Ташаккур ба шумо барои боздид аз Nature.com. Версияи браузере, ки шумо истифода мебаред, дастгирии маҳдуди CSS дорад. Барои таҷрибаи беҳтарин, тавсия медиҳем, ки браузери навшударо истифода баред (ё ҳолати мувофиқатро дар Internet Explorer хомӯш кунед). Дар ҳамин ҳол, барои таъмини дастгирии давомдор, мо сайтро бе сабкҳо ва JavaScript намоиш медиҳем.
Аҳамияти мониторинги намунаҳои муҳити зист аз оғози пандемияи COVID-19 хеле қадр карда шудааст ва баъзе кӯшишҳои мониторинг бо истифода аз стандарти тиллоӣ анҷом дода мешаванд, гарчанде усулҳои дар асоси qPCR гарон ҳастанд. Биосенсорҳои электрохимиявии ДНК метавонанд эҳтимолан камхарҷро таъмин кунанд. ҳалли мониторинги намунаҳои оби муҳити зист дар кишварҳои даромади кам ва миёна. Дар ин кор, мо кашфи электрохимиявии ампликонҳоро, ки аз фагҳои Phi6 аз намунаҳои оби кӯл ҷудо карда шудаанд (сурогат маъмул барои SARS-CoV-2) бо истифода аз ENIG нишон медиҳем. то электродхои PCB бе тагйир додани сатхи.ҷинс. Ҷавоби санҷандаҳои электрохимиявӣ барои ду порчаи ДНК-и дарозии гуногун (\({117}\,\hbox {bp}\) ва \({503}\,\hbox {bp}\)) ба таври муфассал тавсиф карда шуд. таъсири намакҳо дар омехтаҳои мастери ПТР ба мутақобилаи кабуди метиленӣ (МБ)-ДНК. Натиҷаҳои мо нишон медиҳанд, ки дарозии пораҳои ДНК ҳассосияти электрохимиявиро ба таври назаррас муайян мекунад ва дар ин кор нишон медиҳад, ки қобилияти ошкор кардани ампликонҳои дароз бидуни тозакунии гели маҳсулоти ПТР барои чен кардани намунаҳои об дар ҷои он муҳим аст.Як ҳалли пурраи автоматӣ барои сарбории вирусӣ хуб аст.
Интиқоли вируси об тавассути об ҳамчун як хатари саломатии аҳолӣ аз солҳои 1940-ум бо нишон додани аввалин далели интиқоли тавассути об тавассути полиомиелит ва гепатити E1 маълум аст. Ташкилоти умумиҷаҳонии тандурустӣ (ТУТ) якчанд микроорганизмҳои вирусии тавассути об интиқолёфтаро, ки аҳамияти миёна ва баланд доранд, тасниф кардааст2. Вируси анъанавӣ усулҳои ошкор ба усулҳои тиллои qPCR асосёфта такя мекунанд, ки хеле ҳассос ва мушаххасанд, аммо аз кормандони ботаҷриба барои санҷиш дар лаборатория бо истифода аз асбобҳои гаронбаҳо талаб мекунанд. Аммо, дар кишварҳои даромади паст ва миёна (LMIC) бо захираҳои маҳдуд, одамон Эҳтимол аст, ки санҷиши намуна нисбат ба мониторинги намунаи об бартарият дошта бошад. Аз ин рӯ, усулҳои алтернативии камхарҷ барои мониторинги устувор ва воқеии намунаҳои об ва партовҳо дар кишварҳои камдаромад ва миёна ҳамчун огоҳии барвақт аз хуруҷи беморӣ заруранд. ба ин васила онҳоро аз таъсири шадиди иҷтимоию иқтисодии пандемияи вирус муҳофизат мекунад. Биосенсорҳои электрохимиявии арзон барои кислотаҳои нуклеинӣ метавонанд ҳалли эҳтимолии ин эҳтиёҷоти қонеънашавандаро таъмин кунанд. Бисёре аз ин биосенсорҳои ДНК бо он кор мекунанд, ки риштаҳои иловагии ДНК дар электрод безарар карда мешаванд. Вақте ки дар намуна як пайдарпаии мувофиқ мавҷуд аст, сатҳ ва гибридизатсия мешаванд. Он гоҳ мумкин аст бо истифода аз миёнаравҳои оксидшавӣ ба монанди оҳани калий/ферросианид ба сигнал табдил дода шавад. Кабуди метиленӣ (MB) яке аз чунин молекулаҳои редокс-фаъол мебошад, ки дорои гузориш дода шудааст, ки ба ДНК-и дуқабата (dsDNA) илова ба пайвастагии ғайримуқаррарии он ба ДНК-и якқатор 5,6. Табиати байниҳамдигарии МБ барои ташаккули комплексҳои МБ-ДНК онҳоро интихоби маъмул ҳамчун миёнаравҳои редокс дар якчанд ДНК электрохимиявӣ месозад. конфигуратсияҳои сенсор5,6,7,8,9. Ҳарчанд пайвастагии МБ ба ДНК ғайримуқаррарӣ аст ва хусусияти ин сенсори электрохимиявӣ асосан аз тозагии праймерҳое, ки барои PCR ё амплификацияи изотермикӣ истифода мешаванд, вобаста аст, он барои амалӣ намудани -вақти электрохимиявӣ дар асоси qPCR ё амплификацияи изотерми флуоресцентӣ ҳамчун алтернатива ба андозагирии консентратсияи ДНК 9 .Дар яке аз чунин татбиқ, Won et al.The сатҳи электродҳои тиллоӣ бо 6-mercapto-1-hexanol (MCH) барои вақти воқеӣ тағир дода шуд. андозагирии ампликонҳои ПТР бо МБ бо истифода аз вольтметрияи дифференсиалии импульс (DPV) 9. Дар дигар ҳолатҳо, Рамирес ва дигарон. Муайян кардани SARS-CoV-2 дар оби партов тавассути реаксияи RT-LAMP бо истифода аз МБ бо электродҳои дар экран чопшуда. Электродҳои платина низ ҳамчун электродҳои in situ дар платформаи microfluidic PCR тарҳрезӣ барои electrochemically ошкор amplicons дар давоми реаксияҳо истифода бурда мешавад 8 .Ҳамаи ин тадқиқот талаб тағйироти сатҳи электродҳо, маънои афзоиши истеҳсолот ва хароҷоти амалиётӣ бо сабаби талаботи нигаҳдории махсус барои устувории ин electrodes functionalized.
Схемаи ҷараёни кор барои дарёфти электрохимиявии ампликонҳо, ки аз зарраҳои консентратсияи вирусӣ дар намунаҳои оби кӯл гирифта шудаанд.
Мо ба наздикӣ ҳассосияти электрохимиявии ампликонҳои SARS-CoV-2-ро бо электродҳои арзони тахтаи микросхемаҳои чопӣ (PCB) дар асоси DPV ва вольтметрияи даврӣ (CV), ки тавассути адсорбсияи комплексҳои МБ-ДНК дар сатҳи электродҳои тағирнаёбанда ба вуҷуд омадаанд, нишон додем. ҷорӣ 11.Мо хабар медиҳем, ки пораҳои дарозтари ДНК (N1-N2, \({943}\, \hbox) бо истифода аз праймерҳои тавсияшудаи CDC N1 ба пеш ва N2 баръакс дар муқоиса бо порчаҳои кӯтоҳтар {bp}\) ташаккул ёфтаанд) дар вокуниши сенсор хатти беҳтар нишон доданд. (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) бо истифода аз маҷмӯаҳои ибтидоии N1 ба пеш ва N1 баръакс ташкил карда шудааст. Дар ин таҳқиқотҳо бо истифода аз маҳлулҳои ДНК дар оби бенуклеаз омода карда шудаанд. Платформа инчунин барои ошкор кардани SARS-CoV истифода шудааст. -2 ампликон дар намунаҳои обҳои партовҳои тақлидшуда (бо роҳи пошидани намунаҳои умумии РНК бо РНК SARS-CoV-2 ба даст оварда шудаанд). Азбаски РНК ҳангоми ҷудокунӣ ва коркарди поёноб ба буридашавӣ ҳассос аст,12,13 бо ин намунаи гетерогенӣ васеъ кардани порчаҳои дарозтар душвор аст. Аз ин рӯ, намоиши ҳассосияти электрохимиявии ампликони SARS-CoV-2 дар оби партов бо порчаи кӯтоҳтари \(72\,\hbox {bp}\) N1 маҳдуд аст.
Дар ин кор, мо имконпазирии ҳассосияти электрохимиявии ENIG дар асоси PCB-и фагҳои Phi6-ро аз намунаҳои оби кӯл мутамарказ ва ҷудошударо таҳқиқ кардем (расми 1). Фагҳои Phi6 аз рӯи ҳаҷм (80-100 нм) бо SARS-CoV-2 ва инчунин мембранаи липидӣ ва протеини хӯша дорад. Бо ин сабабҳо, бактериофаги Phi6 як суррогат маъмул барои SARS-CoV-2 ва дигар вирусҳои патогении РНК мебошад14,15. РНК-и аз зарраҳои фаг ҷудошуда ҳамчун шаблон барои синтези cDNA истифода мешавад PCR барои ба даст овардани ду порчаи ДНК-и ҷуфтҳои 117 ва 503 дар дарозӣ. Бо дарназардошти мушкилоти пурзӯр кардани порчаҳои \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 дар кори пештара, мо пораҳои дарозии фосилавиро (\(117) ҳадаф қарор медиҳем. \,\hbox {bp}\) ва \(503 \,\hbox {bp}\)), дар асоси праймерҳои мавҷуда. Ҷавоби санҷандаҳои электрохимиявӣ дар доираи васеи консентратсияи (\({10}\,{) мунтазам омӯхта шуд. \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) ба \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Барои ҳарду порча дар мавҷудияти МБ, таъсири намак ба вокуниши сенсор бо ченакҳои спектрофотометрӣ тавсиф ва салиб тасдиқ карда шудааст. Ҳиссаҳои асосии ин кор инҳоянд:
Дарозии порчаи ДНК ва мавҷудияти намак дар намуна ба ҳассосият сахт таъсир мерасонад.Натиҷаҳои мо нишон медиҳанд, ки фаъолияти электрохимиявӣ аз механизмҳои гуногуни таъсири мутақобилаи МБ, ДНК ва сенсор дар вокуниши вольтметрӣ вобаста ба консентратсияи ДНК ва дарозӣ вобаста аст, бо дарозии Фрагментҳо ҳассосияти баландтар нишон медиҳанд, гарчанде намак ба таъсири мутақобилаи электростатикии байни онҳо таъсири манфӣ мерасонад. МБ ва ДНК.
Консентратсияи ДНК механизми таъсири мутақобилаи МБ-ДНК-ро дар электродҳои тағйирнашуда муайян мекунад Мо нишон медиҳем, ки механизмҳои гуногуни мутақобилаи МБ-ДНК аз консентратсияи ДНК вобастаанд. Дар консентратсияи ДНК аз миқдори ками \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox) {l}}}\), мо мушоҳида кардем, ки аксуламали ҷараёни электрохимиявӣ асосан тавассути адсорбсияи МБ-ДНК дар электрод муайян карда мешавад, дар ҳоле ки дар консентратсияи пасттар дар консентратсияи баланди ДНК аксуламали ҷараёни электрохимиявӣ бо ҷилавгирӣ аз стерикии редокс муайян карда мешавад. фаъолият аз сабаби ворид кардани МБ байни ҷуфтҳои пойгоҳи ДНК.
Ҳисси электрохимиявии ENIG дар асоси PCB кислотаҳои нуклеинҳои вирусӣ дар намунаҳои оби кӯл. Мушоҳидаҳо бо роҳи кашфи электрохимиявии порчаҳои ДНК-и Phi6 иловашуда \(503\,\hbox {bp}\) аз намунаҳои об аз кӯли Повай, Кампуси IIT Мумбай ба даст оварда шудаанд. Натиҷаи фаг.
Арзиши пасти татбиқ ва потенсиали ҳамгироӣ ба системаҳои мониторинги пурра автоматӣ, олигонуклеотидҳо ё аптамерҳо дар электродҳо бо мӯҳлати дарозтар.
Phage Phi6 як вируси dsRNA пӯшонидашудаи оилаи Cytoviridae мебошад, ки Pseudomonas syringae-ро сироят мекунад. Геномҳои фаги Phi6 дар шакли 3 порча мавҷуд аст: S (\(2,95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4,07) \,\hbox {Kb}\)) ва L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Азбаски фаги Phi6 штамми ғайрипатогении BSL-1 Pseudomonas-ро сироят мекунад, истифодаи он бехатар аст. ва онро дар лаборатория ба осонӣ парвариш кардан мумкин аст. Phage Phi6 ва мизбони он Pseudomonas syringae аз Маркази истинод ба вирусҳои бактериявии Феликс d'Herelle, Донишгоҳи Лавал, Канада харида шудаанд (рақамҳои каталоги маркази истинод мутаносибан HER-102 ва HER-1102 мебошанд) Фаги .Phi6 ва мизбони он мувофиқи дастури маркази истинод дубора эҳё карда шуданд. Фаж Phi6 тавассути лизиси табақ ва элюсия тоза карда шуд, то титрҳои ниҳоӣ бо \(\тақрибан 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (воҳидҳои ташаккули лавҳа/ миллилитр).РНК аз зарраҳои фагҳои тозашуда бо истифода аз маҷмӯаи универсалии умумии RNA поксозии GenElute™ (Sigma-Aldrich) мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда ҷудо карда шуд. Хулоса, суспензияи тозашудаи фаги Phi6\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) лизис карда шуд ва лизат ба сутуни чарх бор карда шуд, то ба РНК имкон диҳад, ки ба сутуни қатрон пайваст шавад . Сипас РНК дар маҳлули элюционӣ элюта карда мешавад \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), ки аз ҷониби маҷмӯа пешбинӣ шудааст. Консентратсияи РНК-ро аз рӯи абсорбенс дар \(260\,\hbox {nm}\ ҳисоб кунед).РНК дар аликвотҳо дар \ нигоҳ дошта шуд. ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) то истифодаи минбаъда.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Маҷмӯаи синтези cDNA iScript (Bio) -Rad Laboratories) ҳамчун шаблон барои синтези cDNA мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда истифода шуд. Хулоса, реаксияи синтези cDNA аз 3 марҳила иборат аст: омодасозӣ дар \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , транскрипсияи баръакси \({20}\,{\hbox {min}}\) дар \({46}\,{^{\circ) }\hbox {C}}\), ва баръакс Сабткунак дар \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) барои \({1}\,{\hbox {дақ. }}\).Вақте ки дар гели агарозии 1% иҷро мешуд, cDNA се банди мувофиқро ба се порчаи РНК-и пешбинишуда нишон дод (маълумот нишон дода нашудааст). Примерҳои зерин барои тақвият додани ду порчаи ДНК-и 117 ва 503 bp дарозӣ истифода шуданд, бо истифода аз cDNA ҳамчун қолаб барои PCR дар сикли гармии miniPCR® mini8:
Примерҳои \(117\,\hbox {bp}\) ва \(503\,\hbox {bp}\) ба нуклеотидҳои 1476-1575 сегменти M ва 458-943 нуклеотидҳои сегменти L, кислотаҳо мувофиқанд. .Ҳамаи маҳсулоти пурқувватшудаи ПТР дар гелҳои агарози 1% электрофорез карда шуданд ва ДНК-и мақсаднок бо истифода аз маҷмӯаи Extraction Gel GeneJET (Thermo Fisher Scientific) тоза карда шуд.
Кӯл дар кампуси IIT Мумбай (Кӯли Повай, Повай, Мумбай) барои илова кардани зарраҳои фаг истифода шуд. Оби кӯл тавассути мембранаи \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) филтр карда шуд. заррачаҳои овезоншуда ва сипас фаги Phi6 илова карда шуд. Иловаи \({1}\,{\hbox {ml}}\) аз \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) ба \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) оби филтршудаи кӯл, дар \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Мо ду усули гуногуни консентратсияи заррачаҳои вируси Phi6-ро санҷидаем: (1) усули адсорбсияи гидроксиди алюминӣ-бориш,19, ки барои консентратсияи якчанд вирусҳои РНК пӯшонидашуда аз намунаҳои муҳити зист тасдиқ шудааст ва (2) ) Усули консентратсияи вирус дар асоси полиэтиленгликол (PEG) аз Flood et al.20 .Азбаски самаранокии барқарорсозии усули ба PEG асосёфта нисбат ба усули гидроксиди алюминий беҳтар аст, усули PEG барои консентратсияи зарраҳои Phi6 аз намунаҳои оби кӯл истифода шуд.
Усули PEG истифодашуда чунин буд: PEG 8000 ва \(\hbox {NaCl}\) ба намунаҳои оби кӯли Phi6 барои ба даст овардани 8% PEG 8000 ва \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Намунаҳо дар ларза инкубатор карда шуданд\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), сипас дар \(4700 \,\hbox {g}\) центрифуга карда мешавад \({45}\,{\hbox {min}}\). Моҳи супернатантро партоед ва пеллетро дар \({1}\, боздоред, {\hbox {ml}}\) дар ҳамон супернатант. Ҳама таҷрибаҳои консентратсияи вирусҳо дар се нусха анҷом дода шуданд. Пас аз консентратсия, як аликвоти хурд барои чен кардани самаранокии барқарорсозӣ тавассути таҳлили лавҳа ҷудо карда шуд. РНК тавре ки қаблан тавсиф шуда, ҷудо карда шуд дар буфери элюционии аз маҷмӯа таъминшуда \({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Азбаски консентратсияи РНК аз намуна ба намуна дар се нусха фарқ мекунад, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) аз РНК барои ҳар се новобаста аз консентратсияи он истифода мешавад Синтези cDNA аз намунаҳо. Синтези cDNA тавре ки қаблан тавсиф шудааст, иҷро карда шуд.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA ҳамчун шаблон барои \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR барои 35 давра барои тақвият додани \ (117\,\hbox {bp}\) ва \(503\,\hbox { bp}\) порчаҳо. Ин намунаҳо ҳамчун “1:1″, яъне бе ҳалкунӣ муаррифӣ карда мешаванд. Назорати бе шаблон (NTC) ҳамчун назорати манфӣ таъсис дода шуд, дар ҳоле ки cDNA бо истифода аз РНК ҷудошуда аз фагҳои тозашуда синтез карда шуд. ҳамчун як қолаб барои назорати мусбат (PC) .Миқдори PCR (qPCR) дар асбоби Stratagene Mx3000P RT-PCR бо истифода аз Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies) анҷом дода шуд. Реаксияҳо дар се нусха ҳамчун қаблан насб карда шуданд. Ҳадди давра (Ct) барои ҳамаи намунаҳо сабт карда шуд. Илова бар ин, намунаҳои маҳлулшуда \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) бо истифода аз cDNA дар 1:100 дар оби филтршудаи кӯл маҳлул карда шуданд. \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR барои 35 давра. Ин намунаҳо ҳамчун "1:100" муаррифӣ мешаванд.
Электродҳои PCB бо истифода аз раванди дастраси камхарҷи Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) бидуни зарурати тиллоии иловагӣ сохта мешаванд. Мушаххасоти электроди ENIG PCB дар кори қаблии мо муфассал оварда шудаанд11. Барои электродҳои ENIG PCB, усулҳои тозакунии анъанавии электрод ба монанди маҳлули пиранҳа ё вольтметрияи циклии кислотаи сулфат тавсия дода намешавад, зеро онҳо метавонанд боиси пӯст шудани қабати тунуки тиллои (ғафсӣ \(\тақрибан\) \(100\,\hbox {nm }\)) ва фош кардани қабатҳои миси зери майл шаванд ба зангзании 21, 22, 23, 24, 25. Аз ин рӯ, электродҳоро бо матои тоза, ки бо IPA тар карда шудааст, тоза кунед. Намунаи санҷидашуда бо \({50}\,{\upmu \hbox {M} инкубатор карда шуд. }\) МБ дар \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) барои воридкунии осон.Дар кори қаблии мо , мо мушоҳида кардем, ки ҳассосият ва хаттии сенсор тавассути афзоиши консентратсияи МБ беҳтар шудааст 11 .Дар асоси оптимизатсияҳое, ки дар кори қаблии мо гузориш дода шудаанд, мо \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) МБ-ро истифода бурдем. консентратсияҳо барои ворид кардани ДНК дар ин таҳқиқот. Муайян кардани электрохимиявии ДНК-и дуқабата (ds-DNA) мумкин аст бо истифода аз интеркалаторҳои анионӣ ё катионӣ ба даст оварда шавад. Ҳарчанд интеркалаторҳои анионӣ ДНК-ро бо интихоби беҳтар муайян мекунанд, онҳо инкубатсияи якшабаро талаб мекунанд, ки дар натиҷа вақти муайянкунии дарозтар мешавад. аз тарафи дигар, интеркалаторҳои катионӣ, ба монанди МБ, вақти кӯтоҳтари инкубатсияро талаб мекунанд, тақрибан \({1}\,{\hbox {h}}\) барои муайян кардани электрохимиявии ds-DNA6. Ҳар як андозагирӣ тақсим кардани намунаеро дар бар мегирад, ки бояд дар рӯи дастгоҳ санҷида шавад. электрод\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), баъд бо латтаи намнокшудаи IPA, пеш аз гузаштан ба намунаи дигар тоза кунед.як андозагирӣ. Ҳар як намуна дар 5 электроди гуногун санҷида шуд, агар тартиби дигаре пешбинӣ нашуда бошад. Андозаҳои DPV ва CV бо истифода аз потенсиостати PalmSens Sensit Smart анҷом дода шуданд ва нармафзори PSTrace барои конфигуратсияи потенциостат ва ба даст овардани маълумот, аз ҷумла ҳисобҳои авҷи ҷорӣ истифода шуд. Танзимоти зерин истифода мешаванд. барои андозагирии DPV ва CV:
DPV: Вақти мувозинат = \(8\,\hbox {s}\), Қадами шиддат = \(3\,\hbox {mV}\), шиддати пулс = \(25\,\hbox {mV}\), давомнокии набзи = \(50\,\hbox {ms}\), суръати скан = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Вақти мувозинат = \(8\,\hbox {s}\), Қадами шиддат = \(3\,\hbox {mV}\), Меъёри тозакунӣ = \({300}\,\hbox {mV/s) }\)
Қуллаҳои ҷараёнҳое, ки аз вольтаммограммаҳои ДНК бо \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) МБ ба даст оварда шудаанд: (a) \(503\, \hbox {bp}\) DPV, (b) \ (503 \, \ hbox {bp} \) CV, (в) \ (117 \, \ hbox {bp} \) DPV, (г) \ (117 \, \ hbox {bp} \) CV.
Вольтаммограммаҳои DPV ва CV дар электродҳои ENIG PCB \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) МБ бо ДНК комплексӣ гирифта шуданд (дар консентратсияи 10–\({20}\,{\ hbox {ng) }/{\upmu \hbox {l}}}\) яъне 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) барои \(117\,\hbox {bp}\ ) ва 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) барои \(503\,\hbox {bp}\)).Волтаммограммаҳои намояндагӣ дар расми S1 дар Маълумоти иловагӣ нишон дода шудаанд. Расми 2 натиҷаҳоро нишон медиҳад. андозагирии DPV ва CV (қуллаи ҷараён) бо истифода аз маҳсулоти PCR-жел тоза карда шудааст. барои ҳар як қуттӣ дар қуттии қуттӣ андозагирӣ аз 5 электродро дар бар мегирад. Ҳама ченакҳо як маҷмӯи электродҳоро истифода мебаранд, то аз хатогиҳои андозагирӣ аз сабаби тағирёбии электрод ба электрод пешгирӣ кунанд. Мо тамоюли афзояндаи ҷараёнҳои қуллаи ченшавандаи DPV ва CV-ро барои консентратсияи пасти ДНК мушоҳида кардем. , дарозтар (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ дар муқоиса бо \(117) ) пора. адсорбсияи комплекси МБ-ДНК интиқоли зарядро дар электрод осон мекунад, ки ба баланд шудани ҷараёни қулла мусоидат мекунад.Тадқиқотҳои дигар таъсири андоза ва пайдарпаии олигонуклеотидҳоро ба интеркалатсияи МБ-ДНК нишон доданд27,28,29,30.Гуанин Мазмуни -ситозин (GC) дар ду ампликон (\(117\,\hbox {bp}\) ва \(503\,\hbox {bp}\)) тақрибан 50% буд, ки ин нишон медиҳад, ки мушоҳида Фарқият аз сабаби он аст. ба дарозии ампликон. Аммо, барои консентратсияи баландтари ДНК (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), барои \(503\,\hbox {bp} \) ва \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) барои \(117\,\hbox {bp}\)), мо ду тақвиятро мушоҳида мекунем ҷараёнҳои қуллаи зерборишҳо ҳам дар андозагирии DPV ва ҳам CV кам карда мешаванд. Ин аз он сабаб аст, ки МБ байни ҷуфтҳои асосии ДНК сер мешавад ва ба ҳам мепайвандад, ки дар натиҷа монеаи стерикии фаъолияти оксидшавии гурӯҳи коҳишёбанда дар MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503) \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Намакҳои дар омехтаҳои Master PCR мавҷудбуда ба мутақобилаи электростатикӣ байни МБ ва ДНК халал мерасонанд, аз ин рӯ бо илова кардани \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) бо \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) МБ маҳсулоти гел-тозашуда барои омӯзиши таъсири намак ба мутақобилаи МБ-ДНК. Тавре ки дар расми 3 нишон дода шудааст, мо мушоҳида кардем, ки барои консентратсияи баландтари ДНК (\(>{2}\,{\) hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) ва \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) барои \(117\,\hbox {bp} \)), дар DPV ва CV Иловаи намак ба андозагирӣ ба таври ҷиддӣ таъсир нарасонд (ниг. Расми S2 дар Маълумоти иловагӣ барои вотаммограммаҳои намояндагӣ). Аммо, дар консентратсияи пасти ДНК, илова кардани намак ҳассосиятро хеле коҳиш медиҳад, ки дар натиҷа дар ҷараёни консентратсияи ДНК тағироти назаррас ба вуҷуд намеояд. Таъсири манфии шабеҳи намак ба мутақобилаи МБ-ДНК ва интеркалатсия қаблан аз ҷониби дигар муҳаққиқон гузориш шуда буданд33,34.\(\hbox { Катионҳои Mg}^{2+}\) ба пояи фосфати манфии ДНК пайваст шуда, ба ин васила ба таъсири электростатикии байни МБ ва ДНК халал мерасонанд. Дар консентратсияи баландтари ДНК, монеъшавии стерикии МБ-и оксид-фаъол боиси ҷараёнҳои қуллаҳои пасттар мегардад, аз ин рӯ таъсири мутақобилаи электростатикӣ ба вокуниши сенсор ба таври назаррас таъсир намерасонад. Нуқтаи асосӣ дар он аст, ки ин биосенсор барои муайян кардани консентратсияи баландтари ДНК мувофиқтар аст (аҳёнан \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ё баландтар), барои пурра- Коркарди автоматиконидашудаи намунаҳои оби муҳити зист, ки дар он ҷо тозакунии гели маҳсулоти PCR имконнопазир аст.
Майдони зери хатти абсорбсия барои диапазони дарозии мавҷ 600–700 \(\hbox {nm}\) барои консентратсияи гуногуни ДНК бо \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) МБ: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) бо ва бе намак (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) бо намак ва бе намак (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Консентратсияи ДНК мувофиқ ба \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) МБ Намунаҳои ДНК нест.
Барои тасдиқи минбаъдаи натиҷаҳои дар боло овардашуда, мо бо истифода аз спектрофотометри UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO) андозагирии оптикӣ анҷом додем, намунаҳои \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) барои ҳар як истифода бурда шуданд. Андоза. Имзои азхудкунӣ бо афзоиши консентратсияи ДНК коҳиш меёбад, тавре ки аз тамоюли майдони зери хати абсорбсия барои диапазони дарозии мавҷ \(600\,\hbox {nm}\) то \(700\,\hbox { nm}\), тавре ки дар расми 4 нишон дода шудааст (спектри азхудкунӣ дар расми S3 дар Маълумоти иловагӣ нишон дода шудааст). Барои намунаҳое, ки консентратсияи ДНК камтар аз \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox) {l}}}\), фарқияти ҷиддии қабул дар байни намунаҳои дорои ДНК ва танҳо МБ вуҷуд надошт (барои \(503\,\hbox {bp}\) ва \(117\,\hbox {bp}\ ) порчаҳои дарозӣ), ки набудани монеъшавии стерикии оксид-фаъол МБ.Дар консентратсияи баландтари ДНК, мо тадриҷан коҳиш ёфтани сигнали абсорбенсро мушоҳида кардем ва коҳиши камтари абсорбенсро дар ҳузури намак қайд кардем. Ин натиҷаҳо ба молекулавӣ марбут буданд. мутақобила ва монеъшавии стерикӣ бо stacking базавӣ дар гибридҳои ДНК. Натиҷаҳои мо бо гузоришҳо дар адабиёт оид ба таҳқиқоти спектроскопии интеркалатсияи МБ-ДНК мувофиқанд, ки гипохроматиро бо коҳиши энергия дар \(\pi\)-\(\pi ^*\ алоқаманд мекунанд. ) гузаришҳои электронӣ аз ҳисоби интеркалатсия Қабатҳои 36, 37, 38.
Агарози гели электрофорези фаги Phi6: Маҳсулоти ПТР дарозии \(117\,\hbox {bp}\) ва \(503\,\hbox {bp}\) аз намунаҳои оби кӯл. Маркери M-DNA;Назорати NTC-но-шаблон, праймерҳои дорои ампликонҳои мувофиқ;назорати мусбии компютер;1, 2, 3-намудҳои оби кӯл дар се нусха. hbox {bp}\) хати.
Мо фоиданокии сенсорро бо истифода аз намунаҳои оби кӯли Повай арзёбӣ кардем. Консентратсияи РНК аз намунаҳои оби фаг ҷудошуда аз 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), дар ҳоле ки онҳое, ки аз суспензияҳои фагҳои тозашуда ҷудо карда шудаанд, тахмин карда шудааст, ки РНК \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) буда, самаранокии барқарорсозӣ тақрибан 1 аст. %.RNA баръакс ба cDNA транскрипсия карда шуд ва ҳамчун қолаб барои PCR ва qPCR истифода шуд. Андозаи маҳсулот тавассути электрофорези гели агарозӣ (расми 5) пеш аз санҷиш бо сенсор тасдиқ карда шуд. инчунин ампликонҳои таваҷҷӯҳ. Қиматҳои Ct, ки ҳангоми qPCR сабт шудаанд (Ҷадвали 1) нишон дода шудаанд, ки бо консентратсияи РНК ҷудошуда аз намунаҳои обии мувофиқ мувофиқат мекунанд. Қимати Ct шумораи давраҳои заруриро барои сигнали флуоресцентӣ барои аз ҳадди остона ё сигнали замина зиёданд. Қиматҳои баландтари Ct консентратсияи пасти қолабҳоро нишон медиҳанд ва баръакс. Қиматҳои Ct-и намунаҳои NTC он қадар баланд буданд, ки интизор мерафтанд. Фарқият дар арзишҳои \(\тақрибан 3\) Ct байни назорати мусбӣ ва намунаи санҷишӣ минбаъд нишон медиҳад, ки ҳар як намунаи санҷишӣ дорои тақрибан 1% қолиб дар муқоиса бо назорати мусбат.Мо қаблан муҳокима кардем, ки ампликонҳои дарозтар ба ҳассосияти беҳтар оварда мерасонанд. Амплификацияи порчаҳои дарозтар аз намунаҳои гетерогении муҳити зист ҷудошуда бо назардошти нуқсонҳо душвор аст консентратсияи пасти вирусҳо ва таназзули РНК. Аммо, бо ғанисозии вирус ва протоколи тақвияти PCR, мо тавонистем бомуваффақият порчаи \(503\,\hbox {bp}\)-ро барои ҳассосияти электрохимиявӣ тақвият диҳем.
Дар расми 6 натиҷаҳои санҷандаҳои электрохимиявии ампликони порчаи \(503\,\hbox {bp}\) нишон дода шудааст, ки ҳам cDNA-и ҳалнашуда ҳамчун қолаб (1:1) ва ҳам cDNA-и 100-каратаи иловашуда ҳамчун қолаб (1:100) иҷрошудаи PCR , дар муқоиса бо NTC ва PC (ниг. Расми S4 дар Маълумоти иловагӣ барои вотаммограммаҳои намояндагӣ). Ҳар як қуттии қуттии қуттии расми 6 дорои ченакҳо аз се намуна дар 5 электрод мебошад. Барои чен кардани ҳамаи намунаҳо барои пешгирӣ кардани хатогиҳо аз электрод ҳамон электродҳо истифода мешуданд. Дар муқоиса бо андозагирии CV, ченакҳои DPV барои фарқ кардани намунаҳои санҷишӣ ва компютерӣ аз NTCҳо ҳалли беҳтареро нишон медиҳанд, зеро тавре ки қаблан зикр гардид, ҷараёнҳои Фарадӣ аз сабаби ҷараёнҳои пасзаминаи иқтидори пасзаминаи охирин пинҳон мешаванд. Барои ампликонҳои дарозтар, мо мушоҳида кардем, ки назорати манфӣ (NTC) боиси баланд шудани ҷараёнҳои баландтари CV ва DPV нисбат ба назорати мусбӣ гардид, дар ҳоле ки намунаҳои санҷиши мусбӣ ва безарар баландтарин қуллаҳои ҷараёнҳои қуллаи DPV-ро нишон доданд. Қиматҳои миёнаи ченшуда ва медианӣ барои ҳар як ҳалнашуда (1:1) ) намунаи санҷишӣ ва компютерро аз баромади сенсор барои намунаи NTC ба таври равшан ҳал кардан мумкин аст, дар ҳоле ки ҳалли намунаи 1:100 маҳлулшуда камтар аст. Барои 100-каратаи разбавии cDNA, мо ҳангоми электрофорези гел ягон бандро мушоҳида накардем. (хатрҳо дар расми 5 нишон дода нашудаанд) ва ҷараёнҳои қуллаи мувофиқи DPV ва CV ба онҳое, ки барои NTC интизор буданд, шабеҳ буданд. Натиҷаҳои порчаи \(117\,\hbox {bp}\) дар Маълумоти иловагӣ нишон дода шудаанд. назорат вокуниши электрохимиявии сенсори PCB ба сабаби адсорбсияи МБ озод дар электрод ва таъсири мутақобилаи МБ бо олигонуклеотиди якқатор праймерро ба вуҷуд овард. Аз ин рӯ, ҳар дафъае, ки намуна санҷида мешавад, назорати манфӣ бояд иҷро карда шавад ва ҷараёни қуллаи намунаи санҷишӣ дар муқоиса бо ҷараёни қуллаи аз ҷониби назорати манфӣ ба даст овардашуда барои ноил шудан ба андозагирии дифференсиалӣ (нисбӣ)39,40 барои тасниф кардани намунаи санҷишӣ ҳамчун мусбат ё манфӣ.
(a) DPV, ва (б) ҷараёнҳои қуллаи CV барои муайянкунии электрохимиявии порчаҳои \(503\,\hbox {bp}\) дар намунаҳои оби кӯл. Намунаҳои санҷишӣ дар се нусха чен карда шуданд ва бо ҳеҷ гуна назорати қолаб (NTC) муқоиса карда шуданд ва назорати мусбӣ (PC).
Бозёфтҳои мо механизмҳои гуногунеро нишон медиҳанд, ки ба кори сенсорҳои электрохимиявӣ барои ампликонҳои дарозии гуногун барои ДНК-ҳои гуногун таъсир мерасонанд, ки консентратсияҳо бо ченакҳои оптикӣ бо истифода аз спектрофотометри UV/Vis тасдиқ карда мешаванд. Мушоҳидаҳои мо фаҳмишро таъкид мекунанд, ки пораҳои дарозтари ДНК то \(\тақрибан\) \(500\,\hbox {bp}\) бо ҳассосияти баландтар муайян кардан мумкин аст ва мавҷудияти намак дар намуна ҳассосият надорад. \hbox {l}}}\) ва болотар).Мо мушоҳида кардем, ки DPV ҳалли беҳтареро таъмин кард, зеро ҷараёни пасзаминаи пасзамина низ ба андозагирии CV таъсир мерасонад ва онро камтар ҳассос мекунад.
Амплификацияи порчаҳои дарозтар аз якпорчагии РНК-и геномии вирусӣ вобаста аст. Якчанд таҳқиқот нишон доданд, ки амплификацияи порчаҳои дарозтар аз сабаби таназзули РНК дар муҳити зист ва эҳтимолияти пайвастшавӣ ҳангоми изолятсия на ҳамеша самаранок аст11,41,42,43,44 .Мо мушоҳида кардем, ки усули консентратсияи вирус дар асоси PEG дар консентратсияи фаги Phi-6 дар намунаҳои оби кӯл нисбат ба усули консентратсияи вирус дар гидроксиди алюминий самараноктар буд. Қобилияти ошкор кардани порчаҳои дарози ДНК исбот кард, ки талабот ба мултиплекси PCR-ро бартараф кунад. барои васеъ кардани якчанд қолибҳои дарозии кӯтоҳ ва кам кардани эҳтимолияти хосияти салиб.
Намунаҳои биологӣ каманд, аз ин рӯ зарурати тарҳрезии биосенсор вуҷуд дорад, ки намунаҳои ҳадди ақалро барои санҷиш талаб мекунад. Электродҳои PCB ENIG, ки дар ин таҳқиқот истифода мешаванд, танҳо \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ лозиманд. ) намунаҳо барои санҷиш барои пӯшонидани майдони самараноки электродҳо. Илова бар ин, ҳамон электродро пас аз тоза кардан пеш аз додани намунаи навбатӣ дубора истифода бурдан мумкин аст. Намунаҳои пурқувватшуда илова кардани ягон кимиёвии ғайр аз кабуди метиленӣ, ки арзон аст, талаб намекунанд. ва кимиёвии маъмулан истифодашаванда аст. Азбаски барои истеҳсоли ҳар як электрод тақрибан $0,55 (ё INR 40) арзиш дорад, ин биосенсор метавонад як алтернативаи камхарҷ ба технологияҳои мавҷудаи ошкоркунӣ бошад. Ҷадвали 2 муқоисаи ин корро бо дигар сенсорҳо дар адабиёт нишон медиҳад. Порчаҳои ДНК дар намунаҳои гетерогенӣ.
Бо дарназардошти он, ки протоколҳои муайянкунии электрохимиявии бар МБ ба хусусияти PCR такя мекунанд, як маҳдудияти асосии ин усул потенсиали тақвияти ғайримуқаррарӣ дар намунаҳои гетерогенӣ ба монанди обҳои партов ва оби кӯл ё истифодаи праймерҳои тозагии паст мебошад. Барои беҳтар кардани ҳассосияти усулҳои муайянкунии электрохимиявӣ барои муайян кардани ДНК маҳсулоти тозанашавандаи ПТР бо истифода аз электродҳои бетағйиршудаи ENIG PCB, беҳтар фаҳмидани хатогиҳое, ки аз ҷониби dNTPs ва праймерҳои истифоданашуда ворид шудаанд ва оптимизатсия кардани шароити реаксия ва протоколҳои таҳлил зарур аст. Талаботи оксиген (BOD)-и намунаи об низ метавонад барои беҳтар кардани дақиқии андозагирӣ чен карда шавад.
Хулоса, мо як сенсори арзони электрохимиявии ENIG PCB-ро барои ошкор кардани вирус дар намунаҳои муҳити зист (оби кӯл) пешниҳод менамоем. Баръакси электродҳои олигонуклеотидҳои иммобилизатсияшуда ё субстратҳои фармоишӣ барои ҳассосияти ДНК, ки барои нигоҳ доштани ҳассосият нигоҳдории криогениро талаб мекунанд53,54 техникаи мо PCB-и тағирнаёфтаро истифода мебарад. электродҳо бо мӯҳлати нигоҳдории дарозтар ва талаботи махсуси нигоҳдорӣ надоранд ва аз ин рӯ барои таҳияи қарорҳои андозагирӣ бо коркарди автоматии намуна дар LMICs мувофиқанд. Биосенсор рангҳои арзони DNA-интеркалатории редокс (МБ) -ро барои ошкор кардани босуръати ампликонҳои ҳадаф истифода мебарад. Амплификацияи ғайримуқаррарӣ Дар намунаҳои муҳити зист маъмул аст, ки хосияти ин усули ҳассосро аз сабаби пайвастшавии ғайримуқаррарии МБ ба олигонуклеотидҳои як ва дуқатор коҳиш медиҳад. Аз ин рӯ, хосияти ин санҷиш аз оптимизатсияи праймерҳо ва шароити реаксияи PCR вобаста аст. Илова бар ин, CV ва ҷараёнҳои қуллаи DPV, ки аз намунаҳои санҷидашуда ба даст оварда шудаанд, бояд нисбат ба посухҳои аз назорати манфӣ (NTC) барои ҳар як санҷиш гирифташуда тафсир карда шаванд. Тарҳҳо ва усулҳои санҷандаҳои электрохимиявӣ, ки дар ин кор пешниҳод шудаанд, метавонанд бо автомати намунавӣ муттаҳид карда шаванд. - ҳалли арзиш, ки метавонад намунаҳоро ҷамъоварӣ ва таҳлил кунад ва натиҷаҳоро ба лаборатория интиқол диҳад.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Усулҳои консентратсияи ибтидоии вирусҳо аз намунаҳои об: барраси ва мета-таҳлили таҳқиқоти охирин.J.Ариза.микроорганизм.115, с.1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Вирусҳои обӣ: Монеаҳо барои оби бехатари нӯшокӣ. PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Эпидемиологияи обҳои партов барои назорати миқёси камхарҷ аз COVID-19 дар кишварҳои камдаромад ва миёна: мушкилот ва имкониятҳо.Water 13, 2897 (2021).
Палечек, E. & Bartosik, M. Электрохимияи кислотаи нуклеинӣ. Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Метилении кабуд ҳамчун дискриминатори электрохимиявии олигонуклеотидҳои якқатор ва дуқабата дар субстратҳои тиллоӣ immobilized. Таҳлилгари 126, 1756-1759 (2001).
Вонг, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Муқоисаи Интеркалаторҳои катион ва анион барои интиқоли электрохимиявии гибридизатсияи ДНК тавассути интиқоли электронии дарозмуддат. Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Вонг, Эл ва Гудинг, JJ Интиқоли барқ тавассути ДНК: як интихобкунандаи электрохимиявии ДНК biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al. Дастгоҳи микрофлюидикии PCR дар вақти воқеӣ бо муайянкунии ҳамзамон электрохимиявӣ. сенсори биологӣ. Биоэлектроника.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. Омӯзиши механизми сигнализатсия ва санҷиши иҷрои системаи электрохимиявии PCR дар вақти воқеӣ дар асоси таъсири мутақобилаи кабуди метилен бо DNA.Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al. Sensor электрохимиявии изотермикӣ дар асоси ampplification Loop миёнаравӣ барои ошкор кардани sars-cov-2 дар намунаҳои оби партов.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Кумар, М. ва дигарон. Ҳисси электрохимиявии ампликонҳои SARS-CoV-2 бо электродҳои PCB. Сенсор фаъол аст. B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Муайянкунии самараноки SARS-CoV-2 RNA дар фраксияи сахти партовҳои об.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al. Усулҳои таҳлилӣ барои ошкор кардани SARS-CoV-2 дар партов: Протокол ва дурнамои оянда. TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Федоренко, А., Гринберг, М., Ореви, Т. ва Каштан, Н. Зинда мондани бактериофаги лифофаи Phi6 (суррогат барои SARS-CoV-2) дар қатраҳои оби бухоршуда, ки дар рӯи шиша ҷойгир шудаанд.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Дей, Р., Длусская, Э. ва Эшболт, Ню Ҷейс Истодагарии экологии суррогат SARS-CoV-2 (Phi6) дар амебаи озод зиндагӣ мекунад.Тандурустии об 20, 83 (2021).
Миндич, Л. Бастабандии дақиқи се порчаи геномии бактериофаги РНК-и дуқабата\(\varphi\)6.микроорганизм.Мур.биология.Рев.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Сохтори дуюми DH RNA phage \(\varphi\)6 минтақаи бастабандӣ.RNA 6, 880-889 (2000).
Bonilla, N. et al. Phages on the Tap - Протоколи зуд ва муассир барои омода кардани захираҳои лаборатории бактериофагҳо. PeerJ 4, e2261 (2016).
Вақти фиристодан: 27 май-2022