Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт. Сез кулланган браузер версиясе CSS өчен чикләнгән ярдәмгә ия. Иң яхшы тәҗрибә өчен без яңартылган браузерны кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'та яраклашу режимын сүндерегез). Шул арада тәэмин итү өчен дәвамлы ярдәм, без сайтны стильләр һәм JavaScriptсыз күрсәтәчәкбез.
COVID-19 пандемиясе башланганнан бирле экологик үрнәкләрне мониторинглауның мөһимлеге бик югары бәяләнде, һәм кайбер мониторинг эшләре алтын стандарт ярдәмендә башкарыла, qPCR нигезендә техника кыйммәт булса да. Электрохимик ДНК биосенсорлары чыгымнарны нәтиҗәле тәэмин итә алалар. Аз һәм урта керемле илләрдә экологик су үрнәкләрен мониторинглау өчен чишелеш. Бу эштә без ENIG кулланып, Phi6 фазасыннан алынган ампликоннарны электрохимик ачыклауны күрсәтәбез (SARS-CoV-2 өчен популяр суррогат). PCB электродларын өслекне үзгәртмичә тәмамларга.секс. Электрохимик сенсор реакциясе төрле озынлыктагы ике ДНК фрагменты өчен яхшы характерланган (\ ({117} \, \ hbox {bp} \) һәм \ ({503} \, \ hbox {bp} \)), һәм PCR мастерындагы тозларның метилен зәңгәр (МБ) -ДНК үзара тәэсиренә тәэсире. Безнең нәтиҗәләр шуны күрсәтә: ДНК фрагментларының озынлыгы электрохимик сизгерлекне сизелерлек билгели һәм бу эштә PCR продуктларын гел чистартмыйча озын ампликоннарны табу сәләтен күрсәтә. су үрнәкләрен ситу үлчәү өчен мөһим.Вируслы йөк өчен тулы автоматлаштырылган чишелеш яхшы.
Су аша вирус тарату 1940-нчы еллардан башлап халыкка сәламәтлек өчен куркыныч булып билгеле, полиомиелит һәм гепатитның су аша таралуының беренче дәлиле. Бөтендөнья сәламәтлек саклау оешмасы (WHO) уртача һәм югары сәламәтлек әһәмиятендәге берничә вируслы патогенны классификацияләде. Традицион вирус ачыклау ысуллары алтын-стандарт qPCR нигезендәге техникага таяналар, алар бик сизгер һәм конкрет, ләкин квалификацияле кадрлар ярдәмендә лабораториядә сынауны таләп итәләр. Ләкин, аз һәм урта керемле илләрдә (LMIC) ресурслары чикләнгән, кеше үрнәк сынау, мөгаен, экологик су үрнәге мониторингыннан өстенрәк булыр. Шуңа күрә, аз һәм урта керемле илләрдә су һәм агып торган сулар үрнәкләрен тотрыклы, реаль вакытта мониторинглау өчен альтернатив арзан ысуллар кирәк, барлыкка килүче авырулар турында алдан кисәтү буларак, шулай итеп аларны вирус пандемиясенең каты социаль-икътисади йогынтысыннан саклый. Нуклеин кислоталары өчен аз чыгымлы электрохимик биосенсорлар бу ихтыяҗны чишү өчен өметле потенциаль чишелеш тәкъдим итә алалар. Бу ДНК биосенсорларының күбесе тулы ДНК полосалары электродта имобилизацияләнгән. ampleрнәктә туры килгән эзлеклелек булганда өслек һәм гибридизация. Бу аннары калий тимер / феррокянид кебек редокс арадашчыларны кулланып төрле электрохимик техника ярдәмендә сигналга әверелергә мөмкин. Метилен зәңгәр (МБ) шундый редокс-актив молекулаларның берсе. ике катлы ДНКга (dsDNA) үзара бәйләнешкә кертелүе турында хәбәр ителде, аның бер полосалы ДНК белән бәйләнеше булмаган, 56. МБ-ДНК комплексларын формалаштыру өчен МБларның үзара бәйләнеше аларны берничә электрохимик ДНКда редокс арадашчы буларак популяр сайлау ясый. сенсор конфигурацияләре 5,6,7,8,9. МБның ДНК белән инкальациясе билгеле булмаса да, һәм бу электрохимик сенсорның үзенчәлеге күбесенчә PCR яки изотермаль көчәйтү өчен кулланылган праймерларның чисталыгына бәйле, ул реаль тормышка ашыру өчен бик яраклы. - электрохимик нигезләнгән qPCR яки флуоресцент изотермаль көчәйтү ДНК концентрациясен үлчәү өчен альтернатива 9 .Бу тормышка ашыруның берсендә җиңде һәм башкалар. Алтын электродлар өслеге реаль вакытта 6-меркапто-1-гексанол (MCH) белән үзгәртелде. PCR ампликоннарын дифференциаль импульс волтамметриясе (DPV) кулланып үлчәү 9. Башка очракларда, Рамирез һ.б. микрофлуидик PCR платформасындагы ситу электродлар кебек кулланыла, реакцияләр вакытында ампликоннарны электрохимик рәвештә ачыклау өчен эшләнгән .Бу тикшеренүләрнең барысы да электродларның өслек модификациясен таләп итә, бу функциональ электродларның тотрыклылыгы өчен махсус саклау таләпләре аркасында җитештерү һәм эш чыгымнарын арттыруны күздә тота.
Күл суы үрнәкләрендә концентрацияләнгән вирус кисәкчәләреннән алынган ампликоннарны электрохимик ачыклау өчен эш процессының схемасы.
Күптән түгел без DPV нигезендә цикллы волтамметрия (CV) нигезендә аз бәяле басылган схема тактасы (PCB) электродлары белән SARS-CoV-2 ампликоннарның электрохимик сизүен күрсәттек, иң югары үзгәрүләр агым11.Без хәбәр итәбез, CDC тәкъдим ителгән N1 алга һәм N2 кире праймериз ярдәмендә формалашкан озын ДНК фрагментлары (N1-N2, \ ({943} \, \ hbox) сенсор реакциясендә яхшырак сызык күрсәттеләр. (N1, \. -2 ампликон симуляцияләнгән сулар үрнәкләрендә (гомуми РНК үрнәкләрен SARS-CoV-2 RNA белән чабып алынган) .РНК изоляция һәм агым эшкәртү вакытында кыркуга мохтаҗ, 12,13 бу гетероген үрнәк белән озын фрагментларны көчәйтү кыен. Шуңа күрә, сулар суларында SARS-CoV-2 ампликонының электрохимик сиземлеген күрсәтү кыска \ (72 \, \ hbox {bp} \) N1 фрагменты белән чикләнә.
Бу эштә без ENIG PCB нигезендәге Phi6 фазының электрохимик сизү мөмкинлеген тикшердек, күл суы үрнәкләреннән концентрацияләнгән һәм изоляцияләнгән (1 нче рәсем) .Phi6 этаплары зурлыгы белән чагыштырыла (80-100 нм) SARS-CoV-2 һәм шулай ук липид мембранасы һәм чәчле протеин бар. Бу сәбәпләр аркасында Phi6 бактериофаг - SARS-CoV-2 өчен популяр суррогат һәм башка конвертланган патоген РНК вируслары14,15.RNA фаз кисәкчәләреннән изоляцияләнгән, аннары CDNA синтезы шаблоны буларак кулланылган. PCR озынлыгы 117 һәм 503 төп парның ике ДНК фрагментын алу өчен. Элеккеге эшебездә N1-N2 фрагментларын көчәйтү проблемасын бирегез (\ (117) \, \ hbox {bp} \) һәм \ (503 \, \ hbox {bp} \)), булган праймерларга нигезләнеп. Электрохимик сенсор реакциясе системалы рәвештә киң концентрация диапазонында өйрәнелде (\ ({10} \, { \ hbox {pg} / {\ upmu \ hbox {l}}} \) to \ ({20} \, {\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox {l}}} \)) Ике фрагмент өчен дә МБ булу, тозның сенсор реакциясенә тәэсире спектропотометрик үлчәүләр белән характерланган һәм кросс-расланган. Бу эшнең төп өлешләре түбәндәгечә:
ДНК фрагментының озынлыгы һәм үрнәктә тозның булуы сизгерлеккә нык тәэсир итә.Безнең нәтиҗәләр шуны күрсәтә: электрохимик активлык МБ, ДНК һәм сенсорның волтамметрик реакциядә үзара тәэсир итүнең төрле механизмнарына бәйле, ДНК концентрациясенә һәм озынлыгына карап, озынрак фрагментлар югары сизгерлекне күрсәтәләр, тоз электростатик үзара тәэсиргә тискәре йогынты ясыйлар. МБ һәм ДНК.
ДНК концентрациясе модификацияләнмәгән электродларда MB-DNA үзара тәэсир итү механизмын билгели Без MB-DNA үзара бәйләнешнең төрле механизмнары ДНК концентрациясенә бәйле булуын күрсәтәбез. ДНК концентрацияләре аз күләмдә \ ({\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox {l}}} \), без электрохимик ток реакциясенең электродта МБ-ДНКның adsorbsion белән билгеләнүен күзәттек, ә түбән концентрацияләрдә югары ДНК концентрацияләрендә электрохимик ток реакциясе редоксның стерик тыюлыгы белән билгеләнде. ДНК баз парлары арасында МБ кертү аркасында активлык.
ENIG PCB нигезендәге вируслы нуклеин кислоталарын электрохимик сенсор Күл су үрнәкләрендә күзәтүләр Phi6 кушылган \ (503 \, \ hbox {bp} \) ДНК фрагментларын Пауай күленнән, Мумбай кампусыннан алынган. Нәтиҗә этабы.
Аз куллану бәясе һәм тулы автоматлаштырылган мониторинг системаларына, олигонуклеотидларга яки озын гомерле электродларда аптамерларга интеграцияләнү өчен потенциал.
Phi6 Phage - Cytoviridae гаиләсенең конвертланган dsRNA вирусы, Псевдомонас шприцын зарарлый. Phi6 фаза геномы 3 фрагмент формасында бар: S (\ (2.95 \, \ hbox {Kb} \)), M (\ (4.07) \, \ hbox {Kb} \)) һәм L (\ (6.37 \, \ hbox {Kb} \)) 16,17. һәм лабораториядә җиңел үстерелергә мөмкин. Phi6 Phage һәм аны алып баручы Псевдоном шприцы Феликс д'Херелле бактерия вируслары белешмә үзәгеннән, Канада Лаваль университеты (белешмә үзәк каталог номерлары HER-102 һәм HER-1102) сатып алынган. .Phi6 фейге һәм аның хуҗасы белешмә үзәк кушуы буенча торгызылды. Phi6 фазасы тәлинкә лизиясе белән чистартылды һәм \ (\ якынча 10 ^ {12} \, {\ hbox {PFU} / \ hbox {) мл}} \). 100} \, {{\ upmu \ hbox {l}}} \) лизизацияләнде һәм лизат әйләнү баганасына йөкләнде, РНКны резин баганасына бәйләргә рөхсәт ителде .РНК аннары элитация чишелешендә чыгарыла \ ({ 50} \, {{\ upmu \ hbox {l}}} \) комплект белән тәэмин ителгән. РНК концентрациясен \ (260 \, \ hbox {nm} \) белән үзләштерегез. РНК аликотларда сакланган ({-80} \, {^ {\ circ} \ hbox {C}} \) алга таба кулланганчы. \ ({2} \, {\ upmu \ hbox {g}} \) iScript cDNA синтез комплекты (Био -Рад лабораторияләре) җитештерүче күрсәтмәсе буенча cDNA синтезы өчен шаблон буларак кулланылды. Кыскасы, cDNA синтез реакциясе 3 этаптан тора: \ ({25} \, {^ {\ circ} \ hbox {C}} \ ) \ ({5} \, {\ hbox {мин}} \), \ ({20} \, {\ hbox {мин}} \) кире транскрипция \ } \ hbox {C}} \), һәм кире магнитофон \ ({95} \, {^ {\ circ} \ hbox {C}} \) өчен \ ({1} \, {\ hbox {мин %}). miniPCR® mini8 җылылык велосипедында PCR өчен шаблон буларак cDNA куллану:
\ (117 \, \ hbox {bp} \) һәм \ (503 \, \ hbox {bp} \) өчен праймериз M сегментының 1476-1575 нуклеотидларына һәм L сегментының 458-943 нуклеотидларына туры килә. .Бары көчәйтелгән PCR продуктлары 1% агароза гелендә электропорезланган, һәм көчәйтелгән максатлы ДНК GeneJET гел чыгару комплекты ярдәмендә чистартылган (Термо Фишер Фәнни).
IIT Мумбай кампусындагы күл (Пауай күле, Пауай, Мумбай) фаз кисәкчәләрен өстәү өчен кулланылды. Күл суы \ ({5} \, {\ upmu \ hbox {m}} \) мембранасы аша чистартылды. асылынган кисәкчәләр, аннары Phi6 фейджы өстәлде. \) to \ ({100} \, {\ hbox {ml}} \) фильтрланган күл суы, \ ({4} \, {^ {\ түгәрәк} \ hbox {C}} \). Кечкенә аликот булган Такта анализы белән вируслы йөкне үлчәү өчен сакланган. Без Phi6 вирус кисәкчәләрен концентрацияләү өчен ике төрле ысул сынадык: (1) алюминий гидроксиды адсорбция-явым-төшем ысулы, 19 экологик үрнәкләрдән берничә РНК вирусы концентрациясе өчен расланган, һәм (2)) Полиэтилен гликол (PEG) нигезләнгән вирус концентрацияләү ысулы Туфан һ.б.20 .ПЕГ нигезендәге ысулның торгызу эффективлыгы алюминий гидроксид ысулына караганда яхшырак булганлыктан, PEG нигезендәге ысул Phi6 кисәкчәләрен күл су үрнәкләреннән туплау өчен кулланылды.
Кулланылган PEG ысулы түбәндәгечә булды: PEG 8000 һәм \ (\ hbox {NaCl} \) Phi6 очлы күл су үрнәкләренә 8% PEG 8000 һәм \ (0.2 \, \ hbox {M} \) \ ( \ hbox {NaCl} \). sрнәкләр салгычта инкубацияләнде \ ({4} \, {^ {\ circ} \ hbox {C}} \) \ ({4} \, {\ hbox {h}} \ ), аннары центрифугацияләнгән (4700 \, \ hbox {g} \) \ ({45} \, {\ hbox {min}} \). Супернантны ташлагыз һәм пелетны \ ({1} \, {\ hbox {мл}} \) шул ук супернатантта. Барлык чәчү һәм вирус концентрация экспериментлары өчпочмакта үткәрелде. Концентрациядән соң, кечкенә аликот плитка анализы белән торгызу эффективлыгын үлчәү өчен сакланган. комплект белән тәэмин ителгән элитация буферында \ ({40} \, {\ upmu \ hbox {l}} \). hbox {l}} \) РНКның концентрациясенә карамастан, өчесендә дә кулланыла. cDNA үрнәкләре синтезы алдан әйтелгәнчә башкарылды. \ ({1} \, {\ upmu \ hbox {l}} \) cDNA \ ({20} \, {\ upmu \ hbox {l}} \) шаблон буларак кулланылды, PCR көчәйтү өчен 35 цикл өчен \ (117 \, \ hbox {bp} \) һәм \ (503 \, \ hbox { bp} \) фрагментлар. Бу үрнәкләр "1: 1 ″", ягъни эретүсез күрсәтелә. Шаблонсыз контроль (NTC) тискәре контроль буларак куелган, чистартылган этаптан изоляцияләнгән РНК ярдәмендә синтезланган CDNA урнаштырылган. Позитив контроль (PC) шаблоны буларак .Кванитатив PCR (qPCR) Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies) ярдәмендә Stratagene Mx3000P RT-PCR коралында башкарылды. Барлык үрнәкләр өчен цикл бусагасы (Ct) теркәлде. Моннан тыш, эретелгән үрнәкләр \ ({1} \, {\ upmu \ hbox {l}} \) фильтрланган күл суында 1: 100 эретелгән cDNA кулланып; \ ({20} \, {\ upmu \ hbox {l}} \) 35 цикл өчен PCR. Бу үрнәкләр “1: 100 as” итеп күрсәтелә.
PCB электродлары коммерцияле аз бәяле Электролсыз Никель Чумдыру Алтын (ENIG) процессын кулланып ясалганнар, өстәмә алтын каплау кирәксез. ENIG PCB электрод спецификасы алдагы эшебездә җентекләп аңлатылган11. пиранха эремәсе яки күкерт кислотасы цикллы волтамметрия тәкъдим ителми, чөнки алар нечкә алтын катламның кабыгына китерергә мөмкин (калынлыгы \ (\ якынча \) \ (100 \, \ hbox {nm} \)) һәм бакыр катламнарын фаш итәләр. коррозиягә 21, 22, 23, 24, 25. Шуңа күрә электродларны IPA белән дымланган линтсыз тукымалар белән чистартыгыз. Тикшерелергә тиешле үрнәк \ ({50} \, {\ upmu \ hbox {M}) Easy \) МБ \ ({4} \, {^ {\ circ} \ hbox {C}} \) \ ({1} \, {\ hbox {h}} \) җиңел кертү өчен. Элекке эшебездә , без сенсорның сизгерлеге һәм сызыклылыгы МБ концентрациясен арттырып яхшырганын күрдек. Элекке эшебездә хәбәр ителгән оптимизациягә нигезләнеп, без \ ({50} \, {\ upmu \ hbox {M}} \) MB кулландык. Бу тикшеренүдә ДНКны туплау өчен концентрацияләр. Ике катлы ДНКны (ds-DNA) электрохимик ачыклауга анионик яки катиональ инкалаторлар ярдәмендә ирешеп була. икенче яктан, МБ кебек катиональ интеркалаторлар кыска инкубация вакытын таләп итәләр, ds-DNA6 электрохимик ачыклау өчен якынча \ ({1} \, {\ hbox {h}} \). электрод \ ({5} \, {{\ upmu \ hbox {l}}} \), аннары бүтән үрнәкне дәвам итәр алдыннан IPA-дымлы чүпрәк белән чистарту.бер үлчәү. ampleрнәк 5 төрле электродта сыналды, башкача әйтелмәгән булса. DPV һәм CV үлчәүләре PalmSens Sensit Smart potentiostat ярдәмендә башкарылды, һәм PSTrace программа тәэминаты потенциостат конфигурациясе һәм мәгълүмат алу өчен кулланылды, шул исәптән иң югары агымдагы исәпләүләр. Түбәндәге көйләүләр кулланыла. DPV һәм CV үлчәүләре өчен:
DPV: Тигезлек вакыты = \ (8 \, \ hbox {s} \), көчәнеш адымы = \ (3 \, \ hbox {mV} \), импульс көчәнеше = \ (25 \, \ hbox {mV} \), импульсның озынлыгы = \ (50 \, \ hbox {ms} \), сканерлау тизлеге = \ ({20} \, \ hbox {mV / s} \)
CV: Тигезлек вакыты = \ (8 \, \ hbox {s} \), көчәнеш адымы = \ (3 \, \ hbox {mV} \), сөртү ставкасы = \ ({300} \, \ hbox {mV / s } \)
ДНКның волтамограммаларыннан алынган иң югары агымнар \ ({50} \, {\ upmu \ hbox {M}} \) МБ белән катлаулы: (a) \ (503 \, \ hbox {bp} \) DPV, (b) \ (503 \, \ hbox {bp} \) CV, (c) \ (117 \, \ hbox {bp} \) DPV, (d) \ (117 \, \ hbox {bp} \) CV.
DPV һәм CV волтамограммалары ENIG PCB электродларында алынган ({50} \, {\ upmu \ hbox {M}} \) МБ ДНК белән катлаулы (10 - \ ({20} \, {\ hbox {ng) (/ 117 - (({0.06} \, {\ upmu \ hbox {M}} \) өчен (503 \, \ hbox {bp} \)). Волтамограммалар өстәмә мәгълүматтагы S1 рәсемдә күрсәтелгән. DPV һәм CV үлчәүләре (иң югары ток) гель белән чистартылган PCR продуктларын кулланып. CV үлчәүләре белән чагыштырганда, DPV үлчәүләре югары сизгерлекне күрсәтәләр (ток ДНК концентрациясе функциясе буларак), чөнки CV үлчәүләрендәге фон конденсатор агымнары Фарадаик агымнарын яшерәләр 26 .Бу мәгълүматлар тартмадагы һәр тартма өчен 5 электродтан үлчәүләр бар. Барлык үлчәүләр дә бер үк электродлар җыелмасын кулланалар, электрод-электрод вариациясе аркасында үлчәү хаталарын булдырмас өчен. Без DPV һәм CV-ның арту тенденциясен күзәттек, ДНКның түбән концентрацияләре өчен , озынрак (\ (503 \, \ hbox {bp} \)) \, \ hbox {bp} \ фрагмент белән чагыштырганда. МБ-ДНК комплексының adsorption электродта корылма күчерүне җиңеләйтә, бу иң югары токның үсүенә ярдәм итә. Башка тикшеренүләр күрсәткәнчә, олигонуклеотид зурлыгы һәм эзлеклелеге MB-DNA интеркалациясенә 27,28,29,30. Гуанин -ситозин (GC) ике ампликонның эчтәлеге (\ (117 \, \ hbox {bp} \) һәм \ (503 \, \ hbox {bp} \)) якынча 50% булган, бу күзәтү аерманың тиешлеген күрсәтә ампликон озынлыгына. Шулай да, югары ДНК концентрацияләре өчен (\ (> {2} \, {\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox {l}}} \), \ өчен (503 \, \ hbox {bp}) \) һәм \ (> {10} \, {\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox {l}} \) өчен \ (117 \, \ hbox {bp} \)), без ике көчәйтүне күзәтәбез The субсларның иң югары агымнары DPV һәм CV үлчәүләрендә дә кими. Бу бит МБ туендыра һәм төп парлар ДНК арасында үзара бәйләнештә тора, нәтиҗәдә MB31,32 киметелгән төркемнең редокс активлыгын стерик тыюга китерә.
在 存在 \ (2 \, \ hbox {mM} \) \ ({\ hbox {MgCl} _2} \): (a) \ (503 \, \ hbox {bp} \) DPV, (b) \ (503 \, \ hbox {bp} \) CV, (c) \ (117 \, \ hbox {bp} \) DPV ， (d) \ (117 \, \ hbox {bp} \) CV。
PCR мастерында булган тозлар МБ һәм ДНК арасында электростатик үзара бәйләнешкә комачаулый, шуңа күрә \ (2 \, \ hbox {mM} \) \ (\ hbox {MgCl} _2 \) белән \ ({50} \, {\ upmu \ hbox {M}} \) МБ-ДНК үзара тәэсиренә тозның тәэсирен өйрәнү өчен гель белән чистартылган продукт. 3 нче рәсемдә күрсәтелгәнчә, без югары ДНК концентрацияләре өчен күзәттек (\ (> {2} \, {\) hbox {ng} / {\ upmu \ hbox {l}}} \) (503 \, \ hbox {bp} \) һәм \ (> {10} \, {\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox { l}}} \) өчен (117 \, \ hbox {bp} \)), DPV һәм CVда тоз өстәү үлчәмнәргә зур йогынты ясамады (вәкил волтамограммалар өчен өстәмә мәгълүматтагы S2 рәсемен карагыз). Ләкин шулай да түбән ДНК концентрацияләре, тоз өстәү сизгерлекне сизелерлек киметә, нәтиҗәдә ДНК концентрациясе белән токның зур үзгәреше юк. Тозның MB-DNA үзара тәэсиренә һәм инкальациягә охшаш тискәре йогынтысы бүтән тикшерүчеләр тарафыннан хәбәр ителгән33,34. \ (\ hbox { Mg} ^ {2 +} \) катионнар ДНКның тискәре фосфат арка сөягенә бәйләнәләр, шуның белән МБ һәм ДНК арасында электростатик үзара бәйләнешкә комачаулыйлар. сенсор реакциясенә сизелерлек тәэсир итмәгез. Төп фикер - бу биосенсор югары ДНК концентрацияләрен ачыклау өчен яхшырак (сирәк \ (h \ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox {l}}} \) яки югарырак), PCR продуктларын гел чистарту мөмкин булмаган экологик су үрнәкләрен тулысынча автоматлаштырылган эшкәртү өчен.
ДНКның төрле концентрацияләре өчен дулкын озынлыгы 600-700 \ (\ hbox {nm} \) өчен үзләштерү сызыгы астындагы мәйдан \ ({50} \, {\ upmu \ hbox {M}} \) MB: (a ) \ (503 \, \ hbox {bp} \) тозсыз һәм (\ (2 \, \ hbox {mM} \) \ (\ hbox {MgCl} _2 \)), (b) \ (117 \, \ hbox {bp} \) тозсыз һәм (\ (2 \, \ hbox {mM} \) \ (\ hbox {MgCl} _2 \)). \ ({0} \, {\ hbox {pg} / {\ upmu \ hbox {l}}} \) \ ({50} \, {\ upmu \ hbox {M}} \) туры килгән ДНК концентрацияләре ДНК юк.
Aboveгарыдагы нәтиҗәләрне тагын да тикшерү өчен, без UV / Vis спектропотометры (Термо Фәнни Мультискан GO) ярдәмендә оптик үлчәүләр ясадык, үрнәкләр \ ({50} \, {{\ upmu \ hbox {l}}} \) кулланылды. Asлчәү. ДНК концентрациясенең артуы белән үзләштерү имзасы кими, дулкын озынлыгы диапазоны өчен үзләштерү сызыгы астындагы мәйдан тенденциясеннән күренгәнчә \ (600 \, \ hbox {nm} \) - \ (700 \, \ hbox { nm} \), 4 нче рәсемдә күрсәтелгәнчә (өстәмә мәгълүматта S3 рәсемдә күрсәтелгән үзләштерү спектры) .ДНК концентрацияләре булган үрнәкләр өчен \ ({1} \, {\ hbox {ng} / {\ upmu \ hbox {l}}} \), ДНК булган һәм МБ гына булган үрнәкләр арасында (\ (503 \, \ hbox {bp} \) һәм \ (117 \, \ hbox {bp} \) арасында зур аерма юк. ) озынлык фрагментлары), редокс-актив МБның стерик тыюлыгы юклыгын күрсәтеп. ДНК концентрацияләре югары булганда, без үзләштерү сигналының әкренләп кимүен күзәттек һәм тоз булганда үзләштерүнең кимүен күрдек. Бу нәтиҗәләр молекуляр булганга бәйле. ДНК гибридларында төп стакинг белән үзара бәйләнешләр һәм стерик тыюлар. Безнең нәтиҗәләр әдәбияттагы MB-DNA инкальациясенең спектроскопик тикшеренүләре турындагы докладларга туры килә, алар гипохроматиканы энергия дәрәҗәсенең кимүе белән бәйлиләр (\ pi \) - \ (\ pi ^ * \ ) 36, 37, 38 катламнары аркасында электрон күчү.
Phi6 этапының агароза гели электрофорезы: PCR продуктлары \ (117 \, \ hbox {bp} \) һәм \ (503 \, \ hbox {bp} \) күл су үрнәкләреннән. M-DNA маркеры;NTC-шаблон контроле, тиешле ампликоннарны үз эченә алган праймерлар;ПК уңай контроль;1, 2, 3-суытылмаган (1: 1) өчпочмаклы күл су үрнәкләре. \ (503 \, \) кулланылмаган олигонуклеотидлар аркасында бер төркем \ (\ якынча 50 \, \ hbox {bp} \) күренеп тора. hbox {bp} \) юл.
Phi6 фаҗы белән сугарылган Повай күле су үрнәкләрен кулланып, сенсорның файдалы булуын бәяләдек. мл}} \), чистартылган фаза асылмаларыннан изоляцияләнгәннәр РНК \ ({1945} \, {\ upmu \ hbox {g} / \ hbox {ml}} \) дип бәяләнде % .RNA кире cDNAга транскрипцияләнде һәм PCR һәм qPCR өчен шаблон буларак кулланылды. Продукт күләме сенсор белән сынап караганчы агароза гели электрофорезы белән расланды. Бу үрнәкләр гел чистартылмаган, шуңа күрә PCRның барлык компонентлары бар. шулай ук кызыксыну ампликоннары. QPCR вакытында язылган Ct кыйммәтләре (1 таблица) тиешле су үрнәкләреннән изоляцияләнгән РНК концентрациясе белән бәйләнештә күрсәтелде. Ct кыйммәте флуоресцент сигнал өчен кирәк булган цикллар санын күрсәтә. бусагадан яки фон сигналыннан артып китегез. Cгары Ct кыйммәтләре түбән шаблон концентрацияләрен күрсәтә һәм киресенчә. NTC үрнәкләренең Ct кыйммәтләре көтелгәнчә югары иде. \ (\ Якынча 3 \) Ct кыйммәтләре арасындагы аерма уңай контроль һәм сынау үрнәге алга таба һәр сынау үрнәгендә уңай контроль белән чагыштырганда якынча 1% шаблон барлыгын күрсәтә. Без алдан ампликоннарның яхшырак сизгерлеккә китерүе турында сөйләшкән идек. Гетероген экологик үрнәкләрдән аерылган озын фрагментларны көчәйтү авыр. аз вируслы концентрация һәм РНК деградациясе. Шулай да, безнең вирусны баету һәм PCR көчәйтү протоколы ярдәмендә без электрохимик сенсор өчен \ (503 \, \ hbox {bp} \) фрагментын уңышлы көчәйтә алдык.
6-нчы рәсемдә \ (503 \, \ hbox {bp} \) фрагмент ампликонының электрохимик сенсор нәтиҗәләре күрсәтелгән, икесе дә шаблон (1: 1) һәм 100 тапкыр эретелгән cDNA шаблоны (1: 100) PCR башкарылган. , NTC һәм PC белән чагыштырганда (волтамограммалар өчен өстәмә мәгълүматтагы S4 рәсемен карагыз). 6-нчы рәсемдәге тартмадагы һәрбер тартмада 5 электродта өч үрнәк үлчәмнәре бар. Шул ук электродлар электрод аркасында хаталар булмасын өчен барлык үрнәкләрне үлчәү өчен кулланылган. - электрод вариациясе. CV үлчәүләре белән чагыштырганда, DPV үлчәүләре тест һәм компьютер үрнәкләрен NTC'лардан аеру өчен яхшырак карар күрсәтәләр, чөнки алда әйтелгәнчә, Фарадаик агымнары соңгы конденсатор агымнары аркасында яшерелгән. Озын ампликоннар өчен без күзәттек. тискәре контроль (NTC) уңай контрольгә караганда югарырак CV һәм DPV ток агымнарына китерде, ә уңай һәм суытылмаган сынау үрнәкләре DPV иң югары агымнарның охшаш биеклекләрен күрсәттеләр. Eachәрбер үлчәнмәгән уртача һәм уртача кыйммәтләр (1: 1) ) сынау үрнәге һәм компьютер NTC үрнәге өчен сенсор чыганагыннан ачык чишелергә мөмкин, шул ук вакытта 1: 100 эретелгән үрнәк өчен резолюция азрак әйтелә. CDNA 100 тапкыр эретү өчен, без гель электрофорезы вакытында бернинди полосаны күзәтмәдек. (5 нче рәсемдә күрсәтелмәгән полосалар), һәм тиешле DPV һәм CV иң югары агымнар NTC өчен көтелгәннәргә охшаш иде. контроль PCB сенсорыннан электрохимик җавап бирде, электродта бушлай МБның adsorbsion һәм МБның бер полосалы пример олигонуклеотид белән үзара тәэсире аркасында. Шуңа күрә, үрнәк тикшерелгән саен, тискәре контроль эшләнергә тиеш һәм тест үрнәгенең иң югары токы тискәре контроль белән алынган дифференциаль (чагыштырма) үлчәмгә ирешү өчен алынган иң югары ток белән чагыштырганда 39,40 тест үрнәген уңай яки тискәре классификацияләү өчен.
(а) DPV, һәм (b) күлнең су үрнәкләрендә \ (503 \, \ hbox {bp} \) фрагментларын электрохимик ачыклау өчен CV иң югары ток. уңай контроль (ПК).
Безнең ачышлар төрле ДНКлар өчен төрле озынлыктагы ампликоннар өчен электрохимик сенсорларның эшләвенә тәэсир итүче төрле механизмнарны күрсәтә, концентрацияләр UV / Vis спектропотометры ярдәмендә оптик үлчәүләр белән расланган. Безнең күзәтүләр ДНК фрагментларының озынрак булуын күрсәтә (\ якынча \) \. \ hbox {l}}} \) һәм өстә). Моннан тыш, без төрле типтагы үрнәкләрнең эффектын тикшердек, шул исәптән гель белән чистартылган ампликоннар тозсыз һәм кушылмыйча, һәм DPV һәм CV үлчәүләрендә күл су үрнәкләрен өстәү.Без DPV яхшырак резолюция биргәнен күзәттек, чөнки фон конденсатор ток CV үлчәвенә тәэсир итә, аны сизгеррәк итә.
Озын фрагментларны көчәйтү вируслы геном РНКның тулылыгына бәйле. Төрле тикшеренүләр күрсәткәнчә, әйләнә-тирәдәге РНК деградациясе һәм изоляция вакытында ярылу потенциалы аркасында озын фрагментларны көчәйтү һәрвакытта да эффектив түгел .11,41,42,43,44 .Безнең PEG нигезендә вирус концентрацияләү ысулы алюминий гидроксид нигезендәге вирус концентрацияләү ысулына караганда Phi-6 фазын концентрацияләүдә нәтиҗәлерәк булуын күрдек. берничә кыска озынлык шаблоннарын көчәйтү һәм үзара бәйләнеш мөмкинлеген киметү.
Биологик үрнәкләр бик аз, шуңа күрә сынау өчен минималь үрнәкләр таләп итә торган биосенсор эшләргә кирәк. Бу тикшеренүдә кулланылган ENIG PCB электродлары бары тик таләп ителә \ ({5} \, {{\ upmu \ hbox {l}}} \ ) электродларның эффектив өлкәсен каплау өчен сынау өчен үрнәкләр. Өстәвенә, шул ук электрод киләсе үрнәкне таратканчы чистартканнан соң кабат кулланылырга мөмкин. Күчерелгән үрнәкләр метилен зәңгәрдән башка химик матдәләр кушуны таләп итми, бу арзан. һәм гадәттә кулланыла торган химик. eachәрбер электрод җитештерү өчен якынча 0,55 $ (яки INR 40) булганга, бу биосенсор булган ачыклау технологияләренә чыгымлы альтернатива булырга мөмкин. 2 нче таблицада бу әсәрнең әдәбиятта язылган башка сенсорлар белән чагыштырылуы күрсәтелә. Гетероген үрнәкләрдә ДНК фрагментлары.
МБ нигезендәге электрохимик ачыклау протоколларының PCR үзенчәлегенә таянганын исәпкә алсак, бу ысулның төп чикләнеше - сулар һәм күл суы кебек гетероген үрнәкләрдә специаль булмаган көчәйтү потенциалы яки аз чисталыклы примерлар куллану. модификацияләнмәгән ENIG PCB электродларын кулланып, расланмаган PCR продуктларын ДНКны табу өчен электрохимик ысуллар, кулланылмаган dNTP һәм праймерлар кертелгән хаталарны яхшырак аңларга, реакция шартларын оптимальләштерергә һәм протоколларны анализларга кирәк. PH, температура, биологик өстәмә физикохимик параметрлар. су үрнәгенең кислородка ихтыяҗы (BOD) шулай ук үлчәү төгәллеген яхшырту өчен үлчәнергә кирәк булырга мөмкин.
Ахырда, без экологик (күл суы) үрнәкләрендә вирусны ачыклау өчен аз чыгымлы электрохимик ENIG PCB сенсорын тәкъдим итәбез. озынрак саклану вакыты булган һәм махсус саклау таләпләре булмаган электродлар, шуңа күрә LMIC урнаштырылган автоматлаштырылган үрнәк эшкәртү белән үлчәү чишелешләрен эшләү өчен яраклы. Биосенсор максатлы ампликоннарны тиз табу өчен арзан ДНК-үзара редокс буяуларын куллана (билгеле булмаган көчәйтү). Экологик үрнәкләрдә киң таралган бу сизү ысулының үзенчәлеген киметә, МБның бер һәм ике катлы олигонуклеотидларга бәйләнеше аркасында. Шуңа күрә, бу тестның үзенчәлеге праймериз оптимизациясенә һәм PCR реакция шартларына бәйле. Моннан тыш, CV Тестланган үрнәкләрдән алынган DPV иң югары агымнары һәр тест өчен тискәре контрольдән алынган җавапларга карата аңлатылырга тиеш. Бу эштә күрсәтелгән электрохимик сенсор конструкцияләре һәм ысуллары автоматлаштырылганнар белән тулы автоматлаштырылган һәм түбән үсеш өчен интеграцияләнергә мөмкин. - үрнәкләрне җыя һәм анализлый һәм чыбыксыз нәтиҗәләрне лабораториягә җибәрә ала.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Вирусларның су үрнәкләреннән концентрацияләнү ысуллары: соңгы тикшеренүләргә күзәтү һәм мета-анализ.Кушымта.microorganism.115, 1-11 б. (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Су белән вируслар: Эчәрлек су өчен киртәләр. PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Шреста, С. һ.б. Аз һәм урта керемле илләрдә COVID-19 чыгымлы эффектив зур масштаблы күзәтү өчен чиста сулар эпидемиологиясе: проблемалар һәм мөмкинлекләр. Су 13, 2897 (2021).
Палекек, Э. & Бартосик, М. Нуклеин кислотасы электрохимиясе.Химик.Рев.112, 3427–3481 (2012).
Тани, А., Томсон, А.Ж.
Вонг, ЭЛ, Эрохкин, П.
Wong, EL & Gooding, JJ ДНК аша зарядны күчерү: сайлап алынган электрохимик ДНК biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH һ.б. Реаль вакыт PCR микрофлуидик җайланма бер үк вакытта электрохимик ачыклау.биологик сенсор.Биоэлектроника.24, 2131–2136 (2009).
Метилен зәңгәрнең ДНК белән үзара тәэсиренә нигезләнеп, электрохимик реаль вакыттагы PCR системасының сигнализация механизмын өйрәнү һәм эшне тикшерү. Анализ 136, 1573-1579 (2011).
Рамирез-Чавария, Р.Г.Әйләнә-тирәлек.Химик.Британ.10, 107488 (2022).
Кумар М.
Китамура, К., Садамасу, К., Мураматсу, М. & Йошида, Х.
Алигизакис, Н. һ.б. Чиста суларда SARS-CoV-2 ачыклау өчен аналитик ысуллар: Протокол һәм киләчәк перспективалар. TraC тренд анализы.
Федоренко, А., Гринберг, М., Ореви, Т. & Каштан, Н.10, 1-10 (2020).
Дей, Р., Длусская, Э.Су сәламәтлеге 20, 83 (2021).
Миндич, Л. Ике катлы РНК бактериофагының өч геном фрагментының төгәл упаковкасы \ (\ varphi \) 6.микроорганизм.63, 149-160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, DH RNA фазасының икенчел структурасы \ (\ varphi \) 6 төрү өлкәсе.RNA 6, 880–889 (2000).
Бонилла, Н.
Пост вакыты: 27-2022 май