирането беше запазена малка аликвотна част за измерване на ефективността на възстановяване чрез анализ на плака. РНК беше изолирана, както е описано по-горе, и елуирана в доставен от комплекта елуиращ буфер\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Тъй като концентрацията на РНК ще варира от проба до проба в три екземпляра, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) на РНК се използва и за трите, независимо от неговата концентрация cDNA синтез на проби. cDNA синтезът беше извършен, както е описано по-горе.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA беше използван като шаблон за \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR за 35 цикъла за амплифициране на \ (117\,\hbox {bp}\) и \(503\,\hbox { bp}\) фрагменти. Тези проби са представени като „1:1″, т.е. без разреждане. Като отрицателна контрола е настроена контрола без шаблон (NTC), докато е настроена сДНК, синтезирана с помощта на РНК, изолирана от пречистен фаг като шаблон за положителна контрола (PC). Количествената PCR (qPCR) беше извършена в Stratagene Mx3000P RT-PCR инструмент, използвайки Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Реакциите бяха настроени в три екземпляра, както преди описан. Прагът на цикъла (Ct) беше записан за всички проби. В допълнение, разредените проби бяха \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) с помощта на cDNA, разредена 1:100 във филтрирана езерна вода като \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR за 35 цикъла. Тези проби са представени като „1:100″.
Електродите за печатни платки се произвеждат с помощта на наличен в търговската мрежа евтин процес на безелектрическо потапяне на никелово злато (ENIG) без необходимост от допълнително позлатяване. Спецификациите на електродите на ENIG PCB са описани подробно в предишната ни работа11. За електродите ENIG PCB традиционните методи за почистване на електроди, като напр. не се препоръчва циклична волтаметрия с разтвор на пираня или сярна киселина, тъй като те могат да причинят отлепване на тънкия златен слой (дебелина \(\приблизително\) \(100\,\hbox {nm }\)) и да изложат подлежащите медни слоеве, които са предразположени до корозия 21, 22, 23, 24, 25. Следователно, почистете електродите с кърпа без власинки, навлажнена с IPA. Пробата за тестване беше инкубирана с \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB в \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) за лесно вмъкване. В предишната ни работа , ние забелязахме, че чувствителността и линейността на сензора са подобрени чрез увеличаване на MB концентрацията 11. Въз основа на оптимизациите, докладвани в нашата по-ранна работа, използвахме \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB концентрации за вграждане на ДНК в това изследване. Електрохимично откриване на двойноверижна ДНК (ds-ДНК) може да се постигне с помощта на анионни или катионни интеркалатори. Въпреки че анионните интеркалатори откриват ДНК с по-добра селективност, те изискват инкубация за една нощ, което води до по-дълги времена за откриване. от друга страна, катионните интеркалатори като MB изискват по-кратки времена на инкубация, приблизително \({1}\,{\hbox {h}}\) за електрохимично откриване на ds-DNA6. Всяко измерване включва дозиране на пробата за тестване върху електрод\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), след това почистване с парцал, навлажнен с IPA, преди да продължите с друга проба.едно измерване. Всяка проба беше тествана на 5 различни електрода, освен ако не е посочено друго. Измерванията на DPV и CV бяха извършени с помощта на потенциостат PalmSens Sensit Smart, а софтуерът PSTrace беше използван за конфигурация на потенциостата и събиране на данни, включително изчисления на пиков ток. Използват се следните настройки за DPV и CV измервания:
DPV: Време за равновесие = \(8\,\hbox {s}\), стъпка на напрежението = \(3\,\hbox {mV}\), импулсно напрежение = \(25\,\hbox {mV}\), продължителност на импулса = \(50\,\hbox {ms}\), скорост на сканиране = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Време за равновесие = \(8\,\hbox {s}\), стъпка на напрежение = \(3\,\hbox {mV}\), скорост на движение = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Пикови токове, получени от волтамограми на ДНК в комплекс с \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV и CV волтамограми са получени върху ENIG PCB електроди \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB, комплексирани с ДНК (при концентрации от 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) т.е. 0,13–\({0,26}\, {\upmu \hbox {M}}\) за \(117\,\hbox {bp}\ ) и 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) за \(503\,\hbox {bp}\)). Представителни волтамограми са показани на фигура S1 в допълнителна информация. Фигура 2 показва резултатите на DPV и CV измервания (пиков ток) с помощта на пречистени с гел PCR продукти. В сравнение с CV измерванията, DPV измерванията показват по-висока чувствителност (ток като функция на концентрацията на ДНК), тъй като фоновите капацитивни токове в CV измерванията крият фарадеевите токове 26. Данните за всяка кутия в boxplot съдържа измервания от 5 електрода. Всички измервания използват един и същ набор от електроди, за да се избегнат грешки в измерването, дължащи се на вариация между електродите. Наблюдавахме нарастваща тенденция в DPV и CV измерените пикови токове за по-ниски концентрации на ДНК , по-дълъг (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ в сравнение с \(117) ) фрагмент. Това е в съответствие с очакваната тенденция на електродна адсорбция, докладвана в предишната ни работа. адсорбцията на MB-DNA комплекса улеснява преноса на заряд върху електрода, което допринася за увеличаване на пиковия ток. Други проучвания показват ефекта на размера и последователността на олигонуклеотида върху интеркалирането на MB-DNA 27,28,29,30. Гуанинът -съдържанието на цитозин (GC) в двата ампликона (\(117\,\hbox {bp}\) и \(503\,\hbox {bp}\)) е приблизително 50%, което показва, че наблюдението Разликата се дължи към дължината на ампликона. Въпреки това, за по-високи концентрации на ДНК (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), за \(503\,\hbox {bp} \) и \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) за \(117\,\hbox {bp}\)), наблюдаваме две усилвания пиковите токове на подводниците са намалени както при DPV, така и при CV измервания. Това е така, защото MB се насища и интеркалира между базовите двойки на ДНК, което води до пространствено инхибиране на редокс активността на редуцируемата група в MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Солите, присъстващи в PCR главните смеси, пречат на електростатичните взаимодействия между MB и ДНК, така че чрез добавяне на \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) с \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB пречистен с гел продукт за изследване на ефекта на солта върху взаимодействието MB-ДНК. Както е показано на Фигура 3, наблюдавахме, че за по-високи концентрации на ДНК (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) и \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) за \(117\,\hbox {bp} \)), в DPV и CV Добавянето на сол не е повлияло значително на измерванията (вижте Фигура S2 в Допълнителна информация за представителни волтамограми). Въпреки това, при по-ниски концентрации на ДНК, добавянето на сол значително намалява чувствителността, което води до липса на значителна промяна в тока с концентрацията на ДНК. Подобни отрицателни ефекти на солта върху взаимодействията и интеркалирането на MB-DNA са докладвани по-рано от други изследователи33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) катиони се свързват с отрицателния фосфатен скелет на ДНК, като по този начин възпрепятстват електростатичното взаимодействие между МВ и ДНК. При по-високи концентрации на ДНК пространственото инхибиране на редокс-активни МВ води до по-ниски пикови токове, така че електростатичните взаимодействия не влияят значително на реакцията на сензора. Ключовият момент е, че този биосензор е по-подходящ за откриване на по-високи концентрации на ДНК (рядко \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) или по-високи), за напълно автоматизирана обработка на водни проби от околната среда, където гел пречистването на PCR продукти може да не е осъществимо.
Площ под кривата на поглъщане за диапазона на дължината на вълната 600–700 \(\hbox {nm}\) за различни концентрации на ДНК в комплекс с \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) със и без сол (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) със и без сол (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) ДНК концентрации, съответстващи на \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB проби Няма ДНК.
За по-нататъшна проверка на горните резултати, извършихме оптични измервания с помощта на UV/Vis спектрофотометър (Thermo Scientific Multiskan GO), пробите \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) бяха използвани за всеки Измерване. Сигнатурата на абсорбция намалява с увеличаване на концентрацията на ДНК, както може да се види от тенденцията на площта под кривата на абсорбция за диапазона на дължината на вълната \(600\,\hbox {nm}\) до \(700\,\hbox { nm}\), както е показано на Фиг. 4 (спектър на поглъщане, показан на Фиг. S3 в Допълнителна информация). За проби с концентрации на ДНК по-малки от \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), не е имало значителна разлика в поглъщането между проби, съдържащи ДНК и само MB (за \(503\,\hbox {bp}\) и \(117\,\hbox {bp}\ ) дължина на фрагменти), което показва липсата на пространствено инхибиране на редокс-активен МВ. При по-високи концентрации на ДНК наблюдаваме постепенно намаляване на абсорбционния сигнал и отбелязахме по-малко намаление на абсорбцията в присъствието на сол. Тези резултати се приписват на молекулно взаимодействия и пространствено инхибиране с натрупване на бази в ДНК хибриди. Нашите резултати са в съответствие с докладите в литературата за спектроскопски изследвания на интеркалиране на MB-ДНК, които свързват хипохроматичността с намалени енергийни нива в \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) електронни преходи, дължащи се на интеркалационни слоеве 36, 37, 38.
Агарозна гел електрофореза на фаг Phi6: PCR продукти с дължина \(117\,\hbox {bp}\) и \(503\,\hbox {bp}\) от проби от езерна вода. M-ДНК маркер;NTC-без шаблонна контрола, праймери, съдържащи съответните ампликони;PC положителна контрола;1, 2, 3-неразредени (1:1) проби от езерна вода в три екземпляра. Вижда се лента при \(\около 50\,\hbox {bp}\) поради неизползвани олигонуклеотиди в \(503\,\ hbox {bp}\) платно.
Ние оценихме полезността на сензора, като използвахме водни проби от езерото Powai, добавени с Phi6 фаг. Концентрациите на РНК, изолирани от добавени с фаги водни проби, варираха от 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), докато тези, изолирани от пречистени фагови суспензии, РНК се оценява на \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) с ефективност на възстановяване от приблизително 1 %.RNA беше обратно транскрибирана в cDNA и използвана като шаблон за PCR и qPCR. Размерът на продукта беше потвърден чрез електрофореза в агарозен гел (Фигура 5) преди тестването със сензора. Тези проби не са пречистени с гел и следователно съдържат всички компоненти на PCR като както и интересуващите ни ампликони. Показано е, че Ct стойностите, записани по време на qPCR (Таблица 1), корелират с концентрацията на РНК, изолирана от съответните водни проби с добавка. Ct стойността разкрива броя на циклите, необходими за флуоресцентния сигнал да надвишават прага или фоновия сигнал. По-високите стойности на Ct показват по-ниски концентрации на шаблона и обратно. Стойностите на Ct на пробите NTC са толкова високи, колкото се очаква. Разликата в \(\приблизително 3\) стойности на Ct между положителната контрола и тестовата проба допълнително показват, че всяка тестова проба има приблизително 1% шаблон в сравнение с положителната контрола. По-рано сме обсъждали, че по-дългите ампликони водят до по-добра чувствителност. Амплификацията на по-дълги фрагменти, изолирани от хетерогенни проби от околната среда, е предизвикателство предвид недостатъците на ниска вирусна концентрация и разграждане на РНК. Въпреки това, с нашето обогатяване на вируси и протокол за PCR амплификация, ние успяхме успешно да амплифицираме \(503\,\hbox {bp}\) фрагмента за електрохимично отчитане.
Фигура 6 показва резултатите от електрохимичния сензор на \(503\,\hbox {bp}\) фрагментен ампликон, като и двата използват неразредена cDNA като матрица (1:1) и 100-кратно разредена cDNA като матрица (1:100), извършена PCR , в сравнение с NTC и PC (вижте Фигура S4 в Допълнителна информация за представителни волтамограми). Всяка кутия в кутията на Фигура 6 съдържа измервания от три проби при 5 електрода. Същите електроди бяха използвани за измерване на всички проби, за да се избегнат грешки, дължащи се на електрода вариация -към електрод. В сравнение с CV измерванията, DPV измерванията показват по-добра разделителна способност за разграничаване на тестови и компютърни проби от NTC, тъй като, както беше споменато по-рано, фарадеевите токове са скрити поради фонови капацитивни токове в последните. За по-дълги ампликони наблюдавахме, че отрицателната контрола (NTC) доведе до по-високи CV и DPV пикови токове спрямо положителната контрола, докато положителните и неразредени тестови проби показаха подобни пикови височини на DPV пикови токове. Измерените средни и средни стойности за всеки неразреден (1:1) ) тестовата проба и PC могат да бъдат ясно разделени от изхода на сензора за NTC пробата, докато разделителната способност за разредената 1:100 проба е по-слабо изразена. За 100-кратно разреждане на cDNA не наблюдавахме никакви ивици по време на гел електрофореза (лентите не са показани на Фигура 5) и съответните DPV и CV пикови токове бяха подобни на очакваните за NTC. Резултатите за \(117\,\hbox {bp}\) фрагмента са показани в Допълнителна информация. Отрицателният контролът индуцира електрохимичен отговор от PCB сензора поради адсорбцията на свободен MB върху електрода и взаимодействието на MB с едноверижния праймер олигонуклеотид. Следователно, всеки път, когато се тества проба, трябва да се пусне отрицателна контрола и пиков ток на тестовата проба в сравнение с пиковия ток, получен от отрицателната контрола, за да се постигне диференциално (относително) измерване39,40 за класифициране на тестовата проба като положителна или отрицателна.
(a) DPV и (b) CV пиков ток за електрохимично откриване на \(503\,\hbox {bp}\) фрагменти в проби от езерна вода. Тестовите проби бяха измерени в три екземпляра и сравнени с контроли без шаблон (NTC) и положителни контроли (PC).
Нашите открития илюстрират различни механизми, влияещи върху работата на електрохимични сензори за ампликони с различна дължина за различни ДНК, с концентрации, проверени чрез оптични измервания с помощта на UV/Vis спектрофотометър. Нашите наблюдения подчертават прозрението, че по-дългите ДНК фрагменти до \(\приблизително\) \(500\,\hbox {bp}\) може да се открие с по-висока чувствителност и че наличието на сол в пробата не Чувствителност ДНК концентрация, която влияе върху по-високата чувствителност (рядко \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) и по-горе). В допълнение, ние изследвахме ефекта на различни типове проби, включително пречистени с гел ампликони с и без добавена сол и добавяне на проби от езерна вода при DPV и CV измервания.Забелязахме, че DPV осигурява по-добра разделителна способност, тъй като фоновият капацитивен ток също влияе върху измерването на CV, което го прави по-малко чувствителен.
Амплификацията на по-дълги фрагменти зависи от целостта на вирусната геномна РНК. Няколко проучвания показват, че амплификацията на по-дълги фрагменти не винаги е ефективна поради разграждането на РНК в околната среда и потенциала за сплайсинг по време на изолация11,41,42,43,44 .Наблюдавахме, че методът за концентрация на вируса, базиран на PEG, е по-ефективен при концентрирането на фаг Phi-6, добавен в проби от езерна вода, отколкото метода за концентрация на вирус, базиран на алуминиев хидроксид. Способността за откриване на дълги ДНК фрагменти доказа, че преодолява изискването за мултиплексна PCR за усилване на множество шаблони с по-къса дължина и намаляване на възможността за кръстосана специфичност.
Биологичните проби са оскъдни, така че е необходимо да се проектира биосензор, който изисква минимални проби за тестване. Електродите ENIG PCB, използвани в това изследване, изискват само \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) проби за тестване за покриване на ефективната площ на електродите. Освен това, същият електрод може да се използва повторно след почистване, преди да се разпредели следващата проба. Усилените проби не изискват добавяне на други химикали освен метиленово синьо, което е евтино и често използван химикал. Тъй като всеки електрод струва около $0,55 (или 40 INR) за производство, този биосензор може да бъде рентабилна алтернатива на съществуващите технологии за откриване. Таблица 2 показва сравнение на тази работа с други сензори, докладвани в литературата от дълго време ДНК фрагменти в хетерогенни проби.
Като се има предвид, че базираните на MB протоколи за електрохимично откриване разчитат на специфичността на PCR, основното ограничение на този метод е потенциалът за неспецифично усилване в хетерогенни проби като отпадъчни води и езерна вода или използване на праймери с ниска чистота. За подобряване на чувствителността на електрохимични методи за откриване на ДНК на непречистени PCR продукти, използващи немодифицирани ENIG PCB електроди, е необходимо да се разберат по-добре грешките, въведени от неизползваните dNTP и праймери, и да се оптимизират реакционните условия и протоколите за анализ. Допълнителни физикохимични параметри като pH, температура и биологични потреблението на кислород (БПК) на водната проба също може да се наложи да се измери, за да се подобри точността на измерването.
В заключение, ние предлагаме евтин електрохимичен ENIG PCB сензор за откриване на вируси в проби от околната среда (езерна вода). За разлика от имобилизирани олигонуклеотидни електроди или потребителски субстрати за ДНК сензори, които изискват криогенно съхранение, за да поддържат чувствителността,53,54 нашата техника използва немодифицирани PCB електроди с по-дълъг срок на годност и без специфични изисквания за съхранение и следователно подходящи за разработване на решения за измерване с автоматизирана обработка на проби, внедрена в LMIC. Биосензорът използва евтини ДНК-интеркалиращи редокс багрила (MB) за бързо откриване на целеви ампликони. Неспецифичното усилване често срещан в пробите от околната среда намалява специфичността на този сензорен метод поради неспецифичното свързване на МВ към едно- и двуверижни олигонуклеотиди. Следователно, специфичността на този тест зависи от оптимизирането на праймерите и условията на PCR реакцията. В допълнение, CV и DPV пиковите токове, получени от тестваните проби, трябва да се тълкуват по отношение на отговорите, получени от отрицателната контрола (NTC) за всеки тест. Електрохимичните сензорни проекти и методи, представени в тази работа, могат да бъдат интегрирани с автосамплери за разработване на напълно автоматизиран и нисък -ценово решение, което може да събира и анализира проби и безжично да предава резултатите обратно в лабораторията.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Методи за първоначална концентрация на вируси от водни проби: преглед и мета-анализ на скорошни проучвания. J.Application.microorganism.115, стр. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Водни вируси: Бариери пред безопасна питейна вода. PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Епидемиология на отпадъчните води за рентабилно широкомащабно наблюдение на COVID-19 в страни с ниски и средни доходи: предизвикателства и възможности. Вода 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Електрохимия на нуклеинова киселина. Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Метиленово синьо като електрохимичен дискриминатор на едноверижни и двойноверижни олигонуклеотиди, имобилизирани върху златни субстрати. Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Сравнение на катионни и анионни интеркалатори за електрохимична трансдукция на ДНК хибридизация чрез електронен трансфер на дълги разстояния.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Прехвърляне на заряд през ДНК: селективен електрохимичен ДНК биосензор.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al. PCR микрофлуидно устройство в реално време с едновременно електрохимично откриване. биологичен сензор. Bioelectronics. 24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. Изследване на сигнален механизъм и проверка на ефективността на електрохимична PCR система в реално време, базирана на взаимодействието на метиленово синьо с ДНК. Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al. Loop-медииран изотермичен електрохимичен сензор, базиран на усилване, за откриване на sars-cov-2 в проби от отпадъчни води.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al. Електрохимично отчитане на SARS-CoV-2 ампликони с PCB електроди. Сензорът е активиран. B Chemistry. 343, 130169 (2021).
Китамура, К., Садамасу, К., Мурамацу, М. и Йошида, Х. Ефективно откриване на РНК на SARS-CoV-2 в твърдата фракция на отпадъчни води.наука.обща среда.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al. Аналитични методи за откриване на SARS-CoV-2 в отпадъчни води: Протокол и бъдещи перспективи. TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Оцеляване на обвития бактериофаг Phi6 (сурогат на SARS-CoV-2) в изпарени капчици слюнка, отложени върху стъклени повърхности.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Екологична устойчивост на заместител на SARS-CoV-2 (Phi6) в свободно живееща амеба.J.Здраве на водата 20, 83 (2021).
Mindich, L. Прецизно опаковане на три геномни фрагмента от двойноверижна РНК бактериофаг\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Вторична структура на DH RNA фаг\(\varphi\)6 опаковъчен регион.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al. Phages on the Tap – Бърз и ефективен протокол за приготвяне на лабораторни запаси от бактериофаги. PeerJ 4, e2261 (2016).
Време на публикуване: 27 май 2022 г