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自 COVID-19 大流行开始以来，监测环境样本的重要性得到了极大的重视，一些监测工作正在使用金标准进行，尽管基于 qPCR 的技术很昂贵。电化学 DNA 生物传感器可以提供潜在的成本效益用于监测低收入和中等收入国家环境水样的解决方案。在这项工作中，我们演示了使用 ENIG 对从加标湖水样本（SARS-CoV-2 的流行替代品）中分离的 Phi6 噬菌体获得的扩增子进行电化学检测无需表面改性即可完成PCB电极。性。对两个不同长度的 DNA 片段 (\({117}\,\hbox {bp}\) 和 \({503}\,\hbox {bp}\)) 和PCR 预混液中的盐对亚甲蓝 (MB)-DNA 相互作用的影响。我们的结果表明，DNA 片段的长度显着决定了电化学灵敏度，并且在这项工作中证明，无需对 PCR 产物进行凝胶纯化即可检测长扩增子的能力是对水样的原位测量很重要。一个完全自动化的病毒载量解决方案是个好兆头。
自 1940 年代以来，水传播病毒传播一直被认为是一种公共卫生危害，首次出现脊髓灰质炎和戊型肝炎水传播的证据。世界卫生组织 (WHO) 将几种具有中度至高度健康意义的水传播病毒病原体归类为 2。传统病毒检测方法依赖基于金标准的 qPCR 技术，具有高灵敏度和特异性，但需要熟练人员使用昂贵的仪器在实验室进行检测。然而，在资源有限的低收入和中等收入国家 (LMIC)，人力样品检测可能优先于环境水样监测。因此，需要替代低成本方法对低收入和中等收入国家的水和废水样品进行可持续、实时监测，作为新发疾病爆发的早期预警，从而保护他们免受病毒大流行的严重社会经济影响。低成本的核酸电化学生物传感器可以为这一未满足的需求提供一个有前途的潜在解决方案。许多这些 DNA 生物传感器的工作原理是互补的 DNA 链被固定在电极上当样品中存在匹配序列时表面和杂交。然后可以通过各种电化学技术使用氧化还原介质（例如钾铁/亚铁氰化物）将其转化为信号。亚甲蓝 (MB) 是一种这样的氧化还原活性分子，它具有据报道，除了与单链 DNA 的非特异性结合外，还可以嵌入双链 DNA (dsDNA)5,6。MB 形成 MB-DNA 复合物的嵌入性质使其成为多种电化学 DNA 中作为氧化还原介质的流行选择传感器配置5、6、7、8、9。尽管 MB 与 DNA 的嵌入是非特异性的，并且这种电化学传感器的特异性在很大程度上取决于用于 PCR 或等温扩增的引物的纯度，但它非常适合实施真正的-时间电化学 qPCR 或荧光等温扩增作为 DNA 浓度测量的替代方法 9使用微分脉冲伏安法 (DPV) 9 测量 MB 的 PCR 扩增子。在其他情况下，Ramirez 等人。使用带丝网印刷电极的 MB 通过 RT-LAMP 反应检测废水中的 SARS-CoV-2。铂电极也已被用作微流体 PCR 平台中的原位电极，旨在在反应过程中以电化学方式检测扩增子 8。所有这些研究都需要对电极进行表面改性，这意味着由于对这些功能化电极的稳定性有特殊的存储要求，因此会增加生产和运营成本。
从湖水样品中浓缩的病毒颗粒中获得的扩增子的电化学检测工作流程示意图。
我们最近展示了使用基于 DPV 和循环伏安法 (CV) 的低成本印刷电路板 (PCB) 电极对 SARS-CoV-2 扩增子进行电化学传感，该方法是由 MB-DNA 复合物吸附在未修饰电极表面引起的）峰值变化当前11。我们报告说，与较短的片段 {bp}\) 相比，使用 CDC 推荐的 N1 正向和 N2 反向引物形成的较长 DNA 片段（N1-N2、\({943}\、\hbox)）在传感器响应中表现出更好的线性( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) 使用 N1 正向和 N1 反向引物组形成。这些研究报告使用在无核酸酶水中制备的 DNA 稀释液。该平台还用于检测 SARS-CoV -2 模拟废水样本中的扩增子（通过在总 RNA 样本中加入 SARS-CoV-2 RNA 获得）。由于 RNA 在分离和下游处理过程中容易发生剪切，12,13 因此很难用这种异质样本扩增较长的片段。因此，废水中 SARS-CoV-2 扩增子的电化学检测仅限于较短的 \(72\,\hbox {bp}\) N1 片段。
在这项工作中，我们研究了基于 ENIG PCB 的电化学传感从湖水样品中浓缩和分离的噬菌体 Phi6 的可行性（图 1）。Phi6 噬菌体的大小（80-100 nm）与 SARS-CoV-2 相当，并且也有脂质膜和刺突蛋白。由于这些原因，噬菌体 Phi6 是 SARS-CoV-2 和其他包膜致病性 RNA 病毒的流行替代品 14,15。从噬菌体颗粒中分离的 RNA 被用作 cDNA 合成的模板，然后进行PCR 获得长度为 117 和 503 个碱基对的两个 DNA 片段。鉴于在我们之前的工作中扩增 \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 片段的挑战，我们针对中等长度片段 (\(117 \,\hbox {bp}\) 和 \(503 \,\hbox {bp}\))，基于可用的引物。在很宽的浓度范围 (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) 到 \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) 对于两个片段在 MB 的存在下，盐对传感器响应的影响已通过分光光度测量进行表征和交叉验证。这项工作的主要贡献如下：
DNA 片段长度和样品中盐的存在强烈影响灵敏度。我们的结果表明，电化学活性取决于 MB、DNA 和传感器在伏安响应中相互作用的不同机制，取决于 DNA 浓度和长度，较长的片段显示出更高的灵敏度，尽管盐对它们之间的静电相互作用有负面影响MB 和 DNA。
DNA 浓度决定了未修饰电极中 MB-DNA 相互作用的机制我们证明了 MB-DNA 相互作用的不同机制取决于 DNA 浓度。在 DNA 浓度低于少量{l}}}\)，我们观察到电化学电流响应主要由MB-DNA在电极上的吸附决定，而在低浓度和高DNA浓度下，电化学电流响应由氧化还原的位阻抑制决定由于在 DNA 碱基对之间插入 MB 而产生的活性。
基于 ENIG PCB 的湖水样本中病毒核酸的电化学传感 通过电化学检测从印度理工学院孟买校区 Powai 湖的水样中获得的添加 Phi6 \(503\,\hbox {bp}\) 的 DNA 片段来验证观察结果结果噬菌体。
实施成本低，并有可能集成到全自动监测系统、寡核苷酸或电极上的适配体中，保质期更长。
Phi6噬菌体是感染丁香假单胞菌的细胞病毒科的一种有包膜的dsRNA病毒。Phi6噬菌体的基因组以3个片段形式存在：S(\(2.95\,\hbox{Kb}\))、M(\(4.07 \,\hbox {Kb}\)) 和 L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17。由于 Phi6 噬菌体感染非致病性 BSL-1 假单胞菌菌株，因此使用安全Phage Phi6 及其宿主 Pseudomonas syringae 购自加拿大拉瓦尔大学 Felix d'Herelle 细菌病毒参考中心（参考中心目录号分别为 HER-102 和 HER-1102） .Phi6 噬菌体及其宿主按照参考中心的指示复活。Phi6 噬菌体通过平板裂解和洗脱纯化，获得最终滴度为 \(\about 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\)（噬菌斑形成单位/毫升）。根据制造商的说明，使用 GenElute™ 通用总 RNA 纯化试剂盒（Sigma-Aldrich）从纯化的噬菌体颗粒中分离 RNA。简而言之，纯化的噬菌体 Phi6 悬浮液\（{ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) 被裂解并将裂解物加载到离心柱上以允许 RNA 结合到树脂柱上。然后 RNA 在洗脱溶液中洗脱 \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) 由试剂盒提供。通过在 \(260\,\hbox {nm}\) 处的吸光度估计 RNA 的浓度。RNA 以等分试样储存在 \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) 直到进一步使用。\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA 合成试剂盒 (Bio -Rad Laboratories) 按照制造商的说明用作 cDNA 合成的模板。简而言之，cDNA 合成反应包括 3 个步骤：在 \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , \({20}\,{\hbox {min}}\) 在 \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), 并且反向记录器在 \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) for \({1}\,{\hbox {min }}\)。当在 1% 琼脂糖凝胶上运行时，cDNA 显示三个条带，对应于预期的三个 RNA 片段（数据未显示）。以下引物用于扩增两个长度为 117 和 503 bp 的 DNA 片段，在 miniPCR® mini8 热循环仪中使用 cDNA 作为 PCR 模板：
\(117\,\hbox {bp}\)和\(503\,\hbox {bp}\)的引物分别对应M段的1476-1575个核苷酸和L段的458-943个核苷酸，分别为酸.所有扩增的 PCR 产物在 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳，并使用 GeneJET 凝胶提取试剂盒（Thermo Fisher Scientific）纯化扩增的目标 DNA。
IIT孟买校区（Powai Lake, Powai, Mumbai）的一个湖被用来添加噬菌体颗粒。湖水经过\({5}\,{\upmu \hbox {m}}\)膜过滤以去除添加 \({1}\,{\hbox {ml}}\) of \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) 到 \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) 过滤湖水，在 \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\) 中。一小部分是保留用于通过噬菌斑测定进行病毒载量测量。我们测试了两种不同的方法来浓缩掺入的 Phi6 病毒颗粒：(1) 氢氧化铝吸附-沉淀法，19 已针对环境样本中的几种包膜 RNA 病毒的浓缩进行了验证，以及(2) ) 基于聚乙二醇 (PEG) 的病毒浓缩方法改编自 Flood 等人。20 . 由于发现基于 PEG 的方法的回收效率优于氢氧化铝方法，因此使用基于 PEG 的方法从湖水样品中浓缩 Phi6 粒子。
使用的 PEG 方法如下：将 PEG 8000 和 \(\hbox {NaCl}\) 添加到 Phi6 加标湖水样品中以获得 8 % PEG 8000 和 \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\)。样品在摇床上孵育\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), 然后在 \(4700 \,\hbox {g}\) 下离心为 \({45}\,{\hbox {min}}\)。丢弃上清液并在 \({1}\, {\hbox {ml}}\) 在同一上清液中。所有加标和病毒浓度实验一式三份进行。浓缩后，保留一小部分用于通过噬菌斑测定测量回收效率。如前所述分离 RNA 并洗脱在试剂盒提供的洗脱缓冲液中\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\)。由于 RNA 浓度会因样品而异，一式三份，\({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) 的 RNA 用于所有三个，无论其浓度如何 cDNA 样品的合成。cDNA 合成如前所述进行。\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA用作 \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR 35 个循环的模板以扩增 \(117\,\hbox {bp}\) 和 \(503\,\hbox { bp}\)片段。这些样品表示为“1:1”，即没有稀释。设置无模板对照（NTC）作为阴性对照，同时设置使用从纯化的噬菌体中分离的RNA合成的cDNA作为阳性对照 (PC) 的模板。使用 Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies) 在 Stratagene Mx3000P RT-PCR 仪器中进行定量 PCR (qPCR)。如前所述，一式三份设置反应描述。记录所有样品的循环阈值 (Ct)。此外，稀释的样品是 \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) 使用在过滤湖水中 1:100 稀释的 cDNA 作为\({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR 35 个循环。这些样本表示为“1:100”。
PCB 电极采用市售的低成本化学镀镍浸金 (ENIG) 工艺制造，无需额外镀金。ENIG PCB 电极规格在我们之前的工作中有详细说明11。对于 ENIG PCB 电极，传统的电极清洁方法如不推荐使用食人鱼溶液或硫酸循环伏安法，因为它们可能会导致薄金层（厚度\(\approx\)\(100\,\hbox {nm }\)）剥落并暴露下面容易发生的铜层腐蚀 21、22、23、24、25。因此，用蘸有 IPA 的无绒布清洁电极。待测样品用 \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB in \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) 便于插入。在我们之前的工作中，我们观察到传感器的灵敏度和线性度通过增加 MB 浓度 11 得到改善。根据我们早期工作中报告的优化，我们使用 \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB在这项研究中嵌入 DNA 的浓度。双链 DNA (ds-DNA) 的电化学检测可以使用阴离子或阳离子嵌入剂来实现。虽然阴离子嵌入剂检测 DNA 具有更好的选择性，但它们需要过夜孵育，从而导致更长的检测时间。另一方面，阳离子嵌入剂如 MB 需要更短的孵育时间，大约 \({1}\,{\hbox {h}}\) 用于 ds-DNA6 的电化学检测。每次测量都涉及将要测试的样品分配到电极\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\)，然后用浸有 IPA 的抹布清洁，然后再处理另一个样品。一次测量。除非另有说明，否则每个样品都在 5 个不同的电极上进行测试。使用 PalmSens Sensit Smart 恒电位仪进行 DPV 和 CV 测量，并使用 PSTrace 软件进行恒电位仪配置和数据采集，包括峰值电流计算。使用以下设置对于 DPV 和 CV 测量：
DPV：平衡时间 = \(8\,\hbox {s}\)，电压阶跃 = \(3\,\hbox {mV}\)，脉冲电压 = \(25\,\hbox {mV}\)，脉冲持续时间 = \(50\,\hbox {ms}\)，扫描速率 = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV：平衡时间 = \(8\,\hbox {s}\)，电压步进 = \(3\,\hbox {mV}\)，扫描速率 = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
从与 \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB 复合的 DNA 伏安图中获得的峰值电流：(a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV，(b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV，(c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
在 ENIG PCB 电极上获得 DPV 和 CV 伏安图}/{\upmu \hbox {l}}}\) 即 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) 对于 \(117\,\hbox {bp}\ ) 和 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) for \(503\,\hbox {bp}\)）。代表性伏安图显示在补充信息的图 S1 中。图 2 显示了结果使用凝胶纯化的 PCR 产品的 DPV 和 CV 测量（峰值电流）。与 CV 测量相比，DPV 测量显示更高的灵敏度（电流作为 DNA 浓度的函数），因为 CV 测量中的背景电容电流隐藏了法拉第电流 26。数据箱线图中的每个方框包含来自 5 个电极的测量值。所有测量都使用同一组电极，以避免由于电极与电极之间的差异而导致的测量误差。我们观察到 DPV 和 CV 测量峰值电流的增加趋势对于较低浓度的 DNA , 更长的 (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ compared to \(117) ) 片段。这与我们之前工作中报告的电极吸附的预期趋势一致。 MB-DNA 复合物的吸附促进了电极上的电荷转移，这有助于增加峰值电流。其他研究表明寡核苷酸大小和序列对 MB-DNA 嵌入的影响27,28,29,30。鸟嘌呤- 两个扩增子（\(117\,\hbox {bp}\)和\(503\,\hbox {bp}\)）的胞嘧啶（GC）含量约为50%，说明观察到的差异是由于到扩增子长度。但是，对于更高的 DNA 浓度 (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)，对于 \(503\,\hbox {bp} \) 和 \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) 对于 \(117\,\hbox {bp}\))，我们观察到两个放大在 DPV 和 CV 测量中，潜艇的峰值电流都降低了。这是因为 MB 饱和并插入 DNA 碱基对之间，导致 MB31,32 中可还原基团的氧化还原活性受到空间抑制。
存在于 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
PCR 主混合物中存在的盐会干扰 MB 和 DNA 之间的静电相互作用，因此通过添加 \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) 和 \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB 凝胶纯化产物来研究盐对 MB-DNA 相互作用的影响。如图 3 所示，我们观察到对于较高的 DNA 浓度 (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) 和 \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) 对于 \(117\,\hbox {bp} \)), 在 DPV 和 CV 中盐的添加对测量没有显着影响（参见代表性伏安图补充信息中的图 S2）。然而，在较低的 DNA 浓度，添加盐会大大降低灵敏度，导致电流随 DNA 浓度没有显着变化。盐对 MB-DNA 相互作用和嵌入的类似负面影响先前已被其他研究人员报道 33、34。\(\hbox { Mg}^{2+}\) 阳离子与 DNA 的负磷酸盐骨架结合，从而阻碍 MB 与 DNA 之间的静电相互作用。在较高的 DNA 浓度下，氧化还原活性 MB 的空间抑制导致较低的峰值电流，因此静电相互作用不会显着影响传感器响应。关键是这种生物传感器更适合检测更高的 DNA 浓度（很少 \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) 或更高），用于环境水样的全自动处理，其中 PCR 产物的凝胶纯化可能不可行。
对于与 \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) 复合的各种浓度的 DNA，波长范围为 600–700 \(\hbox {nm}\) 的吸收曲线下面积：( a ) \(503\,\hbox {bp}\) 加盐和不加盐 (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) 含盐和不含盐 (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) 对应于 \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB 样本的 DNA 浓度 无 DNA。
为了进一步验证上述结果，我们使用 UV/Vis 分光光度计 (Thermo Scientific Multiskan GO) 进行了光学测量，样品 \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) 用于每个测量。吸收特征随着 DNA 浓度的增加而降低，从波长范围 \(600\,\hbox {nm}\) 到 \(700\,\hbox { nm}\) ，如图 4 所示（补充信息中图 S3 所示的吸收光谱）。对于 DNA 浓度小于 \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)，含 DNA 和仅含 MB 的样本（对于 \(503\,\hbox {bp}\) 和 \(117\,\hbox {bp}\）在吸收上没有显着差异) 长度片段），表明不存在氧化还原活性 MB 的空间抑制。在较高的 DNA 浓度下，我们观察到吸光度信号逐渐降低，并注意到在盐存在下吸光度降低较小。这些结果归因于分子相互作用和空间抑制与 DNA 杂交体中的碱基堆叠。我们的结果与文献中关于 MB-DNA 嵌入的光谱研究的报告一致，这些研究将低色度与 \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) 由于嵌入层 36、37、38 引起的电子跃迁。
噬菌体Phi6的琼脂糖凝胶电泳：来自湖水样品的长度为\(117\,\hbox {bp}\)和\(503\,\hbox {bp}\)的PCR产物。M-DNA标记；NTC-无模板对照，含有相应扩增子的引物；PC阳性对照；1、2、3-未稀释 (1:1) 加标湖水样品一式三份。由于 \(503\,\ hbox {bp}\) 车道。
我们使用掺有 Phi6 噬菌体的 Powai 湖水样评估了传感器的效用。从掺有噬菌体的水样中分离出的 RNA 浓度范围为 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\)，而那些从纯化的噬菌体悬浮液中分离出来的 RNA 估计为 \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\)，回收效率约为 1 %.RNA 被逆转录成 cDNA 并用作 PCR 和 qPCR 的模板。在使用传感器进行测试之前，通过琼脂糖凝胶电泳（图 5）确认了产品大小。这些样品未经过凝胶纯化，因此包含 PCR 的所有成分以及感兴趣的扩增子。在 qPCR 期间记录的 Ct 值（表 1）显示与从相应加标水样中分离的 RNA 浓度相关。Ct 值揭示了荧光信号所需的循环次数超过阈值或背景信号。较高的 Ct 值表示模板浓度较低，反之亦然。NTC 样品的 Ct 值与预期一样高。之间的 \(\approximately 3\) Ct 值差异阳性对照和测试样品进一步表明，与阳性对照相比，每个测试样品具有大约 1% 的模板。我们之前已经讨论过，较长的扩增子会导致更好的灵敏度。考虑到缺点，从异质环境样品中分离出的较长片段的扩增具有挑战性低病毒浓度和 RNA 降解。然而，通过我们的病毒富集和 PCR 扩增方案，我们能够成功地扩增 \(503\,\hbox {bp}\) 片段用于电化学传感。
图 6 显示了 \(503\,\hbox {bp}\) 片段扩增子的电化学传感器结果，均使用未稀释的 cDNA 作为模板 (1:1) 和 100 倍稀释的 cDNA 作为模板 (1:100) 进行 PCR , 与 NTC 和 PC 相比（参见代表性伏安图的补充信息中的图 S4）。图 6 中箱线图中的每个框包含来自 5 个电极的三个样品的测量值。使用相同的电极测量所有样品以避免由于电极引起的误差- 电极变化。与 CV 测量相比，DPV 测量显示出更好的分辨率，可以区分测试和 PC 样品与 NTC，因为如前所述，法拉第电流由于后者的背景电容电流而被隐藏。对于更长的扩增子，我们观察到阴性对照 (NTC) 导致相对于阳性对照更高的 CV 和 DPV 峰值电流，而阳性和未稀释的测试样品显示相似的 DPV 峰值电流峰高。每个未稀释 (1:1) 的测量平均值和中值) 测试样品和 PC 可以从 NTC 样品的传感器输出中清楚地分辨出来，而 1:100 稀释样品的分辨率不太明显。对于 100 倍稀释的 cDNA，我们在凝胶电泳过程中没有观察到任何条带（图 5 中未显示泳道），相应的 DPV 和 CV 峰值电流与 NTC 预期的相似。\(117\,\hbox {bp}\) 片段的结果显示在补充信息中。负由于电极上游离 MB 的吸附以及 MB 与单链引物寡核苷酸的相互作用，对照诱导了 PCB 传感器的电化学响应。因此，每次测试样品时，都必须运行阴性对照，并且将测试样品的峰值电流与阴性对照获得的峰值电流进行比较，以实现差分（相对）测量 39,40，从而将测试样品分类为阳性或阴性。
(a) DPV，和 (b) 用于电化学检测湖水样品中 \(503\,\hbox {bp}\) 片段的 CV 峰值电流。测试样品一式三份测量，并与无模板对照 (NTC) 和阳性对照（PC）。
我们的研究结果说明了影响不同 DNA 的不同长度扩增子的电化学传感器性能的不同机制，浓度通过使用 UV/Vis 分光光度计的光学测量验证。我们的观察强调了更长的 DNA 片段高达 \(\approx\) \(500\,\hbox {bp}\) 可以以更高的灵敏度检测，样品中盐的存在不会影响更高灵敏度的灵敏度 DNA 浓度（很少 \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) 及以上）。此外，我们研究了不同类型样品的影响，包括添加和不添加盐的凝胶纯化扩增子，以及在 DPV 和 CV 测量中添加湖水样品。我们观察到 DPV 提供了更好的分辨率，因为背景电容电流也会影响 CV 测量，使其灵敏度降低。
较长片段的扩增取决于病毒基因组 RNA 的完整性。多项研究表明，由于环境中 RNA 的降解以及分离过程中可能发生的剪接，较长片段的扩增并不总是有效 11,41,42,43,44 .我们观察到，基于 PEG 的病毒浓缩方法比基于氢氧化铝的病毒浓缩方法更有效地浓缩湖水样品中掺入的噬菌体 Phi-6。事实证明，检测长 DNA 片段的能力克服了多重 PCR 的要求扩增多个较短长度的模板并降低交叉特异性的可能性。
生物样品稀缺，因此需要设计一种需要最少样品进行测试的生物传感器。本研究中使用的 ENIG PCB 电极仅需要 \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) 样品以覆盖电极的有效面积。此外，同一电极在清洗后可以重复使用，然后再分配下一个样品。放大的样品不需要添加亚甲蓝以外的任何化学物质，亚甲蓝是一种廉价的和常用化学品。由于每个电极的制造成本约为 0.55 美元（或 40 印度卢比），因此这种生物传感器可以成为现有检测技术的一种经济高效的替代品。表 2 显示了这项工作与文献中长期报道的其他传感器的比较异质样品中的 DNA 片段。
鉴于基于 MB 的电化学检测方案依赖于 PCR 的特异性，该方法的一个主要限制是可能在废水和湖水等异质样品中进行非特异性扩增或使用低纯度引物。提高灵敏度使用未修饰的 ENIG PCB 电极对未纯化的 PCR 产物进行 DNA 检测的电化学检测方法，有必要更好地了解未使用的 dNTP 和引物引入的错误，并优化反应条件和测定方案。额外的物理化学参数，如 pH、温度和生物可能还需要测量水样的需氧量 (BOD)，以提高测量的准确性。
总之，我们提出了一种用于环境（湖水）样品中病毒检测的低成本电化学 ENIG PCB 传感器。与需要低温储存以保持灵敏度的固定化寡核苷酸电极或用于 DNA 传感的定制底物不同，53,54 我们的技术使用未修改的 PCB具有更长保质期且没有特定存储要求的电极，因此适用于开发部署在 LMIC 中的自动样品处理的测量解决方案。生物传感器利用廉价的 DNA 嵌入氧化还原染料 (MB) 快速检测目标扩增子。非特异性扩增由于 MBs 与单链和双链寡核苷酸的非特异性结合，环境样品中常见的环境样品降低了这种传感方法的特异性。因此，该测试的特异性取决于引物和 PCR 反应条件的优化。此外，CV从测试样品中获得的和 DPV 峰值电流应相对于从每次测试的阴性对照 (NTC) 获得的响应进行解释。本工作中介绍的电化学传感器设计和方法可以与自动进样器集成，以开发完全自动化和低成本低廉的解决方案，可以收集和分析样本并将结果无线传输回实验室。
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发布时间：May-27-2022