پی سی بی الیکٹروڈ کا استعمال کرتے ہوئے پانی کے نمونوں میں وائرل نیوکلک ایسڈز کی الیکٹرو کیمیکل سینسنگ کے لیے لمبے لمبے ایمپلیونز بہتر حساسیت فراہم کرتے ہیں۔

Nature.com پر جانے کے لیے آپ کا شکریہ۔ آپ جو براؤزر ورژن استعمال کر رہے ہیں اس میں CSS کے لیے محدود سپورٹ ہے۔ بہترین تجربہ کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ ایک اپ ڈیٹ شدہ براؤزر استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں کمپیٹیبلٹی موڈ آف کریں)۔ اس دوران، یقینی بنانے کے لیے۔ مسلسل سپورٹ، ہم سائٹ کو اسٹائل اور جاوا اسکرپٹ کے بغیر ڈسپلے کریں گے۔
ماحولیاتی نمونوں کی نگرانی کی اہمیت کو COVID-19 کی وبا کے آغاز سے ہی بہت سراہا گیا ہے، اور کچھ نگرانی کی کوششیں گولڈ اسٹینڈرڈ کا استعمال کرتے ہوئے کی جا رہی ہیں، حالانکہ qPCR پر مبنی تکنیکیں مہنگی ہیں۔ کم اور درمیانی آمدنی والے ممالک میں ماحولیاتی پانی کے نمونوں کی نگرانی کے لیے حل۔ اس کام میں، ہم ENIG کا استعمال کرتے ہوئے، جھیل کے پانی کے نمونوں (SARS-CoV-2 کے لیے ایک مقبول سروگیٹ) سے الگ تھلگ Phi6 فیج سے حاصل کیے گئے ایمپلی کون کی الیکٹرو کیمیکل شناخت کا مظاہرہ کرتے ہیں۔ سطح کی ترمیم کے بغیر پی سی بی الیکٹروڈ کو مکمل کرنے کے لیے۔جنس۔ الیکٹرو کیمیکل سینسر کے ردعمل کو مختلف لمبائی کے دو DNA ٹکڑوں (\({117}\,\hbox {bp}\) اور \({503}\,\hbox {bp}\)) کے لیے اچھی طرح سے خصوصیت دی گئی تھی، اور پی سی آر ماسٹر مکسز میں نمکیات کا اثر میتھیلین بلیو (ایم بی) ڈی این اے تعاملات پر۔ ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ ڈی این اے کے ٹکڑوں کی لمبائی نمایاں طور پر الیکٹرو کیمیکل حساسیت کا تعین کرتی ہے اور اس کام میں یہ ظاہر کرتی ہے کہ پی سی آر مصنوعات کی جیل پیوریفیکیشن کے بغیر لمبے ایمپلیون کا پتہ لگانے کی صلاحیت ہے۔ پانی کے نمونوں کی صورتحال کی پیمائش کے لیے اہم۔وائرل لوڈ کے لیے ایک مکمل خودکار حل اچھی طرح سے کام کرتا ہے۔
پانی سے پیدا ہونے والے وائرس کی منتقلی کو 1940 کی دہائی سے صحت عامہ کے لیے خطرہ کے طور پر جانا جاتا ہے، پولیو اور ہیپاٹائٹس E1 کی پانی سے منتقلی کے پہلے ثبوت کے ساتھ۔ عالمی ادارہ صحت (WHO) نے متعدد پانی سے پیدا ہونے والے وائرل پیتھوجینز کی درجہ بندی کی ہے جو اعتدال سے لے کر اعلیٰ صحت کی اہمیت رکھتے ہیں2۔ روایتی وائرس پتہ لگانے کے طریقے سونے کے معیاری کیو پی سی آر پر مبنی تکنیکوں پر انحصار کرتے ہیں، جو کہ انتہائی حساس اور مخصوص ہیں، لیکن مہنگے آلات کا استعمال کرتے ہوئے تجربہ گاہ میں جانچ کے لیے ہنر مند افراد کی ضرورت ہوتی ہے۔ تاہم، کم اور درمیانی آمدنی والے ممالک (LMICs) میں محدود وسائل کے ساتھ، انسانی ممکنہ طور پر نمونے کی جانچ کو ماحولیاتی پانی کے نمونوں کی نگرانی پر ترجیح دی جائے گی۔ اس لیے، کم اور درمیانی آمدنی والے ممالک میں پانی اور گندے پانی کے نمونوں کی پائیدار، حقیقی وقت میں نگرانی کے لیے متبادل کم لاگت کے طریقوں کی ضرورت ہے کیونکہ ابھرتی ہوئی بیماریوں کے پھیلنے کی ابتدائی وارننگ، اس طرح ان کو وائرس کی وبا کے شدید سماجی اقتصادی اثرات سے بچاتا ہے۔ نیوکلک ایسڈز کے لیے کم لاگت والے الیکٹرو کیمیکل بائیو سینسرز اس غیر پورا ہونے والی ضرورت کا ایک امید افزا ممکنہ حل فراہم کر سکتے ہیں۔ ان میں سے بہت سے ڈی این اے بائیو سینسرز اس حقیقت سے کام کرتے ہیں کہ تکمیلی ڈی این اے اسٹرینڈز الیکٹروڈ پر متحرک ہوتے ہیں۔ جب نمونے میں مماثل ترتیب موجود ہو تو سطح اور ہائبرڈائز کریں۔ اسے پھر ریڈوکس ثالثوں جیسے پوٹاشیم آئرن/فیروکیانائیڈ کا استعمال کرتے ہوئے مختلف الیکٹرو کیمیکل تکنیکوں کے ذریعے سگنل میں تبدیل کیا جا سکتا ہے۔ میتھیلین بلیو (ایم بی) ایسا ہی ایک ریڈوکس فعال مالیکیول ہے، سنگل پھنسے ہوئے DNA5,6 پر زیادہ غیر مخصوص پابند ہونے کے علاوہ ڈبل سٹرینڈڈ DNA (dsDNA) میں انٹرکیلیٹ ہونے کی اطلاع دی گئی ہے۔ MB-DNA کمپلیکس بنانے کے لیے MBs کی انٹرکیلیٹنگ نوعیت انہیں کئی الیکٹرو کیمیکل DNA میں ریڈوکس ثالث کے طور پر ایک مقبول انتخاب بناتی ہے۔ سینسر کنفیگریشنز5,6,7,8,9۔اگرچہ MB سے DNA کا تعامل غیر مخصوص ہے، اور اس الیکٹرو کیمیکل سینسر کی خاصیت زیادہ تر PCR یا isothermal amplification کے لیے استعمال ہونے والے پرائمر کی پاکیزگی پر منحصر ہے، لیکن یہ حقیقی کو لاگو کرنے کے لیے اچھی طرح سے موزوں ہے۔ وقتی الیکٹرو کیمیکل پر مبنی کیو پی سی آر یا فلوروسینس آئسوتھرمل ایمپلیفیکیشن ڈی این اے کی حراستی پیمائش کے متبادل کے طور پر 9 .ایسے ہی ایک نفاذ میں، وون ایٹ ال۔ سونے کے الیکٹروڈ کی سطح کو حقیقی وقت کے لیے 6-mercapto-1-hexanol (MCH) کے ساتھ تبدیل کیا گیا تھا۔ ڈیفرینشل پلس وولٹامیٹری (DPV) کا استعمال کرتے ہوئے MB کے ساتھ PCR amplicons کی پیمائش 9۔ دیگر معاملات میں، Ramirez et al. سکرین پرنٹ شدہ الیکٹروڈ کے ساتھ MB کا استعمال کرتے ہوئے RT-LAMP ردعمل کے ذریعے گندے پانی میں SARS-CoV-2 کا پتہ لگانا۔ پلاٹینم الیکٹروڈ بھی ایک مائکرو فلائیڈک پی سی آر پلیٹ فارم میں سیٹو الیکٹروڈ کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے جو رد عمل کے دوران الیکٹرو کیمیکل طور پر ایمپلیون کا پتہ لگانے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے 8 .ان تمام مطالعات میں الیکٹروڈ کی سطح میں تبدیلی کی ضرورت ہوتی ہے، جس کا مطلب یہ ہے کہ ان فنکشنلائزڈ الیکٹروڈز کے استحکام کے لیے اسٹوریج کی خصوصی ضروریات کی وجہ سے پیداوار اور آپریٹنگ اخراجات میں اضافہ ہوتا ہے۔
جھیل کے پانی کے نمونوں میں مرتکز وائرل ذرات سے حاصل کردہ ایمپلیونز کے الیکٹرو کیمیکل پتہ لگانے کے لیے ورک فلو کا منصوبہ۔
ہم نے حال ہی میں SARS-CoV-2 amplicons کی الیکٹرو کیمیکل سینسنگ کا مظاہرہ کیا جس میں کم لاگت والے پرنٹ شدہ سرکٹ بورڈ (PCB) الیکٹروڈ کی بنیاد پر DPV اور سائکلک وولٹامیٹری (CV) غیر ترمیم شدہ الیکٹروڈز کی سطح پر MB-DNA کمپلیکس کے جذب سے حوصلہ افزائی کی گئی ہے ) چوٹی میں تبدیلیاں۔ موجودہ 11۔ہم رپورٹ کرتے ہیں کہ چھوٹے ٹکڑوں {bp}\) کے مقابلے CDC کے تجویز کردہ N1 فارورڈ اور N2 ریورس پرائمر کا استعمال کرتے ہوئے بنائے گئے لمبے DNA کے ٹکڑے (N1-N2, \({943}\, \hbox)) نے سینسر کے ردعمل میں بہتر خطوط ظاہر کیا۔ (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) N1 فارورڈ اور N1 ریورس پرائمر سیٹ کا استعمال کرتے ہوئے تشکیل دیا گیا ہے۔ یہ مطالعات نیوکلیز سے پاک پانی میں تیار کردہ DNA کی کمزوریوں کا استعمال کرتے ہوئے رپورٹ کی گئی ہیں۔ پلیٹ فارم کو SARS-CoV کا پتہ لگانے کے لیے بھی استعمال کیا گیا تھا۔ مصنوعی گندے پانی کے نمونوں میں -2 ایمپلی کون (SARS-CoV-2 RNA کے ساتھ کل RNA نمونوں کو بڑھا کر حاصل کیا گیا)۔ چونکہ RNA تنہائی اور بہاو پروسیسنگ کے دوران مونڈنے کے لیے حساس ہے، 12,13 اس متضاد نمونے کے ساتھ لمبے ٹکڑوں کو بڑھانا مشکل ہے۔ لہذا، گندے پانی میں SARS-CoV-2 amplicon کی الیکٹرو کیمیکل سینسنگ کا مظاہرہ چھوٹے \(72\,\hbox {bp}\) N1 ٹکڑے تک محدود ہے۔
اس کام میں، ہم نے جھیل کے پانی کے نمونوں (تصویر 1) سے ENIG پی سی بی کی بنیاد پر الیکٹرو کیمیکل سینسنگ کی فزیبلٹی کی چھان بین کی جو جھیل کے پانی کے نمونوں (تصویر 1) سے الگ ہو گئی ہے۔ اس میں لپڈ جھلی اور ایک سپائیک پروٹین بھی ہوتا ہے۔ ان وجوہات کی بناء پر، بیکٹیریوفیج Phi6 SARS-CoV-2 اور دیگر لپیٹے ہوئے پیتھوجینک RNA وائرس14,15 کے لیے ایک مقبول سروگیٹ ہے۔ phage ذرات سے الگ تھلگ RNA کو cDNA کی ترکیب کے لیے ایک ٹیمپلیٹ کے طور پر استعمال کیا جاتا تھا۔ PCR لمبائی میں 117 اور 503 بیس جوڑوں کے دو DNA ٹکڑے حاصل کرنے کے لیے۔ ہمارے پچھلے کام میں N1-N2 ٹکڑوں کو بڑھاوا دینے کے چیلنج کو دیکھتے ہوئے، ہم درمیانی لمبائی کے ٹکڑوں کو نشانہ بناتے ہیں (\(117) \,\hbox {bp}\) اور \(503 \,\hbox {bp}\))، دستیاب پرائمر کی بنیاد پر۔ الیکٹرو کیمیکل سینسر کے ردعمل کا ایک وسیع ارتکاز رینج (\({10}\,{) پر منظم طریقے سے مطالعہ کیا گیا تھا۔ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) سے \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) ایم بی کی موجودگی، سینسر کے ردعمل پر نمک کے اثر کی خصوصیت اور اسپیکٹرو فوٹو میٹرک پیمائش کے ذریعے تصدیق کی گئی ہے۔ اس کام کی اہم شراکتیں درج ذیل ہیں:
ڈی این اے کے ٹکڑے کی لمبائی اور نمونے میں نمک کی موجودگی حساسیت کو سخت متاثر کرتی ہے۔ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ الیکٹرو کیمیکل سرگرمی ایم بی، ڈی این اے، اور وولٹامیٹرک ردعمل میں سینسر کے تعامل کے مختلف میکانزم پر منحصر ہے، ڈی این اے کے ارتکاز اور لمبائی پر منحصر ہے، لمبے ٹکڑوں کے ساتھ زیادہ حساسیت ظاہر ہوتی ہے، حالانکہ نمک کا الیکٹرو سٹیٹک تعاملات پر منفی اثر پڑتا ہے۔ ایم بی اور ڈی این اے۔
ڈی این اے کا ارتکاز غیر ترمیم شدہ الیکٹروڈز میں MB-DNA تعامل کے طریقہ کار کا تعین کرتا ہے ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ MB-DNA تعامل کے مختلف میکانزم DNA کے ارتکاز پر منحصر ہیں۔ {l}}})، ہم نے مشاہدہ کیا کہ الیکٹرو کیمیکل کرنٹ ردعمل کا تعین بنیادی طور پر الیکٹروڈ پر MB-DNA کے جذب سے ہوتا ہے، جب کہ کم ارتکاز میں زیادہ DNA کی تعداد میں، الیکٹرو کیمیکل کرنٹ ردعمل کا تعین ریڈوکس کی سٹرک روک تھام کے ذریعے کیا جاتا تھا۔ DNA بیس جوڑوں کے درمیان MB داخل کرنے کی وجہ سے سرگرمی۔
جھیل کے پانی کے نمونوں میں وائرل نیوکلک ایسڈز کی ENIG PCB پر مبنی الیکٹرو کیمیکل سینسنگ Phi6-added \(503\,\hbox {bp}\) DNA کے ٹکڑوں کی الیکٹرو کیمیکل کھوج کے ذریعے پائی گئی جھیل، IIT ممبئی کیمپس سے پانی کے نمونوں سے حاصل کی گئی۔ نتیجہ کا مرحلہ۔
عمل درآمد کی کم لاگت اور طویل شیلف لائف والے الیکٹروڈز پر مکمل طور پر خودکار نگرانی کے نظام، oligonucleotides یا aptamers میں انضمام کی صلاحیت۔
Phage Phi6 Cytoviridae خاندان کا ایک لفافہ dsRNA وائرس ہے جو Pseudomonas syringae کو متاثر کرتا ہے۔ Phi6 phage کا جینوم 3 ٹکڑوں کی شکل میں موجود ہے: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) اور L (\ (6.37\,\hbox{Kb}\))16,17۔چونکہ Phi6 فیز ایک غیر پیتھوجینک BSL-1 Pseudomonas سٹرین کو متاثر کرتا ہے، اس لیے اس کا استعمال محفوظ ہے۔ اور لیبارٹری میں آسانی سے اگایا جا سکتا ہے۔ Phage Phi6 اور اس کے میزبان Pseudomonas syringae کو Felix d'Herelle Reference Center for Bacterial Viruses، Laval University، Canada سے خریدا گیا تھا (ریفرنس سینٹر کے کیٹلاگ نمبر بالترتیب HER-102 اور HER-1102 ہیں) .Phi6 فیج اور اس کے میزبان کو ریفرنس سینٹر کی ہدایت کے مطابق بحال کیا گیا۔ فیج Phi6 کو پلیٹ لیسس اور ایلیوشن کے ذریعے خالص کیا گیا تاکہ \(\تقریباً 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox} کے ساتھ حتمی ٹائٹرز حاصل کیے جا سکیں۔ ml}}\) (پلاک بنانے والے یونٹس/ملی لیٹر)۔ RNA کو مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق GenElute™ یونیورسل ٹوٹل RNA پیوریفیکیشن کٹ (Sigma-Aldrich) کا استعمال کرتے ہوئے پیوریفائیڈ فیز پارٹیکلز سے الگ کیا گیا تھا۔ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) lysed کیا گیا تھا اور RNA کو رال کے کالم سے منسلک کرنے کی اجازت دینے کے لیے lysate کو اسپن کالم پر لوڈ کیا گیا تھا۔ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) کٹ کے ذریعے فراہم کیا گیا ہے۔ RNA کے ارتکاز کو جاذبیت کے ذریعے \(260\,\hbox {nm}\) کا اندازہ لگائیں۔RNA کو ایلی کوٹس میں ذخیرہ کیا گیا تھا۔ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) مزید استعمال ہونے تک۔ -Rad Laboratories) کو کارخانہ دار کی ہدایات پر عمل کرتے ہوئے cDNA کی ترکیب کے لیے ایک ٹیمپلیٹ کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ مختصراً، cDNA ترکیب کا رد عمل 3 مراحل پر مشتمل ہوتا ہے: \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ پر پرائمنگ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , \({20}\,{\hbox {min}}\) کی ریورس ٹرانسکرپشن \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)، اور ریورس ریکارڈر \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) \({1}\,{\hbox {منٹ) میں ہے۔ }}\).جب 1% ایگروز جیل پر چلایا جاتا ہے، تو cDNA نے متوقع تین RNA ٹکڑوں کے مطابق تین بینڈ دکھائے تھے (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا)۔ درج ذیل پرائمر 117 اور 503 bp کے دو DNA ٹکڑوں کو بڑھانے کے لیے استعمال کیے گئے تھے، miniPCR® mini8 تھرمل سائیکلر میں PCR کے لیے بطور ٹیمپلیٹ cDNA استعمال کرنا:
\(117\,\hbox {bp}\) اور \(503\,\hbox {bp}\) کے پرائمر M طبقہ کے 1476-1575 نیوکلیوٹائڈس اور L طبقہ کے 458-943 نیوکلیوٹائڈز کے مطابق ہیں، بالترتیب تیزاب۔ .تمام ایمپلیفائیڈ پی سی آر پروڈکٹس کو 1% ایگروز جیلوں پر الیکٹروفورس کیا گیا تھا، اور جنی جے ای ٹی جیل ایکسٹریکشن کٹ (تھرمو فشر سائنٹیفک) کا استعمال کرتے ہوئے ایمپلیفائیڈ ٹارگٹ ڈی این اے کو صاف کیا گیا تھا۔
آئی آئی ٹی ممبئی کیمپس میں ایک جھیل (پوائی جھیل، پووائی، ممبئی) فیز کے ذرات کو شامل کرنے کے لیے استعمال کی گئی تھی۔ جھیل کے پانی کو ہٹانے کے لیے \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) جھلی کے ذریعے فلٹر کیا گیا تھا۔ معطل شدہ ذرات، اور پھر Phi6 فیز شامل کر دیا گیا۔ \({1}\,{\hbox {ml}}\) \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} کا اضافہ کریں \) سے \({100}\ ,{\hbox {ml}}\) فلٹر شدہ جھیل کے پانی، \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\) میں۔ایک چھوٹا سا الکوٹ تھا۔ پلاک پرکھ کے ذریعے وائرل لوڈ کی پیمائش کے لیے محفوظ ہے۔ ہم نے تیز Phi6 وائرس کے ذرات کو مرتکز کرنے کے لیے دو مختلف طریقوں کا تجربہ کیا: (1) ایلومینیم ہائیڈرو آکسائیڈ جذب کرنے کا طریقہ، 19 جسے ماحولیاتی نمونوں سے کئی لفافے RNA وائرس کے ارتکاز کے لیے درست کیا گیا ہے، اور (2) ) پولی تھیلین گلائکول (پی ای جی) پر مبنی وائرس کی حراستی کا طریقہ فلڈ ایٹ ال سے اپنایا گیا تھا۔20 .چونکہ پی ای جی پر مبنی طریقہ کی بازیابی کی کارکردگی ایلومینیم ہائیڈرو آکسائیڈ کے طریقہ کار سے بہتر پائی گئی، پی ای جی پر مبنی طریقہ جھیل کے پانی کے نمونوں سے Phi6 ذرات کو مرتکز کرنے کے لیے استعمال کیا گیا۔
PEG طریقہ استعمال کیا گیا تھا: PEG 8000 اور \(\hbox {NaCl}\) Phi6-spiced جھیل کے پانی کے نمونوں میں 8% PEG 8000 اور \(0.2\,\hbox {M} \) حاصل کرنے کے لیے شامل کیے گئے تھے۔ \ hbox {NaCl}\). نمونے ایک شیکر پر لگائے گئے تھے\({4}\,{^{\circ}\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ )، پھر \(4700 \,\hbox {g}\) پر سینٹرفیوج کیا جاتا ہے \({45}\,{\hbox {min}}\)۔ سپرنٹنٹ کو خارج کر دیں اور گولی کو \({1}\,) میں دوبارہ معطل کریں۔ {\hbox {ml}}\) ایک ہی سپرنٹنٹ میں۔ تمام اسپائکنگ اور وائرس کے ارتکاز کے تجربات سہ رخی میں کیے گئے تھے۔ ارتکاز کے بعد، پلاک پرکھ کے ذریعے بحالی کی کارکردگی کی پیمائش کے لیے ایک چھوٹا سا ایلیکوٹ محفوظ کیا گیا تھا۔ RNA کو الگ تھلگ کیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا کٹ کے ذریعے فراہم کردہ ایلیوشن بفر\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\) میں۔چونکہ RNA کا ارتکاز ایک نمونے سے دوسرے نمونے تک مختلف ہوگا، اس لیے \({2}\,{\upmu \ RNA کا hbox {l}}\) ان تینوں کے لیے استعمال کیا جاتا ہے قطع نظر اس کے سی ڈی این اے کی ارتکاز کے نمونے کی ترکیب۔ cDNA کی ترکیب کو انجام دیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے۔\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA۔ 35 سائیکلوں کے لیے \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR کے لیے بطور ٹیمپلیٹ استعمال کیا گیا تھا \(117\,\hbox {bp}\) اور \(503\,\hbox { bp}\) ٹکڑے۔ ان نمونوں کو "1:1″ کے طور پر دکھایا گیا ہے، یعنی بغیر کسی کمزوری کے۔ ایک نو ٹیمپلیٹ کنٹرول (NTC) کو منفی کنٹرول کے طور پر ترتیب دیا گیا تھا، جب کہ پیوریفائیڈ فیز سے الگ تھلگ RNA کا استعمال کرتے ہوئے ایک cDNA ترکیب کیا گیا تھا۔ مثبت کنٹرول (PC) کے سانچے کے طور پر۔ کوانٹیٹیو PCR (qPCR) کو Stratagene Mx3000P RT-PCR آلے میں شاندار III الٹرا فاسٹ SYBR گرین QPCR ماسٹر مکس (ایجیلنٹ ٹیکنالوجیز) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا تھا۔ بیان کیا گیا ہے۔ تمام نمونوں کے لیے سائیکل کی حد (Ct) ریکارڈ کی گئی تھی۔ اس کے علاوہ، پتلے ہوئے نمونے \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA کو فلٹر شدہ جھیل کے پانی میں 1:100 کا استعمال کرتے ہوئے تھے۔ \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) 35 سائیکلوں کے لیے PCR۔ ان نمونوں کو "1:100″ کے طور پر دکھایا گیا ہے۔
پی سی بی الیکٹروڈز کو تجارتی طور پر دستیاب کم لاگت والے الیکٹرو لیس نکل وسرجن گولڈ (ENIG) کے عمل کا استعمال کرتے ہوئے بنا یا گیا ہے جس میں اضافی گولڈ چڑھانے کی ضرورت نہیں ہے۔ ENIG PCB الیکٹروڈ کی وضاحتیں ہمارے پچھلے کام میں تفصیل سے دی گئی ہیں۔ ENIG PCB الیکٹروڈ کے لیے، روایتی الیکٹروڈ صفائی کے طریقے جیسے کہ پیرانہ محلول یا سلفیورک ایسڈ سائکلک وولٹامیٹری کی سفارش نہیں کی جاتی ہے کیونکہ یہ سونے کی پتلی تہہ (موٹائی \(\تقریبا\) \(100\,\hbox {nm }\)) کو چھیلنے کا سبب بن سکتے ہیں اور تانبے کی بنیادی تہوں کو بے نقاب کر سکتے ہیں جو کہ شکار ہیں۔ سنکنرن کے لیے 21, 22, 23, 24, 25۔ اس لیے، IPA کے ساتھ گیلے ہوئے لنٹ فری کپڑے سے الیکٹروڈز کو صاف کریں۔ جس نمونے کی جانچ کی جائے گی اسے \({50}\,{\upmu\hbox {M}) سے لگایا گیا تھا۔ }\) MB in \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) آسان اندراج کے لیے۔ ہمارے پچھلے کام میں ، ہم نے مشاہدہ کیا کہ سینسر کی حساسیت اور خطوطی کو MB کے ارتکاز میں اضافہ کرکے بہتر کیا گیا ہے۔ ہمارے پہلے کام میں اطلاع دی گئی اصلاح کی بنیاد پر، ہم نے \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB کا استعمال کیا۔ اس مطالعے میں ڈی این اے کو سرایت کرنے کے لیے ارتکاز۔ ڈبل پھنسے ہوئے ڈی این اے (ds-DNA) کی الیکٹرو کیمیکل شناخت anionic یا cationic intercalators کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کی جا سکتی ہے۔ اگرچہ anionic intercalators بہتر انتخاب کے ساتھ DNA کا پتہ لگاتے ہیں، انہیں راتوں رات انکیوبیشن کی ضرورت ہوتی ہے، جس کے نتیجے میں پتہ لگانے کا وقت زیادہ ہوتا ہے۔ دوسری طرف، کیٹیشنک انٹرکیلیٹرس جیسے ایم بی کو ds-DNA6 کی الیکٹرو کیمیکل شناخت کے لیے کم انکیوبیشن اوقات کی ضرورت ہوتی ہے، تقریباً \({1}\,{\hbox {h}}\)۔ الیکٹروڈ\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\)، پھر کسی اور نمونے کے ساتھ آگے بڑھنے سے پہلے، IPA سے نمی شدہ چیتھڑے سے صاف کریں۔ایک پیمائش۔ ہر نمونے کا 5 مختلف الیکٹروڈز پر تجربہ کیا گیا جب تک کہ دوسری صورت میں بیان نہ کیا گیا ہو۔ DPV اور CV کی پیمائش PalmSens Sensit Smart potentiostat کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی تھی، اور PSTrace سافٹ ویئر کو potentiostat کی ترتیب اور ڈیٹا کے حصول کے لیے استعمال کیا گیا تھا، بشمول چوٹی کے موجودہ حسابات۔ درج ذیل ترتیبات استعمال کی جاتی ہیں۔ DPV اور CV پیمائش کے لیے:
DPV: توازن کا وقت = \(8\,\hbox {s}\), وولٹیج مرحلہ = \(3\,\hbox {mV}\), پلس وولٹیج = \(25\,\hbox {mV}\)، نبض کا دورانیہ = \(50\,\hbox {ms}\), اسکین کی شرح = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: متوازن وقت = \(8\,\hbox {s}\), وولٹیج مرحلہ = \(3\,\hbox {mV}\), سویپ ریٹ = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV، (b) \ کے ساتھ پیچیدہ DNA کے وولٹاموگرامس سے حاصل کردہ چوٹی کرنٹ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV۔
DPV اور CV وولٹاموگرامس ENIG PCB الیکٹروڈس \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB DNA کے ساتھ کمپلیکس پر حاصل کیے گئے تھے (10–\({20}\,{\ hbox {ng کی تعداد میں) }/{\upmu \hbox {l}}}\) یعنی 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(117\,\hbox {bp}\ ) اور 0.03 کے لیے –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(503\,\hbox {bp}\) کے لیے۔ نمائندہ وولٹاموگرامس کو ضمنی معلومات میں شکل S1 میں دکھایا گیا ہے۔ شکل 2 نتائج دکھاتی ہے۔ جیل پیوریفائیڈ پی سی آر پروڈکٹس کا استعمال کرتے ہوئے ڈی پی وی اور سی وی کی پیمائش (چوٹی کرنٹ)۔ باکس پلاٹ میں ہر باکس کے لیے 5 الیکٹروڈ سے پیمائش ہوتی ہے۔ تمام پیمائشیں الیکٹروڈ سے الیکٹروڈ تغیر کی وجہ سے پیمائش کی غلطیوں سے بچنے کے لیے الیکٹروڈ کے ایک ہی سیٹ کا استعمال کرتی ہیں۔ ہم نے ڈی این اے کے کم ارتکاز کے لیے DPV اور CV ماپنے والے چوٹی کرنٹ میں بڑھتے ہوئے رجحان کا مشاہدہ کیا۔ , طویل (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ کے مقابلے میں \(117) ) ٹکڑے۔ یہ ہمارے پچھلے کام میں رپورٹ کردہ الیکٹروڈ جذب کے متوقع رجحان سے مطابقت رکھتا ہے۔ MB-DNA کمپلیکس کا جذب الیکٹروڈ پر چارج کی منتقلی کو آسان بناتا ہے، جو چوٹی کرنٹ میں اضافے میں معاون ہوتا ہے۔ دیگر مطالعات نے MB-DNA انٹرکلیشن پر oligonucleotide سائز اور ترتیب کا اثر دکھایا ہے۔ 27,28,29,30. Guanine دو ایمپلیونز (\(117\,\hbox {bp}\) اور \(503\,\hbox {bp}\)) میں سائٹوسین (GC) کا مواد تقریباً 50% تھا، جو اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ مشاہدے میں فرق کی وجہ سے ہے۔ تاہم، اعلی ڈی این اے ارتکاز (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), \(503\,\hbox {bp} کے لیے \) اور \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) \(117\,\hbox {bp}\) کے لیے)، ہم دو وسعتوں کا مشاہدہ کرتے ہیں۔ DPV اور CV دونوں پیمائشوں میں سبس کے چوٹی کے کرنٹ کو کم کیا جاتا ہے۔ اس کی وجہ یہ ہے کہ MB DNA کے بیس جوڑوں کے درمیان سیچوریٹ اور انٹرکیلیٹ ہوتا ہے، جس کے نتیجے میں MB31,32 میں کمی پذیر گروپ کی ریڈوکس سرگرمی کی سٹرک روک تھام ہوتی ہے۔
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV۔
پی سی آر ماسٹر مکسز میں موجود نمکیات ایم بی اور ڈی این اے کے درمیان الیکٹرو سٹیٹک تعاملات میں مداخلت کرتے ہیں، اس لیے \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) کو \({50} \,{\) کے ساتھ شامل کر کے upmu \hbox {M}}\) MB جیل سے پیوریفائیڈ پروڈکٹ MB-DNA تعامل پر نمک کے اثر کا مطالعہ کرنے کے لیے۔ جیسا کہ شکل 3 میں دکھایا گیا ہے، ہم نے مشاہدہ کیا کہ DNA کی زیادہ تعداد کے لیے (\(>{2}\,{\) hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) اور \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) \(117\,\hbox {bp} \)) کے لیے، DPV اور CV میں نمک کے اضافے سے پیمائش پر کوئی خاص اثر نہیں پڑا (نمائندہ وولٹاموگرامس کے لیے ضمنی معلومات میں شکل S2 دیکھیں) تاہم، پر کم ڈی این اے ارتکاز، نمک کے اضافے سے حساسیت بہت کم ہو جاتی ہے، جس کے نتیجے میں ڈی این اے کے ارتکاز کے ساتھ کرنٹ میں کوئی خاص تبدیلی نہیں آتی۔ MB-DNA کے تعاملات اور تعاملات پر نمک کے اسی طرح کے منفی اثرات پہلے دوسرے محققین 33,34 کے ذریعے رپورٹ کر چکے ہیں۔\(\hbox { Mg}^{2+}\) کیشنز ڈی این اے کے منفی فاسفیٹ ریڑھ کی ہڈی سے منسلک ہوتے ہیں، اس طرح ایم بی اور ڈی این اے کے درمیان الیکٹرو اسٹاٹک تعامل میں رکاوٹ پیدا ہوتی ہے۔ زیادہ ڈی این اے ارتکاز پر، ریڈوکس ایکٹیو ایم بی کی سٹرک روکنا نچلی چوٹی کرنٹ کا نتیجہ ہوتا ہے، لہذا الیکٹرو اسٹاٹک تعاملات سینسر کے ردعمل کو نمایاں طور پر متاثر نہیں کرتے ہیں۔ اہم نکتہ یہ ہے کہ یہ بائیو سینسر زیادہ DNA کی حراستی کا پتہ لگانے کے لیے بہتر ہے (شاذ و نادر ہی \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) یا اس سے زیادہ)، ماحولیاتی پانی کے نمونوں کی مکمل طور پر خودکار پروسیسنگ کے لیے، جہاں PCR مصنوعات کی جیل پیوریفیکیشن ممکن نہ ہو۔
ڈی این اے کے مختلف ارتکاز کے لیے طول موج کی حد 600–700 \(\hbox {nm}\) کے لیے جذب وکر کے نیچے کا رقبہ \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) نمک کے ساتھ اور بغیر نمک (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) نمک کے ساتھ اور بغیر نمک (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)))\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB کے نمونے کوئی DNA نہیں ہے۔
مندرجہ بالا نتائج کی مزید تصدیق کرنے کے لیے، ہم نے UV/Vis spectrophotometer (Thermo Scientific Multiskan GO) کا استعمال کرتے ہوئے آپٹیکل پیمائش کی، ہر ایک کے لیے نمونے \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) استعمال کیے گئے تھے۔ پیمائش۔ ڈی این اے کے بڑھتے ہوئے ارتکاز کے ساتھ جذب کے دستخط میں کمی آتی ہے، جیسا کہ طول موج کی حد \(600\,\hbox {nm}\) سے \(700\,\hbox} کے لیے جذب وکر کے نیچے علاقے کے رجحان سے دیکھا جا سکتا ہے۔ nm}\)، جیسا کہ تصویر 4 میں دکھایا گیا ہے (اضافی معلومات میں تصویر S3 میں دکھایا گیا ہے)۔ \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu\hbox) سے کم ڈی این اے کے ارتکاز والے نمونوں کے لیے {l}}}، ڈی این اے پر مشتمل اور صرف ایم بی کے نمونوں (کے لیے \(503\,\hbox {bp}\) اور \(117\,\hbox {bp}\) کے درمیان لینے میں کوئی خاص فرق نہیں تھا۔ ) لمبائی کے ٹکڑے)، redox-active MB کے steric inhibition کی عدم موجودگی کی نشاندہی کرتے ہیں۔ زیادہ DNA concentrations پر، ہم نے جاذب سگنل میں بتدریج کمی دیکھی اور نمک کی موجودگی میں جاذبیت میں کم کمی نوٹ کی۔ ان نتائج کو مالیکیولر سے منسوب کیا گیا۔ ڈی این اے ہائبرڈز میں بیس اسٹیکنگ کے ساتھ تعاملات اور سٹرک روکنا۔ ہمارے نتائج MB-DNA انٹرکلیشن کے سپیکٹروسکوپک اسٹڈیز پر لٹریچر میں رپورٹس سے مطابقت رکھتے ہیں جو \(\pi\)-\(\pi ^*\) میں کم توانائی کی سطح کے ساتھ ہائپوکرومیٹیٹی کو جوڑتے ہیں۔ ) انٹرکلیشن پرتوں کی وجہ سے الیکٹرانک ٹرانزیشنز 36, 37, 38۔
فیج Phi6 کا ایگروز جیل الیکٹروفورسس: جھیل کے پانی کے نمونوں سے پی سی آر کی لمبائی \(117\,\hbox {bp}\) اور \(503\,\hbox {bp}\) کی مصنوعات۔ M-DNA مارکر؛این ٹی سی-نو-ٹیمپلیٹ کنٹرول، متعلقہ ایمپلی کون پر مشتمل پرائمر؛پی سی مثبت کنٹرول؛1، 2، 3-انڈیلیٹڈ (1:1) جھیل کے پانی کے نمونے سہ رخی میں۔ \(503\,\) میں غیر استعمال شدہ اولیگونیوکلیوٹائڈس کی وجہ سے ایک بینڈ \(\تقریباً 50\,\hbox {bp}\) پر دکھائی دیتا ہے۔ hbox {bp}\) لین۔
ہم نے پوائی جھیل کے پانی کے نمونوں کا استعمال کرتے ہوئے سینسر کی افادیت کا جائزہ لیا جو Phi6 فیج کے ساتھ بڑھے ہوئے تھے۔ فیز اسپائک پانی کے نمونوں سے الگ تھلگ RNA کی تعداد 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\)، جب کہ پیوریفائیڈ فیز سسپنشنز سے الگ تھلگ RNA کا تخمینہ تقریباً 1 کی بازیابی کی کارکردگی کے ساتھ \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) تھا۔ %.RNA کو cDNA میں الٹا نقل کیا گیا تھا اور PCR اور qPCR کے سانچے کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ پروڈکٹ کے سائز کی تصدیق ایگروز جیل الیکٹروفورسس (شکل 5) سے سینسر کے ساتھ جانچ سے پہلے کی گئی تھی۔ یہ نمونے جیل سے پاک نہیں ہیں اور اس لیے پی سی آر کے تمام اجزاء پر مشتمل ہیں۔ اس کے ساتھ ساتھ دلچسپی کے امپلیون بھی۔ qPCR (ٹیبل 1) کے دوران ریکارڈ کی گئی Ct قدریں متعلقہ تیز پانی کے نمونوں سے الگ تھلگ RNA کے ارتکاز کے ساتھ تعلق رکھتی ہیں۔ Ct قدر فلوروسینٹ سگنل کے لیے درکار سائیکلوں کی تعداد کو ظاہر کرتی ہے۔ حد یا بیک گراؤنڈ سگنل سے تجاوز کریں۔ اعلیٰ Ct قدریں ٹیمپلیٹ کی کم ارتکاز کی نشاندہی کرتی ہیں اور اس کے برعکس۔ NTC نمونوں کی Ct قدریں توقع کے مطابق زیادہ تھیں۔ \(\تقریباً 3\) Ct اقدار کے درمیان فرق مثبت کنٹرول اور ٹیسٹ کا نمونہ مزید اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ ہر ٹیسٹ کے نمونے میں مثبت کنٹرول کے مقابلے میں تقریباً 1% ٹیمپلیٹ ہوتا ہے۔ ہم نے پہلے بات کی ہے کہ لمبے amplicons بہتر حساسیت کا باعث بنتے ہیں۔ نقصانات کے پیش نظر متفاوت ماحولیاتی نمونوں سے الگ تھلگ لمبے ٹکڑوں کو بڑھانا مشکل ہے۔ کم وائرل ارتکاز اور آر این اے انحطاط۔ تاہم، ہمارے وائرس افزودگی اور پی سی آر ایمپلیفیکیشن پروٹوکول کے ساتھ، ہم الیکٹرو کیمیکل سینسنگ کے لیے \(503\,\hbox {bp}\) ٹکڑے کو کامیابی کے ساتھ بڑھانے میں کامیاب رہے۔
شکل 6 میں \(503\,\hbox {bp}\) فریگمنٹ ایمپلیکن کے الیکٹرو کیمیکل سینسر کے نتائج دکھائے گئے ہیں، دونوں ٹیمپلیٹ (1:1) کے طور پر undiluted cDNA اور 100-fold diluted cDNA کو بطور ٹیمپلیٹ (1:100) PCR پرفارم کر رہے ہیں۔ NTC اور PC کے مقابلے (نمائندہ وولٹاموگرامس کے لیے ضمنی معلومات میں شکل S4 دیکھیں)۔ تصویر 6 میں باکس پلاٹ کے ہر باکس میں 5 الیکٹروڈ پر تین نمونوں کی پیمائش شامل ہے۔ الیکٹروڈ کی وجہ سے ہونے والی غلطیوں سے بچنے کے لیے تمام نمونوں کی پیمائش کے لیے وہی الیکٹروڈ استعمال کیے گئے تھے۔ - سے الیکٹروڈ تغیر۔ CV پیمائش کے مقابلے میں، DPV پیمائشیں ٹیسٹ اور پی سی کے نمونوں کو NTCs سے ممتاز کرنے کے لیے بہتر ریزولیوشن دکھاتی ہیں کیونکہ جیسا کہ پہلے ذکر کیا گیا ہے، فارادیک کرنٹ بعد میں پس منظر کیپسیٹیو کرنٹ کی وجہ سے چھپے ہوئے ہیں۔ طویل ایمپلیونز کے لیے، ہم نے مشاہدہ کیا کہ منفی کنٹرول (NTC) کے نتیجے میں مثبت کنٹرول کے مقابلے میں اعلی CV اور DPV چوٹی کے کرنٹ نکلے، جب کہ مثبت اور غیر منقطع ٹیسٹ کے نمونوں نے DPV چوٹی کے دھاروں کی ایک جیسی چوٹی کی اونچائی ظاہر کی۔ ) ٹیسٹ کے نمونے اور پی سی کو NTC نمونے کے لیے سینسر آؤٹ پٹ سے واضح طور پر حل کیا جا سکتا ہے، جب کہ 1:100 پتلے نمونے کے لیے ریزولوشن کم واضح ہے۔ (شکل 5 میں لینز نہیں دکھائے گئے)، اور متعلقہ DPV اور CV چوٹی کے کرنٹ NTC کے لیے متوقع تھے۔ \(117\,\hbox {bp}\) ٹکڑے کے نتائج ضمنی معلومات میں دکھائے گئے ہیں۔ منفی کنٹرول نے پی سی بی سینسر سے الیکٹروڈ پر فری ایم بی کے جذب اور سنگل اسٹرینڈ پرائمر اولیگونوکلیوٹائڈ کے ساتھ ایم بی کے تعامل کی وجہ سے الیکٹرو کیمیکل ردعمل پیدا کیا۔ اس لیے، جب بھی نمونے کی جانچ کی جاتی ہے، منفی کنٹرول چلایا جانا چاہیے اور ٹیسٹ کے نمونے کا چوٹی کرنٹ منفی کنٹرول کے ذریعے حاصل کردہ چوٹی کرنٹ کے مقابلے میں فرق (رشتہ دار) پیمائش حاصل کرنے کے لیے 39,40 ٹیسٹ کے نمونے کو مثبت یا منفی کے طور پر درجہ بندی کرنے کے لیے۔
(a) DPV، اور (b) جھیل کے پانی کے نمونوں میں \(503\,\hbox {bp}\) ٹکڑوں کی الیکٹرو کیمیکل پتہ لگانے کے لیے CV چوٹی کرنٹ۔ ٹیسٹ کے نمونوں کو سہ رخی میں ماپا گیا اور ان کا موازنہ بغیر کسی ٹیمپلیٹ کنٹرول (NTC) اور مثبت کنٹرول (PC)
ہمارے نتائج مختلف ڈی این اے کے لیے مختلف لمبائیوں کے ایمپلیونز کے لیے الیکٹرو کیمیکل سینسر کی کارکردگی کو متاثر کرنے والے مختلف میکانزم کی وضاحت کرتے ہیں، جس میں UV/Vis spectrophotometer کا استعمال کرتے ہوئے نظری پیمائش کے ذریعے تصدیق شدہ ارتکاز ہوتا ہے۔ ہمارے مشاہدات اس بصیرت کو واضح کرتے ہیں کہ DNA کے ٹکڑے \(\ تقریبا\) تک ہوتے ہیں۔ \(500\,\hbox {bp}\) کو زیادہ حساسیت کے ساتھ پتہ لگایا جا سکتا ہے اور یہ کہ نمونے میں نمک کی موجودگی DNA کی حساسیت کو متاثر نہیں کرتی ہے جو زیادہ حساسیت کو متاثر کرتی ہے (شاذ و نادر ہی \({\hbox {ng}/{\upmu) \hbox {l}}}\) اور اس سے اوپر)۔ اس کے علاوہ، ہم نے مختلف قسم کے نمونوں کے اثر کی چھان بین کی، بشمول شامل کردہ نمک کے ساتھ اور بغیر جیل پیوریفائیڈ ایمپلی کون، اور DPV اور CV پیمائش میں جھیل کے پانی کے نمونوں کا اضافہ۔ہم نے مشاہدہ کیا کہ DPV نے بہتر ریزولیوشن فراہم کیا، کیونکہ پس منظر کیپسیٹیو کرنٹ بھی CV کی پیمائش کو متاثر کرتا ہے، جس سے یہ کم حساس ہوتا ہے۔
لمبے ٹکڑوں کی افزائش کا انحصار وائرل جینومک RNA کی سالمیت پر ہوتا ہے۔ متعدد مطالعات سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ ماحول میں RNA کی تنزلی اور تنہائی کے دوران الگ ہونے کے امکانات کی وجہ سے لمبے ٹکڑوں کو بڑھانا ہمیشہ کارگر نہیں ہوتا۔ .ہم نے مشاہدہ کیا کہ پی ای جی پر مبنی وائرس کے ارتکاز کا طریقہ ایلومینیم ہائیڈرو آکسائیڈ پر مبنی وائرس کے ارتکاز کے طریقے کے مقابلے جھیل کے پانی کے نمونوں میں فیج Phi-6 کو مرتکز کرنے میں زیادہ موثر تھا۔ DNA کے لمبے ٹکڑوں کا پتہ لگانے کی صلاحیت ملٹی پلیکس PCR کی ضرورت پر قابو پانے کے لیے ثابت ہوئی۔ ایک سے زیادہ چھوٹی لمبائی کے ٹیمپلیٹس کو بڑھانا اور کراس اسپیسیسیٹی کے امکان کو کم کرنا۔
حیاتیاتی نمونے نایاب ہیں، اس لیے ایک بائیو سینسر ڈیزائن کرنے کی ضرورت ہے جس کے لیے جانچ کے لیے کم سے کم نمونوں کی ضرورت ہے۔ اس تحقیق میں استعمال ہونے والے ENIG PCB الیکٹروڈز کی ضرورت ہے صرف \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) الیکٹروڈز کے مؤثر علاقے کا احاطہ کرنے کے لیے جانچ کے لیے نمونے۔ مزید برآں، اگلے نمونے کو تقسیم کرنے سے پہلے صفائی کے بعد اسی الیکٹروڈ کو دوبارہ استعمال کیا جا سکتا ہے۔ ایمپلیفائیڈ نمونوں میں میتھیلین بلیو کے علاوہ کسی اور کیمیکل کے اضافے کی ضرورت نہیں ہوتی، جو کہ ایک سستا ہے۔ اور عام طور پر استعمال ہونے والا کیمیکل۔ چونکہ ہر الیکٹروڈ کی تیاری میں تقریباً $0.55 (یا INR 40) لاگت آتی ہے، اس لیے یہ بائیو سینسر موجودہ پتہ لگانے والی ٹیکنالوجیز کے لیے ایک سستا متبادل ہو سکتا ہے۔ متضاد نمونوں میں ڈی این اے کے ٹکڑے۔
یہ دیکھتے ہوئے کہ MB پر مبنی الیکٹرو کیمیکل پتہ لگانے کے پروٹوکول PCR کی مخصوصیت پر انحصار کرتے ہیں، اس طریقہ کار کی ایک بڑی حد متضاد نمونوں جیسے کہ گندے پانی اور جھیل کے پانی میں غیر مخصوص پرورش کی صلاحیت ہے یا کم طہارت والے پرائمر کا استعمال کرنا ہے۔ غیر ترمیم شدہ ENIG PCB الیکٹروڈ کا استعمال کرتے ہوئے غیر پیوریفائیڈ PCR مصنوعات کے DNA کا پتہ لگانے کے الیکٹرو کیمیکل پتہ لگانے کے طریقے، غیر استعمال شدہ dNTPs اور پرائمر کے ذریعے متعارف کرائی گئی غلطیوں کو بہتر طور پر سمجھنا اور رد عمل کے حالات اور پرکھ کے پروٹوکول کو بہتر بنانے کے لیے ضروری ہے۔ پیمائش کی درستگی کو بہتر بنانے کے لیے پانی کے نمونے کی آکسیجن کی طلب (BOD) کو بھی ناپا جانے کی ضرورت ہو سکتی ہے۔
آخر میں، ہم ماحولیاتی (جھیل کے پانی) کے نمونوں میں وائرس کا پتہ لگانے کے لیے ایک کم لاگت والا الیکٹرو کیمیکل ENIG PCB سینسر تجویز کرتے ہیں۔ DNA سینسنگ کے لیے غیر متحرک اولیگونیوکلیوٹائڈ الیکٹروڈز یا حسب ضرورت ذیلی جگہوں کے برعکس جن کو حساسیت برقرار رکھنے کے لیے کرائیوجینک اسٹوریج کی ضرورت ہوتی ہے، 53,54 ہماری تکنیک غیر ترمیم شدہ PCB کا استعمال کرتی ہے۔ طویل شیلف لائف کے ساتھ الیکٹروڈز اور اسٹوریج کی کوئی خاص ضرورت نہیں ہے اور اس وجہ سے LMICs میں تعینات خودکار نمونہ پروسیسنگ کے ساتھ پیمائش کے حل کی ترقی کے لیے موزوں ہے۔ بائیو سینسر ہدف ایمپلی کنز کی تیزی سے پتہ لگانے کے لیے سستے ڈی این اے-انٹرکلیٹنگ ریڈوکس رنگوں (MB) کا استعمال کرتا ہے۔ ماحولیاتی نمونوں میں عام طور پر MBs کے سنگل اور ڈبل سٹرینڈڈ oligonucleotides کے غیر مخصوص پابند ہونے کی وجہ سے اس سینسنگ طریقہ کی خصوصیت کو کم کر دیتا ہے۔ اس لیے، اس ٹیسٹ کی خصوصیت پرائمر اور PCR کے رد عمل کے حالات کی اصلاح پر منحصر ہے۔ اس کے علاوہ، CV اور ٹیسٹ شدہ نمونوں سے حاصل کردہ DPV چوٹی کے کرنٹ کی ہر ٹیسٹ کے لیے منفی کنٹرول (NTC) سے حاصل کردہ جوابات کے مطابق تشریح کی جانی چاہیے۔ اس کام میں پیش کیے گئے الیکٹرو کیمیکل سینسر کے ڈیزائن اور طریقوں کو آٹو سیمپلرز کے ساتھ مربوط کیا جا سکتا ہے تاکہ مکمل طور پر خودکار اور کم - لاگت کا حل جو نمونے جمع اور تجزیہ کر سکتا ہے اور نتائج کو وائرلیس طور پر لیبارٹری میں منتقل کر سکتا ہے۔
کیش ڈالر، جے اینڈ وائمر، ایل پانی کے نمونوں سے وائرس کے ابتدائی ارتکاز کے طریقے: حالیہ مطالعات کا جائزہ اور میٹا تجزیہ۔ جے۔Application.microorganism.115، pp. 1-11 (2013)۔
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL پانی سے پیدا ہونے والے وائرس: پینے کے صاف پانی میں رکاوٹیں. PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015)۔
کم اور درمیانی آمدنی والے ممالک میں COVID-19 کی لاگت سے موثر بڑے پیمانے پر نگرانی کے لیے شریستھا، ایس ایٹ ال ویسٹ واٹر ایپیڈیمولوجی: چیلنجز اور مواقع۔ واٹر 13، 2897 (2021)۔
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112، 3427–3481 (2012)۔
تانی، اے.، تھامسن، اے جے اینڈ بٹ، جے این میتھیلین بلیو ایک الیکٹرو کیمیکل امتیاز کرنے والے کے طور پر سونے کے ذیلی ذخائر پر متحرک واحد اور ڈبل پھنسے ہوئے اولیگونوکلیوٹائڈس۔ تجزیہ کار 126، 1756–1759 (2001)۔
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparison of Cation and Anion Intercalators for DNA Hybridization کے Electrochemical Transduction by long-range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004)۔
وونگ، ای ایل اور گوڈنگ، جے جے چارج ٹرانسفر بذریعہ ڈی این اے: ایک سلیکٹیو الیکٹرو کیمیکل ڈی این اے بائیو سینسر۔انس۔کیمیکل۔78، 2138–2144 (2006)۔
Fang, TH et al. ریئل ٹائم PCR مائیکرو فلائیڈک ڈیوائس جس میں کنکرنٹ الیکٹرو کیمیکل ڈیٹیکشن۔ بائیولوجیکل سینسر۔ بائیو الیکٹرانکس۔24، 2131–2136 (2009)۔
Win, BY et al. DNA کے ساتھ میتھیلین بلیو کے تعامل پر مبنی الیکٹرو کیمیکل ریئل ٹائم پی سی آر سسٹم کی سگنلنگ میکانزم کا مطالعہ اور کارکردگی کی تصدیق۔ تجزیہ کار 136، 1573–1579 (2011)۔
Ramirez-Chavaria, RG et al.Loop-mediated isothermal amplification-based electrochemical sensor for sars-cov-2 کے گندے پانی کے نمونوں میں۔Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022)۔
کمار، M. et al. PCB الیکٹروڈ کے ساتھ SARS-CoV-2 amplicons کی الیکٹرو کیمیکل سینسنگ۔ سینسر فعال ہو گیا ہے۔B Chemistry.343, 130169 (2021)۔
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. گندے پانی کے ٹھوس حصے میں SARS-CoV-2 RNA کا موثر پتہ لگانا.science.general environment.763, 144587 (2021)۔
Alygizakis, N. et al. گندے پانی میں SARS-CoV-2 کا پتہ لگانے کے لیے تجزیاتی طریقے: پروٹوکول اور مستقبل کے تناظر۔TraC رجحان ساز anal.Chemical.134, 116125 (2020)۔
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. شیشے کی سطحوں پر جمع ہونے والے بخارات سے بنی تھوک کی بوندوں میں لفافہ بیکٹیریوفیج Phi6 (SARS-CoV-2 کے لیے ایک سروگیٹ) کی بقا۔10، 1–10 (2020)۔
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ آزاد زندگی گزارنے والے امیبا میں SARS-CoV-2 سروگیٹ (Phi6) کی ماحولیاتی استقامت۔پانی کی صحت 20، 83 (2021)۔
Mindich, L. ڈبل پھنسے ہوئے RNA بیکٹیریوفیج\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev کے تین جینومک ٹکڑوں کی درست پیکیجنگ۔63، 149–160 (1999)۔
Pirttimaa, MJ & Bamford, DH RNA phage\(\varphi\)6 پیکیجنگ ریجن کا ثانوی ڈھانچہ۔RNA 6, 880–889 (2000)۔
Bonilla, N. et al. Phages on the Tap – بیکٹیریوفیجز کے لیبارٹری اسٹاک کی تیاری کے لیے ایک تیز اور موثر پروٹوکول۔ PeerJ 4, e2261 (2016)۔