ขอขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.com เวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS ที่จำกัด เพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดตแล้ว (หรือปิดโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้แน่ใจว่า การสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
ความสำคัญของการตรวจสอบตัวอย่างสิ่งแวดล้อมได้รับการชื่นชมอย่างมากตั้งแต่จุดเริ่มต้นของการระบาดใหญ่ของ COVID-19 และความพยายามในการตรวจสอบบางอย่างดำเนินการโดยใช้มาตรฐานทองคำ แม้ว่าเทคนิคที่ใช้ qPCR จะมีราคาแพง ไบโอเซนเซอร์ DNA เคมีไฟฟ้าสามารถให้ความคุ้มค่าที่อาจเกิดขึ้น โซลูชันสำหรับการตรวจสอบตัวอย่างน้ำสิ่งแวดล้อมในประเทศที่มีรายได้น้อยและปานกลาง ในงานนี้ เราสาธิตการตรวจจับทางเคมีไฟฟ้าของแอมพลิคอนที่ได้จาก Phi6 phage ที่แยกได้จากตัวอย่างน้ำในทะเลสาบที่ถูกแทง (ตัวแทนยอดนิยมสำหรับ SARS-CoV-2) โดยใช้ ENIG เพื่อให้อิเล็กโทรด PCB สมบูรณ์โดยไม่ต้องดัดแปลงพื้นผิวเพศ การตอบสนองของเซ็นเซอร์เคมีไฟฟ้ามีลักษณะเฉพาะสำหรับชิ้นส่วนดีเอ็นเอสองชิ้นที่มีความยาวต่างกัน (\({117}\,\hbox {bp}\) และ \({503}\,\hbox {bp}\)) และ ผลของเกลือในสารผสมหลัก PCR ต่อปฏิกิริยาระหว่างเมทิลีนบลู (MB)-DNA ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าความยาวของชิ้นส่วนดีเอ็นเอกำหนดความไวของเคมีไฟฟ้าอย่างมีนัยสำคัญ และแสดงให้เห็นในงานนี้ว่าความสามารถในการตรวจจับแอมพลิคอนยาวโดยไม่ต้องใช้เจลทำให้บริสุทธิ์ของผลิตภัณฑ์ PCR คือ มีความสำคัญต่อการตรวจวัดตัวอย่างน้ำในแหล่งกำเนิดโซลูชันอัตโนมัติเต็มรูปแบบสำหรับการโหลดไวรัสเป็นลางดี
การแพร่กระจายของไวรัสทางน้ำเป็นที่ทราบกันดีว่าเป็นอันตรายต่อสุขภาพของประชาชนตั้งแต่ทศวรรษที่ 1940 โดยมีหลักฐานครั้งแรกของการแพร่เชื้อโปลิโอและไวรัสตับอักเสบ E1 ทางน้ำ องค์การอนามัยโลก (WHO) ได้จำแนกไวรัสที่ก่อโรคในน้ำหลายชนิดว่ามีความสำคัญต่อสุขภาพในระดับปานกลางถึงสูง2.ไวรัสแบบดั้งเดิม วิธีการตรวจจับอาศัยเทคนิคมาตรฐานทองคำ qPCR ซึ่งมีความไวสูงและเฉพาะเจาะจง แต่ต้องใช้บุคลากรที่มีทักษะในการทดสอบในห้องปฏิบัติการโดยใช้เครื่องมือราคาแพง อย่างไรก็ตาม ในประเทศที่มีรายได้น้อยและปานกลาง (LMICs) ที่มีทรัพยากรจำกัด มนุษย์ การทดสอบตัวอย่างมีแนวโน้มที่จะมีความสำคัญเหนือกว่าการตรวจสอบตัวอย่างน้ำในสิ่งแวดล้อม ดังนั้น วิธีการทางเลือกต้นทุนต่ำจึงมีความจำเป็นสำหรับการตรวจสอบตัวอย่างน้ำและน้ำเสียแบบเรียลไทม์อย่างยั่งยืนอย่างยั่งยืนในประเทศที่มีรายได้น้อยและปานกลาง เพื่อเป็นการเตือนล่วงหน้าถึงการระบาดของโรคอุบัติใหม่ ด้วยเหตุนี้จึงช่วยปกป้องพวกมันจากผลกระทบทางเศรษฐกิจและสังคมอย่างรุนแรงของไวรัส ไบโอเซนเซอร์เคมีไฟฟ้าเคมีต้นทุนต่ำสำหรับกรดนิวคลีอิกสามารถให้ทางออกที่เป็นไปได้สำหรับความต้องการที่ไม่ได้รับการตอบสนอง ไบโอเซนเซอร์ DNA จำนวนมากเหล่านี้ทำงานโดยข้อเท็จจริงที่ว่าสาย DNA เสริมถูกตรึงไว้บนอิเล็กโทรด พื้นผิวและไฮบริไดซ์เมื่อมีลำดับการจับคู่อยู่ในตัวอย่าง จากนั้นสิ่งนี้สามารถแปลงเป็นสัญญาณได้ด้วยเทคนิคเคมีไฟฟ้าต่างๆ โดยใช้ตัวกลางรีดอกซ์ เช่น โพแทสเซียมเหล็ก/เฟอร์โรไซยาไนด์ เมทิลีนบลู (MB) เป็นหนึ่งในโมเลกุลที่ออกฤทธิ์รีดอกซ์ซึ่งมี มีรายงานว่ามีการสอดแทรกเข้าไปใน DNA แบบเกลียวคู่ (dsDNA) นอกเหนือไปจากการจับแบบไม่เจาะจงกับ DNA แบบสายเดี่ยว5,6 ลักษณะการแทรกซ้อนของ MBs เพื่อสร้างคอมเพล็กซ์ MB-DNA ทำให้พวกมันเป็นตัวเลือกยอดนิยมในฐานะตัวกลางรีดอกซ์ใน DNA เคมีไฟฟ้าหลายตัว การกำหนดค่าเซ็นเซอร์5,6,7,8,9 แม้ว่าการแทรกระหว่าง MB กับ DNA จะไม่เฉพาะเจาะจง และความจำเพาะของเซ็นเซอร์ไฟฟ้าเคมีนี้ขึ้นอยู่กับความบริสุทธิ์ของไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับ PCR หรือการขยายความร้อนแบบไอโซเทอร์มอลเป็นส่วนใหญ่ แต่ก็เหมาะสำหรับการใช้งานจริง -time qPCR ที่ใช้เคมีไฟฟ้าหรือฟลูออเรสเซนซ์แบบไอโซเทอร์มอลแอมพลิฟายเออร์เป็นทางเลือกแทนการวัดความเข้มข้นของ DNA 9 ในการใช้งานดังกล่าว วอน และคณะ พื้นผิวของอิเล็กโทรดทองคำได้รับการแก้ไขด้วย 6-mercapto-1-hexanol (MCH) ตามเวลาจริง การวัดแอมพลิคอน PCR ด้วย MB โดยใช้ดิฟเฟอเรนเชียลพัลส์โวลแทมเมทรี (DPV) 9. ในกรณีอื่นๆ รามิเรซและคณะ การตรวจหา SARS-CoV-2 ในน้ำเสียโดยปฏิกิริยา RT-LAMP โดยใช้ MB กับอิเล็กโทรดที่พิมพ์หน้าจอ นอกจากนี้ อิเล็กโทรดแพลทินัมยังได้รับ ใช้เป็นอิเล็กโทรดในแหล่งกำเนิดในแพลตฟอร์ม PCR ของไมโครฟลูอิดิกที่ออกแบบมาเพื่อตรวจจับแอมพลิคอนทางเคมีไฟฟ้าระหว่างปฏิกิริยา 8 การศึกษาทั้งหมดนี้จำเป็นต้องมีการปรับเปลี่ยนพื้นผิวของอิเล็กโทรด ซึ่งหมายถึงต้นทุนการผลิตและการดำเนินงานที่เพิ่มขึ้นเนื่องจากข้อกำหนดการจัดเก็บพิเศษเพื่อความเสถียรของอิเล็กโทรดที่ใช้งานได้เหล่านี้
แผนผังขั้นตอนการทำงานสำหรับการตรวจจับทางเคมีไฟฟ้าของแอมพลิคอนที่ได้จากอนุภาคไวรัสเข้มข้นในตัวอย่างน้ำในทะเลสาบ
เมื่อเร็ว ๆ นี้เราได้แสดงการตรวจจับทางเคมีไฟฟ้าของแอมพลิคอน SARS-CoV-2 ด้วยอิเล็กโทรดแผงวงจรพิมพ์ (PCB) ต้นทุนต่ำตาม DPV และไซคลิกโวลแทมเมทรี (CV) ที่เกิดจากการดูดซับของคอมเพล็กซ์ MB-DNA บนพื้นผิวของอิเล็กโทรดที่ไม่ได้แก้ไข ) การเปลี่ยนแปลงในจุดสูงสุด ปัจจุบัน11.เรารายงานว่าชิ้นส่วน DNA ที่ยาวขึ้น (N1-N2, \({943}\, \hbox) เกิดขึ้นโดยใช้ไพรเมอร์ N1 ไปข้างหน้าและ N2 ที่ CDC แนะนำเมื่อเปรียบเทียบกับชิ้นส่วนที่สั้นกว่า {bp}\)) แสดงความเป็นเส้นตรงที่ดีขึ้นในการตอบสนองของเซ็นเซอร์ ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) เกิดขึ้นจากชุดไพรเมอร์ N1 ไปข้างหน้าและ N1 ย้อนกลับ การศึกษาเหล่านี้รายงานโดยใช้การเจือจางดีเอ็นเอที่เตรียมในน้ำที่ปราศจากนิวคลีเอส แพลตฟอร์มนี้ยังใช้ในการตรวจหา SARS-CoV -2 แอมพลิคอนในตัวอย่างน้ำเสียจำลอง (ได้จากการเพิ่มจำนวนตัวอย่าง RNA ทั้งหมดด้วย SARS-CoV-2 RNA) เนื่องจาก RNA ไวต่อการตัดระหว่างการแยกและการประมวลผลขั้นปลายน้ำ 12,13 จึงเป็นเรื่องยากที่จะขยายชิ้นส่วนที่ยาวขึ้นด้วยตัวอย่างที่แตกต่างกันนี้ ดังนั้น การสาธิตการตรวจจับทางเคมีไฟฟ้าของแอมพลิคอน SARS-CoV-2 ในน้ำเสียจึงถูกจำกัดไว้ที่ส่วน \(72\,\hbox {bp}\) N1 ที่สั้นกว่า
ในงานนี้ เราตรวจสอบความเป็นไปได้ของการตรวจวัดไฟฟ้าเคมีที่ใช้ ENIG PCB ของ phage Phi6 ที่เข้มข้นและแยกได้จากตัวอย่างน้ำในทะเลสาบ (รูปที่ 1) phages Phi6 มีขนาดเทียบเคียงได้ (80-100 นาโนเมตร) กับ SARS-CoV-2 และ นอกจากนี้ยังมีเยื่อหุ้มไขมันและโปรตีนขัดขวาง ด้วยเหตุนี้ bacteriophage Phi6 จึงเป็นตัวแทนยอดนิยมสำหรับ SARS-CoV-2 และไวรัส RNA ที่ทำให้เกิดโรคอื่น ๆ ที่ห่อหุ้ม 14,15.RNA ที่แยกได้จากอนุภาคฟาจถูกใช้เป็นแม่แบบสำหรับการสังเคราะห์ cDNA ตามด้วย PCR เพื่อให้ได้ชิ้นส่วน DNA สองชิ้นที่มีความยาว 117 และ 503 คู่เบส จากความท้าทายในการขยาย \(943\,\hbox {bp}\) ชิ้นส่วน N1-N2 ในงานก่อนหน้าของเรา เรากำหนดเป้าหมายชิ้นส่วนที่มีความยาวปานกลาง (\(117 \,\hbox {bp}\) และ \(503 \,\hbox {bp}\)) ตามไพรเมอร์ที่มีอยู่ การตอบสนองของเซ็นเซอร์ไฟฟ้าเคมีได้รับการศึกษาอย่างเป็นระบบในช่วงความเข้มข้นที่กว้าง (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) ถึง \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) สำหรับทั้งสองส่วนใน การปรากฏตัวของ MB ผลกระทบของเกลือต่อการตอบสนองของเซ็นเซอร์มีลักษณะพิเศษและผ่านการตรวจสอบโดยการวัดสเปกโตรโฟโตเมตริก การสนับสนุนหลักของงานนี้มีดังนี้:
ความยาวของชิ้นส่วน DNA และการมีอยู่ของเกลือในตัวอย่างมีผลอย่างมากต่อความไวผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่ากิจกรรมทางเคมีไฟฟ้าขึ้นอยู่กับกลไกต่างๆ ของการทำงานร่วมกันของ MB, DNA และเซ็นเซอร์ในการตอบสนองแบบโวลแทมเมตริก โดยขึ้นอยู่กับความเข้มข้นและความยาวของ DNA โดยชิ้นส่วนที่ยาวขึ้นจะแสดงความไวที่สูงขึ้น แม้ว่าเกลือจะมีผลเสียต่อปฏิกิริยาไฟฟ้าสถิตระหว่าง MB และ DNA
ความเข้มข้นของ DNA กำหนดกลไกของการทำงานร่วมกันของ MB-DNA ในอิเล็กโทรดที่ไม่ได้ดัดแปลง เราแสดงให้เห็นว่ากลไกต่างๆ ของการทำงานร่วมกันของ MB-DNA ขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของ DNA ที่ความเข้มข้นของ DNA ต่ำกว่า \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox) เล็กน้อย {l}}}\) เราสังเกตว่าการตอบสนองของกระแสไฟฟ้าเคมีส่วนใหญ่ถูกกำหนดโดยการดูดซับของ MB-DNA บนอิเล็กโทรด ในขณะที่ความเข้มข้นต่ำกว่า ที่ความเข้มข้นของ DNA สูง การตอบสนองของกระแสไฟฟ้าเคมีถูกกำหนดโดยการยับยั้งรีดอกซ์แบบสเตอริก กิจกรรมเนื่องจากการแทรก MB ระหว่างคู่เบสของ DNA
ENIG PCB-Based Electrochemical Sensing of Viral Nucleic Acids in Lake Water Examples การสังเกตได้รับการตรวจสอบโดยการตรวจจับทางเคมีไฟฟ้าของชิ้นส่วน DNA ที่เพิ่มด้วย Phi6 \(503\,\hbox {bp}\) ที่ได้จากตัวอย่างน้ำจากทะเลสาบ Powai, IIT วิทยาเขตมุมไบ หน้าผลลัพธ์
ค่าใช้จ่ายในการดำเนินการต่ำและศักยภาพในการรวมเข้ากับระบบตรวจสอบอัตโนมัติเต็มรูปแบบ oligonucleotides หรือ aptamers บนอิเล็กโทรดที่มีอายุการเก็บรักษานานขึ้น
Phage Phi6 เป็นไวรัส dsRNA ที่ห่อหุ้มอยู่ในตระกูล Cytoviridae ซึ่งแพร่เชื้อ Pseudomonas syringae จีโนมของ Phi6 phage มีอยู่ในรูปแบบของ 3 ส่วน: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07 \,\hbox {Kb}\)) และ L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17 เนื่องจาก Phi6 ติดเชื้อสายพันธุ์ Pseudomonas BSL-1 ที่ไม่ก่อโรค จึงปลอดภัยที่จะใช้ และสามารถเติบโตได้ง่ายในห้องปฏิบัติการ Phage Phi6 และโฮสต์ Pseudomonas syringae ซื้อมาจาก Felix d'Herelle Reference Center for Bacterial Viruses มหาวิทยาลัย Laval ประเทศแคนาดา (หมายเลขแคตตาล็อกของศูนย์อ้างอิงคือ HER-102 และ HER-1102 ตามลำดับ) .Phage Phi6 และโฮสต์ของมันได้รับการฟื้นฟูตามคำแนะนำของศูนย์อ้างอิง Phage Phi6 ได้รับการทำให้บริสุทธิ์โดยการสลายด้วยเพลตและการชะออกเพื่อให้ได้ titers สุดท้ายด้วย \(\about 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (หน่วยก่อตัวเป็นคราบจุลินทรีย์/ มิลลิลิตร) แยก RNA ออกจากอนุภาคฟาจบริสุทธิ์โดยใช้ GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต กล่าวโดยย่อ สารแขวนลอย phage Phi6 ที่บริสุทธิ์\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) ถูก lysed และ lysate ถูกบรรจุลงในคอลัมน์สปินเพื่อให้ RNA จับกับคอลัมน์เรซิน จากนั้น RNA จะถูกชะออกในสารละลายชะ \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) จัดทำโดยชุดทดสอบ ประเมินความเข้มข้นของ RNA โดยการดูดกลืนแสงที่ \(260\,\hbox {nm}\)RNA ถูกเก็บไว้ในส่วนลงตัวใน \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) จนกว่าจะใช้งานต่อไป\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) ชุดการสังเคราะห์ iScript cDNA (Bio -Rad Laboratories) ถูกใช้เป็นแม่แบบสำหรับการสังเคราะห์ cDNA ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยสังเขป ปฏิกิริยาการสังเคราะห์ cDNA ประกอบด้วย 3 ขั้นตอน: priming ที่ \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , การถอดความแบบย้อนกลับของ \({20}\,{\hbox {min}}\) ที่ \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) และย้อนกลับ ตัวบันทึกอยู่ใน \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) สำหรับ \({1}\,{\hbox {นาที }}\) เมื่อรันบนเจลอะกาโรส 1% cDNA แสดงแถบสามแถบที่สอดคล้องกับชิ้นส่วน RNA สามชิ้นที่คาดไว้ (ไม่แสดงข้อมูล) ไพรเมอร์ต่อไปนี้ใช้เพื่อขยายชิ้นส่วน DNA สองชิ้นที่มีความยาว 117 และ 503 bp การใช้ cDNA เป็นแม่แบบสำหรับ PCR ใน miniPCR® mini8 thermal cycler:
ไพรเมอร์สำหรับ \(117\,\hbox {bp}\) และ \(503\,\hbox {bp}\) สอดคล้องกับ 1476-1575 นิวคลีโอไทด์ของส่วน M และ 458-943 นิวคลีโอไทด์ของส่วน L ตามลำดับ กรด ผลิตภัณฑ์ PCR ที่ขยายแล้วทั้งหมดถูกอิเล็กโตรโฟรีบนเจลอะกาโรส 1% และ DNA เป้าหมายที่ขยายถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific)
ทะเลสาบที่วิทยาเขต IIT มุมไบ (ทะเลสาบ Powai, Powai, มุมไบ) ถูกใช้เพื่อเพิ่มอนุภาคฟาจ น้ำในทะเลสาบถูกกรองผ่านเมมเบรน \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) เพื่อเอาออก อนุภาคแขวนลอย จากนั้น Phi6 phage ถูกเพิ่ม เพิ่ม \({1}\,{\hbox {ml}}\) จาก \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) ถึง \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) น้ำในทะเลสาบที่ผ่านการกรองแล้ว ใน \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\) ส่วนลงตัวเล็กน้อยคือ สงวนไว้สำหรับการวัดปริมาณไวรัสโดยการทดสอบคราบจุลินทรีย์ เราทดสอบสองวิธีที่ต่างกันในการรวมอนุภาคไวรัส Phi6 ที่มีหนาม: (1) วิธีการดูดซับอะลูมิเนียมไฮดรอกไซด์-การตกตะกอน19 ซึ่งผ่านการตรวจสอบความเข้มข้นของไวรัส RNA ที่ห่อหุ้มหลายตัวจากตัวอย่างสิ่งแวดล้อม และ (2) ) วิธีความเข้มข้นของไวรัสที่ใช้โพลีเอทิลีนไกลคอล (PEG) ถูกดัดแปลงมาจากน้ำท่วมและคณะ20 .เนื่องจากพบว่าประสิทธิภาพการกู้คืนของวิธีที่ใช้ PEG ดีกว่าวิธีอะลูมิเนียมไฮดรอกไซด์ จึงใช้วิธีที่ใช้ PEG เพื่อรวบรวมอนุภาค Phi6 จากตัวอย่างน้ำในทะเลสาบ
วิธี PEG ที่ใช้มีดังนี้: เพิ่ม PEG 8000 และ \(\hbox {NaCl}\) ลงในตัวอย่างน้ำทะเลสาบที่มีหนามแหลม Phi6 เพื่อให้ได้ PEG 8000 8 % และ \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\) ตัวอย่างถูกบ่มบนเครื่องปั่น\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ) จากนั้นปั่นแยกที่ \(4700 \,\hbox {g}\) จะได้ \({45}\,{\hbox {min}}\)ทิ้งส่วนลอยและแขวนตะกอนกลับเข้าไปใน \({1}\, {\hbox {ml}}\) ใน supernatant เดียวกัน การทดลองที่พุ่งสูงขึ้นและความเข้มข้นของไวรัสทั้งหมดดำเนินการเป็นสามเท่า หลังจากการรวมความเข้มข้นแล้ว ส่วนที่เหลือเล็กน้อยถูกสงวนไว้สำหรับการวัดประสิทธิภาพการกู้คืนโดยการทดสอบคราบจุลินทรีย์ อาร์เอ็นเอถูกแยกออกตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้และชะล้างออกไป ในบัฟเฟอร์การชะที่ให้มาในชุดเครื่องมือ\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\) เนื่องจากความเข้มข้นของ RNA จะแตกต่างกันไปในแต่ละตัวอย่างเป็นสามเท่า ดังนั้น \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) ของ RNA ใช้สำหรับทั้งสามโดยไม่คำนึงถึงความเข้มข้นของการสังเคราะห์ cDNA ของตัวอย่าง การสังเคราะห์ cDNA ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA ถูกใช้เป็นแม่แบบสำหรับ \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR เป็นเวลา 35 รอบเพื่อขยาย \ (117\,\hbox {bp}\) และ \(503\,\hbox { ชิ้นส่วน bp}\) ตัวอย่างเหล่านี้แสดงเป็น “1:1″ นั่นคือไม่มีการเจือจาง การควบคุมแบบไม่ใช้แม่แบบ (NTC) ถูกตั้งค่าเป็นการควบคุมเชิงลบ ในขณะที่ cDNA สังเคราะห์โดยใช้ RNA ที่แยกได้จาก phage บริสุทธิ์ถูกตั้งค่า เป็นแม่แบบสำหรับการควบคุมเชิงบวก (PC) ดำเนินการ PCR เชิงปริมาณ (qPCR) ในเครื่องมือ Stratagene Mx3000P RT-PCR โดยใช้ Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies) ปฏิกิริยาถูกตั้งค่าเป็นสามเท่าเหมือนก่อนหน้านี้ อธิบายไว้ ค่าขีดจำกัดของวัฏจักร (Ct) ถูกบันทึกสำหรับตัวอย่างทั้งหมด นอกจากนี้ ตัวอย่างที่เจือจางคือ \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) โดยใช้ cDNA ที่เจือจาง 1:100 ในน้ำทะเลสาบที่ผ่านการกรองเป็น \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR เป็นเวลา 35 รอบ ตัวอย่างเหล่านี้แสดงเป็น “1:100″
อิเล็กโทรด PCB ถูกประดิษฐ์ขึ้นโดยใช้กระบวนการ Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) ที่มีต้นทุนต่ำซึ่งมีจำหน่ายในท้องตลาดโดยไม่จำเป็นต้องชุบทองเพิ่มเติม ข้อมูลจำเพาะของอิเล็กโทรด ENIG PCB มีรายละเอียดในงานก่อนหน้าของเรา11 สำหรับอิเล็กโทรด ENIG PCB วิธีทำความสะอาดอิเล็กโทรดแบบดั้งเดิม เช่น ไม่แนะนำให้ใช้สารละลายปลาปิรันย่าหรือกรดซัลฟิวริกไซคลิกโวลแทมเมทรี เนื่องจากอาจทำให้เกิดการหลุดลอกของชั้นทองบาง ๆ (ความหนา \(\ประมาณ\) \(100\,\hbox {นาโนเมตร}\)) และทำให้ชั้นทองแดงด้านล่างที่มีแนวโน้ม ต่อการกัดกร่อน 21, 22, 23, 24, 25 ดังนั้น ทำความสะอาดอิเล็กโทรดด้วยผ้าไม่เป็นขุยชุบ IPA ตัวอย่างที่จะทดสอบถูกบ่มด้วย \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB in \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) เพื่อให้ง่ายต่อการแทรก ในงานก่อนหน้าของเรา เราสังเกตเห็นว่าความไวและความเป็นเชิงเส้นของเซ็นเซอร์ได้รับการปรับปรุงโดยการเพิ่มความเข้มข้นของ MB 11 ตามการเพิ่มประสิทธิภาพที่รายงานในงานก่อนหน้านี้ เราใช้ \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB ความเข้มข้นเพื่อฝัง DNA ในการศึกษานี้ การตรวจจับทางเคมีไฟฟ้าของ DNA แบบเกลียวคู่ (ds-DNA) สามารถทำได้โดยใช้อินเทอร์คาเลเตอร์ประจุลบหรือประจุบวก แม้ว่าอินเทอร์คาเลเตอร์ประจุลบจะตรวจจับ DNA ด้วยการคัดเลือกที่ดีกว่า ในทางกลับกัน เครื่องคำนวณประจุบวก เช่น MB ต้องการเวลาฟักตัวที่สั้นกว่า ประมาณ \({1}\,{\hbox {h}}\) สำหรับการตรวจจับทางเคมีไฟฟ้าของ ds-DNA6 การวัดแต่ละครั้งเกี่ยวข้องกับการจ่ายตัวอย่างที่จะทดสอบบน อิเล็กโทรด\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) จากนั้นทำความสะอาดด้วยผ้าขี้ริ้วชุบ IPA ก่อนดำเนินการกับตัวอย่างอื่นการวัดหนึ่งครั้ง แต่ละตัวอย่างได้รับการทดสอบบนอิเล็กโทรดที่แตกต่างกัน 5 อิเล็กโทรด เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น การวัด DPV และ CV ดำเนินการโดยใช้โพเทนชิโอสแตตอัจฉริยะ PalmSens Sensit และใช้ซอฟต์แวร์ PSTrace สำหรับการกำหนดค่าโพเทนชิโอสแตตและการเก็บข้อมูล รวมถึงการคำนวณกระแสสูงสุด มีการใช้การตั้งค่าต่อไปนี้ สำหรับการวัด DPV และ CV:
DPV: เวลาสมดุล = \(8\,\hbox {s}\), ขั้นแรงดัน = \(3\,\hbox {mV}\), แรงดันพัลส์ = \(25\,\hbox {mV}\) , ระยะเวลาของพัลส์ = \(50\,\hbox {ms}\), อัตราการสแกน = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: เวลาสมดุล = \(8\,\hbox {s}\), สเต็ปแรงดัน = \(3\,\hbox {mV}\), อัตราการกวาด = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
กระแสสูงสุดที่ได้จากโวลแทมโมแกรมของ DNA ที่ซับซ้อนด้วย \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV
ได้รับโวลแทมโมแกรม DPV และ CV บนอิเล็กโทรด ENIG PCB \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB เชิงซ้อนกับ DNA (ที่ความเข้มข้น 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) เช่น 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) สำหรับ \(117\,\hbox {bp}\ ) และ 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) สำหรับ \(503\,\hbox {bp}\)) โวลแทมโมแกรมตัวแทนแสดงในรูปที่ S1 ในข้อมูลเสริมรูปที่ 2 แสดงผล ของการวัด DPV และ CV (กระแสสูงสุด) โดยใช้ผลิตภัณฑ์ PCR ที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์ด้วยเจล เมื่อเปรียบเทียบกับการวัด CV การวัด DPV จะแสดงความไวที่สูงกว่า (กระแสเป็นฟังก์ชันของความเข้มข้นของ DNA) เนื่องจากกระแสประจุพื้นหลังในการวัด CV จะซ่อนกระแส Faradaic ไว้ 26 ข้อมูล สำหรับแต่ละกล่องในพล็อตพล็อตประกอบด้วยการวัดจากอิเล็กโทรด 5 อิเล็กโทรด การวัดทั้งหมดใช้อิเล็กโทรดชุดเดียวกันเพื่อหลีกเลี่ยงข้อผิดพลาดในการวัดเนื่องจากการเปลี่ยนแปลงระหว่างอิเล็กโทรดกับอิเล็กโทรด เราสังเกตเห็นแนวโน้มที่เพิ่มขึ้นในกระแสพีคที่วัดด้วย DPV และ CV สำหรับความเข้มข้นที่ต่ำกว่าของ DNA , ยาวกว่า (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ เทียบกับ \(117) ) ส่วนนี้สอดคล้องกับแนวโน้มที่คาดหวังของการดูดซับอิเล็กโทรดที่รายงานในงานก่อนหน้าของเรา การดูดซับของคอมเพล็กซ์ MB-DNA ช่วยอำนวยความสะดวกในการถ่ายโอนประจุบนอิเล็กโทรด ซึ่งก่อให้เกิดการเพิ่มขึ้นของกระแสไฟฟ้าสูงสุด การศึกษาอื่น ๆ ได้แสดงผลของขนาดและลำดับของโอลิโกนิวคลีโอไทด์ต่อการแทรกสอดของ MB-DNA27,28,29,30 กวานีน เนื้อหา -cytosine (GC) ของแอมพลิคอนสองตัว (\(117\,\hbox {bp}\) และ \(503\,\hbox {bp}\)) อยู่ที่ประมาณ 50% ซึ่งบ่งชี้ว่าการสังเกตความแตกต่างนั้นเกิดจาก ถึงความยาวแอมพลิคอน อย่างไรก็ตาม สำหรับความเข้มข้นของ DNA ที่สูงขึ้น (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) สำหรับ \(503\,\hbox {bp} \) และ \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) สำหรับ \(117\,\hbox {bp}\)) เราสังเกตการขยายเสียงสองครั้ง ค่าสูงสุดของกระแสย่อยจะลดลงทั้งในการวัด DPV และ CV เนื่องจาก MB อิ่มตัวและแทรกระหว่างคู่เบสของ DNA ส่งผลให้เกิดการยับยั้ง steric ของกิจกรรมรีดอกซ์ของกลุ่มที่ลดค่าได้ใน MB31,32
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
เกลือที่มีอยู่ในสารผสมหลัก PCR รบกวนการทำปฏิกิริยาไฟฟ้าสถิตระหว่าง MB และ DNA ดังนั้นโดยการเพิ่ม \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) ด้วย \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) ผลิตภัณฑ์เจลบริสุทธิ์ MB เพื่อศึกษาผลกระทบของเกลือต่อปฏิสัมพันธ์ของ MB-DNA ดังแสดงในรูปที่ 3 เราสังเกตว่าสำหรับความเข้มข้นของ DNA ที่สูงขึ้น (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) และ \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) สำหรับ \(117\,\hbox {bp} \)) ใน DPV และ CV การเติมเกลือไม่ส่งผลกระทบต่อการวัดอย่างมีนัยสำคัญ (ดูรูปที่ S2 ในข้อมูลเสริมสำหรับตัวแทนโวลแทมโมแกรม) อย่างไรก็ตาม ที่ ความเข้มข้นของ DNA ที่ต่ำกว่า การเติมเกลือจะลดความไวลงอย่างมาก ทำให้ไม่มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในปัจจุบันที่มีความเข้มข้นของ DNA ผลกระทบด้านลบที่คล้ายคลึงกันของเกลือต่อการปฏิสัมพันธ์ของ MB-DNA และการแทรกสอดมีรายงานก่อนหน้านี้โดยนักวิจัยคนอื่น ๆ 33,34\(\hbox { Mg}^{2+}\) ไอออนบวกจับกับแกนฟอสเฟตเชิงลบของ DNA ซึ่งขัดขวางปฏิสัมพันธ์ของไฟฟ้าสถิตระหว่าง MB และ DNA ที่ความเข้มข้นของ DNA ที่สูงขึ้น การยับยั้ง steric ของ MBs ที่แอคทีฟรีดอกซ์ส่งผลให้กระแสสูงสุดลดลง ดังนั้นอันตรกิริยาของไฟฟ้าสถิต ไม่ส่งผลกระทบต่อการตอบสนองของเซ็นเซอร์อย่างมีนัยสำคัญ ประเด็นสำคัญคือไบโอเซ็นเซอร์นี้เหมาะสมกว่าในการตรวจจับความเข้มข้นของ DNA ที่สูงขึ้น (ซึ่งไม่ค่อยจะ \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) หรือสูงกว่า) สำหรับการประมวลผลตัวอย่างน้ำในสิ่งแวดล้อมแบบอัตโนมัติโดยสมบูรณ์ โดยที่การทำเจลให้บริสุทธิ์ของผลิตภัณฑ์ PCR อาจไม่สามารถทำได้
พื้นที่ใต้เส้นโค้งการดูดกลืนแสงสำหรับช่วงความยาวคลื่น 600–700 \(\hbox {nm}\) สำหรับความเข้มข้นต่างๆ ของ DNA เชิงซ้อนที่มี \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) มีและไม่มีเกลือ (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) มีและไม่มีเกลือ (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) ความเข้มข้นของ DNA ที่สอดคล้องกับตัวอย่าง \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB ไม่มี DNA
ในการตรวจสอบผลลัพธ์ข้างต้นเพิ่มเติม เราได้ดำเนินการตรวจวัดด้วยแสงโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO) โดยใช้ตัวอย่าง \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) สำหรับแต่ละตัวอย่าง การวัด ลักษณะการดูดกลืนแสงจะลดลงตามความเข้มข้นของ DNA ที่เพิ่มขึ้น ดังจะเห็นได้จากแนวโน้มของพื้นที่ใต้เส้นโค้งการดูดกลืนแสงสำหรับช่วงความยาวคลื่น \(600\,\hbox {nm}\) ถึง \(700\,\hbox { nm}\) ดังแสดงในรูปที่ 4 (สเปกตรัมการดูดซึมที่แสดงในรูปที่ S3 ในข้อมูลเสริม) สำหรับตัวอย่างที่มีความเข้มข้นของ DNA น้อยกว่า \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในการดูดซึมระหว่างตัวอย่างที่มี DNA และตัวอย่างเฉพาะ MB (สำหรับ \(503\,\hbox {bp}\) และ \(117\,\hbox {bp}\ ) ส่วนความยาว) ซึ่งบ่งชี้ว่าไม่มีการยับยั้ง steric ของรีดอกซ์-แอกทีฟ MB ที่ความเข้มข้นของ DNA ที่สูงขึ้น เราสังเกตเห็นการลดลงทีละน้อยในสัญญาณการดูดกลืนแสง และสังเกตการลดลงของการดูดกลืนแสงเมื่อมีเกลือน้อยลง ผลลัพธ์เหล่านี้เกิดจากโมเลกุล ปฏิสัมพันธ์และการยับยั้ง steric กับการซ้อนฐานใน DNA ลูกผสม ผลลัพธ์ของเราสอดคล้องกับรายงานในเอกสารเกี่ยวกับการศึกษาทางสเปกโทรสโกปีของ MB-DNA intercalation ที่เชื่อมโยงภาวะขาดสีกับระดับพลังงานที่ลดลงใน \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) การเปลี่ยนทางอิเล็กทรอนิกส์เนื่องจาก intercalation Layers 36, 37, 38
Agarose gel electrophoresis ของ phage Phi6: ผลิตภัณฑ์ PCR ที่มีความยาว \(117\,\hbox {bp}\) และ \(503\,\hbox {bp}\) จากตัวอย่างน้ำในทะเลสาบ เครื่องหมาย M-DNA;การควบคุมแบบไม่มีเทมเพลต NTC, ไพรเมอร์ที่มีแอมพลิคอนที่สอดคล้องกัน;การควบคุมในเชิงบวกของพีซี1, 2, 3-ไม่เจือปน (1:1) ตัวอย่างน้ำในทะเลสาบที่เพิ่มปริมาณขึ้นเป็น 3 เท่า จะเห็นแถบที่ \(\ประมาณ 50\,\hbox {bp}\) เนื่องจากโอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่ไม่ได้ใช้ใน \(503\,\ ช่อง hbox {bp}\)
เราประเมินประโยชน์ของเซ็นเซอร์โดยใช้ตัวอย่างน้ำในทะเลสาบ Powai ที่เติมด้วย Phi6 phage ความเข้มข้นของ RNA ที่แยกได้จากตัวอย่างน้ำที่มี phage-spik มีค่าตั้งแต่ 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\) ในขณะที่พวกที่แยกได้จากสารแขวนลอยฟาจบริสุทธิ์ RNA นั้นประมาณว่า \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) โดยมีประสิทธิภาพการกู้คืนประมาณ 1 %.RNA ถูกคัดลอกย้อนกลับเป็น cDNA และใช้เป็นแม่แบบสำหรับ PCR และ qPCR ขนาดของผลิตภัณฑ์ได้รับการยืนยันโดย agarose gel electrophoresis (รูปที่ 5) ก่อนการทดสอบด้วยเซ็นเซอร์ ตัวอย่างเหล่านี้ไม่ได้ผ่านการทำให้บริสุทธิ์ด้วยเจล ดังนั้นจึงมีส่วนประกอบทั้งหมดของ PCR เป็น รวมทั้งแอมพลิคอนที่สนใจ ค่า Ct ที่บันทึกระหว่าง qPCR (ตารางที่ 1) แสดงให้เห็นว่ามีความสัมพันธ์กับความเข้มข้นของ RNA ที่แยกได้จากตัวอย่างน้ำที่ถูกแทง ค่า Ct จะแสดงจำนวนรอบที่จำเป็นสำหรับสัญญาณเรืองแสงถึง เกินเกณฑ์หรือสัญญาณพื้นหลัง ค่า Ct ที่สูงขึ้นบ่งชี้ถึงความเข้มข้นของเทมเพลตที่ต่ำกว่า และในทางกลับกัน ค่า Ct ของตัวอย่าง NTC นั้นสูงตามที่คาดไว้ ความแตกต่างใน \(\ ประมาณ 3\) ค่า Ct ระหว่าง การควบคุมเชิงบวกและตัวอย่างทดสอบบ่งชี้เพิ่มเติมว่าตัวอย่างทดสอบแต่ละรายการมีเทมเพลตประมาณ 1% เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมเชิงบวก ก่อนหน้านี้เราได้กล่าวถึงว่าแอมพลิคอนที่ยาวขึ้นนำไปสู่ความไวที่ดีขึ้น การขยายชิ้นส่วนที่ยาวขึ้นซึ่งแยกได้จากตัวอย่างสิ่งแวดล้อมที่แตกต่างกันเป็นสิ่งที่ท้าทายเนื่องจากข้อเสีย มีความเข้มข้นของไวรัสต่ำและการสลายตัวของ RNA อย่างไรก็ตาม ด้วยการเพิ่มปริมาณไวรัสและโปรโตคอลการขยาย PCR ของเรา เราจึงสามารถขยายส่วน \(503\,\hbox {bp}\) สำหรับการตรวจจับทางเคมีไฟฟ้าได้สำเร็จ
รูปที่ 6 แสดงผลเซ็นเซอร์ไฟฟ้าเคมีของแอมพลิคอนแฟรกเมนต์ \(503\,\hbox {bp}\) ทั้งที่ใช้ cDNA ที่ไม่เจือปนเป็นแม่แบบ (1:1) และ cDNA ที่เจือจาง 100 เท่าเป็นแม่แบบ (1:100 ) ดำเนินการ PCR เทียบกับ NTC และ PC (ดูรูปที่ S4 ในข้อมูลเสริมสำหรับโวลแทมโมแกรมที่เป็นตัวแทน) แต่ละกล่องในแผนผังกล่องในรูปที่ 6 มีการวัดจากตัวอย่างสามตัวอย่างที่อิเล็กโทรด 5 อิเล็กโทรด อิเล็กโทรดเดียวกันถูกใช้เพื่อวัดตัวอย่างทั้งหมดเพื่อหลีกเลี่ยงข้อผิดพลาดเนื่องจากอิเล็กโทรด -to-อิเล็กโทรดที่แปรผัน เมื่อเปรียบเทียบกับการวัด CV การวัด DPV แสดงความละเอียดที่ดีกว่าเพื่อแยกแยะตัวอย่างการทดสอบและพีซีจาก NTC เนื่องจากตามที่กล่าวไว้ก่อนหน้านี้ กระแส Faradaic ถูกซ่อนไว้เนื่องจากกระแส capacitive เบื้องหลังในช่วงหลัง สำหรับแอมพลิคอนที่ยาวขึ้น เราสังเกตว่า การควบคุมเชิงลบ (NTC) ส่งผลให้กระแสสูงสุด CV และ DPV สูงขึ้นเมื่อเทียบกับการควบคุมเชิงบวก ในขณะที่ตัวอย่างทดสอบที่เป็นบวกและไม่เจือปนแสดงความสูงสูงสุดของกระแสพีค DPV ที่ใกล้เคียงกัน ค่าเฉลี่ยที่วัดได้และค่ามัธยฐานสำหรับแต่ละรายการที่ไม่เจือปน (1:1 ) ตัวอย่างทดสอบและ PC สามารถแก้ไขได้อย่างชัดเจนจากเอาต์พุตเซ็นเซอร์สำหรับตัวอย่าง NTC ในขณะที่ความละเอียดสำหรับตัวอย่างที่เจือจาง 1:100 นั้นเด่นชัดน้อยกว่า สำหรับการเจือจาง cDNA 100 เท่า เราไม่สังเกตเห็นแถบใดๆ ในระหว่างเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส (เลนไม่แสดงในรูปที่ 5) และกระแสสูงสุด DPV และ CV ที่สอดคล้องกันนั้นใกล้เคียงกับที่คาดไว้สำหรับ NTC ผลลัพธ์สำหรับชิ้นส่วน \(117\,\hbox {bp}\) จะแสดงอยู่ในข้อมูลเสริม ส่วนค่าลบ การควบคุมทำให้เกิดการตอบสนองทางเคมีไฟฟ้าจากเซ็นเซอร์ PCB เนื่องจากการดูดซับของ MB อิสระบนอิเล็กโทรดและการทำงานร่วมกันของ MB กับไพรเมอร์โอลิโกนิวคลีโอไทด์แบบเส้นเดี่ยว ดังนั้น ทุกครั้งที่มีการทดสอบตัวอย่าง จะต้องดำเนินการควบคุมเชิงลบและ กระแสสูงสุดของตัวอย่างทดสอบเทียบกับกระแสสูงสุดที่ได้รับจากการควบคุมเชิงลบเพื่อให้ได้การวัดผลต่าง (สัมพัทธ์) เพื่อจำแนกตัวอย่างทดสอบว่าเป็นบวกหรือลบ
(a) DPV และ (b) กระแส CV สูงสุดสำหรับการตรวจจับทางเคมีไฟฟ้าของชิ้นส่วน \(503\,\hbox {bp}\) ในตัวอย่างน้ำในทะเลสาบ ตัวอย่างทดสอบถูกวัดเป็นสามเท่าและเปรียบเทียบกับไม่มีการควบคุมแม่แบบ (NTC) และ การควบคุมเชิงบวก (PC)
การค้นพบของเราแสดงให้เห็นกลไกต่างๆ ที่ส่งผลต่อประสิทธิภาพของเซ็นเซอร์ไฟฟ้าเคมีสำหรับแอมพลิคอนที่มีความยาวต่างกันสำหรับ DNA ที่แตกต่างกัน โดยมีการตรวจสอบความเข้มข้นโดยการวัดด้วยแสงโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ UV/Vis การสังเกตของเราเน้นย้ำข้อมูลเชิงลึกว่าชิ้นส่วน DNA ที่ยาวขึ้นถึง \(\ประมาณ\) \(500\,\hbox {bp}\) สามารถตรวจจับได้ด้วยความไวที่สูงขึ้น และการมีเกลือในตัวอย่างไม่มีความเข้มข้นของ DNA ความไวที่ส่งผลต่อความไวที่สูงขึ้น (ไม่ค่อยพบ \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) และสูงกว่า) นอกจากนี้ เรายังตรวจสอบผลกระทบของตัวอย่างประเภทต่างๆ รวมถึงแอมพลิคอนเจลบริสุทธิ์ที่มีและไม่มีการเติมเกลือ และการเติมตัวอย่างน้ำในทะเลสาบในการวัด DPV และ CVเราสังเกตเห็นว่า DPV ให้ความละเอียดที่ดีกว่า เนื่องจากกระแส capacitive ในพื้นหลังยังส่งผลต่อการวัด CV ทำให้มีความไวน้อยลง
การขยายชิ้นส่วนที่ยาวขึ้นนั้นขึ้นอยู่กับความสมบูรณ์ของ RNA จีโนมของไวรัส การศึกษาหลายชิ้นแสดงให้เห็นว่าการขยายชิ้นส่วนที่ยาวขึ้นนั้นไม่ได้มีประสิทธิภาพเสมอไป เนื่องจากการย่อยสลายของ RNA ในสิ่งแวดล้อมและศักยภาพในการประกบกันระหว่างการแยก 11,41,42,43,44 เราสังเกตเห็นว่าวิธีความเข้มข้นของไวรัสที่ใช้ PEG นั้นมีประสิทธิภาพมากกว่าในการรวม phage Phi-6 ที่พุ่งสูงขึ้นในตัวอย่างน้ำในทะเลสาบมากกว่าวิธีความเข้มข้นของไวรัสที่ใช้อะลูมิเนียมไฮดรอกไซด์ เพื่อขยายเท็มเพลตความยาวที่สั้นกว่าหลายรายการ และลดความเป็นไปได้ของการข้ามความเฉพาะเจาะจง
ตัวอย่างทางชีวภาพมีน้อย ดังนั้นจึงจำเป็นต้องออกแบบไบโอเซนเซอร์ที่ต้องใช้ตัวอย่างน้อยที่สุดสำหรับการทดสอบ อิเล็กโทรด ENIG PCB ที่ใช้ในการศึกษานี้ต้องการเพียง \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) ตัวอย่างสำหรับการทดสอบให้ครอบคลุมพื้นที่ที่มีประสิทธิภาพของอิเล็กโทรด นอกจากนี้ สามารถนำอิเล็กโทรดเดิมกลับมาใช้ใหม่ได้หลังจากทำความสะอาดก่อนจ่ายตัวอย่างถัดไป ตัวอย่างที่ขยายไม่จำเป็นต้องเติมสารเคมีใดๆ นอกจากเมทิลีนบลูซึ่งมีราคาไม่แพง และสารเคมีที่ใช้กันทั่วไป เนื่องจากอิเล็กโทรดแต่ละอันมีราคาประมาณ 0.55 ดอลลาร์สหรัฐฯ (หรือ 40 รูปีอินเดีย) ในการผลิต ไบโอเซนเซอร์นี้จึงเป็นทางเลือกที่คุ้มค่าสำหรับเทคโนโลยีการตรวจจับที่มีอยู่ ตารางที่ 2 แสดงการเปรียบเทียบงานนี้กับเซ็นเซอร์อื่นๆ ที่รายงานในวรรณกรรมมาเป็นเวลานาน ชิ้นส่วนดีเอ็นเอในตัวอย่างที่ต่างกัน
เนื่องจากโปรโตคอลการตรวจจับทางเคมีไฟฟ้าที่ใช้ MB อาศัยความจำเพาะของ PCR ข้อจำกัดที่สำคัญของวิธีนี้คือศักยภาพในการขยายแบบไม่จำเพาะในตัวอย่างที่ต่างกัน เช่น น้ำเสียและน้ำในทะเลสาบ หรือการใช้ไพรเมอร์ที่มีความบริสุทธิ์ต่ำ เพื่อปรับปรุงความไวของ วิธีการตรวจจับทางเคมีไฟฟ้าสำหรับการตรวจจับ DNA ของผลิตภัณฑ์ PCR ที่ไม่บริสุทธิ์โดยใช้อิเล็กโทรด ENIG PCB ที่ไม่ได้ดัดแปลง จำเป็นต้องเข้าใจข้อผิดพลาดที่เกิดจาก dNTP และไพรเมอร์ที่ไม่ได้ใช้ได้ดีขึ้น และเพื่อปรับสภาพปฏิกิริยาและโปรโตคอลการทดสอบให้เหมาะสม พารามิเตอร์ทางเคมีกายภาพเพิ่มเติม เช่น pH อุณหภูมิ และชีวภาพ อาจต้องมีการวัดความต้องการออกซิเจน (BOD) ของตัวอย่างน้ำด้วย เพื่อปรับปรุงความแม่นยำของการวัด
โดยสรุป เราขอเสนอเซ็นเซอร์ ENIG PCB เคมีไฟฟ้าต้นทุนต่ำสำหรับการตรวจจับไวรัสในตัวอย่างสิ่งแวดล้อม (น้ำในทะเลสาบ) ซึ่งแตกต่างจากอิเล็กโทรดโอลิโกนิวคลีโอไทด์ตรึงหรือสารตั้งต้นแบบกำหนดเองสำหรับการตรวจจับดีเอ็นเอที่ต้องใช้การเก็บความเย็นเพื่อรักษาความไว 53,54 เทคนิคของเราใช้ PCB ที่ไม่ได้แก้ไข อิเล็กโทรดที่มีอายุการเก็บรักษานานขึ้นและไม่มีข้อกำหนดในการจัดเก็บเฉพาะ ดังนั้นจึงเหมาะสำหรับการพัฒนาโซลูชันการวัดด้วยการประมวลผลตัวอย่างอัตโนมัติที่ติดตั้งใน LMIC ไบโอเซนเซอร์ใช้สีย้อมรีดอกซ์ที่แทรกระหว่างดีเอ็นเอ (MB) ราคาไม่แพงสำหรับการตรวจจับแอมพลิคอนเป้าหมายอย่างรวดเร็ว การขยายแบบไม่จำเพาะเจาะจง ที่พบทั่วไปในตัวอย่างสิ่งแวดล้อมช่วยลดความจำเพาะของวิธีการตรวจจับนี้ เนื่องจากการจับ MBs แบบไม่จำเพาะเจาะจงกับโอลิโกนิวคลีโอไทด์แบบเส้นเดี่ยวและแบบสองเส้น ดังนั้น ความจำเพาะของการทดสอบนี้ขึ้นอยู่กับการปรับให้เหมาะสมของไพรเมอร์และสภาวะของปฏิกิริยา PCR นอกจากนี้ CV และกระแสสูงสุด DPV ที่ได้จากตัวอย่างที่ทดสอบควรตีความโดยสัมพันธ์กับการตอบสนองที่ได้รับจากการควบคุมเชิงลบ (NTC) สำหรับการทดสอบแต่ละครั้ง การออกแบบและวิธีการเซ็นเซอร์ไฟฟ้าเคมีที่นำเสนอในงานนี้สามารถรวมเข้ากับเครื่องเก็บตัวอย่างอัตโนมัติเพื่อพัฒนาแบบอัตโนมัติเต็มรูปแบบและมีค่าต่ำ - โซลูชันต้นทุนที่สามารถรวบรวมและวิเคราะห์ตัวอย่างและส่งผลลัพธ์แบบไร้สายกลับไปยังห้องปฏิบัติการ
Cashdollar, J. & Wymer, L. วิธีการสำหรับความเข้มข้นเริ่มต้นของไวรัสจากตัวอย่างน้ำ: การทบทวนและการวิเคราะห์อภิมานของการศึกษาล่าสุด J.Application.microorganism.115, น. 1-11 (2556).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL ไวรัสจากน้ำ: อุปสรรคต่อน้ำดื่มที่ปลอดภัย PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015)
Shrestha, S. et al. ระบาดวิทยาน้ำเสียสำหรับการเฝ้าระวังขนาดใหญ่ของ COVID-19 ที่คุ้มค่าในประเทศที่มีรายได้น้อยและปานกลาง: ความท้าทายและโอกาส Water 13, 2897 (2021)
Palecek, E. & Bartosik, M. เคมีไฟฟ้าของกรดนิวคลีอิก Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2555).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylene blue เป็นตัวจำแนกทางเคมีไฟฟ้าของโอลิโกนิวคลีโอไทด์แบบเส้นเดี่ยวและแบบสองเส้นที่ตรึงบนพื้นผิวทองคำ นักวิเคราะห์ 126, 1756–1759 (2001)
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ การเปรียบเทียบระหว่างประจุบวกและไอออนประจุลบสำหรับการถ่ายโอนทางเคมีไฟฟ้าของการผสมดีเอ็นเอโดยการถ่ายโอนอิเล็กตรอนระยะไกล Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004)
Wong, EL & Gooding, JJ การถ่ายโอนประจุผ่าน DNA: biosensor DNA เคมีไฟฟ้าแบบเลือก.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2549)
Fang, TH และคณะ อุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิก PCR แบบเรียลไทม์พร้อมการตรวจจับไฟฟ้าเคมีพร้อมกัน เซ็นเซอร์ชีวภาพ ไบโออิเล็กทรอนิกส์ 24, 2131–2136 (2009)
Win, BY et al. การศึกษากลไกการส่งสัญญาณและการตรวจสอบประสิทธิภาพของระบบ PCR แบบเรียลไทม์เคมีไฟฟ้าตามปฏิสัมพันธ์ของเมทิลีนบลูกับ DNA นักวิเคราะห์ 136, 1573–1579 (2011)
Ramirez-Chavarria, RG et al. เซ็นเซอร์ไฟฟ้าเคมีไฟฟ้าเคมีที่ใช้แอมพลิฟายเออร์แบบไอโซเทอร์มอลแบบใช้ความร้อนแบบวนซ้ำสำหรับการตรวจจับ sars-cov-2 ในตัวอย่างน้ำเสีย J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022)
Kumar, M. et al. การตรวจจับด้วยไฟฟ้าเคมีของแอมพลิคอน SARS-CoV-2 ด้วยขั้วไฟฟ้า PCB เซ็นเซอร์ถูกเปิดใช้งาน B Chemistry.343, 130169 (2021)
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. การตรวจจับ SARS-CoV-2 RNA อย่างมีประสิทธิภาพในส่วนที่เป็นของแข็งของ Wastewater.science.general environment.763, 144587 (2021)
Alygizakis, N. et al.Analytical Methods for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020)
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orev, T. & Kashtan, N. การอยู่รอดของ bacteriophage Phi6 ที่ถูกห่อหุ้ม (ตัวแทนสำหรับ SARS-CoV-2) ในน้ำลายระเหยที่สะสมอยู่บนพื้นผิวกระจก Science.Rep.10, 1–10 (2020)
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ การคงอยู่ทางสิ่งแวดล้อมของตัวแทน SARS-CoV-2 (Phi6) ในอะมีบาอิสระสุขภาพน้ำ 20, 83 (2021).
Mindich, L. การบรรจุที่แม่นยำของชิ้นส่วนจีโนมสามส่วนของแบคทีเรีย RNA แบบเกลียวคู่\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (2542).
Pirttimaa, MJ & Bamford, โครงสร้างรองของภูมิภาคบรรจุภัณฑ์ DH RNA phage\(\varphi\)6RNA 6, 880–889 (2000)
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – โปรโตคอลที่รวดเร็วและมีประสิทธิภาพสำหรับการเตรียมสต็อกแบคทีเรียในห้องปฏิบัติการ PeerJ 4, e2261 (2016)
เวลาโพสต์: พฤษภาคม 27-2022