Дякуємо за відвідування Nature.com. Версія веб-переглядача, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS. Для найкращої роботи радимо використовувати оновлений веб-переглядач (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Тим часом, щоб забезпечити продовження підтримки, ми будемо відображати сайт без стилів і JavaScript.
Важливість моніторингу зразків навколишнього середовища була високо оцінена з початку пандемії COVID-19, і деякі зусилля з моніторингу виконуються з використанням золотого стандарту, хоча методи на основі кПЦР є дорогими. Електрохімічні біосенсори ДНК можуть стати потенційно економічно ефективним рішення для моніторингу зразків води в навколишньому середовищі в країнах з низьким і середнім рівнем доходу. У цій роботі ми демонструємо електрохімічне виявлення ампліконів, отриманих із фага Phi6, виділеного зі зразків озерної води (популярний сурогат SARS-CoV-2), за допомогою ENIG для завершення електродів друкованої плати без модифікації поверхні.стать. Відповідь електрохімічного сенсора була ретельно охарактеризована для двох фрагментів ДНК різної довжини (\({117}\,\hbox {bp}\) і \({503}\,\hbox {bp}\)), і вплив солей у головних сумішах ПЛР на взаємодію метиленового синього (МВ) з ДНК. Наші результати показують, що довжина фрагментів ДНК суттєво визначає електрохімічну чутливість, і демонструють у цій роботі, що здатність виявляти довгі амплікони без очищення продуктів ПЛР гелем є важливі для вимірювання зразків води на місці.Повністю автоматизоване рішення для боротьби з вірусним навантаженням є хорошим передвісником.
Передача вірусу, що передається через воду, відома як небезпека для громадського здоров’я з 1940-х років, з першими доказами передачі поліомієліту та гепатиту Е1 через воду. Всесвітня організація охорони здоров’я (ВООЗ) класифікувала кілька збудників, що передаються через воду, від середньої до високої значущості для здоров’я2. Традиційний вірус Методи виявлення покладаються на методи на основі золотого стандарту КПЦР, які є високочутливими та специфічними, але вимагають кваліфікованого персоналу для тестування в лабораторії з використанням дорогих приладів. Однак у країнах з низьким і середнім рівнем доходу (LMIC) з обмеженими ресурсами тестування зразків, ймовірно, матиме перевагу над моніторингом проб води в навколишньому середовищі. Тому необхідні альтернативні недорогі методи для сталого моніторингу проб води та стічних вод у реальному часі в країнах із низьким і середнім рівнем доходу як раннє попередження про нові спалахи захворювань, тим самим захищаючи їх від серйозних соціально-економічних наслідків пандемії вірусу. Недорогі електрохімічні біосенсори для нуклеїнових кислот можуть забезпечити багатообіцяюче потенційне вирішення цієї незадоволеної потреби. Багато з цих біосенсорів ДНК працюють завдяки тому факту, що комплементарні ланцюги ДНК іммобілізовані на електроді. на поверхні та гібридизуються, коли відповідна послідовність присутня у зразку. Потім це можна перетворити на сигнал різними електрохімічними методами з використанням окисно-відновних медіаторів, таких як залізо/фероціанід калію. Метиленовий синій (MB) є однією з таких окисно-відновних молекул, яка має Повідомлялося, що він вставляється в дволанцюгову ДНК (dsDNA) на додаток до більш неспецифічного зв’язування з одноланцюговою ДНК5,6. Характер інтеркаляції MB для утворення комплексів MB-ДНК робить їх популярним вибором як окисно-відновні медіатори в кількох електрохімічних ДНК конфігурації сенсора5,6,7,8,9. Хоча інтеркаляція МВ до ДНК неспецифічна, а специфічність цього електрохімічного сенсора значною мірою залежить від чистоти праймерів, що використовуються для ПЛР або ізотермічної ампліфікації, він добре підходить для реалізації реальних КПЦР на основі електрохімічних процесів або флуоресцентна ізотермічна ампліфікація як альтернатива вимірюванню концентрації ДНК 9. В одній із таких реалізацій Won et al. Поверхня золотих електродів була модифікована 6-меркапто-1-гексанолом (MCH) для реального часу вимірювання ПЛР-ампліконів з MB за допомогою диференціальної імпульсної вольтамперометрії (DPV)9. В інших випадках Ramirez та ін. Виявлення SARS-CoV-2 у стічних водах за допомогою реакції RT-LAMP з використанням MB з електродами з трафаретним друком. Також були використані платинові електроди. використовуються як in situ електроди в мікрофлюїдній ПЛР-платформі, призначеній для електрохімічного виявлення ампліконів під час реакцій 8. Усі ці дослідження вимагають модифікації поверхні електродів, що передбачає збільшення виробничих та експлуатаційних витрат через спеціальні вимоги до зберігання для стабільності цих функціональних електродів.
Схема робочого процесу електрохімічного виявлення ампліконів, отриманих із концентрованих вірусних частинок у зразках озерної води.
Нещодавно ми продемонстрували електрохімічне зондування ампліконів SARS-CoV-2 за допомогою недорогих електродів на друкованій платі (PCB) на основі DPV та циклічної вольтамперометрії (CV), викликаної адсорбцією комплексів MB-DNA на поверхні немодифікованих електродів) зміни піку струм11.Ми повідомляємо, що довші фрагменти ДНК (N1-N2, \({943}\, \hbox), утворені за допомогою рекомендованих CDC прямих і зворотних праймерів N1 порівняно з коротшими фрагментами {bp}\)), показали кращу лінійність у відповіді сенсора ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)), сформований за допомогою наборів праймерів N1 прямого та зворотного N1. Повідомляється про ці дослідження з використанням розведень ДНК, приготовлених у воді без нуклеази. Платформу також використовували для виявлення SARS-CoV -2 амплікони в змодельованих зразках стічних вод (отриманих шляхом додавання РНК SARS-CoV-2 до зразків загальної РНК). Оскільки РНК чутлива до зсуву під час ізоляції та подальшої обробки12,13, важко ампліфікувати довші фрагменти за допомогою цього гетерогенного зразка. Таким чином, демонстрація електрохімічного зондування амплікону SARS-CoV-2 у стічних водах обмежена коротшим \(72\,\hbox {bp}\) фрагментом N1.
У цій роботі ми досліджували можливість електрохімічного зондування фага Phi6 на основі ENIG, сконцентрованого та виділеного із зразків озерної води (рис. 1). Розміри фагів Phi6 (80-100 нм) можна порівняти з SARS-CoV-2 і також мають ліпідну мембрану та спайковий білок. З цих причин бактеріофаг Phi6 є популярним замінником SARS-CoV-2 та інших патогенних РНК-вірусів з оболонкою14,15. РНК, виділену з фагових частинок, використовували як матрицю для синтезу кДНК, а потім ПЛР для отримання двох фрагментів ДНК довжиною 117 і 503 пар основ. Враховуючи проблему ампліфікації \(943\,\hbox {bp}\) фрагментів N1-N2 у нашій попередній роботі, ми націлюємося на фрагменти проміжної довжини (\(117 \,\hbox {bp}\) і \(503 \,\hbox {bp}\)), на основі доступних праймерів. Відповідь електрохімічного сенсора систематично вивчали в широкому діапазоні концентрацій (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) до \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Для обох фрагментів у присутність MB, вплив солі на відповідь датчика було охарактеризовано та перехресно підтверджено спектрофотометричними вимірюваннями. Основні внески цієї роботи такі:
На чутливість сильно впливає довжина фрагмента ДНК і наявність солі в зразку.Наші результати показують, що електрохімічна активність залежить від різних механізмів взаємодії MB, ДНК і сенсора в вольтамперометричному відгукі, залежно від концентрації та довжини ДНК, причому довші фрагменти демонструють вищу чутливість, хоча сіль негативно впливає на електростатичну взаємодію між MB і ДНК.
Концентрація ДНК визначає механізм взаємодії MB-ДНК у немодифікованих електродах Ми демонструємо, що різні механізми взаємодії MB-ДНК залежать від концентрації ДНК. При концентраціях ДНК нижче невеликої кількості \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {1}}}\), ми помітили, що відповідь електрохімічного струму в основному визначалася адсорбцією MB-ДНК на електроді, тоді як при нижчих концентраціях. При високих концентраціях ДНК відповідь електрохімічного струму визначалася стеричним інгібуванням окислювально-відновних процесів. активність за рахунок вставки MB між парами основ ДНК.
Електрохімічне визначення вірусних нуклеїнових кислот у зразках озерної води на основі ENIG PCB. Спостереження підтверджено електрохімічним виявленням \(503\,\hbox {bp}\) фрагментів ДНК, отриманих із зразків води з озера Повай, кампус IIT в Мумбаї. Результат фаг.
Низька вартість впровадження та можливість інтеграції в повністю автоматизовані системи моніторингу, олігонуклеотиди або аптамери на електродах з довшим терміном зберігання.
Фаг Phi6 — це дцРНК-вірус із оболонкою сімейства Cytoviridae, який інфікує Pseudomonas syringae. Геном фага Phi6 існує у вигляді 3 фрагментів: S (\(2,95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4,07) \,\hbox {Kb}\)) і L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Оскільки фаг Phi6 інфікує непатогенний штам BSL-1 Pseudomonas, його безпечно використовувати і його можна легко вирощувати в лабораторії. Phage Phi6 і його хазяїн Pseudomonas syringae були придбані в Довідковому центрі бактеріальних вірусів Фелікса д'Ерелля, Університет Лаваля, Канада (каталожні номери довідкового центру HER-102 і HER-1102 відповідно). Фаг .Phi6 та його хазяїна були відроджені відповідно до вказівок референс-центру. Фаг Phi6 був очищений шляхом лізису планшета та елюції для отримання кінцевих титрів із \(\приблизно 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { мл}}\) (одиниці, що утворюють бляшку/мілілітри). РНК виділяли з очищених фагових частинок за допомогою універсального набору для очищення загальної РНК GenElute™ (Sigma-Aldrich) відповідно до інструкцій виробника. Коротко кажучи, очищену суспензію фага Phi6\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) лізували, а лізат завантажували на обертову колонку, щоб дозволити РНК зв’язатися з колонкою зі смолою. Потім РНК елюювали елююючим розчином \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), що надається в наборі. Оцініть концентрацію РНК за поглинанням \(260\,\hbox {нм}\). РНК зберігалася аліквотами в \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) до подальшого використання.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Набір iScript для синтезу кДНК (біо -Rad Laboratories) використовували як матрицю для синтезу кДНК відповідно до інструкцій виробника. Коротко кажучи, реакція синтезу кДНК складається з 3 етапів: праймування на \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , зворотна транскрипція \({20}\,{\hbox {min}}\) у \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), і навпаки. Реєстратор знаходиться в \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) протягом \({1}\,{\hbox {хв. }}\). Під час аналізу на 1% агарозному гелі кДНК показала три смуги, що відповідають очікуваним трьом фрагментам РНК (дані не показані). Наступні праймери використовували для ампліфікації двох фрагментів ДНК довжиною 117 і 503 bp, використання кДНК як матриці для ПЛР у термоциклері miniPCR® mini8:
Праймери для \(117\,\hbox {bp}\) і \(503\,\hbox {bp}\) відповідають 1476-1575 нуклеотидам сегмента М і 458-943 нуклеотидам сегмента L відповідно Усі ампліфіковані продукти ПЛР піддавали електрофорезу на 1% агарозних гелях, а ампліфіковану цільову ДНК очищали за допомогою набору для екстракції гелю GeneJET (Thermo Fisher Scientific).
Озеро в кампусі IIT Mumbai (Powai Lake, Powai, Mumbai) використовувалося для додавання фагових частинок. Озерну воду фільтрували через мембрану \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) для видалення зважених частинок, а потім додано фаг Phi6. Додайте \({1}\,{\hbox {ml}}\) з \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) до \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) відфільтрованої озерної води, у \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Невелика аліквота була зарезервовано для вимірювання вірусного навантаження за допомогою аналізу бляшок. Ми випробували два різні методи концентрації частинок вірусу Phi6 з шипами: (1) метод адсорбції-преципітації гідроксиду алюмінію,19 який був валідований для концентрації кількох вірусів з оболонкою РНК із зразків навколишнього середовища, і (2) ) Метод концентрації вірусу на основі поліетиленгліколю (PEG) був адаптований з Flood et al.20. Оскільки виявилося, що ефективність відновлення методу на основі ПЕГ краща, ніж методу гідроксиду алюмінію, метод на основі ПЕГ використовувався для концентрації частинок Phi6 із зразків озерної води.
Використовували наступний метод PEG: PEG 8000 і \(\hbox {NaCl}\) додавали до зразків озерної води з Phi6, щоб отримати 8 % PEG 8000 і \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\). Зразки інкубували на шейкері\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), потім центрифугують при \(4700 \,\hbox {g}\) становить \({45}\,{\hbox {min}}\). Викиньте супернатант і ресуспендуйте осад у \({1}\, {\hbox {ml}}\) у тому самому супернатанті. Усі експерименти з підживленням і концентрацією вірусу проводили в трьох примірниках. Після концентрування невелику аліквоту резервували для вимірювання ефективності відновлення за допомогою аналізу нальоту. РНК виділяли, як описано раніше, і елюювали у буфері для елюції, що надається в наборі\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Оскільки концентрація РНК змінюватиметься від зразка до зразка в трьох примірниках, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) РНК використовується для всіх трьох незалежно від його концентрації. Синтез кДНК зразків. Синтез кДНК проводили, як описано раніше.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) кДНК використовувався як шаблон для \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) ПЛР протягом 35 циклів для ампліфікації \ (117\,\hbox {bp}\) і \(503\,\hbox { bp}\) фрагменти. Ці зразки представлені як “1:1″, тобто без розведення. Контроль без шаблону (NTC) був встановлений як негативний контроль, тоді як кДНК, синтезована з використанням РНК, виділеної з очищеного фага, була встановлена як шаблон для позитивного контролю (PC). Кількісну ПЛР (qPCR) проводили в інструменті Stratagene Mx3000P RT-PCR з використанням Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Реакції встановлювали в трьох примірниках, як і раніше. Порогове значення циклу (Ct) було зареєстровано для всіх зразків. Крім того, розведені зразки \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) використовували кДНК, розведену 1:100 у відфільтрованій озерній воді як \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) ПЛР протягом 35 циклів. Ці зразки представлені як «1:100″.
Електроди для друкованих плат виготовляються за допомогою комерційно доступного процесу Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) без необхідності додаткового золотого покриття. Технічні характеристики електродів для друкованих плат ENIG детально описано в нашій попередній роботі11. Для електродів ENIG для друкованих плат застосовуються традиційні методи очищення електродів, такі як не рекомендується використовувати циклічну вольтамперометрію з розчином піраньї або сірчаною кислотою, оскільки вони можуть спричинити відшарування тонкого шару золота (товщина \(\приблизно\) \(100\,\hbox {нм }\)) і оголити нижні шари міді, які схильні до корозії 21, 22, 23, 24, 25. Тому очистіть електроди тканиною без ворсу, змоченою IPA. Зразок для тестування інкубували з \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) МБ у \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) для легкого вставлення. У нашій попередній роботі , ми помітили, що чутливість і лінійність датчика були покращені завдяки збільшенню концентрації MB 11 . На основі оптимізацій, про які повідомлялося в нашій попередній роботі, ми використовували \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB Електрохімічного виявлення дволанцюгової ДНК (ds-DNA) можна досягти за допомогою аніонних або катіонних інтеркаляторів. Хоча аніонні інтеркалятори виявляють ДНК з кращою вибірковістю, вони потребують інкубації протягом ночі, що призводить до довшого часу виявлення. з іншого боку, катіонні інтеркалятори, такі як MB, вимагають коротшого часу інкубації, приблизно \({1}\,{\hbox {h}}\) для електрохімічного виявлення ds-DNA6. Кожне вимірювання передбачає розподіл зразка для тестування на електрод\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), потім очистіть ганчіркою, зволоженою IPA, перш ніж продовжити з іншим зразком.одне вимірювання. Кожен зразок перевіряли на 5 різних електродах, якщо не зазначено інше. Вимірювання DPV і CV проводили за допомогою потенціостата PalmSens Sensit Smart, а програмне забезпечення PSTrace використовувалося для налаштування потенціостата та збору даних, включаючи обчислення пікового струму. Використовуються наступні налаштування для вимірювань DPV і CV:
DPV: час рівноваги = \(8\,\hbox {s}\), крок напруги = \(3\,\hbox {мВ}\), імпульсна напруга = \(25\,\hbox {мВ}\), тривалість імпульсу = \(50\,\hbox {мс}\), швидкість сканування = \({20}\,\hbox {мВ/с}\)
CV: рівноважний час = \(8\,\hbox {с}\), крок напруги = \(3\,\hbox {мВ}\), швидкість розгортки = \({300}\,\hbox {мВ/с) }\)
Пікові струми, отримані з вольтамперограмм ДНК у комплексі з \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV та CV вольтамперограмми були отримані на електродах ENIG PCB \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB у комплексі з ДНК (у концентраціях 10–\({20}\,{\ hbox {ng) }/{\upmu \hbox {l}}}\) тобто 0,13–\({0,26}\, {\upmu \hbox {M}}\) для \(117\,\hbox {bp}\ ) та 0,03 –\({0,06}\,{\upmu \hbox {M}}\) для \(503\,\hbox {bp}\)). Репрезентативні вольтамперограмми показано на малюнку S1 у Додатковій інформації. На малюнку 2 показано результати вимірювань DPV і CV (піковий струм) з використанням продуктів ПЛР, очищених гелем. Порівняно з вимірюваннями CV, вимірювання DPV демонструють вищу чутливість (струм як функція концентрації ДНК), оскільки фонові ємнісні струми в вимірюваннях CV приховують фарадеївські струми 26. Дані для кожної коробки в коробці містяться вимірювання з 5 електродів. Усі вимірювання використовують один і той же набір електродів, щоб уникнути помилок вимірювань через різницю між електродами. Ми спостерігали тенденцію до збільшення виміряних пікових струмів DPV і CV для нижчих концентрацій ДНК , довший (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ порівняно з \(117) ) фрагмент. Це узгоджується з очікуваною тенденцією адсорбції електрода, про яку повідомлялося в нашій попередній роботі. адсорбція комплексу MB-ДНК полегшує перенесення заряду на електроді, що сприяє збільшенню пікового струму. Інші дослідження показали вплив розміру олігонуклеотиду та послідовності на інтеркаляцію MB-ДНК27,28,29,30. Гуанін Вміст -цитозину (GC) у двох ампліконах (\(117\,\hbox {bp}\) і \(503\,\hbox {bp}\)) становив приблизно 50%, що вказує на те, що спостереження. до довжини амплікону. Однак для вищих концентрацій ДНК (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), для \(503\,\hbox {bp} \) та \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) для \(117\,\hbox {bp}\)), ми спостерігаємо два посилення пікові струми сабвуферів зменшуються як у вимірюваннях DPV, так і в CV. Це пояснюється тим, що MB насичується та інтеркалюється між парами основ ДНК, що призводить до стеричного інгібування окислювально-відновної активності відновлюваної групи в MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Солі, присутні в основних сумішах для ПЛР, заважають електростатичним взаємодіям між MB і ДНК, тому, додаючи \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) з \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) гель-очищений продукт MB для вивчення впливу солі на взаємодію MB-ДНК. Як показано на малюнку 3, ми спостерігали, що для вищих концентрацій ДНК (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) і \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) для \(117\,\hbox {bp} \)), у DPV та CV. Додавання солі суттєво не вплинуло на вимірювання (див. Малюнок S2 у Додатковій інформації для репрезентативних вольтамперограмм). більш низьких концентраціях ДНК, додавання солі значно знижує чутливість, що не призводить до суттєвої зміни струму з концентрацією ДНК. Подібний негативний вплив солі на взаємодії MB-ДНК та інтеркаляцію раніше повідомляли інші дослідники33,34.\(\hbox { Катіони Mg}^{2+}\) зв’язуються з негативним фосфатним скелетом ДНК, тим самим перешкоджаючи електростатичній взаємодії між МВ і ДНК. При вищих концентраціях ДНК теричне інгібування окислювально-відновних МВ призводить до менших пікових струмів, тому електростатичні взаємодії не впливають суттєво на реакцію датчика. Ключовим моментом є те, що цей біосенсор краще підходить для виявлення вищих концентрацій ДНК (рідко \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) або вище), для повністю автоматизованої обробки проб навколишньої води, де гелеве очищення продуктів ПЛР може бути неможливим.
Площа під кривою поглинання для діапазону довжин хвиль 600–700 \(\hbox {nm}\) для різних концентрацій ДНК у комплексі з \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) із сіллю та без неї (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) із сіллю та без неї (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Концентрації ДНК, що відповідають \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB зразків Без ДНК.
Для подальшої перевірки наведених вище результатів ми провели оптичні вимірювання за допомогою спектрофотометра UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), зразки \({50}\, {{\upmu \hbox {l}}}\) використовувалися для кожного Вимірювання. Сигнатура поглинання зменшується зі збільшенням концентрації ДНК, як видно з тренду площі під кривою поглинання для діапазону довжин хвиль від \(600\,\hbox {nm}\) до \(700\,\hbox { нм}\), як показано на рис. 4 (спектр поглинання показано на рис. S3 у Додатковій інформації). Для зразків із концентрацією ДНК менше \({1}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), не було суттєвої різниці в поглинанні між зразками, що містять ДНК, і зразками, які містять лише MB (для \(503\,\hbox {bp}\) та \(117\,\hbox {bp}\ ) фрагменти довжини), що вказує на відсутність стеричного інгібування окислювально-відновного MB. При більш високих концентраціях ДНК ми спостерігали поступове зниження сигналу поглинання та помітили менше зниження поглинання в присутності солі. Ці результати були пов’язані з молекулярним взаємодії та стеричного інгібування з накопиченням основ у гібридах ДНК. Наші результати узгоджуються з повідомленнями в літературі про спектроскопічні дослідження інтеркаляції MB-ДНК, які пов’язують гіпохроматичність зі зниженими рівнями енергії в \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) електронні переходи через інтеркаляційні шари 36, 37, 38.
Електрофорез фага Phi6 у агарозному гелі: продукти ПЛР довжиною \(117\,\hbox {bp}\) та \(503\,\hbox {bp}\) із зразків води озера. Маркер М-ДНК;NTC-no-template контроль, праймери, що містять відповідні амплікони;ПК позитивний контроль;1, 2, 3-нерозведені (1:1) зразки озерної води з додаванням у трьох примірниках. Видно смугу на \(\приблизно 50\,\hbox {bp}\) через невикористані олігонуклеотиди в \(503\,\ hbox {bp}\) пров.
Ми оцінили корисність датчика, використовуючи зразки води озера Повай, додані фагом Phi6. Концентрації РНК, виділених із зразків води, доданих фагом, коливалися від 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), тоді як виділені з очищених суспензій фагів РНК оцінювали як \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) з ефективністю відновлення приблизно 1 %.РНК була зворотно транскрибована в кДНК і використана як матриця для ПЛР і кПЦР. Розмір продукту був підтверджений за допомогою електрофорезу в агарозному гелі (рис. 5) перед тестуванням за допомогою датчика. Ці зразки не очищаються гелем і тому містять усі компоненти ПЛР, як а також цікаві амплікони. Показано, що значення Ct, зареєстровані під час кПЦР (таблиця 1), корелюють з концентрацією РНК, виділеної з відповідних зразків води з домішками. Значення Ct показує кількість циклів, необхідних для флуоресцентного сигналу до перевищують поріг або фоновий сигнал. Більш високі значення Ct вказують на нижчу концентрацію шаблону і навпаки. Значення Ct зразків NTC були такими ж високими, як очікувалося. Різниця в \(\приблизно 3\) значеннях Ct між позитивний контроль і тестовий зразок також вказують на те, що кожен тестовий зразок має приблизно 1% матриці порівняно з позитивним контролем. Раніше ми обговорювали, що довші амплікони призводять до кращої чутливості. Ампліфікація довших фрагментів, виділених із гетерогенних зразків навколишнього середовища, є складною, враховуючи недоліки низька концентрація вірусу та деградація РНК. Однак за допомогою нашого протоколу збагачення вірусу та ПЛР-ампліфікації ми змогли успішно ампліфікувати фрагмент \(503\,\hbox {bp}\) для електрохімічного зондування.
На рисунку 6 показані результати електрохімічного датчика для амплікону фрагмента \(503\,\hbox {bp}\) з використанням нерозведеної кДНК як матриці (1:1) і 100-кратно розведеної кДНК як матриці (1:100), виконаної ПЛР , у порівнянні з NTC і PC (див. Малюнок S4 у Додатковій інформації для репрезентативних вольтамперограмм). Кожна коробка в коробці на Малюнку 6 містить вимірювання трьох зразків на 5 електродах. Для вимірювання всіх зразків використовувалися однакові електроди, щоб уникнути помилок через електрод Порівняно з CV-вимірюваннями, DPV-вимірювання показують кращу роздільну здатність, щоб відрізнити тестові зразки та зразки ПК від NTC, оскільки, як згадувалося раніше, фарадеївські струми приховані через фонові ємнісні струми в останніх. Для довших ампліконів ми помітили, що негативний контроль (NTC) призвів до вищих пікових струмів CV і DPV порівняно з позитивним контролем, тоді як позитивні та нерозведені досліджувані зразки показали однакові висоти піків пікових струмів DPV. Виміряні середні та медіанні значення для кожного нерозведеного (1:1) ) тестовий зразок і PC можна чітко розділити на виході датчика для зразка NTC, тоді як роздільна здатність для зразка, розведеного 1:100, менш виражена. Для 100-кратного розведення кДНК ми не спостерігали жодних смуг під час гель-електрофорезу. (смуги не показані на малюнку 5), а відповідні пікові струми DPV і CV були подібними до очікуваних для NTC. Результати для фрагмента \(117\,\hbox {bp}\) показані в Додатковій інформації. Негативний контроль викликав електрохімічну реакцію датчика PCB через адсорбцію вільного MB на електроді та взаємодію MB з одноланцюговим праймерним олігонуклеотидом. Тому кожного разу, коли тестується зразок, необхідно запускати негативний контроль і піковий струм тестового зразка порівняно з піковим струмом, отриманим негативним контролем, для досягнення диференціального (відносного) вимірювання39,40 для класифікації тестового зразка як позитивного або негативного.
(a) DPV і (b) CV піковий струм для електрохімічного виявлення \(503\,\hbox {bp}\) фрагментів у зразках озерної води. Тестові зразки вимірювали в трьох примірниках і порівнювали з контролем без шаблону (NTC) і позитивні контролі (ПК).
Наші висновки ілюструють різні механізми, що впливають на роботу електрохімічних сенсорів для ампліконів різної довжини для різних ДНК, з концентраціями, підтвердженими оптичними вимірюваннями за допомогою спектрофотометра UV/Vis. Наші спостереження підкреслюють розуміння того, що довші фрагменти ДНК до \(\приблизно\) \(500\,\hbox {bp}\) можна виявити з вищою чутливістю і що присутність солі в зразку не впливає на чутливість Концентрація ДНК, яка впливає на вищу чутливість (рідко \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) і вище). Крім того, ми досліджували вплив різних типів зразків, включаючи очищені гелем амплікони з додаванням солі та без нього, а також додавання зразків озерної води на вимірювання DPV і CV.Ми помітили, що DPV забезпечує кращу роздільну здатність, оскільки фоновий ємнісний струм також впливає на вимірювання CV, роблячи його менш чутливим.
Ампліфікація довших фрагментів залежить від цілісності геномної РНК вірусу. Декілька досліджень показали, що ампліфікація довших фрагментів не завжди ефективна через деградацію РНК у середовищі та потенціал сплайсингу під час ізоляції11,41,42,43,44 .Ми помітили, що метод концентрації вірусу на основі ПЕГ був більш ефективним у концентруванні фага Phi-6, доданого в зразки озерної води, ніж метод концентрації вірусу на основі гідроксиду алюмінію. Доведено, що здатність виявляти довгі фрагменти ДНК подолає вимогу мультиплексної ПЛР. щоб підсилити кілька коротших шаблонів і зменшити можливість перехресної специфічності.
Біологічні зразки є дефіцитними, тому існує потреба розробити біосенсор, який вимагає мінімальних зразків для тестування. Електроди ENIG PCB, використані в цьому дослідженні, вимагали лише \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) зразки для тестування, щоб охопити ефективну площу електродів. Крім того, той самий електрод можна повторно використовувати після очищення перед дозуванням наступного зразка. Посилені зразки не вимагають додавання будь-яких хімікатів, крім метиленового синього, який є недорогим Оскільки виробництво кожного електрода коштує приблизно 0,55 доларів США (або 40 індійських рупій), цей біосенсор може бути економічно ефективною альтернативою існуючим технологіям виявлення. Фрагменти ДНК в гетерогенних зразках.
З огляду на те, що протоколи електрохімічного виявлення на основі МВ покладаються на специфічність ПЛР, основним обмеженням цього методу є можливість неспецифічної ампліфікації в неоднорідних зразках, таких як стічні води та озерна вода, або використання праймерів низької чистоти. Для підвищення чутливості електрохімічні методи виявлення ДНК неочищених продуктів ПЛР з використанням немодифікованих електродів ENIG PCB, необхідно краще розуміти помилки, внесені невикористаними dNTP і праймерами, а також оптимізувати умови реакції та протоколи аналізу. Додаткові фізико-хімічні параметри, такі як pH, температура та біологічні також може знадобитися виміряти споживання кисню (БПК) зразка води, щоб підвищити точність вимірювання.
На закінчення ми пропонуємо недорогий електрохімічний сенсор ENIG PCB для виявлення вірусів у зразках навколишнього середовища (озерна вода). На відміну від іммобілізованих олігонуклеотидних електродів або спеціальних субстратів для зондування ДНК, які потребують кріогенного зберігання для підтримки чутливості,53,54 наша техніка використовує немодифікований PCB електроди з довшим терміном придатності та без спеціальних вимог до зберігання, тому придатні для розробки рішень для вимірювання з автоматизованою обробкою зразків, розгорнутою в LMIC. У біосенсорі використовуються недорогі окислювально-відновні барвники (MB), що інтеркалюють ДНК, для швидкого виявлення цільових ампліконів. Неспецифічна ампліфікація поширений у зразках навколишнього середовища знижує специфічність цього методу чутливості через неспецифічне зв’язування MB з одно- та дволанцюговими олігонуклеотидами. Тому специфічність цього тесту залежить від оптимізації праймерів та умов реакції ПЛР. Крім того, CV та пікові струми DPV, отримані з перевірених зразків, слід інтерпретувати відносно відповідей, отриманих від негативного контролю (NTC) для кожного тесту. Конструкції та методи електрохімічних датчиків, представлені в цій роботі, можна інтегрувати з автосамплерами для розробки повністю автоматизованого та низького рівня недороге рішення, яке може збирати та аналізувати зразки та бездротовим способом передавати результати назад до лабораторії.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Методи початкової концентрації вірусів із проб води: огляд і мета-аналіз останніх досліджень.J.Application.microorganism.115, pp. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Waterborne viruss: Barries to safe drinking water.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Епідеміологія стічних вод для економічно ефективного широкомасштабного нагляду за COVID-19 у країнах з низьким і середнім рівнем доходу: проблеми та можливості. Вода 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Метиленовий синій як електрохімічний дискримінатор одно- та дволанцюгових олігонуклеотидів, іммобілізованих на золотих підкладках. Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ. Порівняння інтеркаляторів катіонів та аніонів для електрохімічної трансдукції гібридизації ДНК шляхом перенесення електронів на великі відстані. Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Вонг, Е. Л. та Гудінг, Дж. Дж. Перенесення заряду через ДНК: селективний електрохімічний біосенсор ДНК.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH та ін. Мікрофлюїдний пристрій ПЛР у реальному часі з одночасним електрохімічним виявленням. біологічний датчик. Біоелектроніка. 24, 2131–2136 (2009).
Win, BY та ін. Дослідження механізму сигналізації та перевірка ефективності електрохімічної системи ПЛР у реальному часі на основі взаємодії метиленового синього з ДНК. Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG та ін. Електрохімічний датчик ізотермічної ампліфікації на основі петлі для виявлення SARS-COV-2 у зразках стічних вод.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Кумар, М. та інші. Електрохімічне зондування ампліконів SARS-CoV-2 за допомогою електродів з друкованої плати. Датчик активований. B Chemistry. 343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Ефективне виявлення РНК SARS-CoV-2 у твердій фракції стічних вод.science.general environment.763, 144587 (2021).
Алігізакіс, Н. та ін. Аналітичні методи виявлення SARS-CoV-2 у стічних водах: протокол і майбутні перспективи. TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Федоренко, А., Грінберг, М., Ореві, Т. і Каштан, Н. Виживання бактеріофага з оболонкою Phi6 (сурогат SARS-CoV-2) у випарених краплях слини, нанесених на скляні поверхні.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Дей, Р., Длуська, Е. та Ешболт, Нью-Джерсі. Екологічна стійкість сурогату SARS-CoV-2 (Phi6) у вільноживучих амеб.J.Здоров'я води 20, 83 (2021).
Mindich, L. Точне пакування трьох геномних фрагментів дволанцюгової РНК бактеріофага\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Secondary structure of the DH RNA phage\(\varphi\)6 packaging region.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al. Phages on the Tap – Швидкий та ефективний протокол для підготовки лабораторних запасів бактеріофагів. PeerJ 4, e2261 (2016).
Час публікації: 27 травня 2022 р