Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümü sınırlı CSS desteğine sahiptir. En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da uyumluluk modunu kapatmanızı) öneririz. sürekli destek, siteyi stiller ve JavaScript olmadan göstereceğiz.
Çevresel numunelerin izlenmesinin önemi, COVID-19 salgınının başlangıcından bu yana büyük ölçüde takdir edilmiştir ve qPCR tabanlı teknikler pahalı olmasına rağmen, bazı izleme çabaları altın standart kullanılarak gerçekleştirilmektedir. Elektrokimyasal DNA biyosensörleri, potansiyel olarak uygun maliyetli bir ortam sağlayabilir. düşük ve orta gelirli ülkelerde çevresel su numunelerini izlemek için çözüm. PCB elektrotlarını yüzey değişikliği olmadan tamamlamak için.cinsiyet. Elektrokimyasal sensör tepkisi, farklı uzunluklardaki (\({117}\,\hbox {bp}\) ve \({503}\,\hbox {bp}\)) iki DNA parçası için baştan sona karakterize edildi ve PCR ana karışımlarındaki tuzların metilen mavisi (MB)-DNA etkileşimleri üzerindeki etkisi. Sonuçlarımız, DNA fragmanlarının uzunluğunun elektrokimyasal duyarlılığı önemli ölçüde belirlediğini ve bu çalışmada PCR ürünlerinin jel saflaştırması olmadan uzun amplikonları tespit etme yeteneğinin olduğunu göstermektedir. su örneklerinin yerinde ölçümü için önemlidir.Viral yük için tam otomatik bir çözüm iyiye işarettir.
Su yoluyla bulaşan virüs bulaşması, çocuk felci ve hepatit E1'in su yoluyla bulaştığına dair ilk kanıtlarla birlikte 1940'lardan beri bir halk sağlığı tehlikesi olarak bilinmektedir. Dünya Sağlık Örgütü (WHO), suyla taşınan birkaç viral patojeni orta ila yüksek sağlık önemi olarak sınıflandırmıştır2. Geleneksel virüs tespit yöntemleri, oldukça hassas ve spesifik olan ancak pahalı aletler kullanarak laboratuvarda test yapmak için kalifiye personel gerektiren altın standart qPCR tabanlı tekniklere dayanır. Ancak, sınırlı kaynaklara sahip düşük ve orta gelirli ülkelerde (LMIC'ler), insan numune testi muhtemelen çevresel su numunesi izlemeye göre öncelikli olacaktır. Bu nedenle, ortaya çıkan hastalık salgınlarının erken uyarıları olarak düşük ve orta gelirli ülkelerde su ve atık su numunelerinin sürdürülebilir, gerçek zamanlı izlenmesi için alternatif düşük maliyetli yöntemlere ihtiyaç vardır. böylece onları virüs pandemisinin ciddi sosyoekonomik etkilerinden korur.Nükleik asitler için düşük maliyetli elektrokimyasal biyosensörler, bu karşılanmamış ihtiyaca umut verici bir potansiyel çözüm sağlayabilir.Bu DNA biyosensörlerinin çoğu, tamamlayıcı DNA şeritlerinin elektrot üzerinde sabitlenmesi gerçeğiyle çalışır numunede eşleşen bir dizi bulunduğunda yüzeye çıkar ve hibritleşir. Bu daha sonra potasyum demir/ferrosiyanür gibi redoks aracıları kullanılarak çeşitli elektrokimyasal tekniklerle bir sinyale dönüştürülebilir. Metilen mavisi (MB), bu tür bir redoks-aktif moleküldür. tek sarmallı DNA'ya daha spesifik olmayan bağlanmasına ek olarak çift sarmallı DNA'ya (dsDNA) interkalasyon yaptığı bildirilmiştir5,6. MB'lerin MB-DNA kompleksleri oluşturmak için araya giren doğası, onları birkaç elektrokimyasal DNA'da redoks aracıları olarak popüler bir seçim haline getirir. sensör konfigürasyonları5,6,7,8,9.MB'nin DNA'ya interkalasyonu spesifik olmamasına ve bu elektrokimyasal sensörün özgüllüğü büyük ölçüde PCR veya izotermal amplifikasyon için kullanılan primerlerin saflığına bağlı olmasına rağmen, gerçek DNA konsantrasyonu ölçümüne alternatif olarak zamanlı elektrokimyasal tabanlı qPCR veya floresan izotermal amplifikasyon 9. Böyle bir uygulamada, Won ve diğerleri. Altın elektrotların yüzeyi, gerçek zamanlı olarak 6-merkapto-1-heksanol (MCH) ile modifiye edildi. Diferansiyel nabız voltammetrisi (DPV)9 kullanılarak MB ile PCR amplikonlarının ölçümü9. Diğer durumlarda, Ramirez ve diğerleri.Ekran baskılı elektrotlarla MB kullanılarak RT-LAMP reaksiyonuyla atık sudaki SARS-CoV-2'nin tespiti.Platin elektrotlar da kullanılmıştır. reaksiyonlar sırasında amplikonları elektrokimyasal olarak tespit etmek için tasarlanmış bir mikroakışkan PCR platformunda yerinde elektrotlar olarak kullanılır 8. Bu çalışmaların tümü, elektrotların yüzey modifikasyonunu gerektirir; bu, işlevselleştirilmiş elektrotların kararlılığı için özel depolama gereklilikleri nedeniyle artan üretim ve işletme maliyetleri anlamına gelir.
Göl suyu numunelerinde konsantre viral partiküllerden elde edilen amplikonların elektrokimyasal tespiti için iş akışının şeması.
Yakın zamanda, DPV'ye dayalı düşük maliyetli baskılı devre kartı (PCB) elektrotları ile SARS-CoV-2 amplikonlarının elektrokimyasal algılamasını gösterdik ve MB-DNA komplekslerinin tepe noktasındaki değişikliklerin yüzeyinde MB-DNA komplekslerinin adsorpsiyonuyla indüklenen döngüsel voltametri (CV) gösterdik. akım11.CDC tarafından önerilen N1 ileri ve N2 ters primerleri kullanılarak oluşturulan daha uzun DNA parçalarının (N1-N2, \({943}\, \hbox) daha kısa parçalar {bp}\)) ile karşılaştırıldığında sensör yanıtında daha iyi doğrusallık gösterdiğini bildiriyoruz. ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) N1 ileri ve N1 ters primer setleri kullanılarak oluşturulmuştur. Bu çalışmalar, nükleaz içermeyen suda hazırlanan DNA dilüsyonları kullanılarak rapor edilmiştir. Platform, SARS-CoV'u tespit etmek için de kullanılmıştır. Simüle edilmiş atık su numunelerinde -2 amplikon (toplam RNA numunelerine SARS-CoV-2 RNA eklenmesiyle elde edilir). RNA, izolasyon ve sonraki işlemler sırasında kesilmeye duyarlı olduğundan,12,13 bu heterojen numuneyle daha uzun fragmanları çoğaltmak zordur. Bu nedenle, atık sudaki SARS-CoV-2 amplikonunun elektrokimyasal algılamasının gösterimi, daha kısa \(72\,\hbox {bp}\) N1 fragmanı ile sınırlıdır.
Bu çalışmada, göl suyu örneklerinden konsantre ve izole edilmiş Phi6 fajının ENIG PCB tabanlı elektrokimyasal algılamasının fizibilitesini araştırdık (Şekil 1). Phi6 fajlarının boyutu (80-100 nm) SARS-CoV-2 ile karşılaştırılabilir ve ayrıca bir lipit membrana ve bir spike proteine sahiptir. Bu nedenlerden dolayı, bakteriyofaj Phi6, SARS-CoV-2 ve diğer zarflı patojenik RNA virüsleri için popüler bir vekildir14,15. Faj parçacıklarından izole edilen RNA, cDNA sentezi için bir şablon olarak kullanıldı ve ardından 117 ve 503 baz çift uzunluğunda iki DNA fragmanı elde etmek için PCR.Önceki çalışmamızda \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 fragmanlarını büyütme zorluğu göz önüne alındığında, orta uzunluktaki fragmanları hedefliyoruz (\(117) \,\hbox {bp}\) ve \(503 \,\hbox {bp}\)), mevcut primerlere dayalıdır. Elektrokimyasal sensör yanıtı, geniş bir konsantrasyon aralığında (\({10}\,{) sistematik olarak incelenmiştir. \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) ila \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) içindeki her iki parça için MB'nin varlığı, tuzun sensör tepkisi üzerindeki etkisi karakterize edilmiş ve spektrofotometrik ölçümlerle çapraz doğrulanmıştır. Bu çalışmanın ana katkıları aşağıdaki gibidir:
DNA fragman uzunluğu ve numunede tuz bulunması hassasiyeti güçlü bir şekilde etkiler.Sonuçlarımız, elektrokimyasal aktivitenin voltametrik yanıtta MB, DNA ve sensörün etkileşiminin farklı mekanizmalarına bağlı olduğunu, DNA konsantrasyonuna ve uzunluğuna bağlı olarak daha uzun Fragmanların daha yüksek hassasiyet gösterdiğini, ancak tuzun arasındaki elektrostatik etkileşimler üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. MB ve DNA.
DNA konsantrasyonu, değiştirilmemiş elektrotlardaki MB-DNA etkileşim mekanizmasını belirler MB-DNA etkileşiminin farklı mekanizmalarının DNA konsantrasyonuna bağlı olduğunu gösteriyoruz. Az miktarda \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), elektrokimyasal akım yanıtının esas olarak MB-DNA'nın elektrot üzerinde adsorpsiyonu tarafından belirlendiğini, daha düşük konsantrasyonlarda ise yüksek DNA konsantrasyonlarında, elektrokimyasal akım yanıtının redoksun sterik inhibisyonu tarafından belirlendiğini gözlemledik. DNA baz çiftleri arasına MB eklenmesi nedeniyle aktivite.
Göl Suyu Örneklerindeki Viral Nükleik Asitlerin ENIG PCB Tabanlı Elektrokimyasal Algılaması Powai Gölü, IIT Bombay Kampüsü'nden alınan su örneklerinden elde edilen Phi6-eklenmiş \(503\,\hbox {bp}\) DNA parçalarının elektrokimyasal saptanmasıyla doğrulanmıştır. Sonuç faj.
Düşük uygulama maliyeti ve daha uzun raf ömrüne sahip elektrotlar üzerinde tam otomatik izleme sistemlerine, oligonükleotitlere veya aptamerlere entegrasyon potansiyeli.
Faj Phi6, Pseudomonas syringae'yi enfekte eden Cytoviridae familyasından zarflı bir dsRNA virüsüdür. Phi6 fajının genomu 3 fragman şeklinde bulunur: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\))), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) ve L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17.Phi6 faj, patojenik olmayan bir BSL-1 Pseudomonas suşunu enfekte ettiğinden, kullanımı güvenlidir ve laboratuvarda kolayca büyütülebilir. Phi6 fajı ve onun konakçısı Pseudomonas syringae, Felix d'Herelle Bacterial Viruses Referans Merkezi, Laval Üniversitesi, Kanada'dan satın alınmıştır (referans merkezi katalog numaraları sırasıyla HER-102 ve HER-1102'dir) .Phi6 faj ve konakçısı, referans merkezi tarafından yönlendirildiği şekilde canlandırıldı. Phi6 fajı, \(\yaklaşık 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (plak oluşturan birim/ mililitre).RNA, üreticinin talimatlarına göre GenElute™ Evrensel Toplam RNA Saflaştırma Kiti (Sigma-Aldrich) kullanılarak saflaştırılmış faj parçacıklarından izole edildi. Kısaca, saflaştırılmış bir faj Phi6 süspansiyonu\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) parçalandı ve lizat, RNA'nın reçine kolonuna bağlanmasına izin vermek için bir döndürme kolonuna yüklendi. Daha sonra RNA elüsyon solüsyonu \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) kit tarafından sağlanmıştır. RNA konsantrasyonunu \(260\,\hbox {nm}\)'de absorbans ile tahmin edin. ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) sonraki kullanıma kadar.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA Sentez Kiti (Bio -Rad Laboratories), üreticinin talimatları izlenerek cDNA sentezi için bir şablon olarak kullanıldı. Kısaca, bir cDNA sentezi reaksiyonu 3 adımdan oluşur: \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\'de hazırlama )\({5}\,{\hbox {min} }\) , \({20}\,{\hbox {min}}\) ifadesinin ters transkripsiyonu \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) ve ters Kayıt cihazı \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) konumunda \({1}\,{\hbox {dk. }}\).%1 agaroz jel üzerinde çalıştırıldığında, cDNA, beklenen üç RNA fragmanına karşılık gelen üç bant gösterdi (veriler gösterilmemiştir). Aşağıdaki primerler, 117 ve 503 bp uzunluğundaki iki DNA fragmanını çoğaltmak için kullanıldı, miniPCR® mini8 termal döngüleyicide PCR için şablon olarak cDNA'nın kullanılması:
\(117\,\hbox {bp}\) ve \(503\,\hbox {bp}\) için primerler sırasıyla M segmentinin 1476-1575 nükleotidine ve L segmentinin 458-943 nükleotidine karşılık gelir, asit .Bütün güçlendirilmiş PCR ürünleri, %1 agaroz jeller üzerinde elektroforeze tabi tutuldu ve güçlendirilmiş hedef DNA, GeneJET Jel Ekstraksiyon Kiti (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak saflaştırıldı.
IIT Mumbai kampüsündeki bir göl (Powai Lake, Powai, Mumbai) faj parçacıkları eklemek için kullanıldı. asılı parçacıklar ve ardından Phi6 faj eklendi. \({1}\,{\hbox {ml}}\) of \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} ekleyin \) ila \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) filtrelenmiş göl suyu, \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). plak tahlili ile viral yük ölçümü için ayrılmıştır. Eklenmiş Phi6 virüs partiküllerini konsantre etmek için iki farklı yöntemi test ettik: (1) çevresel numunelerden birkaç zarflı RNA virüsünün konsantrasyonu için doğrulanmış olan alüminyum hidroksit adsorpsiyon-çökeltme yöntemi19 ve (2) ) Polietilen glikol (PEG) bazlı virüs konsantrasyon yöntemi, Flood ve ark.20. PEG tabanlı yöntemin geri kazanım etkinliğinin alüminyum hidroksit yönteminden daha iyi bulunması nedeniyle, göl suyu örneklerinden Phi6 partiküllerini konsantre etmek için PEG tabanlı yöntem kullanıldı.
Kullanılan PEG yöntemi şu şekildeydi: %8 PEG 8000 ve \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Numuneler bir çalkalayıcıda inkübe edildi\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), daha sonra \(4700 \,\hbox {g}\)'de santrifüjlenir: \({45}\,{\hbox {dak}}\). Süpernatantı atın ve peleti \({1}\'de yeniden süspanse edin, {\hbox {ml}}\) aynı süpernatanda. Tüm ekleme ve virüs konsantrasyonu deneyleri üç kopya halinde gerçekleştirildi. Konsantrasyondan sonra, plak tahliliyle geri kazanım verimliliğinin ölçülmesi için küçük bir alikot ayrıldı. RNA daha önce tarif edildiği gibi izole edildi ve ayrıştırıldı kit tarafından sağlanan elüsyon tamponunda\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\).RNA konsantrasyonu numuneden numuneye üç kez değişeceğinden, \({2}\,{\upmu \ RNA'nın hbox {l}}\) konsantrasyonu ne olursa olsun üçü için de kullanılır. Örneklerin cDNA sentezi.cDNA sentezi daha önce anlatıldığı gibi yapılmıştır.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR için şablon olarak kullanıldı ve \(117\,\hbox {bp}\) ve \(503\,\hbox { bp}\) fragmanları. Bu numuneler "1:1", yani seyreltilmemiş olarak temsil edilir. Negatif kontrol olarak bir şablonsuz kontrol (NTC) kurulurken, saflaştırılmış fajdan izole edilen RNA kullanılarak sentezlenen bir cDNA kuruldu. Pozitif kontrol (PC) için bir şablon olarak. Kantitatif PCR (qPCR), Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies) kullanılarak bir Stratagene Mx3000P RT-PCR cihazında gerçekleştirildi. Reaksiyonlar daha önce olduğu gibi üç kopya halinde kuruldu. Tüm numuneler için döngü eşiği (Ct) kaydedildi. Ek olarak, seyreltilmiş numuneler, aşağıdaki gibi filtrelenmiş göl suyunda 1:100 oranında seyreltilmiş cDNA kullanılarak \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) idi. 35 döngü için \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR. Bu örnekler “1:100” olarak temsil edilir.
PCB elektrotları, ek altın kaplamaya ihtiyaç duymadan piyasada bulunan düşük maliyetli Akımsız Nikel Daldırma Altın (ENIG) işlemi kullanılarak üretilir.ENIG PCB elektrot spesifikasyonları önceki çalışmalarımızda detaylandırılmıştır11.ENIG PCB elektrotları için, piranha solüsyonu veya sülfürik asit siklik voltametrisi, ince altın tabakanın soyulmasına (kalınlık \(\yaklaşık\) \(100\,\hbox {nm }\)) neden olabileceğinden ve alttaki eğilimli bakır tabakaları açığa çıkarabileceğinden önerilmez. 21, 22, 23, 24, 25 korozyona karşı.Bu nedenle elektrotları tüy bırakmayan, IPA ile nemlendirilmiş bir bezle temizleyin. Test edilecek numune \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB, kolay yerleştirme için \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) içinde. Önceki çalışmamızda , MB konsantrasyonunu artırarak sensörün hassasiyetinin ve doğrusallığının arttığını gözlemledik 11 .Daha önceki çalışmalarımızda bildirilen optimizasyonlara dayanarak \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB kullandık Bu çalışmada DNA'yı gömmek için konsantrasyonlar. Çift sarmallı DNA'nın (ds-DNA) elektrokimyasal tespiti, anyonik veya katyonik birleştiriciler kullanılarak elde edilebilir. Öte yandan, MB gibi katyonik ara katkı maddeleri, ds-DNA6'nın elektrokimyasal tespiti için yaklaşık olarak \({1}\,{\hbox {h}}\) olmak üzere daha kısa inkübasyon süreleri gerektirir. elektrot\({5}\, {{\upmu \hbox {l}}}\), ardından başka bir numuneye geçmeden önce IPA ile nemlendirilmiş bir bezle temizleyin.tek ölçüm.Aksi belirtilmediği sürece her numune 5 farklı elektrot üzerinde test edilmiştir.DPV ve CV ölçümleri PalmSens Sensit Smart potansiyostat kullanılarak yapılmıştır ve tepe akım hesaplamaları da dahil olmak üzere potansiyostat konfigürasyonu ve veri toplama için PSTrace yazılımı kullanılmıştır.Aşağıdaki ayarlar kullanılır DPV ve CV ölçümleri için:
DPV: Denge Süresi = \(8\,\hbox {s}\), Gerilim Adımı = \(3\,\hbox {mV}\), Darbe Gerilimi = \(25\,\hbox {mV}\), darbe süresi = \(50\,\hbox {ms}\), tarama hızı = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Denge Süresi = \(8\,\hbox {s}\), Voltaj Adımı = \(3\,\hbox {mV}\), Tarama Hızı = \({300}\,\hbox {mV/ s) }\)
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ ile kompleks oluşturan DNA'nın voltamogramlarından elde edilen tepe akımları (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV ve CV voltamogramları, DNA ile komplekslenmiş ENIG PCB elektrotları \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB üzerinde elde edildi (10–\({20}\,{\ hbox {ng konsantrasyonlarda) }/{\upmu \hbox {l}}}\) yani \(117\,\hbox {bp}\ ) ve 0.03 için 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) for \(503\,\hbox {bp}\)). Temsili voltamogramlar, Ek Bilgiler'de Şekil S1'de gösterilmektedir. Şekil 2, sonuçları göstermektedir. jelle saflaştırılmış PCR ürünleri kullanılarak DPV ve CV ölçümlerinin (tepe akımı) ölçümü. CV ölçümleriyle karşılaştırıldığında, DPV ölçümleri daha yüksek hassasiyet gösterir (DNA konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak akım), çünkü CV ölçümlerindeki arka plan kapasitif akımlar Faradaik akımları gizler 26. Veriler kutu grafiğindeki her kutu için 5 elektrottan ölçümler içerir. Elektrottan elektrota varyasyondan kaynaklanan ölçüm hatalarını önlemek için tüm ölçümler aynı elektrot setini kullanır. Daha düşük DNA konsantrasyonları için DPV ve CV ölçülen tepe akımlarında artan bir eğilim gözlemledik. , daha uzun (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ ile karşılaştırıldığında \(117) ) fragman. Bu, önceki çalışmalarımızda bildirilen elektrot adsorpsiyonunun beklenen eğilimi ile tutarlıdır. MB-DNA kompleksinin adsorpsiyonu, tepe akımının artmasına katkıda bulunan elektrot üzerindeki yük transferini kolaylaştırır. Diğer çalışmalar, oligonükleotit boyutunun ve dizisinin MB-DNA interkalasyonu üzerindeki etkisini göstermiştir27,28,29,30. Guanin -iki amplikonun (\(117\,\hbox {bp}\) ve \(503\,\hbox {bp}\)) sitozin (GC) içeriği yaklaşık %50 idi, bu da gözlemin farkın kaynaklandığını gösteriyor Ancak, daha yüksek DNA konsantrasyonları için (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), \(503\,\hbox {bp} için) \) ve \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) için \(117\,\hbox {bp}\)) iki büyütme gözlemliyoruz. subs tepe akımları hem DPV hem de CV ölçümlerinde azalır. Bunun nedeni, MB'nin DNA'nın baz çiftleri arasında doygunluğa ulaşması ve araya girerek MB31,32'deki indirgenebilir grubun redoks aktivitesinin sterik inhibisyonu ile sonuçlanmasıdır.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
PCR ana karışımlarında bulunan tuzlar, MB ve DNA arasındaki elektrostatik etkileşimlere müdahale eder, bu nedenle \({50} \,{\ ile \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) ekleyerek upmu \hbox {M}}\) MB jelle saflaştırılmış ürün, tuzun MB-DNA etkileşimi üzerindeki etkisini incelemek için. Şekil 3'te gösterildiği gibi, daha yüksek DNA konsantrasyonları için (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) ve \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) \(117\,\hbox {bp} \)), DPV ve CV'de Tuz ilavesi ölçümleri önemli ölçüde etkilemedi (temsili voltamogramlar için Ek Bilgiler'deki Şekil S2'ye bakın). daha düşük DNA konsantrasyonlarında, tuz eklenmesi hassasiyeti büyük ölçüde azaltır ve DNA konsantrasyonu ile akımda önemli bir değişikliğe neden olmaz. Tuzun MB-DNA etkileşimleri ve interkalasyon üzerindeki benzer olumsuz etkileri daha önce başka araştırmacılar tarafından rapor edilmişti33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) katyonları DNA'nın negatif fosfat omurgasına bağlanarak MB ve DNA arasındaki elektrostatik etkileşimi engeller. sensör yanıtını önemli ölçüde etkilemez. Kilit nokta, bu biyosensörün daha yüksek DNA konsantrasyonlarını (nadiren \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) veya daha yüksek) saptamak için daha uygun olmasıdır. PCR ürünlerinin jel saflaştırmasının mümkün olmayabileceği çevresel su numunelerinin tam otomatik işlenmesi için.
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) ile kompleks oluşturan çeşitli DNA konsantrasyonları için 600–700 \(\hbox {nm}\) dalga boyu aralığı için absorpsiyon eğrisi altındaki alan MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) tuzlu ve tuzsuz (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) tuzlu ve tuzsuz (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB örneklerine karşılık gelen DNA konsantrasyonları DNA yok.
Yukarıdaki sonuçları daha fazla doğrulamak için bir UV/Vis spektrofotometre (Thermo Scientific Multiskan GO) kullanarak optik ölçümler yaptık, her biri için \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) numuneleri kullanıldı. Ölçüm. \(600\,\hbox {nm}\) ila \(700\,\hbox { nm}\) , Şekil 4'te gösterildiği gibi (Ek Bilgilerde Şekil S3'te gösterilen absorpsiyon spektrumu). DNA konsantrasyonları \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), DNA içeren ve yalnızca MB içeren numuneler arasında önemli bir alım farkı yoktu (\(503\,\hbox {bp}\) ve \(117\,\hbox {bp}\ için) ) uzunluk fragmanları), redoks-aktif MB'nin sterik inhibisyonunun olmadığını gösterir. Daha yüksek DNA konsantrasyonlarında, absorbans sinyalinde kademeli bir düşüş gözlemledik ve tuz varlığında absorbansta daha az bir düşüş kaydettik. Bu sonuçlar, moleküler DNA hibritlerinde baz istifleme ile etkileşimler ve sterik inhibisyon. Sonuçlarımız, hipokromatikliği \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) Katmanlar 36, 37, 38'in interkalasyonu nedeniyle elektronik geçişler.
Phi6 fajının agaroz jel elektroforezi: göl suyu numunelerinden \(117\,\hbox {bp}\) ve \(503\,\hbox {bp}\) uzunluğundaki PCR ürünleri.M-DNA işaretleyici;NTC-şablonsuz kontrol, karşılık gelen amplikonları içeren primerler;PC pozitif kontrol;1, 2, 3-seyreltilmemiş (1:1) eklenmiş göl suyu numuneleri üç kopya halinde. \(\yaklaşık 50\,\hbox {bp}\)'de, \(503\,\ hbox {bp}\) şeridi.
Phi6 faj eklenmiş Powai Gölü su örneklerini kullanarak sensörün faydasını değerlendirdik. Faj eklenmiş su örneklerinden izole edilen RNA konsantrasyonları 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), saflaştırılmış faj süspansiyonlarından izole edilenler ise RNA'nın yaklaşık 1 geri kazanım verimliliğiyle \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) olduğu tahmin edildi. %.RNA, cDNA'ya ters kopyalandı ve PCR ve qPCR için şablon olarak kullanıldı. Ürün boyutu, sensörle test edilmeden önce agaroz jel elektroforezi (Şekil 5) ile doğrulandı. ilgilenilen amplikonların yanı sıra.qPCR sırasında kaydedilen Ct değerlerinin (Tablo 1), karşılık gelen eklenmiş su örneklerinden izole edilen RNA konsantrasyonu ile korele olduğu gösterilmiştir.Ct değeri, floresan sinyalinin eşiği veya arka plan sinyalini aşar. Yüksek Ct değerleri daha düşük şablon konsantrasyonlarını gösterir ve bunun tersi de geçerlidir. NTC örneklerinin Ct değerleri beklendiği gibi yüksek çıktı. Aradaki \(\yaklaşık 3\) Ct değerleri farkı pozitif kontrol ve test numunesi ayrıca her test numunesinin pozitif kontrole kıyasla yaklaşık %1 şablona sahip olduğunu gösterir. Daha uzun amplikonların daha iyi duyarlılığa yol açtığını daha önce tartışmıştık. Dezavantajları göz önüne alındığında, heterojen çevresel numunelerden izole edilen daha uzun fragmanların amplifikasyonu zordur. düşük viral konsantrasyon ve RNA bozulması.Ancak, virüs zenginleştirme ve PCR amplifikasyon protokolümüzle, elektrokimyasal algılama için \(503\,\hbox {bp}\) fragmanını başarılı bir şekilde amplifiye edebildik.
Şekil 6, her ikisi de şablon olarak seyreltilmemiş cDNA (1:1) ve şablon olarak 100 kat seyreltilmiş cDNA (1:100 ) kullanılarak PCR gerçekleştirilen \(503\,\hbox {bp}\) fragman amplikonunun elektrokimyasal sensör sonuçlarını gösterir. , NTC ve PC ile karşılaştırıldığında (temsili voltammogramlar için Ek Bilgiler'de Şekil S4'e bakın). Şekil 6'daki kutu grafiğindeki her kutu, 5 elektrotta üç numuneden alınan ölçümleri içerir. Elektrottan kaynaklanan hataları önlemek için tüm numuneleri ölçmek için aynı elektrotlar kullanıldı -to-elektrot değişimi. CV ölçümleriyle karşılaştırıldığında, DPV ölçümleri, test ve PC örneklerini NTC'lerden ayırt etmek için daha iyi çözünürlük gösterir çünkü daha önce bahsedildiği gibi, Faradaik akımlar ikincisindeki arka plan kapasitif akımlar nedeniyle gizlenir. Daha uzun amplikonlar için şunu gözlemledik: negatif kontrol (NTC), pozitif kontrole göre daha yüksek CV ve DPV tepe akımları ile sonuçlanırken, pozitif ve seyreltilmemiş test numuneleri, DPV tepe akımlarının benzer tepe yüksekliklerini gösterdi. Her seyreltilmemiş için ölçülen ortalama ve medyan değerler (1:1) ) test numunesi ve PC, NTC numunesi için sensör çıkışından net bir şekilde ayrıştırılabilirken, 1:100 seyreltilmiş numune için çözünürlük daha az belirgindir. 100 kat cDNA seyreltmesi için, jel elektroforezi sırasında herhangi bir bant gözlemlemedik (Şekil 5'te gösterilmeyen şeritler) ve karşılık gelen DPV ve CV tepe akımları, NTC için beklenenlere benzerdi. \(117\,\hbox {bp}\) parçasının sonuçları Ek Bilgilerde gösterilmiştir. Negatif kontrol, elektrot üzerinde serbest MB'nin adsorpsiyonu ve MB'nin tek sarmallı primer oligonükleotit ile etkileşimi nedeniyle PCB sensöründen bir elektrokimyasal tepkiye neden oldu. Bu nedenle, bir numune her test edildiğinde, bir negatif kontrol çalıştırılmalı ve test örneğinin tepe akımı, test örneğini pozitif veya negatif olarak sınıflandırmak için diferansiyel (bağıl) bir ölçüm39,40 elde etmek için negatif kontrol tarafından elde edilen tepe akımıyla karşılaştırılır.
(a) DPV ve (b) göl suyu numunelerinde \(503\,\hbox {bp}\) parçalarının elektrokimyasal tespiti için CV tepe akımı. Test numuneleri üç kopya halinde ölçüldü ve şablonsuz kontrollerle (NTC) karşılaştırıldı ve pozitif kontroller (PC).
Bulgularımız, bir UV/Vis spektrofotometre kullanılarak yapılan optik ölçümlerle doğrulanan konsantrasyonlarla, farklı DNA'lar için farklı uzunluklardaki amplikonlar için elektrokimyasal sensörlerin performansını etkileyen farklı mekanizmaları göstermektedir. Gözlemlerimiz, daha uzun DNA parçalarının \(\yaklaşık\) \(500\,\hbox {bp}\) daha yüksek hassasiyetle tespit edilebilir ve numunedeki tuz varlığının hassaslığı etkilemediği Hassasiyet Daha yüksek hassasiyeti etkileyen DNA konsantrasyonu (nadiren \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ve üstü).Ayrıca, tuz eklenmiş ve eklenmemiş jelle saflaştırılmış amplikonlar ve göl suyu örneklerinin eklenmesi dahil olmak üzere farklı türde örneklerin DPV ve CV ölçümlerindeki etkisini araştırdık.Arka plan kapasitif akımı CV ölçümünü de etkileyerek daha az hassas hale getirdiği için DPV'nin daha iyi çözünürlük sağladığını gözlemledik.
Daha uzun fragmanların amplifikasyonu, viral genomik RNA'nın bütünlüğüne bağlıdır. Birkaç çalışma, daha uzun fragmanların amplifikasyonunun, RNA'nın ortamdaki bozunması ve izolasyon sırasında birleşme potansiyeli nedeniyle her zaman etkili olmadığını göstermiştir11,41,42,43,44 .PEG bazlı virüs konsantrasyon yönteminin, göl suyu numunelerine eklenmiş faj Phi-6'yı alüminyum hidroksit bazlı virüs konsantrasyon yöntemine göre konsantre etmede daha etkili olduğunu gözlemledik. Uzun DNA fragmanlarını tespit etme yeteneği, multipleks PCR gereksiniminin üstesinden geldiğini kanıtladı birden çok daha kısa uzunlukta şablonu büyütmek ve çapraz özgüllük olasılığını azaltmak için.
Biyolojik numuneler azdır, bu nedenle test için minimum numune gerektiren bir biyosensör tasarlamaya ihtiyaç vardır. Bu çalışmada kullanılan ENIG PCB elektrotları yalnızca \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ gerektiriyordu. ) elektrotların etkili alanını kapsayacak şekilde test için numuneler. Ek olarak, aynı elektrot temizlendikten sonra bir sonraki numuneyi dağıtmadan önce tekrar kullanılabilir. Amplifiye numuneler, ucuz olan metilen mavisi dışında herhangi bir kimyasalın eklenmesini gerektirmez. ve yaygın olarak kullanılan kimyasallardır. Her elektrotun üretimi yaklaşık 0,55 $ (veya INR 40) olduğundan, bu biyosensör mevcut algılama teknolojilerine uygun maliyetli bir alternatif olabilir. Tablo 2, bu çalışmanın literatürde uzun süredir bildirilen diğer sensörlerle karşılaştırmasını göstermektedir. Heterojen örneklerde DNA fragmanları.
MB tabanlı elektrokimyasal tespit protokollerinin PCR'nin özgüllüğüne dayandığı göz önüne alındığında, bu yöntemin önemli bir sınırlaması, atık su ve göl suyu gibi heterojen örneklerde veya düşük saflıkta primerlerin kullanılmasında spesifik olmayan amplifikasyon potansiyelidir. Değiştirilmemiş ENIG PCB elektrotları kullanılarak saflaştırılmamış PCR ürünlerinin DNA tespiti için elektrokimyasal algılama yöntemleri, kullanılmayan dNTP'ler ve primerler tarafından ortaya çıkan hataları daha iyi anlamak ve reaksiyon koşullarını ve tahlil protokollerini optimize etmek için gereklidir. pH, sıcaklık ve biyolojik gibi ek fizikokimyasal parametreler Ölçümün doğruluğunu artırmak için su örneğinin oksijen talebinin (BOİ) de ölçülmesi gerekebilir.
Sonuç olarak, çevresel (göl suyu) numunelerde virüs tespiti için düşük maliyetli bir elektrokimyasal ENIG PCB sensörü öneriyoruz. Hassasiyeti korumak için kriyojenik depolama gerektiren DNA algılama için hareketsizleştirilmiş oligonükleotit elektrotlar veya özel substratların aksine,53,54 tekniğimiz değiştirilmemiş PCB kullanır daha uzun raf ömrüne sahip ve özel depolama gereksinimleri olmayan elektrotlar ve bu nedenle LMIC'lerde konuşlandırılmış otomatik numune işleme ile ölçüm çözümlerinin geliştirilmesi için uygundur. Biyosensör, hedef amplikonların hızlı tespiti için ucuz DNA interkalasyonlu redoks boyaları (MB) kullanır. Spesifik olmayan amplifikasyon Çevresel örneklerde yaygın olarak görülen, MB'lerin tek ve çift sarmallı oligonükleotitlere spesifik olmayan bağlanması nedeniyle bu algılama yönteminin özgüllüğünü azaltır. Bu nedenle, bu testin özgüllüğü, primerlerin ve PCR reaksiyon koşullarının optimizasyonuna bağlıdır. Ek olarak, CV ve test edilen numunelerden elde edilen DPV pik akımları, her test için negatif kontrolden (NTC) elde edilen tepkilere göre yorumlanmalıdır. Bu çalışmada sunulan elektrokimyasal sensör tasarımları ve yöntemleri, otomatik numune alıcılarla entegre edilerek tam otomatik ve düşük -Örnekleri toplayıp analiz edebilen ve sonuçları kablosuz olarak laboratuvara iletebilen uygun maliyetli çözüm.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Su numunelerinden virüslerin ilk konsantrasyonu için yöntemler: son çalışmaların gözden geçirilmesi ve meta-analizi.J.Application.microorganism.115, pp. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Suyla taşınan virüsler: Güvenli içme suyuna yönelik engeller.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.Düşük ve orta gelirli ülkelerde COVID-19'un uygun maliyetli büyük ölçekli gözetimi için atık su epidemiyolojisi: zorluklar ve fırsatlar. Su 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nükleik asit elektrokimyası.Kimyasal.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Metilen mavisi, altın substratlar üzerinde immobilize edilmiş tek ve çift sarmallı oligonükleotitlerin elektrokimyasal ayırıcısı olarak. Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Uzun Menzilli Elektron Transferi ile DNA Hibridizasyonunun Elektrokimyasal Transdüksiyonu için Katyon ve Anyon Birleştiricilerinin Karşılaştırması.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ DNA yoluyla yük aktarımı: seçici bir elektrokimyasal DNA biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH ve ark.Eşzamanlı elektrokimyasal algılamaya sahip gerçek zamanlı PCR mikroakışkan cihazı.biyolojik sensör.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY ve diğerleri.Metilen mavisinin DNA ile etkileşimine dayanan bir elektrokimyasal gerçek zamanlı PCR sisteminin sinyal mekanizması çalışması ve performans doğrulaması.Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG ve ark.Atık su numunelerinde sars-cov-2 tespiti için döngü aracılı izotermal amplifikasyon tabanlı elektrokimyasal sensör.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.PCB elektrotları ile SARS-CoV-2 amplikonlarının elektrokimyasal olarak algılanması. Sensör etkinleştirildi.B Kimya.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Atıksu katı fraksiyonunda SARS-CoV-2 RNA'nın verimli tespiti.bilim.genel çevre.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. ve diğerleri.Atıksuda SARS-CoV-2 Tespiti için Analitik Yöntemler: Protokol ve Gelecek Perspektifleri.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Zarflı bakteriyofaj Phi6'nın (SARS-CoV-2 için bir vekil) cam yüzeylerde biriken buharlaştırılmış tükürük damlacıklarında hayatta kalması.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Serbest yaşayan amipte SARS-CoV-2 vekilinin (Phi6) çevresel kalıcılığı.J.Su Sağlığı 20, 83 (2021).
Mindich, L. Çift sarmallı RNA bakteriyofajının üç genomik parçasının hassas paketlenmesi\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, DH RNA fajının ikincil yapısı\(\varphi\)6 paketleme bölgesi.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – Bakteriyofajların laboratuvar stoklarını hazırlamak için hızlı ve verimli bir protokol.PeerJ 4, e2261 (2016).
Gönderim Zamanı: 27 Mayıs-2022