Дзякуй за наведванне Nature.com. Версія браўзера, якую вы выкарыстоўваеце, мае абмежаваную падтрымку CSS. Для найлепшага вопыту мы рэкамендуем вам выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Тым часам, каб гарантаваць працяг падтрымкі, мы будзем адлюстроўваць сайт без стыляў і JavaScript.
Важнасць маніторынгу ўзораў навакольнага асяроддзя была высока ацэнена з пачатку пандэміі COVID-19, і некаторыя намаганні па маніторынгу праводзяцца з выкарыстаннем залатога стандарту, хоць метады на аснове кПЦР каштуюць дорага. Электрахімічныя біясенсары ДНК могуць стаць патэнцыяльна эканамічна эфектыўным рашэнне для маніторынгу проб вады ў навакольным асяроддзі ў краінах з нізкім і сярэднім узроўнем даходу. У гэтай працы мы дэманструем электрахімічнае выяўленне ампліконаў, атрыманых з фага Phi6, выдзеленага з узораў азёрнай вады (папулярны сурагат SARS-CoV-2), з дапамогай ENIG для завяршэння электродаў друкаванай платы без мадыфікацыі паверхні.сэкс. Рэакцыя электрахімічнага датчыка была старанна ахарактарызавана для двух фрагментаў ДНК рознай даўжыні (\({117}\,\hbox {bp}\) і \({503}\,\hbox {bp}\)), і уплыў соляў у майстар-сумесях ПЦР на ўзаемадзеянне метыленавага сіняга (МБ) з ДНК. Нашы вынікі паказваюць, што даўжыня фрагментаў ДНК істотна вызначае электрахімічную адчувальнасць, і дэманструюць у гэтай працы, што здольнасць выяўляць доўгія ампліконы без гелевай ачысткі прадуктаў ПЦР важна для вымярэння проб вады на месцы.Цалкам аўтаматызаванае рашэнне для барацьбы з віруснай нагрузкай прадвесціць добрае.
Перадача віруса праз ваду вядомая як небяспека для грамадскага здароўя з 1940-х гадоў, з першымі сведчаннямі перадачы поліяміэліту і гепатыту E1 праз ваду. Сусветная арганізацыя аховы здароўя (СААЗ) класіфікавала некалькі вірусаў, якія перадаюцца праз ваду, умеранай і высокай значнасці для здароўя2. Традыцыйны вірус метады выяўлення абапіраюцца на метады залатога стандарту на аснове qPCR, якія з'яўляюцца вельмі адчувальнымі і спецыфічнымі, але патрабуюць кваліфікаванага персаналу для праверкі ў лабараторыі з выкарыстаннем дарагіх інструментаў. Аднак у краінах з нізкім і сярэднім узроўнем даходу (LMIC) з абмежаванымі рэсурсамі чалавечыя тэставанне проб, верагодна, будзе мець прыярытэт над маніторынгам проб вады ў навакольным асяроддзі. Такім чынам, неабходныя альтэрнатыўныя недарагія метады для ўстойлівага маніторынгу проб вады і сцёкавых вод у рэжыме рэальнага часу ў краінах з нізкім і сярэднім узроўнем даходу ў якасці ранняга папярэджання аб новых успышках захворванняў, тым самым абараняючы іх ад сур'ёзных сацыяльна-эканамічных наступстваў пандэміі віруса. Недарагія электрахімічныя біясенсары для нуклеінавых кіслот могуць стаць перспектыўным патэнцыяльным рашэннем гэтай незадаволенай патрэбы. Многія з гэтых ДНК-біясенсараў працуюць дзякуючы таму, што камплементарныя ланцугі ДНК імабілізаваны на электродзе паверхню і гібрыдызуюцца, калі адпаведная паслядоўнасць прысутнічае ва ўзоры. Затым гэта можа быць пераўтворана ў сігнал з дапамогай розных электрахімічных метадаў з выкарыстаннем акісляльна-аднаўленчых медыятараў, такіх як каліевае жалеза/ферацыянід. Метыленавы сіні (MB) - адна з такіх акісляльна-аднаўленчых малекул, якая мае паведамляецца, што яны ўстаўляюцца ў двухланцуговую ДНК (dsDNA) у дадатак да больш неспецыфічнага звязвання з адналанцуговай ДНК5,6. Інтэркалявальны характар MB з адукацыяй комплексаў MB-ДНК робіць іх папулярным выбарам у якасці акісляльна-аднаўленчых медыятараў у некалькіх электрахімічных ДНК канфігурацыі датчыка5,6,7,8,9. Нягледзячы на тое, што інтэркаляцыя MB у ДНК неспецыфічная, і спецыфічнасць гэтага электрахімічнага датчыка ў значнай ступені залежыць ад чысціні праймераў, якія выкарыстоўваюцца для ПЦР або ізатэрмічнай ампліфікацыі, ён добра падыходзіць для рэалізацыі рэальных Электрахімічная qPCR на аснове часу або ізатэрмічная ампліфікацыя флуарэсцэнцыі ў якасці альтэрнатывы вымярэнню канцэнтрацыі ДНК 9. У адным з такіх варыянтаў Won et al. Паверхня залатых электродаў была мадыфікавана 6-меркапта-1-гексанолам (MCH) у рэжыме рэальнага часу вымярэнне ПЦР-ампліконаў з MB з дапамогай дыферэнцыяльнай імпульснай вольтампераметрыі (DPV)9. У іншых выпадках Ramirez et al. Выяўленне SARS-CoV-2 у сцёкавых водах з дапамогай рэакцыі RT-LAMP з выкарыстаннем MB з трафарэтнымі электродамі. Плацінавыя электроды таксама былі выкарыстоўваецца ў якасці in situ электродаў у мікрафлюіднай ПЦР-платформе, прызначанай для электрахімічнага выяўлення ампліконаў падчас рэакцый 8. Усе гэтыя даследаванні патрабуюць мадыфікацыі паверхні электродаў, што прадугледжвае павелічэнне вытворчых і эксплуатацыйных выдаткаў з-за асаблівых патрабаванняў да захоўвання для стабільнасці гэтых функцыяналізаваных электродаў.
Схема працоўнага працэсу электрахімічнага выяўлення ампліконаў, атрыманых з канцэнтраваных вірусных часціц у пробах азёрнай вады.
Нядаўна мы прадэманстравалі электрахімічнае зандзіраванне ампліконаў SARS-CoV-2 з недарагімі электродамі на друкаванай плаце (PCB) на аснове DPV і цыклічнай вольтампераметрыі (CV), выкліканай адсорбцыяй комплексаў MB-ДНК на паверхні немадыфікаваных электродаў) змены ў піку ток11.Мы паведамляем, што больш доўгія фрагменты ДНК (N1-N2, \({943}\, \hbox), утвораныя з выкарыстаннем рэкамендаваных CDC N1 прамых і N2 зваротных праймераў у параўнанні з больш кароткімі фрагментамі {bp}\)) паказалі лепшую лінейнасць у адказе датчыка (N1, \(72\,\hbox {bp}\)), сфарміраваны з выкарыстаннем набораў прамых праймераў N1 і зваротнага N1. Паведамляецца, што ў гэтых даследаваннях выкарыстоўваліся развядзенні ДНК, прыгатаваныя ў вадзе без нуклеазы. Платформа таксама выкарыстоўвалася для выяўлення SARS-CoV -2 ампліконы ў змадэляваных узорах сцёкавых вод (атрыманых шляхам дабаўлення агульных узораў РНК да РНК SARS-CoV-2). Паколькі РНК успрымальная да зруху падчас ізаляцыі і далейшай апрацоўкі12,13, цяжка ўзмацніць больш доўгія фрагменты з дапамогай гэтага гетэрагеннага ўзору. Такім чынам, дэманстрацыя электрахімічнага зандзіравання амплікона SARS-CoV-2 у сцёкавых водах абмяжоўваецца больш кароткім фрагментам \(72\,\hbox {bp}\) N1.
У гэтай працы мы даследавалі магчымасць электрахімічнага зандзіравання на аснове ENIG PCB фага Phi6, канцэнтраванага і вылучанага з узораў азёрнай вады (мал. 1). Фагі Phi6 супастаўныя па памеры (80-100 нм) з SARS-CoV-2 і таксама маюць ліпідную мембрану і спайкавы бялок. Па гэтых прычынах бактэрыяфаг Phi6 з'яўляецца папулярным сурагатам ВРВІ-CoV-2 і іншых патагенных РНК-вірусаў з абалонкай14,15. РНК, выдзеленая з фагавых часціц, выкарыстоўвалася ў якасці матрыцы для сінтэзу кДНК з наступным ПЦР для атрымання двух фрагментаў ДНК даўжынёй 117 і 503 пар асноў. Улічваючы праблему ампліфікацыі \(943\,\hbox {bp}\) фрагментаў N1-N2 у нашай папярэдняй працы, мы арыентуемся на фрагменты прамежкавай даўжыні (\(117 \,\hbox {bp}\) і \(503 \,\hbox {bp}\)), заснаваныя на даступных праймерах. Адказ электрахімічнага датчыка сістэматычна вывучаўся ў шырокім дыяпазоне канцэнтрацый (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) да \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Для абодвух фрагментаў у прысутнасць MB, уплыў солі на рэакцыю датчыка быў ахарактарызаваны і пацверджаны спектрафатаметрычнымі вымярэннямі. Асноўныя ўклады гэтай працы заключаюцца ў наступным:
На адчувальнасць моцна ўплывае даўжыня фрагмента ДНК і наяўнасць солі ў пробе.Нашы вынікі паказваюць, што электрахімічная актыўнасць залежыць ад розных механізмаў узаемадзеяння MB, ДНК і датчыка ў вольтамперным адказе, у залежнасці ад канцэнтрацыі і даўжыні ДНК, прычым больш доўгія фрагменты дэманструюць больш высокую адчувальнасць, хоць соль аказвае негатыўны ўплыў на электрастатычныя ўзаемадзеянні паміж MB і ДНК.
Канцэнтрацыя ДНК вызначае механізм узаемадзеяння MB-ДНК у немадыфікаваных электродах. Мы дэманструем, што розныя механізмы ўзаемадзеяння MB-ДНК залежаць ад канцэнтрацыі ДНК. Пры канцэнтрацыях ДНК ніжэй за невялікую колькасць \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), мы заўважылі, што рэакцыя электрахімічнага току ў асноўным вызначалася адсорбцыяй MB-ДНК на электродзе, у той час як пры больш нізкіх канцэнтрацыях. Пры высокіх канцэнтрацыях ДНК рэакцыя электрахімічнага току вызначалася стэрычным інгібіраваннем акісляльна-аднаўленчага актыўнасць за кошт устаўкі MB паміж парамі асноў ДНК.
Электрахімічнае зандзіраванне вірусных нуклеінавых кіслот вірусных нуклеінавых кіслот у пробах азёрнай вады на аснове ENIG на аснове ПХБ. Назіранні былі пацверджаны электрахімічным выяўленнем \(503\,\hbox {bp}\) фрагментаў ДНК з даданнем Phi6, атрыманых з проб вады з возера Поваі, кампус IIT Mumbai Вынік фаг.
Нізкі кошт укаранення і магчымасць інтэграцыі ў цалкам аўтаматызаваныя сістэмы маніторынгу, алігануклеатыды або аптамеры на электродах з больш доўгім тэрмінам захоўвання.
Фаг Phi6 - гэта вірус дцРНК з абалонкай сямейства Cytoviridae, які інфікуе Pseudomonas syringae. Геном фага Phi6 існуе ў выглядзе 3 фрагментаў: S (\(2,95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4,07) \,\hbox {Kb}\)) і L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Паколькі фаг Phi6 заражае непатагенны штам BSL-1 Pseudomonas, яго бяспечна выкарыстоўваць і можа быць лёгка вырашчаны ў лабараторыі.Phage Phi6 і яго гаспадар Pseudomonas syringae былі набыты ў даведачным цэнтры бактэрыяльных вірусаў імя Фелікса д'Эрэля Універсітэта Лаваля, Канада (каталожныя нумары даведачнага цэнтра HER-102 і HER-1102 адпаведна) Фаг .Phi6 і яго гаспадар былі ажыўлены ў адпаведнасці з указаннямі даведачнага цэнтра. Фаг Phi6 быў ачышчаны шляхам лізісу пласцін і элюцыі для атрымання канчатковых тытраў з \(\каля 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { мл}}\) (адзінкі, якія ўтвараюць бляшкі/мілілітры).РНК была вылучана з вычышчаных фагавых часціц з дапамогай універсальнага набору для ачысткі агульнай РНК GenElute™ (Sigma-Aldrich) у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы.Карацей кажучы, завісь вычышчанага фага Phi6\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) быў лізаваны, і лізат быў загружаны ў спінінг-калонку, каб дазволіць РНК звязацца са слупком са смалой. Затым РНК элюіруецца элюючым растворам \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), які пастаўляецца ў камплекце. Ацаніце канцэнтрацыю РНК па абсорбцыі пры \(260\,\hbox {нм}\). РНК захоўвалася аліквотамі ў \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) да далейшага выкарыстання.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Набор для сінтэзу кДНК iScript (бія -Rad Laboratories) выкарыстоўваўся ў якасці шаблону для сінтэзу кДНК у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы. Карацей кажучы, рэакцыя сінтэзу кДНК складаецца з 3 этапаў: праймінг на \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , зваротная транскрыпцыя \({20}\,{\hbox {min}}\) у \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) і назад. Дыктафон знаходзіцца ў \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) на працягу \({1}\,{\hbox {мін }}\). Пры правядзенні на 1% агарозным гелі кДНК паказала тры паласы, якія адпавядаюць чаканым тром фрагментам РНК (дадзеныя не паказаны). Наступныя праймеры былі выкарыстаны для ампліфікацыі двух фрагментаў ДНК даўжынёй 117 і 503 пн, выкарыстанне кДНК у якасці шаблону для ПЦР у термоциклере miniPCR® mini8:
Праймеры для \(117\,\hbox {bp}\) і \(503\,\hbox {bp}\) адпавядаюць 1476-1575 нуклеатыдаў сегмента М і 458-943 нуклеатыдаў сегмента L адпаведна кіслаце Усе ампліфікаваныя ПЦР-прадукты падвергнулі электрафарэзу на 1% агарозных гелях, а ампліфікаваную мэтавую ДНК ачысцілі з дапамогай набору для экстракцыі геля GeneJET (Thermo Fisher Scientific).
Возера ў кампусе IIT Mumbai (Powai Lake, Powai, Mumbai) было выкарыстана для дадання часціц фага. Ваду возера фільтравалі праз мембрану \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) для выдалення узважаныя часціцы, а затым быў дададзены фаг Phi6. Дадайце \({1}\,{\hbox {ml}}\) з \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) у \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) фільтраваную азёрную ваду, у \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Невялікая аліквота была зарэзерваваны для вымярэння віруснай нагрузкі з дапамогай аналізу бляшак. Мы пратэставалі два розныя метады канцэнтрацыі часціц віруса Phi6 з шыпамі: (1) метад адсорбцыі-прэцыпітацыі гідраксіду алюмінію,19 які быў пацверджаны для канцэнтрацыі некалькіх РНК-вірусаў з абалонкай з узораў навакольнага асяроддзя, і (2) ) Метад канцэнтрацыі віруса на аснове поліэтыленгліколя (ПЭГ) быў адаптаваны з Flood et al.20. Паколькі эфектыўнасць аднаўлення метаду на аснове ПЭГ апынулася лепшай, чым метаду гідраксіду алюмінію, метад на аснове ПЭГ быў выкарыстаны для канцэнтрацыі часціц Phi6 з узораў азёрнай вады.
Выкарыстоўваўся наступны метад ПЭГ: ПЭГ 8000 і \(\hbox {NaCl}\) дабаўляліся да пробаў азёрнай вады з дабаўкай Phi6, каб атрымаць 8 % ПЭГ 8000 і \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Узоры інкубавалі на шейкере\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), затым цэнтрыфугуюць пры \(4700 \,\hbox {g}\) \({45}\,{\hbox {min}}\). Выкіньце супернатант і рэсуспендуйце асадак у \({1}\, {\hbox {ml}}\) у тым самым супернатанце. Усе эксперыменты па нарошчванні і канцэнтрацыі віруса праводзіліся ў трох паўторах. Пасля канцэнтрацыі невялікая аліквота была зарэзервавана для вымярэння эфектыўнасці аднаўлення з дапамогай аналізу налёту. РНК была вылучана, як апісана раней, і элюіравана у буферы для элюіравання, які пастаўляецца ў наборы\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Паколькі канцэнтрацыя РНК будзе адрознівацца ад узору да ўзору ў трох паўторах, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) РНК выкарыстоўваецца для ўсіх трох незалежна ад яе канцэнтрацыі. Сінтэз кДНК узораў. Сінтэз кДНК выконваўся, як апісана раней.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) кДНК быў выкарыстаны ў якасці шаблону для \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) ПЦР на працягу 35 цыклаў для ампліфікацыі \ (117\,\hbox {bp}\) і \(503\,\hbox { bp}\) фрагменты. Гэтыя ўзоры прадстаўлены як «1:1», г.зн. без развядзення. Кантроль без шаблону (NTC) быў усталяваны ў якасці адмоўнага кантролю, у той час як кДНК, сінтэзаваная з выкарыстаннем РНК, вылучанай з вычышчанага фага, была ўсталявана у якасці шаблону для станоўчага кантролю (ПК). Колькасная ПЦР (кПЦР) была праведзена ў прыборы Stratagene Mx3000P RT-PCR з выкарыстаннем Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Рэакцыі былі настроены ў трох паўторах, як і раней апісана. Парог цыклу (Ct) быў запісаны для ўсіх узораў. Акрамя таго, разведзеныя ўзоры \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) з выкарыстаннем кДНК, разведзенай 1:100 у адфільтраванай азёрнай вадзе, як \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) ПЦР на працягу 35 цыклаў. Гэтыя ўзоры прадстаўлены як «1:100″.
Электроды друкаванай платы вырабляюцца з выкарыстаннем камерцыйна даступнага недарагога працэсу Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) без неабходнасці дадатковага пазалочанага пакрыцця. Тэхнічныя характарыстыкі электродаў друкаванай платы ENIG падрабязна апісаны ў нашай папярэдняй працы11. Для электродаў друкаванай платы ENIG традыцыйныя метады ачысткі электродаў, такія як цыклічная вольтампераметрыя з растворам піранні або сернай кіслатой не рэкамендуецца, бо яны могуць выклікаць адслойванне тонкага залатога пласта (таўшчыня \(\прыблізна\) \(100\,\hbox {нм }\)) і агаліць ніжэйлеглыя пласты медзі, якія схільныя да карозіі 21, 22, 23, 24, 25. Такім чынам, ачысціце электроды тканінай без ворса, змочанай IPA. Узор для тэставання быў інкубаваны з \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) МБ у \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) для лёгкай устаўкі. У нашай папярэдняй працы , мы заўважылі, што адчувальнасць і лінейнасць датчыка былі палепшаны за кошт павелічэння канцэнтрацыі MB 11 . На аснове аптымізацыі, пра якую паведамлялася ў нашай папярэдняй працы, мы выкарыстоўвалі \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB канцэнтрацыі для ўбудавання ДНК у гэтае даследаванне. Электрахімічнае выяўленне двухцепочечной ДНК (ds-DNA) можа быць дасягнута з дапамогай аніённых або катыённых інтэркалятараў. Хоць аніённыя інтэркалятары выяўляюць ДНК з лепшай селектыўнасцю, яны патрабуюць інкубацыі на працягу ночы, што прыводзіць да больш працяглага часу выяўлення. з іншага боку, катыённыя інтэркалятары, такія як MB, патрабуюць больш кароткага часу інкубацыі, прыблізна \({1}\,{\hbox {h}}\) для электрахімічнага выяўлення ds-DNA6. Кожнае вымярэнне ўключае ў сябе раздачу ўзору для тэставання на электрод\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), затым ачысціце анучай, змочанай IPA, перш чым перайсці да іншага ўзору.адно вымярэнне. Кожны ўзор быў пратэставаны на 5 розных электродах, калі не пазначана іншае. Вымярэнні DPV і CV праводзіліся з дапамогай патэнцыястата PalmSens Sensit Smart, а праграмнае забеспячэнне PSTrace выкарыстоўвалася для канфігурацыі патэнцыястата і збору даных, уключаючы разлікі пікавага току. Выкарыстоўваюцца наступныя налады для вымярэння DPV і CV:
DPV: раўнаважны час = \(8\,\hbox {s}\), крок напружання = \(3\,\hbox {мВ}\), імпульснае напружанне = \(25\,\hbox {мВ}\), працягласць імпульсу = \(50\,\hbox {мс}\), хуткасць сканавання = \({20}\,\hbox {мВ/с}\)
CV: раўнаважны час = \(8\,\hbox {с}\), крок напружання = \(3\,\hbox {мВ}\), хуткасць разгорткі = \({300}\,\hbox {мВ/ с }\)
Пікавыя токі, атрыманыя з вольтамперограмм ДНК у комплексе з \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Вальтампераграмы DPV і CV былі атрыманы на электродах ENIG PCB \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB у комплексе з ДНК (пры канцэнтрацыях 10–\({20}\,{\ hbox {ng) }/{\upmu \hbox {l}}}\) г. зн. 0,13–\({0,26}\, {\upmu \hbox {M}}\) для \(117\,\hbox {bp}\ ) і 0,03 –\({0,06}\,{\upmu \hbox {M}}\) для \(503\,\hbox {bp}\)). Рэпрэзентатыўныя вольтампераграмы паказаны на малюнку S1 у дадатковай інфармацыі. На малюнку 2 паказаны вынікі вымярэнняў DPV і CV (пікавы ток) з выкарыстаннем ачышчаных гелем прадуктаў ПЦР. У параўнанні з вымярэннямі CV, вымярэнні DPV паказваюць больш высокую адчувальнасць (ток як функцыя канцэнтрацыі ДНК), таму што фонавыя ёмістныя токі ў вымярэннях CV хаваюць токі Фарадэя 26. Дадзеныя для кожнай скрынкі ў скрынцы змяшчае вымярэнні ад 5 электродаў. Усе вымярэнні выкарыстоўваюць адзін і той жа набор электродаў, каб пазбегнуць памылак вымярэнняў з-за варыяцый ад электрода да электрода. Мы назіралі тэндэнцыю да росту вымераных пікавых токаў DPV і CV для меншых канцэнтрацый ДНК , даўжэйшы (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ у параўнанні з \(117) ) фрагмент. Гэта адпавядае чаканай тэндэнцыі адсорбцыі электродаў, пра якую паведамлялася ў нашай папярэдняй працы. адсорбцыя комплексу MB-ДНК палягчае перанос зарада на электродзе, што спрыяе павелічэнню пікавага току. Іншыя даследаванні паказалі ўплыў памеру і паслядоўнасці алігануклеатыдаў на інтэркаляцыю MB-ДНК27,28,29,30.Гуанін -утрыманне цытазіну (GC) у двух ампліконах (\(117\,\hbox {bp}\) і \(503\,\hbox {bp}\)) было прыблізна 50 %, што паказвае на тое, што назіранне. да даўжыні амплікона. Аднак для больш высокіх канцэнтрацый ДНК (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), для \(503\,\hbox {bp} \) і \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) для \(117\,\hbox {bp}\)), мы назіраем два ўзмацненні пікавыя токі сабвуфераў зніжаюцца пры вымярэнні як DPV, так і CV. Гэта адбываецца таму, што MB насычае і ўстаўляе паміж парамі асноў ДНК, што прыводзіць да стэрычнага інгібіравання акісляльна-аднаўленчай актыўнасці аднаўляемай групы ў MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Солі, якія прысутнічаюць у асноўных сумесях для ПЦР, перашкаджаюць электрастатычным узаемадзеянням паміж MB і ДНК, таму пры даданні \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) з \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) ачышчаны ў гелі прадукт MB для вывучэння ўплыву солі на ўзаемадзеянне MB-ДНК. Як паказана на малюнку 3, мы заўважылі, што пры больш высокіх канцэнтрацыях ДНК (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) і \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) для \(117\,\hbox {bp} \)), у DPV і CV Даданне солі істотна не паўплывала на вымярэнні (гл. Малюнак S2 у Дадатковай інфармацыі для рэпрэзентатыўных вольтамперограмм). Аднак пры больш нізкія канцэнтрацыі ДНК, дабаўленне солі значна зніжае адчувальнасць, што не прыводзіць да істотных змен току з канцэнтрацыяй ДНК. Аб падобным негатыўным уздзеянні солі на ўзаемадзеянне і інтэркаляцыю MB-ДНК раней паведамлялі іншыя даследчыкі33,34.\(\hbox { Катыёны Mg}^{2+}\) звязваюцца з адмоўным фасфатным касцяком ДНК, тым самым перашкаджаючы электрастатычнаму ўзаемадзеянню паміж MB і ДНК. Пры больш высокіх канцэнтрацыях ДНК стэрычнае інгібіраванне акісляльна-аднаўленчых актыўных MB прыводзіць да меншых пікавых токаў, таму электрастатычныя ўзаемадзеянні істотна не ўплываюць на рэакцыю датчыка. Ключавым момантам з'яўляецца тое, што гэты біясенсар лепш падыходзіць для вызначэння больш высокіх канцэнтрацый ДНК (рэдка \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) або вышэй), для цалкам аўтаматызаванай апрацоўкі ўзораў вады з навакольнага асяроддзя, дзе гелевая ачыстка прадуктаў ПЦР можа быць немагчымай.
Плошча пад крывой паглынання для дыяпазону даўжынь хваль 600–700 \(\hbox {nm}\) для розных канцэнтрацый ДНК у комплексе з \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) з соллю і без яе (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) з соллю і без яе (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Канцэнтрацыі ДНК, якія адпавядаюць \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB узораў ДНК няма.
Для далейшай праверкі вышэйзгаданых вынікаў мы правялі аптычныя вымярэнні з выкарыстаннем спектрафатометра UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), узоры \({50}\, {{\upmu \hbox {l}}}\) выкарыстоўваліся для кожнага Вымярэнне. Сігнатура паглынання памяншаецца з павелічэннем канцэнтрацыі ДНК, як відаць з тэндэнцыі плошчы пад крывой паглынання для дыяпазону даўжынь хваль \(600\,\hbox {nm}\) да \(700\,\hbox { нм}\), як паказана на мал. 4 (спектр паглынання паказаны на мал. S3 у дадатковай інфармацыі). Для ўзораў з канцэнтрацыяй ДНК меншай за \({1}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), не было істотнай розніцы ў паглынанні паміж узорамі, якія змяшчаюць ДНК, і ўзорамі, якія змяшчаюць толькі MB (для \(503\,\hbox {bp}\) і \(117\,\hbox {bp}\ ) даўжынёй фрагментаў), што сведчыць аб адсутнасці стэрычнага інгібіравання акісляльна-аднаўленчага актыўнага MB. Пры больш высокіх канцэнтрацыях ДНК мы назіралі паступовае памяншэнне сігналу паглынання і адзначылі меншае памяншэнне паглынання ў прысутнасці солі. Гэтыя вынікі былі звязаны з малекулярнай узаемадзеянне і стэрычнае інгібіраванне са стэкінгам асноў у гібрыдах ДНК. Нашы вынікі супадаюць з паведамленнямі ў літаратуры аб спектраскапічных даследаваннях інтэркаляцыі MB-ДНК, якія звязваюць гіпахраматычнасць з паніжанымі ўзроўнямі энергіі ў \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) электронныя пераходы з-за інтэркаляцыйных слаёў 36, 37, 38.
Электрафарэз фага Phi6 у агарозным гелі: прадукты ПЦР даўжынёй \(117\,\hbox {bp}\) і \(503\,\hbox {bp}\) з узораў азёрнай вады. Маркер М-ДНК;Кантроль NTC без шаблону, праймеры, якія змяшчаюць адпаведныя ампліконы;ПК станоўчы кантроль;1, 2, 3-неразбаўленыя (1:1) пробы азёрнай вады ў трох экзэмплярах. Паласа бачная ў \(\каля 50\,\hbox {bp}\) з-за нявыкарыстаных алігануклеатыдаў у \(503\,\ hbox {bp}\) зав.
Мы ацанілі карыснасць датчыка, выкарыстоўваючы ўзоры вады з возера Повай, дабаўленыя фагам Phi6. Канцэнтрацыі РНК, выдзеленыя з узораў вады з дадаткам фагаў, вагаліся ў межах 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { мл}}\), у той час як РНК, вылучаная з вычышчаных завісяў фагаў, была ацэнена як \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) з эфектыўнасцю аднаўлення прыблізна 1 %.РНК была зваротна транскрыбавана ў кДНК і выкарыстоўвалася ў якасці шаблону для ПЦР і кПЦР. Памер прадукту быў пацверджаны электрафарэзам у агарозным гелі (малюнак 5) перад тэставаннем з датчыкам. Гэтыя ўзоры не ачышчаны гелем і таму ўтрымліваюць усе кампаненты ПЦР, як а таксама цікавыя ампліконы. Значэнні Ct, запісаныя падчас кПЦР (табліца 1), паказалі, што карэлююць з канцэнтрацыяй РНК, выдзеленай з адпаведных узораў вады з дабаўкай. Значэнне Ct паказвае колькасць цыклаў, неабходных для флуарэсцэнтнага сігналу перавышае парог або фонавы сігнал. Больш высокія значэнні Ct паказваюць на больш нізкія канцэнтрацыі шаблону, і наадварот. Значэнні Ct узораў NTC былі такімі ж высокімі, як чакалася. Розніца ў \(\прыкладна 3\) значэннях Ct паміж станоўчы кантроль і доследны ўзор таксама паказваюць, што кожны доследны ўзор мае прыкладна 1% шаблону ў параўнанні з станоўчым кантролем. Раней мы абмяркоўвалі, што больш доўгія ампліконы прыводзяць да лепшай адчувальнасці. нізкай канцэнтрацыі віруса і дэградацыі РНК. Аднак з дапамогай нашага пратаколу ўзбагачэння віруса і ПЦР-ампліфікацыі мы змаглі паспяхова ўзмацніць фрагмент \(503\,\hbox {bp}\) для электрахімічнага зандзіравання.
На малюнку 6 паказаны вынікі электрахімічнага датчыка амплікону фрагмента \(503\,\hbox {bp}\), абодва з выкарыстаннем неразведзенай кДНК у якасці матрыцы (1:1) і 100-кратна разведзенай кДНК у якасці матрыцы (1:100), праведзенай ПЦР , у параўнанні з NTC і PC (гл. Малюнак S4 у Дадатковай інфармацыі для рэпрэзентатыўных вольтамперограмм). Кожнае поле ў скрынкавым графіку на Малюнку 6 змяшчае вымярэнні трох узораў на 5 электродах. Адны і тыя ж электроды выкарыстоўваліся для вымярэння ўсіх узораў, каб пазбегнуць памылак, выкліканых электродам Варыяцыя ад электрода. У параўнанні з CV-вымярэннямі, DPV-вымярэнні паказваюць лепшую раздзяляльнасць, каб адрозніць тэставыя ўзоры і ўзоры ПК ад NTC, таму што, як згадвалася раней, токі Фарадэя схаваны з-за фонавых ёмістных токаў у апошніх. Для больш доўгіх ампліконаў мы заўважылі, што адмоўны кантроль (NTC) прывёў да больш высокіх пікавых токаў CV і DPV у параўнанні са станоўчым кантролем, у той час як станоўчыя і неразведзеныя доследныя ўзоры паказалі аднолькавую вышыню пікаў пікавых токаў DPV. Вымеранае сярэдняе і медыяна значэнняў для кожнага неразведзенага (1:1) ) тэставы ўзор і ПК можна выразна адрозніць з выхаду датчыка для ўзору NTC, у той час як раздзяленне для ўзору, разведзенага 1:100, менш выяўленае. Для 100-кратнага развядзення кДНК мы не назіралі ніякіх палос падчас гелевага электрафарэзу (палосы не паказаны на малюнку 5), а адпаведныя пікавыя токі DPV і CV былі падобнымі на чаканыя для NTC. Вынікі для фрагмента \(117\,\hbox {bp}\) паказаны ў дадатковай інфармацыі. Адмоўны кантроль выклікаў электрахімічны адказ ад датчыка PCB з-за адсорбцыі вольнага MB на электродзе і ўзаемадзеяння MB з адналанцуговым праймерным алігануклеатыдам. Такім чынам, кожны раз пры тэсціраванні ўзору неабходна запускаць адмоўны кантроль і пікавы ток доследнага ўзору ў параўнанні з пікавым токам, атрыманым адмоўным кантролем для дасягнення дыферэнцыяльнага (адноснага) вымярэння39,40 для класіфікацыі доследнага ўзору як станоўчага або адмоўнага.
(a) DPV і (b) CV пікавы ток для электрахімічнага выяўлення \(503\,\hbox {bp}\) фрагментаў у пробах азёрнай вады. Тэставыя ўзоры вымяраліся ў трох паўторах і параўноўваліся з кантролем без шаблону (NTC) і станоўчы кантроль (ПК).
Нашы высновы ілюструюць розныя механізмы, якія ўплываюць на прадукцыйнасць электрахімічных датчыкаў для ампліконаў рознай даўжыні для розных ДНК, з канцэнтрацыямі, пацверджанымі аптычнымі вымярэннямі з дапамогай УФ/Вісу спектрафатометра. Нашы назіранні падкрэсліваюць разуменне таго, што больш доўгія фрагменты ДНК да \(\прыблізна\) \(500\,\hbox {bp}\) можа быць выяўлена з больш высокай адчувальнасцю і што наяўнасць солі ў пробе не ўплывае на адчувальнасць Канцэнтрацыя ДНК, якая ўплывае на больш высокую адчувальнасць (рэдка \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) і вышэй). Акрамя таго, мы даследавалі ўплыў розных тыпаў узораў, у тым ліку ачышчаных гелем ампліконаў з дабаўленнем солі і без яе, а таксама даданне ўзораў азёрнай вады ў вымярэннях DPV і CV.Мы заўважылі, што DPV забяспечвае лепшае раздзяленне, паколькі фонавы ёмістны ток таксама ўплывае на вымярэнне CV, робячы яго менш адчувальным.
Ампліфікацыя больш доўгіх фрагментаў залежыць ад цэласнасці геномнай РНК віруса. Некалькі даследаванняў паказалі, што ампліфікацыя больш доўгіх фрагментаў не заўсёды эфектыўная з-за дэградацыі РНК у навакольным асяроддзі і магчымасці сплайсінгу падчас ізаляцыі11,41,42,43,44 .Мы заўважылі, што метад канцэнтрацыі віруса на аснове ПЭГ быў больш эфектыўным пры канцэнтрацыі фага Phi-6, дабаўленага ў пробах азёрнай вады, чым метад канцэнтрацыі віруса на аснове гідраксіду алюмінію. Здольнасць выяўляць доўгія фрагменты ДНК даказала, што пераадольвае патрабаванне мультыплекснай ПЦР каб узмацніць некалькі шаблонаў меншай даўжыні і паменшыць магчымасць перакрыжаванай спецыфічнасці.
Біялагічных узораў мала, таму існуе неабходнасць распрацаваць біядатчык, які патрабуе мінімальнай колькасці ўзораў для тэставання. Для электродаў ENIG PCB, якія выкарыстоўваліся ў гэтым даследаванні, патрабавалася толькі \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) узоры для тэставання, каб пакрыць эфектыўную плошчу электродаў. Акрамя таго, той жа электрод можа быць выкарыстаны паўторна пасля ачысткі перад выдачай наступнага ўзору. Узмоцненыя ўзоры не патрабуюць дадання іншых хімічных рэчываў, акрамя метыленавага сіняга, які з'яўляецца недарагім і звычайна выкарыстоўваюцца хімічныя рэчывы. Паколькі вытворчасць кожнага электрода каштуе каля 0,55 долараў (або 40 індыйскіх рупій), гэты біясенсар можа быць эканамічна эфектыўнай альтэрнатывай існуючым тэхналогіям выяўлення. У табліцы 2 паказана параўнанне гэтай працы з іншымі датчыкамі, якія на працягу доўгага часу паведамляліся ў літаратуры Фрагменты ДНК у гетэрагенных узорах.
Улічваючы, што пратаколы электрахімічнага выяўлення на аснове МВ абапіраюцца на спецыфічнасць ПЦР, галоўным абмежаваннем гэтага метаду з'яўляецца магчымасць неспецыфічнай ампліфікацыі ў гетэрагенных узорах, такіх як сцёкавыя вады і азёрная вада, або выкарыстанне праймераў нізкай чысціні. Каб палепшыць адчувальнасць метады электрахімічнай дэтэкцыі для вызначэння ДНК неачышчаных прадуктаў ПЦР з выкарыстаннем немадыфікаваных электродаў ENIG PCB, неабходна лепш разумець памылкі, выкліканыя нявыкарыстанымі dNTP і праймерамі, а таксама аптымізаваць умовы рэакцыі і пратаколы аналізаў. Дадатковыя фізіка-хімічныя параметры, такія як pH, тэмпература і біялагічныя таксама можа спатрэбіцца вымярэнне патрэбнасці ў кіслародзе (БПК) пробы вады, каб павысіць дакладнасць вымярэння.
У заключэнне мы прапануем недарагі электрахімічны датчык ENIG PCB для выяўлення вірусаў у пробах навакольнага асяроддзя (азёрнай вады). У адрозненне ад імабілізаваных алігануклеатыдных электродаў або карыстацкіх субстратаў для зандзіравання ДНК, якія патрабуюць крыягеннага захоўвання для падтрымання адчувальнасці53,54, наша тэхніка выкарыстоўвае немадыфікаваны PCB электроды з больш працяглым тэрмінам прыдатнасці і без асаблівых патрабаванняў да захоўвання, таму падыходзяць для распрацоўкі вымяральных рашэнняў з аўтаматызаванай апрацоўкай узораў, разгорнутай у LMIC. У біядатчыку выкарыстоўваюцца недарагія акісляльна-аднаўленчыя фарбавальнікі (MB), якія інтэркалююць ДНК, для хуткага выяўлення мэтавых ампліконаў. Неспецыфічная ампліфікацыя звычайная ў пробах навакольнага асяроддзя зніжае спецыфічнасць гэтага метаду зандзіравання з-за неспецыфічнага звязвання MB з адна- і двухцепочечными алігануклеатыдамі. Такім чынам, спецыфічнасць гэтага тэсту залежыць ад аптымізацыі праймераў і ўмоў рэакцыі ПЦР. Акрамя таго, CV і пікавыя токі DPV, атрыманыя з доследных узораў, варта інтэрпрэтаваць адносна адказаў, атрыманых ад адмоўнага кантролю (NTC) для кожнага тэсту. Канструкцыі і метады электрахімічных датчыкаў, прадстаўленыя ў гэтай працы, можна інтэграваць з аўтасамплерамі для распрацоўкі цалкам аўтаматызаванага і нізкага -затратнае рашэнне, якое можа збіраць і аналізаваць узоры і перадаваць вынікі па бесправадной сеткі назад у лабараторыю.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Метады пачатковай канцэнтрацыі вірусаў з узораў вады: агляд і мета-аналіз нядаўніх даследаванняў.Application.microorganism.115, стар. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Вірусы, якія перадаюцца праз ваду: перашкоды для бяспечнай пітной вады. PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Эпідэміялогія сцёкавых вод для эканамічна эфектыўнага шырокамаштабнага назірання за COVID-19 у краінах з нізкім і сярэднім узроўнем даходу: праблемы і магчымасці. Вада 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Метыленавы сіні як электрахімічны дыскрымінатар адна- і двухцепочечных алігануклеатыдаў, імабілізаваных на залатых падкладках. Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ. Параўнанне інтэркалятараў катыёнаў і аніёнаў для электрахімічнай трансдукцыі гібрыдызацыі ДНК шляхам пераносу электронаў на вялікія адлегласці.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Перанос зарада праз ДНК: селектыўны электрахімічны ДНК biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al. Мікрафлюідная прылада ПЦР у рэжыме рэальнага часу з адначасовым электрахімічным выяўленнем. біялагічны датчык. Біяэлектроніка. 24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. Даследаванне сігнальнага механізму і праверка прадукцыйнасці электрахімічнай сістэмы ПЦР у рэальным часе, заснаванай на ўзаемадзеянні метиленового сіняга з ДНК. Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Рамірэс-Чаварыя, Р. Г. і інш. Электрахімічны датчык на аснове ізатэрмічнага ўзмацнення з дапамогай цыкла для выяўлення SARS-COV-2 у пробах сцёкавых вод. J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al. Электрахімічнае зандзіраванне ампліконаў SARS-CoV-2 з электродамі PCB. Датчык актываваны. B Chemistry. 343, 130169 (2021).
Кітамура, К., Садамасу, К., Мурамацу, М. і Ёсіда, Х. Эфектыўнае выяўленне РНК SARS-CoV-2 у цвёрдай фракцыі сцёкавых вод.навука.агульнае асяроддзе.763, 144587 (2021).
Алігізакіс, Н. і інш. Аналітычныя метады для выяўлення SARS-CoV-2 у сцёкавых водах: пратакол і будучыя перспектывы. Тэндэнцыя TraC anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Федарэнка, А., Грынберг, М., Арэві, Т. і Каштан, Н. Выжыванне бактэрыяфага з абалонкай Phi6 (сурагат SARS-CoV-2) у выпараных кроплях сліны, асаджаных на шкляных паверхнях.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Дэй Р., Длуская Э. і Эшболт Нью-Джэрсі Экалагічная стойкасць сурагату SARS-CoV-2 (Phi6) у свабодна жывучай амёбы.J.Здароўе вады 20, 83 (2021).
Міндзіч, Л. Дакладная ўпакоўка трох геномных фрагментаў двухцепочечной РНК бактэрыяфага\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Secondary structure of the DH RNA phage\(\varphi\)6 packaging region.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – хуткі і эфектыўны пратакол для падрыхтоўкі лабараторных запасаў бактэрыяфагаў.PeerJ 4, e2261 (2016).
Час размяшчэння: 27 мая 2022 г