పిసిబి ఎలక్ట్రోడ్‌లను ఉపయోగించి నీటి నమూనాలలో వైరల్ న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాల ఎలెక్ట్రోకెమికల్ సెన్సింగ్ కోసం పొడవైన యాంప్లికాన్‌లు మెరుగైన సున్నితత్వాన్ని అందిస్తాయి.

Nature.comని సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు.మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ వెర్షన్ CSSకి పరిమిత మద్దతును కలిగి ఉంది.ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు నవీకరించబడిన బ్రౌజర్‌ని (లేదా Internet Explorerలో అనుకూలత మోడ్‌ని ఆఫ్ చేయండి)ని ఉపయోగించాలని మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము. ఈలోపు, నిర్ధారించుకోవడానికి నిరంతర మద్దతు, మేము స్టైల్స్ మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా సైట్‌ని ప్రదర్శిస్తాము.
COVID-19 మహమ్మారి ప్రారంభమైనప్పటి నుండి పర్యావరణ నమూనాలను పర్యవేక్షించడం యొక్క ప్రాముఖ్యత చాలా ప్రశంసించబడింది మరియు qPCR-ఆధారిత పద్ధతులు ఖరీదైనవి అయినప్పటికీ, కొన్ని పర్యవేక్షణ ప్రయత్నాలు బంగారు ప్రమాణాన్ని ఉపయోగించి నిర్వహించబడుతున్నాయి. ఎలక్ట్రోకెమికల్ DNA బయోసెన్సర్‌లు సమర్థవంతమైన ఖర్చుతో కూడుకున్నవి అందించగలవు. తక్కువ మరియు మధ్య-ఆదాయ దేశాలలో పర్యావరణ నీటి నమూనాలను పర్యవేక్షించడానికి పరిష్కారం. ఈ పనిలో, మేము ENIGని ఉపయోగించి స్పైక్డ్ లేక్ వాటర్ శాంపిల్స్ (SARS-CoV-2 కోసం ఒక ప్రసిద్ధ సర్రోగేట్) నుండి వేరుచేయబడిన Phi6 ఫేజ్ నుండి పొందిన యాంప్లికాన్‌ల ఎలక్ట్రోకెమికల్ గుర్తింపును ప్రదర్శిస్తాము. ఉపరితల మార్పు లేకుండా PCB ఎలక్ట్రోడ్‌లను పూర్తి చేయడానికి.సెక్స్. ఎలెక్ట్రోకెమికల్ సెన్సార్ ప్రతిస్పందన రెండు వేర్వేరు పొడవుల DNA శకలాలు (\({117}\,\hbox {bp}\) మరియు \({503}\,\hbox {bp}\)) కోసం పూర్తిగా వర్గీకరించబడింది మరియు PCR మాస్టర్ మిక్స్‌లలోని లవణాల ప్రభావం మిథైలీన్ బ్లూ (MB)-DNA పరస్పర చర్యలపై చూపుతుంది. DNA శకలాల పొడవు ఎలక్ట్రోకెమికల్ సెన్సిటివిటీని గణనీయంగా నిర్ణయిస్తుందని మా ఫలితాలు చూపిస్తున్నాయి మరియు PCR ఉత్పత్తుల యొక్క జెల్ శుద్ధి లేకుండా పొడవైన యాంప్లికాన్‌లను గుర్తించే సామర్థ్యాన్ని ఈ పనిలో ప్రదర్శిస్తుంది. నీటి నమూనాల సిటు కొలతకు ముఖ్యమైనది.వైరల్ లోడ్ కోసం పూర్తిగా ఆటోమేటెడ్ సొల్యూషన్ మంచిది.
పోలియో మరియు హెపటైటిస్ E1 యొక్క నీటి ద్వారా సంక్రమించే మొదటి సాక్ష్యంతో 1940ల నుండి నీటి ద్వారా వచ్చే వైరస్ వ్యాప్తిని ప్రజారోగ్యానికి ముప్పుగా పరిగణిస్తారు.ప్రపంచ ఆరోగ్య సంస్థ (WHO) మితమైన మరియు అధిక ఆరోగ్య ప్రాముఖ్యత కలిగిన అనేక నీటిలో ఉండే వైరల్ వ్యాధికారకాలను వర్గీకరించింది2.సాంప్రదాయ వైరస్ గుర్తించే పద్ధతులు గోల్డ్-స్టాండర్డ్ qPCR-ఆధారిత సాంకేతికతలపై ఆధారపడతాయి, ఇవి అత్యంత సున్నితమైనవి మరియు నిర్దిష్టమైనవి, అయితే ఖరీదైన పరికరాలను ఉపయోగించి ప్రయోగశాలలో పరీక్షించడానికి నైపుణ్యం కలిగిన సిబ్బంది అవసరం. అయితే, తక్కువ మరియు మధ్య-ఆదాయ దేశాలలో (LMICలు) పరిమిత వనరులతో, మానవ పర్యావరణ నీటి నమూనా పర్యవేక్షణ కంటే నమూనా పరీక్ష ప్రాధాన్యతను తీసుకునే అవకాశం ఉంది. అందువల్ల, తక్కువ మరియు మధ్య-ఆదాయ దేశాలలో నీరు మరియు మురుగునీటి నమూనాల స్థిరమైన, నిజ-సమయ పర్యవేక్షణ కోసం ప్రత్యామ్నాయ తక్కువ-ధర పద్ధతులు అవసరం, అభివృద్ధి చెందుతున్న వ్యాధి వ్యాప్తికి ముందస్తు హెచ్చరికలు, తద్వారా వైరస్ మహమ్మారి యొక్క తీవ్రమైన సామాజిక ఆర్థిక ప్రభావాల నుండి వారిని కాపాడుతుంది. న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాల కోసం తక్కువ-ధర ఎలక్ట్రోకెమికల్ బయోసెన్సర్‌లు ఈ అపరిమితమైన అవసరానికి మంచి సంభావ్య పరిష్కారాన్ని అందించగలవు. ఈ DNA బయోసెన్సర్‌లలో చాలా వరకు పరిపూరకరమైన DNA తంతువులు ఎలక్ట్రోడ్‌పై స్థిరంగా ఉండటం ద్వారా పని చేస్తాయి. నమూనాలో మ్యాచింగ్ సీక్వెన్స్ ఉన్నప్పుడు ఉపరితలం మరియు హైబ్రిడైజ్ చేయండి. ఇది పొటాషియం ఐరన్/ఫెర్రోసైనైడ్ వంటి రెడాక్స్ మధ్యవర్తులను ఉపయోగించి వివిధ ఎలక్ట్రోకెమికల్ టెక్నిక్‌ల ద్వారా సిగ్నల్‌గా మార్చబడుతుంది. మిథిలీన్ బ్లూ (MB) అటువంటి రెడాక్స్-యాక్టివ్ మాలిక్యూల్. సింగిల్-స్ట్రాండెడ్ DNA5,6కి మరింత నిర్ధిష్టమైన బైండింగ్‌తో పాటు డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA (dsDNA)గా ఇంటర్‌కలేట్ చేయబడిందని నివేదించబడింది. MB-DNA కాంప్లెక్స్‌లను రూపొందించడానికి MBల యొక్క ఇంటర్‌కలేటింగ్ స్వభావం వాటిని అనేక ఎలక్ట్రోకెమికల్ DNAలో రెడాక్స్ మధ్యవర్తులుగా ప్రముఖ ఎంపికగా చేస్తుంది. సెన్సార్ కాన్ఫిగరేషన్‌లు5,6,7,8,9. MB నుండి DNA వరకు ఇంటర్‌కలేషన్ నిర్దిష్టంగా లేనప్పటికీ, ఈ ఎలక్ట్రోకెమికల్ సెన్సార్ యొక్క విశిష్టత ఎక్కువగా PCR లేదా ఐసోథర్మల్ యాంప్లిఫికేషన్ కోసం ఉపయోగించే ప్రైమర్‌ల స్వచ్ఛతపై ఆధారపడి ఉంటుంది, ఇది వాస్తవాన్ని అమలు చేయడానికి బాగా సరిపోతుంది. -సమయం ఎలక్ట్రోకెమికల్-ఆధారిత qPCR లేదా ఫ్లోరోసెన్స్ ఐసోథర్మల్ యాంప్లిఫికేషన్ DNA గాఢత కొలతకు ప్రత్యామ్నాయంగా 9 .అటువంటి ఒక అమలులో, Won et al.బంగారు ఎలక్ట్రోడ్‌ల ఉపరితలం నిజ సమయానికి 6-మెర్కాప్టో-1-హెక్సానాల్ (MCH)తో సవరించబడింది. డిఫరెన్షియల్ పల్స్ వోల్టామెట్రీ (DPV)ని ఉపయోగించి MBతో PCR యాంప్లికాన్‌ల కొలత 9. ఇతర సందర్భాల్లో, రామిరేజ్ మరియు ఇతరులు స్క్రీన్-ప్రింటెడ్ ఎలక్ట్రోడ్‌లతో MBని ఉపయోగించి RT-LAMP రియాక్షన్ ద్వారా మురుగు నీటిలో SARS-CoV-2ని గుర్తించడం. ప్లాటినం ఎలక్ట్రోడ్‌లు కూడా ప్రతిచర్యల సమయంలో యాంప్లికాన్‌లను ఎలెక్ట్రోకెమికల్‌గా గుర్తించేందుకు రూపొందించిన మైక్రోఫ్లూయిడ్ PCR ప్లాట్‌ఫారమ్‌లో సిటు ఎలక్ట్రోడ్‌ల వలె ఉపయోగించబడుతుంది 8 .ఈ అధ్యయనాలన్నింటికీ ఎలక్ట్రోడ్‌ల ఉపరితల మార్పు అవసరం, ఈ ఫంక్షనలైజ్డ్ ఎలక్ట్రోడ్‌ల స్థిరత్వం కోసం ప్రత్యేక నిల్వ అవసరాల కారణంగా పెరిగిన ఉత్పత్తి మరియు నిర్వహణ ఖర్చులను సూచిస్తుంది.
సరస్సు నీటి నమూనాలలో సాంద్రీకృత వైరల్ కణాల నుండి పొందిన యాంప్లికాన్‌ల ఎలెక్ట్రోకెమికల్ గుర్తింపు కోసం వర్క్‌ఫ్లో యొక్క స్కీమాటిక్.
మేము ఇటీవల తక్కువ-ధర ప్రింటెడ్ సర్క్యూట్ బోర్డ్ (PCB) ఎలక్ట్రోడ్‌లతో SARS-CoV-2 యాంప్లికాన్‌ల యొక్క ఎలక్ట్రోకెమికల్ సెన్సింగ్‌ను DPV మరియు సైక్లిక్ వోల్టామెట్రీ (CV) ఆధారంగా MB-DNA కాంప్లెక్స్‌ల అధిశోషణం ద్వారా ప్రేరేపించబడిన మార్పులేని ఎలక్ట్రోడ్‌ల ఉపరితలంపై ) గరిష్టంగా మార్పులను ప్రదర్శించాము. ప్రస్తుత 11.CDC-సిఫార్సు చేయబడిన N1 ఫార్వర్డ్ మరియు N2 రివర్స్ ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించి ఏర్పడిన పొడవైన DNA శకలాలు (N1-N2, \({943}\, \hbox) చిన్న శకలాలు {bp}\)) సెన్సార్ ప్రతిస్పందనలో మెరుగైన సరళతను చూపించాయని మేము నివేదిస్తాము. (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) N1 ఫార్వర్డ్ మరియు N1 రివర్స్ ప్రైమర్ సెట్‌లను ఉపయోగించి రూపొందించబడింది. ఈ అధ్యయనాలు న్యూక్లీజ్ లేని నీటిలో తయారు చేయబడిన DNA పలుచనలను ఉపయోగించి నివేదించబడ్డాయి. SARS-CoVని గుర్తించడానికి కూడా ఈ ప్లాట్‌ఫారమ్ ఉపయోగించబడింది. అనుకరణ మురుగునీటి నమూనాలలో -2 యాంప్లికాన్‌లు (SARS-CoV-2 RNAతో మొత్తం RNA నమూనాలను స్పైకింగ్ చేయడం ద్వారా పొందబడతాయి).ఆర్‌ఎన్‌ఏ ఐసోలేషన్ మరియు దిగువ ప్రాసెసింగ్ సమయంలో షిరింగ్‌కు గురవుతుంది కాబట్టి, 12,13 ఈ వైవిధ్య నమూనాతో పొడవైన శకలాలను విస్తరించడం కష్టం. అందువల్ల, మురుగునీటిలో SARS-CoV-2 యాంప్లికాన్ యొక్క ఎలక్ట్రోకెమికల్ సెన్సింగ్ యొక్క ప్రదర్శన చిన్న \(72\,\hbox {bp}\) N1 ఫ్రాగ్‌మెంట్‌కు పరిమితం చేయబడింది.
ఈ పనిలో, సరస్సు నీటి నమూనాల నుండి (Fig. 1) కేంద్రీకృతమై మరియు వేరుచేయబడిన ఫేజ్ Phi6 యొక్క ENIG PCB-ఆధారిత ఎలక్ట్రోకెమికల్ సెన్సింగ్ యొక్క సాధ్యాసాధ్యాలను మేము పరిశోధించాము (Fig. 1).Phi6 ఫేజ్‌లు పరిమాణంలో (80-100 nm) SARS-CoV-2తో పోల్చవచ్చు మరియు లిపిడ్ మెంబ్రేన్ మరియు స్పైక్ ప్రోటీన్ కూడా ఉంది. ఈ కారణాల వల్ల, బ్యాక్టీరియోఫేజ్ Phi6 అనేది SARS-CoV-2 మరియు ఇతర ఎన్వలప్డ్ పాథోజెనిక్ RNA వైరస్‌ల కోసం ఒక ప్రసిద్ధ సర్రోగేట్. PCR 117 మరియు 503 బేస్ జతల పొడవు గల రెండు DNA శకలాలు పొందేందుకు. మా మునుపటి పనిలో \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 శకలాలు విస్తరించే సవాలు కారణంగా, మేము ఇంటర్మీడియట్ పొడవు శకలాలు (\(117) లక్ష్యంగా చేసుకుంటాము \,\hbox {bp}\) మరియు \(503 \,\hbox {bp}\)), అందుబాటులో ఉన్న ప్రైమర్‌ల ఆధారంగా. ఎలక్ట్రోకెమికల్ సెన్సార్ ప్రతిస్పందన క్రమపద్ధతిలో విస్తృత ఏకాగ్రత పరిధిలో అధ్యయనం చేయబడింది (\({10}\,{) \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) నుండి \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) లో రెండు శకలాలు MB ఉనికి, సెన్సార్ ప్రతిస్పందనపై ఉప్పు ప్రభావం స్పెక్ట్రోఫోటోమెట్రిక్ కొలతల ద్వారా వర్గీకరించబడింది మరియు క్రాస్-ధృవీకరించబడింది. ఈ పని యొక్క ప్రధాన రచనలు క్రింది విధంగా ఉన్నాయి:
DNA శకలం పొడవు మరియు నమూనాలో ఉప్పు ఉనికి సున్నితత్వాన్ని బలంగా ప్రభావితం చేస్తుంది.డీఎన్‌ఏ ఏకాగ్రత మరియు పొడవు ఆధారంగా వోల్టామెట్రిక్ ప్రతిస్పందనలో MB, DNA మరియు సెన్సార్ యొక్క పరస్పర చర్య యొక్క వివిధ విధానాలపై ఎలక్ట్రోకెమికల్ కార్యాచరణ ఆధారపడి ఉంటుందని మా ఫలితాలు చూపిస్తున్నాయి, ఎక్కువ శకలాలు అధిక సున్నితత్వాన్ని చూపుతాయి, అయినప్పటికీ ఉప్పు మధ్య ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ పరస్పర చర్యలపై ప్రతికూల ప్రభావాన్ని చూపుతుంది. MB మరియు DNA.
DNA ఏకాగ్రత మార్పు చేయని ఎలక్ట్రోడ్‌లలో MB-DNA పరస్పర చర్య యొక్క యంత్రాంగాన్ని నిర్ణయిస్తుంది MB-DNA పరస్పర చర్య యొక్క వివిధ విధానాలు DNA ఏకాగ్రతపై ఆధారపడి ఉంటాయని మేము నిరూపిస్తాము. DNA సాంద్రతలలో తక్కువ మొత్తంలో \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), ఎలక్ట్రోకెమికల్ కరెంట్ ప్రతిస్పందన ప్రధానంగా ఎలక్ట్రోడ్‌పై MB-DNA యొక్క అధిశోషణం ద్వారా నిర్ణయించబడుతుందని మేము గమనించాము, అయితే తక్కువ సాంద్రతలలో అధిక DNA సాంద్రతలలో, ఎలెక్ట్రోకెమికల్ కరెంట్ ప్రతిస్పందన రెడాక్స్ యొక్క స్టెరిక్ నిరోధం ద్వారా నిర్ణయించబడుతుంది. DNA బేస్ జతల మధ్య MB చొప్పించడం వలన కార్యాచరణ.
లేక్ వాటర్ శాంపిల్స్‌లోని వైరల్ న్యూక్లియిక్ యాసిడ్స్ యొక్క ENIG PCB-ఆధారిత ఎలెక్ట్రోకెమికల్ సెన్సింగ్, Phi6-జోడించిన \(503\,\hbox {bp}\) DNA శకలాలు పోవై సరస్సు, IIT ముంబై క్యాంపస్ నుండి నీటి నమూనాల నుండి పొందిన ఎలక్ట్రోకెమికల్ డిటెక్షన్ ద్వారా పరిశీలనలు ధృవీకరించబడ్డాయి. ఫలితం ఫేజ్.
పూర్తి ఆటోమేటెడ్ మానిటరింగ్ సిస్టమ్‌లు, ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌లు లేదా ఎలక్ట్రోడ్‌లపై ఆప్టామెర్లు ఎక్కువ షెల్ఫ్ లైఫ్‌లో ఏకీకరణకు తక్కువ ధర మరియు సంభావ్యత.
Phage Phi6 అనేది సైటోవిరిడే కుటుంబానికి చెందిన ఒక ఎన్వలప్డ్ dsRNA వైరస్, ఇది సూడోమోనాస్ సిరింగేను సోకుతుంది. Phi6 ఫేజ్ జన్యువు 3 శకలాలు రూపంలో ఉంది: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) మరియు L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17.Phi6 ఫేజ్ నాన్-పాథోజెనిక్ BSL-1 సూడోమోనాస్ జాతికి సోకుతుంది కాబట్టి, దానిని ఉపయోగించడం సురక్షితం మరియు ప్రయోగశాలలో సులభంగా పెంచవచ్చు. ఫేజ్ ఫై6 మరియు దాని హోస్ట్ సూడోమోనాస్ సిరింగేలను ఫెలిక్స్ డి హెరెల్లే రిఫరెన్స్ సెంటర్ ఫర్ బ్యాక్టీరియల్ వైరస్‌లు, లావల్ యూనివర్సిటీ, కెనడా నుండి కొనుగోలు చేశారు (రిఫరెన్స్ సెంటర్ కేటలాగ్ నంబర్‌లు వరుసగా HER-102 మరియు HER-1102) .Phi6 ఫేజ్ మరియు దాని హోస్ట్ రిఫరెన్స్ సెంటర్ నిర్దేశించిన విధంగా పునరుద్ధరించబడ్డాయి. \(\సుమారు 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox {తో ఫైనల్ టైటర్‌లను పొందేందుకు ప్లేట్ లైసిస్ మరియు ఎల్యూషన్ ద్వారా Phi6 శుద్ధి చేయబడింది. ml}}\) (ప్లాక్ ఫార్మింగ్ యూనిట్లు/ మిల్లీలీటర్లు).తయారీదారు సూచనల ప్రకారం GenElute™ యూనివర్సల్ టోటల్ RNA ప్యూరిఫికేషన్ కిట్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్)ని ఉపయోగించి శుద్ధి చేయబడిన ఫేజ్ కణాల నుండి RNA వేరుచేయబడింది. క్లుప్తంగా, శుద్ధి చేయబడిన ఫేజ్ Phi6 సస్పెన్షన్\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) లైస్ చేయబడింది మరియు లైసేట్ స్పిన్ కాలమ్‌పైకి లోడ్ చేయబడింది, తద్వారా RNA రెసిన్ కాలమ్‌కు బంధించబడుతుంది. తర్వాత RNA ఎల్యూషన్ సొల్యూషన్‌లో \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) కిట్ అందించింది. \(260\,\hbox {nm}\) వద్ద శోషణ ద్వారా RNA యొక్క సాంద్రతను అంచనా వేయండి. RNA ఆల్కాట్‌లలో \ లో నిల్వ చేయబడింది. ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) తదుపరి ఉపయోగం వరకు.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA సింథసిస్ కిట్ (బయో -Rad Laboratories) తయారీదారు సూచనలను అనుసరించి cDNA సంశ్లేషణ కోసం ఒక టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించబడింది. క్లుప్తంగా, cDNA సంశ్లేషణ ప్రతిచర్య 3 దశలను కలిగి ఉంటుంది: \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , \({46}\,{^{\circ వద్ద \({20}\,{\hbox {min}}\) యొక్క రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ }\hbox {C}}\), మరియు రివర్స్ రికార్డర్ \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)లో \({1}\,{\hbox {min) ఉంది }}\).1% అగరోజ్ జెల్‌పై అమలు చేసినప్పుడు, cDNA అంచనా వేయబడిన మూడు RNA శకలాలు (డేటా చూపబడలేదు)కి అనుగుణంగా మూడు బ్యాండ్‌లను చూపించింది. 117 మరియు 503 bp పొడవు గల రెండు DNA శకలాలను విస్తరించడానికి క్రింది ప్రైమర్‌లు ఉపయోగించబడ్డాయి, miniPCR® mini8 థర్మల్ సైక్లర్‌లో PCR కోసం cDNAని టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించడం:
\(117\,\hbox {bp}\) మరియు \(503\,\hbox {bp}\) కోసం ప్రైమర్‌లు M విభాగంలోని 1476-1575 న్యూక్లియోటైడ్‌లు మరియు L విభాగంలోని 458-943 న్యూక్లియోటైడ్‌లు, వరుసగా ఆమ్లం .అన్ని యాంప్లిఫైడ్ PCR ఉత్పత్తులు 1% అగరోజ్ జెల్స్‌పై ఎలెక్ట్రోఫోరేస్ చేయబడ్డాయి మరియు GeneJET జెల్ ఎక్స్‌ట్రాక్షన్ కిట్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) ఉపయోగించి విస్తరించిన టార్గెట్ DNA శుద్ధి చేయబడింది.
IIT ముంబై క్యాంపస్‌లోని ఒక సరస్సు (పొవై సరస్సు, పోవై, ముంబై) ఫేజ్ కణాలను జోడించడానికి ఉపయోగించబడింది. సరస్సు నీటిని తీసివేయడానికి \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) పొర ద్వారా ఫిల్టర్ చేయబడింది. సస్పెండ్ చేయబడిన కణాలు, ఆపై Phi6 ఫేజ్ జోడించబడింది. \({1}\,{\hbox {ml}}\) \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}}ని జోడించండి \) నుండి \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) ఫిల్టర్ చేసిన సరస్సు నీరు, \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\).ఒక చిన్న ఆల్కాట్ ఫలకం పరీక్ష ద్వారా వైరల్ లోడ్ కొలత కోసం ప్రత్యేకించబడింది. మేము స్పైక్డ్ Phi6 వైరస్ కణాలను కేంద్రీకరించడానికి రెండు వేర్వేరు పద్ధతులను పరీక్షించాము: (1) అల్యూమినియం హైడ్రాక్సైడ్ అధిశోషణం-అవక్షేపణ పద్ధతి, 19 పర్యావరణ నమూనాల నుండి అనేక ఎన్వలప్డ్ RNA వైరస్ల సాంద్రత కోసం ధృవీకరించబడింది మరియు (2) ) పాలిథిలిన్ గ్లైకాల్ (PEG) ఆధారిత వైరస్ ఏకాగ్రత పద్ధతి ఫ్లడ్ మరియు ఇతరుల నుండి స్వీకరించబడింది.20 .PEG-ఆధారిత పద్ధతి యొక్క పునరుద్ధరణ సామర్థ్యం అల్యూమినియం హైడ్రాక్సైడ్ పద్ధతి కంటే మెరుగ్గా ఉన్నట్లు కనుగొనబడినందున, సరస్సు నీటి నమూనాల నుండి Phi6 కణాలను కేంద్రీకరించడానికి PEG-ఆధారిత పద్ధతి ఉపయోగించబడింది.
PEG పద్ధతి ఈ క్రింది విధంగా ఉపయోగించబడింది: 8 % PEG 8000 మరియు \(0.2\,\hbox {M} \) \(Phi6-స్పైక్డ్ లేక్ వాటర్ శాంపిల్స్‌కు PEG 8000 మరియు \(\hbox {NaCl}\) జోడించబడ్డాయి. \ hbox {NaCl}\).నమూనాలు షేకర్‌పై పొదిగేవి\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), ఆపై \(4700 \,\hbox {g}\) వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయబడింది \({45}\,{\hbox {min}}\). సూపర్‌నాటెంట్‌ను విస్మరించి, \({1}\,లో గుళికను మళ్లీ సస్పెండ్ చేయండి. {\hbox {ml}}\) అదే సూపర్‌నాటెంట్‌లో. అన్ని స్పైకింగ్ మరియు వైరస్ ఏకాగ్రత ప్రయోగాలు త్రిపాదిలో జరిగాయి. ఏకాగ్రత తర్వాత, ప్లేక్ అస్సే ద్వారా రికవరీ సామర్థ్యాన్ని కొలవడానికి ఒక చిన్న ఆల్కాట్ రిజర్వ్ చేయబడింది. RNA గతంలో వివరించిన విధంగా వేరు చేయబడింది మరియు తొలగించబడింది కిట్-సరఫరా చేయబడిన ఎల్యూషన్ బఫర్\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). RNA ఏకాగ్రత నమూనా నుండి నమూనాకు మూడుసార్లు మారుతూ ఉంటుంది కాబట్టి, \({2}\,{\upmu \ RNA యొక్క hbox {l}}\) నమూనాల cDNA సంశ్లేషణ ఏకాగ్రతతో సంబంధం లేకుండా మూడింటికి ఉపయోగించబడుతుంది.cDNA సంశ్లేషణ గతంలో వివరించిన విధంగా నిర్వహించబడింది.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA \(117\,\hbox {bp}\) మరియు \(503\,\hbox {ని విస్తరించడానికి 35 సైకిళ్ల కోసం \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR కోసం టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించబడింది bp}\) శకలాలు.ఈ నమూనాలు “1:1″, అనగా పలుచన లేకుండా సూచించబడతాయి. నో-టెంప్లేట్ నియంత్రణ (NTC) ప్రతికూల నియంత్రణగా సెటప్ చేయబడింది, అయితే శుద్ధి చేయబడిన ఫేజ్ నుండి వేరుచేయబడిన RNAని ఉపయోగించి సంశ్లేషణ చేయబడిన cDNA సెటప్ చేయబడింది. సానుకూల నియంత్రణ (PC) కోసం టెంప్లేట్‌గా. బ్రిలియంట్ III అల్ట్రా-ఫాస్ట్ SYBR గ్రీన్ QPCR మాస్టర్ మిక్స్ (ఎజిలెంట్ టెక్నాలజీస్) ఉపయోగించి స్ట్రాటజీన్ Mx3000P RT-PCR పరికరంలో క్వాంటిటేటివ్ PCR (qPCR) ప్రదర్శించబడింది. వర్ణించబడింది.అన్ని నమూనాల కోసం సైకిల్ థ్రెషోల్డ్ (Ct) రికార్డ్ చేయబడింది.అదనంగా, పలచబరిచిన నమూనాలు \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\)ని ఉపయోగించి ఫిల్టర్ చేసిన సరస్సు నీటిలో 1:100 కరిగించబడ్డాయి \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR 35 చక్రాల కోసం. ఈ నమూనాలు “1:100″గా సూచించబడతాయి.
అదనపు బంగారు పూత అవసరం లేకుండా వాణిజ్యపరంగా లభించే తక్కువ-ధర ఎలక్ట్రోలెస్ నికెల్ ఇమ్మర్షన్ గోల్డ్ (ENIG) ప్రక్రియను ఉపయోగించి PCB ఎలక్ట్రోడ్‌లు తయారు చేయబడ్డాయి.ENIG PCB ఎలక్ట్రోడ్ స్పెసిఫికేషన్‌లు మా మునుపటి పనిలో వివరించబడ్డాయి11. ENIG PCB ఎలక్ట్రోడ్‌ల కోసం, సాంప్రదాయ ఎలక్ట్రోడ్ శుభ్రపరిచే పద్ధతులు పిరాన్హా ద్రావణం లేదా సల్ఫ్యూరిక్ యాసిడ్ సైక్లిక్ వోల్టామెట్రీ సిఫారసు చేయబడలేదు, ఎందుకంటే అవి సన్నని బంగారు పొర (మందం \(\ సుమారు\) \(100\,\hbox {nm }\)) పై తొక్కడానికి కారణం కావచ్చు మరియు అంతర్లీనంగా ఉండే రాగి పొరలను బహిర్గతం చేస్తాయి తుప్పు 21, 22, 23, 24, 25. కాబట్టి, IPAతో తడిపిన మెత్తటి గుడ్డతో ఎలక్ట్రోడ్‌లను శుభ్రం చేయండి. పరీక్షించాల్సిన నమూనా \({50}\,{\upmu \hbox {M}తో పొదిగేది }\) MBని \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) సులభంగా చొప్పించడానికి. మా మునుపటి పనిలో , MB ఏకాగ్రత 11ని పెంచడం ద్వారా సెన్సార్ యొక్క సున్నితత్వం మరియు సరళత మెరుగుపరచబడినట్లు మేము గమనించాము .మా మునుపటి పనిలో నివేదించబడిన ఆప్టిమైజేషన్‌ల ఆధారంగా, మేము \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MBని ఉపయోగించాము. ఈ అధ్యయనంలో DNA పొందుపరచడానికి గాఢత. డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA (ds-DNA) యొక్క ఎలెక్ట్రోకెమికల్ గుర్తింపును యానియోనిక్ లేదా కాటినిక్ ఇంటర్‌కలేటర్‌లను ఉపయోగించి సాధించవచ్చు. అయితే యానియోనిక్ ఇంటర్‌కలేటర్‌లు DNAను మెరుగైన ఎంపికతో గుర్తించినప్పటికీ, వాటికి రాత్రిపూట పొదిగే అవసరం, ఫలితంగా ఎక్కువ కాలం గుర్తించడం జరుగుతుంది. మరోవైపు, MB వంటి కాటినిక్ ఇంటర్‌కలేటర్‌లకు ds-DNA6 యొక్క ఎలెక్ట్రోకెమికల్ గుర్తింపు కోసం సుమారుగా \({1}\,{\hbox {h}}\) తక్కువ పొదిగే సమయాలు అవసరం. ప్రతి కొలతలో పరీక్షించాల్సిన నమూనాను పంపిణీ చేయడం ఉంటుంది. ఎలక్ట్రోడ్\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), ఆపై మరొక నమూనాతో కొనసాగడానికి ముందు, IPA-తేమతో కూడిన గుడ్డతో శుభ్రపరచడం.ఒక కొలత.ప్రతి నమూనాను 5 వేర్వేరు ఎలక్ట్రోడ్‌లలో పరీక్షించారు DPV మరియు CV కొలతల కోసం:
DPV: సమతౌల్య సమయం = \(8\,\hbox {s}\), వోల్టేజ్ దశ = \(3\,\hbox {mV}\), పల్స్ వోల్టేజ్ = \(25\,\hbox {mV}\) , పల్స్ వ్యవధి = \(50\,\hbox {ms}\), స్కాన్ రేటు = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: సమతౌల్య సమయం = \(8\,\hbox {s}\), వోల్టేజ్ దశ = \(3\,\hbox {mV}\), స్వీప్ రేటు = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV మరియు CV వోల్టామోగ్రామ్‌లు ENIG PCB ఎలక్ట్రోడ్‌లపై పొందబడ్డాయి \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB DNAతో సంక్లిష్టంగా (10–\({20}\,{\ hbox {ng సాంద్రతలలో }/{\upmu \hbox {l}}}\) అంటే 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) కోసం \(117\,\hbox {bp}\ ) మరియు 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) కోసం \(503\,\hbox {bp}\)).ప్రాతినిధ్య వోల్టామోగ్రామ్‌లు అనుబంధ సమాచారంలోని మూర్తి S1లో చూపబడ్డాయి. మూర్తి 2 ఫలితాలను చూపుతుంది. జెల్-ప్యూరిఫైడ్ PCR ఉత్పత్తులను ఉపయోగించి DPV మరియు CV కొలతలు (పీక్ కరెంట్) CV కొలతలతో పోలిస్తే, DPV కొలతలు అధిక సున్నితత్వాన్ని చూపుతాయి (ప్రస్తుతం DNA ఏకాగ్రత యొక్క విధిగా) ఎందుకంటే CV కొలతలలో బ్యాక్‌గ్రౌండ్ కెపాసిటివ్ కరెంట్‌లు ఫారడైక్ ప్రవాహాలను దాచిపెడతాయి 26 .దత్తాంశం బాక్స్‌ప్లాట్‌లోని ప్రతి పెట్టెలో 5 ఎలక్ట్రోడ్‌ల నుండి కొలతలు ఉంటాయి. ఎలక్ట్రోడ్-టు-ఎలక్ట్రోడ్ వైవిధ్యం కారణంగా కొలత లోపాలను నివారించడానికి అన్ని కొలతలు ఒకే రకమైన ఎలక్ట్రోడ్‌లను ఉపయోగిస్తాయి. DNA యొక్క తక్కువ సాంద్రత కోసం DPV మరియు CV కొలిచిన పీక్ కరెంట్‌లలో పెరుగుతున్న ట్రెండ్‌ను మేము గమనించాము. , పొడవు (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ తో పోలిస్తే \(117) ) భాగం. ఇది మా మునుపటి పనిలో నివేదించబడిన ఎలక్ట్రోడ్ అధిశోషణం యొక్క అంచనా ధోరణికి అనుగుణంగా ఉంటుంది. MB-DNA కాంప్లెక్స్ యొక్క అధిశోషణం ఎలక్ట్రోడ్‌పై ఛార్జ్ బదిలీని సులభతరం చేస్తుంది, ఇది పీక్ కరెంట్ పెరుగుదలకు దోహదపడుతుంది. ఇతర అధ్యయనాలు MB-DNA ఇంటర్‌కలేషన్‌పై ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్ పరిమాణం మరియు క్రమం యొక్క ప్రభావాన్ని చూపించాయి. గ్వానైన్ రెండు యాంప్లికాన్‌లలోని సైటోసిన్ (GC) కంటెంట్ (\(117\,\hbox {bp}\) మరియు \(503\,\hbox {bp}\)) సుమారుగా 50% ఉంది, ఇది గమనించిన తేడా కారణంగా ఉందని సూచిస్తుంది యాంప్లికాన్ పొడవు వరకు.అయితే, అధిక DNA సాంద్రతల కోసం (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), \(503\,\hbox {bp} కోసం \) మరియు \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) కోసం \(117\,\hbox {bp}\)), మేము రెండు విస్తరణలను గమనిస్తాము సబ్‌ల గరిష్ట ప్రవాహాలు DPV మరియు CV కొలతలు రెండింటిలోనూ తగ్గుతాయి. దీనికి కారణం MB DNA యొక్క బేస్ జతల మధ్య సంతృప్తమవుతుంది మరియు ఇంటర్‌కలేట్ అవుతుంది, దీని ఫలితంగా MB31,32లో తగ్గించదగిన సమూహం యొక్క రెడాక్స్ చర్య యొక్క స్టెరిక్ నిరోధం ఏర్పడుతుంది.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
PCR మాస్టర్ మిక్స్‌లలో ఉండే లవణాలు MB మరియు DNA మధ్య ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ ఇంటరాక్షన్‌లకు అంతరాయం కలిగిస్తాయి, కాబట్టి \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\)ని \({50} \,{\) తో జోడించడం ద్వారా upmu \hbox {M}}\) MB-DNA పరస్పర చర్యపై ఉప్పు ప్రభావాన్ని అధ్యయనం చేయడానికి MB జెల్-శుద్ధి చేసిన ఉత్పత్తి. మూర్తి 3లో చూపిన విధంగా, అధిక DNA సాంద్రతలు (\(>{2}\,{\) మేము గమనించాము hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) మరియు \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) కోసం \(117\,\hbox {bp} \)), DPV మరియు CVలో ఉప్పు కలపడం వలన కొలతలు గణనీయంగా ప్రభావితం కాలేదు (ప్రాతినిధ్య వోల్టామోగ్రామ్‌ల కోసం అనుబంధ సమాచారంలో మూర్తి S2 చూడండి).అయితే, వద్ద తక్కువ DNA సాంద్రతలు, ఉప్పు కలపడం వలన సున్నితత్వం బాగా తగ్గుతుంది, ఫలితంగా DNA గాఢతతో కరెంట్‌లో గణనీయమైన మార్పు ఉండదు. MB-DNA పరస్పర చర్యలు మరియు ఇంటర్‌కలేషన్‌పై ఉప్పు యొక్క ఇలాంటి ప్రతికూల ప్రభావాలను గతంలో ఇతర పరిశోధకులు నివేదించారు33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) కాటయాన్‌లు DNA యొక్క ప్రతికూల ఫాస్ఫేట్ వెన్నెముకతో బంధిస్తాయి, తద్వారా MB మరియు DNA మధ్య ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ పరస్పర చర్యకు ఆటంకం కలిగిస్తుంది. అధిక DNA సాంద్రతలలో, రెడాక్స్-యాక్టివ్ MBల యొక్క స్టెరిక్ నిరోధం తక్కువ గరిష్ట ప్రవాహాలకు దారితీస్తుంది, కాబట్టి ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ పరస్పర చర్యలు సెన్సార్ ప్రతిస్పందనను గణనీయంగా ప్రభావితం చేయదు. ముఖ్య విషయం ఏమిటంటే, ఈ బయోసెన్సర్ అధిక DNA సాంద్రతలను గుర్తించడానికి బాగా సరిపోతుంది (అరుదుగా \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) లేదా అంతకంటే ఎక్కువ), పూర్తిగా- పర్యావరణ నీటి నమూనాల స్వయంచాలక ప్రాసెసింగ్ కోసం, PCR ఉత్పత్తుల యొక్క జెల్ శుద్దీకరణ సాధ్యం కాకపోవచ్చు.
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MBతో సంక్లిష్టమైన DNA యొక్క వివిధ సాంద్రతల కోసం తరంగదైర్ఘ్యం పరిధి 600–700 \(\hbox {nm}\) కోసం శోషణ వక్రరేఖ కింద ప్రాంతం: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) ఉప్పుతో మరియు లేకుండా (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) ఉప్పుతో మరియు లేకుండా (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB నమూనాలకు సంబంధించిన DNA సాంద్రతలు DNA లేదు.
పై ఫలితాలను మరింత ధృవీకరించడానికి, మేము UV/Vis స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ (థర్మో సైంటిఫిక్ మల్టీస్కాన్ GO) ఉపయోగించి ఆప్టికల్ కొలతలను చేసాము, ప్రతిదానికి \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) నమూనాలు ఉపయోగించబడ్డాయి కొలత.తరంగదైర్ఘ్యం పరిధి \(600\,\hbox {nm}\) నుండి \(700\,\hbox { వరకు శోషణ వక్రరేఖ క్రింద ఉన్న ప్రాంతం యొక్క ట్రెండ్ నుండి చూడవచ్చు, పెరుగుతున్న DNA గాఢతతో శోషణ సంతకం తగ్గుతుంది. nm}\) , అంజీర్ 4లో చూపిన విధంగా (అనుబంధ సమాచారంలో ఫిగ్. S3లో చూపిన శోషణ స్పెక్ట్రం). \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox కంటే తక్కువ DNA సాంద్రతలు కలిగిన నమూనాల కోసం {l}}}\), DNA-కలిగిన మరియు MB-మాత్రమే నమూనాల మధ్య తీసుకోవడంలో గణనీయమైన తేడా లేదు (\(503\,\hbox {bp}\) మరియు \(117\,\hbox {bp}\ ) పొడవు శకలాలు), రెడాక్స్-యాక్టివ్ MB యొక్క స్టెరిక్ నిరోధం లేకపోవడాన్ని సూచిస్తుంది. అధిక DNA సాంద్రతలలో, మేము శోషణ సిగ్నల్‌లో క్రమంగా తగ్గుదలని గమనించాము మరియు ఉప్పు సమక్షంలో శోషణలో తక్కువ తగ్గుదలని గుర్తించాము. ఈ ఫలితాలు పరమాణువుకు ఆపాదించబడ్డాయి. DNA హైబ్రిడ్‌లలో బేస్ స్టాకింగ్‌తో పరస్పర చర్యలు మరియు స్టెరిక్ నిరోధం. \(\pi\)–\(\pi ^*\లో తగ్గిన శక్తి స్థాయిలతో హైపోక్రోమాటిసిటీని అనుబంధించే MB-DNA ఇంటర్‌కలేషన్ యొక్క స్పెక్ట్రోస్కోపిక్ అధ్యయనాలపై సాహిత్యంలోని నివేదికలకు మా ఫలితాలు అనుగుణంగా ఉంటాయి. ) ఇంటర్కలేషన్ పొరలు 36, 37, 38 కారణంగా ఎలక్ట్రానిక్ పరివర్తనాలు.
ఫేజ్ Phi6 యొక్క అగరోస్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్: సరస్సు నీటి నమూనాల నుండి పొడవు \(117\,\hbox {bp}\) మరియు \(503\,\hbox {bp}\) యొక్క PCR ఉత్పత్తులు.M-DNA మార్కర్;NTC-నో-టెంప్లేట్ నియంత్రణ, సంబంధిత యాంప్లికాన్‌లను కలిగి ఉన్న ప్రైమర్‌లు;PC సానుకూల నియంత్రణ;1, 2, 3-పలచబడని (1:1) స్పైక్డ్ సరస్సు నీటి నమూనాలు త్రిపాదిలో ఉంటాయి. \(\(\సుమారు 50\,\hbox {bp}\) వద్ద \(503\,\) ఉపయోగించని ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌ల కారణంగా బ్యాండ్ కనిపిస్తుంది. hbox {bp}\) లేన్.
మేము Phi6 ఫేజ్‌తో స్పైక్ చేయబడిన పోవై సరస్సు నీటి నమూనాలను ఉపయోగించి సెన్సార్ యొక్క ప్రయోజనాన్ని విశ్లేషించాము. ఫేజ్-స్పైక్డ్ నీటి నమూనాల నుండి వేరుచేయబడిన RNA సాంద్రతలు 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), శుద్ధి చేయబడిన ఫేజ్ సస్పెన్షన్‌ల నుండి వేరు చేయబడినవి RNA సుమారుగా 1 రికవరీ సామర్థ్యంతో \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\)గా అంచనా వేయబడింది. %.RNA cDNAలోకి రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్ చేయబడింది మరియు PCR మరియు qPCR కోసం టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించబడింది. సెన్సార్‌తో పరీక్షించే ముందు ఉత్పత్తి పరిమాణం అగరోస్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ (మూర్తి 5) ద్వారా నిర్ధారించబడింది. ఈ నమూనాలు జెల్ శుద్ధి చేయబడవు మరియు అందువల్ల PCR యొక్క అన్ని భాగాలను కలిగి ఉంటాయి ఆసక్తిని కలిగించే యాంప్లికాన్‌లు. qPCR (టేబుల్ 1) సమయంలో నమోదు చేయబడిన Ct విలువలు సంబంధిత స్పైక్డ్ వాటర్ శాంపిల్స్ నుండి వేరుచేయబడిన RNA యొక్క గాఢతతో పరస్పర సంబంధం కలిగి ఉన్నట్లు చూపబడింది. Ct విలువ ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్‌కు అవసరమైన చక్రాల సంఖ్యను వెల్లడిస్తుంది. థ్రెషోల్డ్ లేదా బ్యాక్‌గ్రౌండ్ సిగ్నల్‌ను మించిపోయింది.అధిక Ct విలువలు తక్కువ టెంప్లేట్ సాంద్రతలను సూచిస్తాయి మరియు దీనికి విరుద్ధంగా. NTC నమూనాల Ct విలువలు ఊహించినంత ఎక్కువగా ఉన్నాయి. \(\సుమారు 3\) Ct విలువల మధ్య వ్యత్యాసం సానుకూల నియంత్రణ మరియు పరీక్ష నమూనా సానుకూల నియంత్రణతో పోల్చితే ప్రతి పరీక్ష నమూనా సుమారు 1% టెంప్లేట్‌ను కలిగి ఉందని సూచిస్తుంది. పొడవైన యాంప్లికాన్‌లు మెరుగైన సున్నితత్వానికి దారితీస్తాయని మేము గతంలో చర్చించాము. భిన్నమైన పర్యావరణ నమూనాల నుండి వేరుచేయబడిన పొడవైన శకలాలు విస్తరించడం ప్రతికూలతలను బట్టి సవాలుగా ఉంది. తక్కువ వైరల్ గాఢత మరియు RNA క్షీణత. అయినప్పటికీ, మా వైరస్ సుసంపన్నత మరియు PCR యాంప్లిఫికేషన్ ప్రోటోకాల్‌తో, ఎలక్ట్రోకెమికల్ సెన్సింగ్ కోసం మేము \(503\,\hbox {bp}\) భాగాన్ని విజయవంతంగా విస్తరించగలిగాము.
మూర్తి 6 \(503\,\hbox {bp}\) ఫ్రాగ్మెంట్ యాంప్లికాన్ యొక్క ఎలెక్ట్రోకెమికల్ సెన్సార్ ఫలితాలను చూపుతుంది, రెండూ పలచబడని cDNAని టెంప్లేట్‌గా (1:1) మరియు 100 రెట్లు పలచబడిన cDNAని టెంప్లేట్ (1:100 ) ప్రదర్శించిన PCRగా ఉపయోగిస్తాయి. , NTC మరియు PC లతో పోలిస్తే (ప్రాతినిధ్య వోల్టామోగ్రామ్‌ల కోసం అనుబంధ సమాచారంలో మూర్తి S4 చూడండి). మూర్తి 6లోని బాక్స్‌ప్లాట్‌లోని ప్రతి పెట్టె 5 ఎలక్ట్రోడ్‌ల వద్ద మూడు నమూనాల నుండి కొలతలను కలిగి ఉంటుంది. అదే ఎలక్ట్రోడ్‌లు ఎలక్ట్రోడ్ కారణంగా లోపాలను నివారించడానికి అన్ని నమూనాలను కొలవడానికి ఉపయోగించబడ్డాయి. -టు-ఎలక్ట్రోడ్ వైవిధ్యం.CV కొలతలతో పోలిస్తే, DPV కొలతలు NTCల నుండి పరీక్ష మరియు PC నమూనాలను వేరు చేయడానికి మెరుగైన రిజల్యూషన్‌ను చూపుతాయి ఎందుకంటే, గతంలో పేర్కొన్నట్లుగా, ఫారడైక్ కరెంట్‌లు తరువాతి బ్యాక్‌గ్రౌండ్ కెపాసిటివ్ కరెంట్‌ల కారణంగా దాచబడతాయి. పొడవైన యాంప్లికాన్‌ల కోసం, మేము గమనించాము ప్రతికూల నియంత్రణ (NTC) సానుకూల నియంత్రణకు సంబంధించి అధిక CV మరియు DPV పీక్ కరెంట్‌లకు దారితీసింది, అయితే సానుకూల మరియు పలచని పరీక్ష నమూనాలు DPV పీక్ కరెంట్‌ల యొక్క ఒకే విధమైన గరిష్ట ఎత్తులను చూపించాయి. ప్రతి పలచని (1:1) కోసం కొలిచిన సగటు మరియు మధ్యస్థ విలువలు ) పరీక్ష నమూనా మరియు PC NTC నమూనా కోసం సెన్సార్ అవుట్‌పుట్ నుండి స్పష్టంగా పరిష్కరించబడతాయి, అయితే 1:100 పలుచన నమూనా కోసం రిజల్యూషన్ తక్కువగా ఉంటుంది. cDNA యొక్క 100 రెట్లు పలుచన కోసం, మేము జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ సమయంలో ఎటువంటి బ్యాండ్‌లను గమనించలేదు. (చిత్రం 5లో లేన్‌లు చూపబడలేదు), మరియు సంబంధిత DPV మరియు CV పీక్ కరెంట్‌లు NTC కోసం ఆశించిన వాటికి సమానంగా ఉన్నాయి. \(117\,\hbox {bp}\) ఫ్రాగ్‌మెంట్ యొక్క ఫలితాలు అనుబంధ సమాచారంలో చూపబడ్డాయి. ప్రతికూలత ఎలక్ట్రోడ్‌పై ఉచిత MB యొక్క అధిశోషణం మరియు సింగిల్-స్ట్రాండ్డ్ ప్రైమర్ ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌తో MB యొక్క పరస్పర చర్య కారణంగా నియంత్రణ PCB సెన్సార్ నుండి ఎలక్ట్రోకెమికల్ ప్రతిస్పందనను ప్రేరేపించింది. అందువల్ల, ప్రతిసారీ నమూనా పరీక్షించబడినప్పుడు, ప్రతికూల నియంత్రణను అమలు చేయాలి మరియు పరీక్ష నమూనా యొక్క పీక్ కరెంట్‌తో పోలిస్తే ప్రతికూల నియంత్రణ ద్వారా పొందిన పీక్ కరెంట్‌తో పోల్చితే, పరీక్ష నమూనాను సానుకూలంగా లేదా ప్రతికూలంగా వర్గీకరించడానికి అవకలన (సంబంధిత) కొలత39,40 సాధించడానికి.
(ఎ) DPV, మరియు (b) సరస్సు నీటి నమూనాలలో \(503\,\hbox {bp}\) శకలాలు యొక్క ఎలెక్ట్రోకెమికల్ గుర్తింపు కోసం CV పీక్ కరెంట్. పరీక్ష నమూనాలను మూడుసార్లు కొలుస్తారు మరియు ఎటువంటి టెంప్లేట్ నియంత్రణలతో పోల్చబడలేదు (NTC) మరియు సానుకూల నియంత్రణలు (PC).
UV/Vis స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్‌ని ఉపయోగించి ఆప్టికల్ కొలతల ద్వారా ధృవీకరించబడిన సాంద్రతలతో, వివిధ DNAల కోసం వేర్వేరు పొడవులు గల యాంప్లికాన్‌ల కోసం ఎలెక్ట్రోకెమికల్ సెన్సార్‌ల పనితీరును ప్రభావితం చేసే విభిన్న మెకానిజమ్‌లను మా పరిశోధనలు వివరిస్తాయి. మా పరిశీలనలు దీర్ఘ DNA శకలాలు \(\సుమారు\) వరకు ఉండే అంతర్దృష్టిని నొక్కి చెబుతున్నాయి. \(500\,\hbox {bp}\) అధిక సున్నితత్వంతో గుర్తించవచ్చు మరియు నమూనాలో ఉప్పు ఉనికిని సున్నితత్వం DNA గాఢతను ప్రభావితం చేయదు, ఇది అధిక సున్నితత్వాన్ని ప్రభావితం చేస్తుంది (అరుదుగా \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) మరియు అంతకంటే ఎక్కువ).అదనంగా, మేము వివిధ రకాల నమూనాల ప్రభావాన్ని పరిశోధించాము, ఇందులో ఉప్పుతో మరియు జోడించకుండా జెల్-ప్యూరిఫైడ్ యాంప్లికాన్‌లు మరియు DPV మరియు CV కొలతలలో సరస్సు నీటి నమూనాల జోడింపుతో సహా.DPV మెరుగైన రిజల్యూషన్‌ని అందించిందని మేము గమనించాము, ఎందుకంటే బ్యాక్‌గ్రౌండ్ కెపాసిటివ్ కరెంట్ కూడా CV కొలతను ప్రభావితం చేస్తుంది, ఇది తక్కువ సున్నితంగా చేస్తుంది.
పొడవైన శకలాలు విస్తరించడం అనేది వైరల్ జన్యుసంబంధమైన RNA యొక్క సమగ్రతపై ఆధారపడి ఉంటుంది. పర్యావరణంలో RNA యొక్క క్షీణత మరియు ఒంటరిగా ఉన్నప్పుడు విడిపోయే అవకాశం కారణంగా పొడవైన శకలాలు విస్తరించడం ఎల్లప్పుడూ సమర్థవంతంగా ఉండదని అనేక అధ్యయనాలు చూపించాయి. .అల్యూమినియం హైడ్రాక్సైడ్ ఆధారిత వైరస్ ఏకాగ్రత పద్ధతి కంటే సరస్సు నీటి నమూనాలలో స్పైక్ చేసిన ఫేజ్ ఫై-6ని కేంద్రీకరించడంలో PEG-ఆధారిత వైరస్ ఏకాగ్రత పద్ధతి మరింత ప్రభావవంతంగా ఉందని మేము గమనించాము. పొడవైన DNA శకలాలను గుర్తించే సామర్థ్యం మల్టీప్లెక్స్ PCR అవసరాన్ని అధిగమించడానికి నిరూపించబడింది. బహుళ తక్కువ పొడవు టెంప్లేట్‌లను విస్తరించడానికి మరియు క్రాస్-స్పెసిఫిసిటీ యొక్క అవకాశాన్ని తగ్గించడానికి.
బయోలాజికల్ నమూనాలు చాలా తక్కువగా ఉన్నాయి, కాబట్టి పరీక్ష కోసం కనీస నమూనాలు అవసరమయ్యే బయోసెన్సర్‌ను రూపొందించాల్సిన అవసరం ఉంది. ఈ అధ్యయనంలో ఉపయోగించిన ENIG PCB ఎలక్ట్రోడ్‌లు కేవలం \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) ఎలక్ట్రోడ్‌ల యొక్క ప్రభావవంతమైన ప్రాంతాన్ని కవర్ చేయడానికి పరీక్ష కోసం నమూనాలు. అదనంగా, అదే ఎలక్ట్రోడ్‌ను తదుపరి నమూనాను పంపిణీ చేసే ముందు శుభ్రపరిచిన తర్వాత మళ్లీ ఉపయోగించవచ్చు. యాంప్లిఫైడ్ శాంపిల్స్‌కు మిథిలీన్ బ్లూ కాకుండా ఇతర రసాయనాలను జోడించాల్సిన అవసరం లేదు, ఇది చవకైనది. మరియు సాధారణంగా ఉపయోగించే రసాయనం.ప్రతి ఎలక్ట్రోడ్ తయారీకి దాదాపు $0.55 (లేదా INR 40) ఖర్చవుతుంది కాబట్టి, ఈ బయోసెన్సర్ ఇప్పటికే ఉన్న డిటెక్షన్ టెక్నాలజీలకు తక్కువ ఖర్చుతో కూడిన ప్రత్యామ్నాయంగా ఉంటుంది. టేబుల్ 2 ఈ పనిని దీర్ఘకాలంగా సాహిత్యంలో నివేదించబడిన ఇతర సెన్సార్‌లతో పోల్చడాన్ని చూపుతుంది. భిన్నమైన నమూనాలలో DNA శకలాలు.
MB-ఆధారిత ఎలక్ట్రోకెమికల్ డిటెక్షన్ ప్రోటోకాల్‌లు PCR యొక్క విశిష్టతపై ఆధారపడి ఉంటాయి కాబట్టి, ఈ పద్ధతి యొక్క ప్రధాన పరిమితి వ్యర్థ జలాలు మరియు సరస్సు నీరు వంటి వైవిధ్య నమూనాలలో నిర్దిష్ట-కాని విస్తరణకు సంభావ్యత లేదా తక్కువ-స్వచ్ఛత ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించడం. మార్పు చేయని ENIG PCB ఎలక్ట్రోడ్‌లను ఉపయోగించి శుద్ధి చేయని PCR ఉత్పత్తుల DNA గుర్తింపు కోసం ఎలెక్ట్రోకెమికల్ డిటెక్షన్ పద్ధతులు, ఉపయోగించని dNTPలు మరియు ప్రైమర్‌ల ద్వారా పరిచయం చేయబడిన లోపాలను బాగా అర్థం చేసుకోవడం మరియు ప్రతిచర్య పరిస్థితులు మరియు ప్రోటోకాల్‌లను ఆప్టిమైజ్ చేయడం అవసరం. pH, ఉష్ణోగ్రత మరియు జీవసంబంధమైన అదనపు భౌతిక రసాయన పారామితులు కొలత యొక్క ఖచ్చితత్వాన్ని మెరుగుపరచడానికి నీటి నమూనా యొక్క ఆక్సిజన్ డిమాండ్ (BOD) కూడా కొలవవలసి ఉంటుంది.
ముగింపులో, మేము పర్యావరణ (సరస్సు నీరు) నమూనాలలో వైరస్ గుర్తింపు కోసం తక్కువ-ధర ఎలక్ట్రోకెమికల్ ENIG PCB సెన్సార్‌ను ప్రతిపాదిస్తున్నాము. స్థిరత్వాన్ని కొనసాగించడానికి క్రయోజెనిక్ నిల్వ అవసరమయ్యే DNA సెన్సింగ్ కోసం స్థిరమైన ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్ ఎలక్ట్రోడ్‌లు లేదా అనుకూల సబ్‌స్ట్రేట్‌లు కాకుండా, 53,54 మా సాంకేతికత మార్పులేని PCBని ఉపయోగిస్తుంది. ఎలక్ట్రోడ్‌లు ఎక్కువ కాలం ఉండేవి మరియు నిర్దిష్ట నిల్వ అవసరాలు లేవు మరియు అందువల్ల LMICలలో మోహరించిన ఆటోమేటెడ్ శాంపిల్ ప్రాసెసింగ్‌తో కొలత పరిష్కారాల అభివృద్ధికి అనుకూలం ఎన్విరాన్మెంటల్ శాంపిల్స్‌లో సాధారణం MBలను సింగిల్- మరియు డబుల్ స్ట్రాండెడ్ ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌లకు నిర్ధిష్టంగా బంధించడం వలన ఈ సెన్సింగ్ పద్ధతి యొక్క విశిష్టతను తగ్గిస్తుంది. అందువల్ల, ఈ పరీక్ష యొక్క ప్రత్యేకత ప్రైమర్‌ల ఆప్టిమైజేషన్ మరియు PCR ప్రతిచర్య పరిస్థితులపై ఆధారపడి ఉంటుంది. అదనంగా, CV మరియు పరీక్షించిన నమూనాల నుండి పొందిన DPV పీక్ కరెంట్‌లు ప్రతి పరీక్షకు ప్రతికూల నియంత్రణ (NTC) నుండి పొందిన ప్రతిస్పందనలకు సంబంధించి అన్వయించబడాలి. ఈ పనిలో అందించిన ఎలెక్ట్రోకెమికల్ సెన్సార్ డిజైన్‌లు మరియు పద్ధతులు పూర్తిగా ఆటోమేటెడ్ మరియు తక్కువ అభివృద్ధి చేయడానికి ఆటోసాంప్లర్‌లతో అనుసంధానించబడతాయి. నమూనాలను సేకరించి, విశ్లేషించి, ఫలితాలను వైర్‌లెస్‌గా తిరిగి ప్రయోగశాలకు ప్రసారం చేయగల వ్యయ పరిష్కారం.
క్యాష్‌డాలర్, J. & వైమర్, L. నీటి నమూనాల నుండి వైరస్‌ల ప్రారంభ ఏకాగ్రత కోసం పద్ధతులు: ఇటీవలి అధ్యయనాల సమీక్ష మరియు మెటా-విశ్లేషణ.Application.microorganism.115, pp. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL వాటర్‌బోర్న్ వైరస్‌లు: సురక్షితమైన తాగునీటికి అడ్డంకులు.PLoS పాథోజెన్స్.11, E1004867 (2015).
శ్రేష్ఠ, S. మరియు ఇతరులు. తక్కువ మరియు మధ్య-ఆదాయ దేశాలలో కోవిడ్-19 యొక్క ఖర్చుతో కూడిన భారీ-స్థాయి నిఘా కోసం వేస్ట్ వాటర్ ఎపిడెమియాలజీ: సవాళ్లు మరియు అవకాశాలు. నీరు 13, 2897 (2021).
పలెసెక్, E. & బార్టోసిక్, M. న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ ఎలక్ట్రోకెమిస్ట్రీ.కెమికల్.రెవ్.112, 3427–3481 (2012).
తాని, A., థామ్సన్, AJ & బట్, JN మిథైలీన్ బ్లూ ఒక ఎలెక్ట్రోకెమికల్ డిస్క్రిమినేటర్‌గా సింగిల్ మరియు డబుల్ స్ట్రాండెడ్ ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌లను గోల్డ్ సబ్‌స్ట్రేట్‌లపై స్థిరీకరించింది. విశ్లేషకుడు 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ కంపారిజన్ ఆఫ్ కేషన్ అండ్ అయాన్ ఇంటర్‌కలేటర్స్ ఫర్ ఎలెక్ట్రోకెమికల్ ట్రాన్స్‌డక్షన్ ఆఫ్ DNA హైబ్రిడైజేషన్ బై లాంగ్-రేంజ్ ఎలక్ట్రాన్ ట్రాన్స్‌ఫర్.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
వాంగ్, EL & గూడింగ్, JJ ఛార్జ్ ట్రాన్స్‌ఫర్ DNA: ఎ సెలెక్టివ్ ఎలక్ట్రోకెమికల్ DNA biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
ఫాంగ్, TH మరియు ఇతరులు. రియల్-టైమ్ PCR మైక్రోఫ్లూయిడ్ డివైజ్‌తో ఏకకాలిక ఎలక్ట్రోకెమికల్ డిటెక్షన్.బయోలాజికల్ సెన్సార్.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. DNAతో మిథైలీన్ బ్లూ పరస్పర చర్య ఆధారంగా ఎలక్ట్రోకెమికల్ రియల్-టైమ్ PCR సిస్టమ్ యొక్క సిగ్నలింగ్ మెకానిజం అధ్యయనం మరియు పనితీరు ధృవీకరణ. విశ్లేషకుడు 136, 1573–1579 (2011).
రామిరేజ్-చావర్రియా, RG మరియు ఇతరులు. మురుగునీటి నమూనాలలో సార్స్-కోవ్-2ని గుర్తించడం కోసం లూప్-మెడియేటెడ్ ఐసోథర్మల్ యాంప్లిఫికేషన్-ఆధారిత ఎలక్ట్రోకెమికల్ సెన్సార్.J.పర్యావరణం.కెమికల్.బ్రిటన్.10, 107488 (2022).
కుమార్, M. et al.PCB ఎలక్ట్రోడ్‌లతో SARS-CoV-2 యాంప్లికాన్‌ల ఎలక్ట్రోకెమికల్ సెన్సింగ్. సెన్సార్ యాక్టివేట్ చేయబడింది.B కెమిస్ట్రీ.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. SARS-CoV-2 RNAను వ్యర్థజలం.science.general ఎన్విరాన్‌మెంట్ యొక్క ఘన భిన్నంలో సమర్థంగా గుర్తించడం.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al. వ్యర్థ నీటిలో SARS-CoV-2 గుర్తింపు కోసం విశ్లేషణాత్మక పద్ధతులు: ప్రోటోకాల్ మరియు భవిష్యత్తు దృక్పథాలు.TraC ట్రెండింగ్ anal.Kemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. ఆవిరైన లాలాజల బిందువులలో గ్లాస్ ఉపరితలాలపై నిక్షిప్తం చేయబడిన ఆవిరైన లాలాజల బిందువులలో కప్పబడిన బ్యాక్టీరియోఫేజ్ Phi6 (SARS-CoV-2 కొరకు సర్రోగేట్) యొక్క సర్వైవల్.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ ఫ్రీ-లివింగ్ అమీబాలో SARS-CoV-2 సర్రోగేట్ (Phi6) యొక్క ఎన్విరాన్‌మెంటల్ పెర్సిస్టెన్స్.J.నీటి ఆరోగ్యం 20, 83 (2021).
మిండిచ్, L. డబుల్ స్ట్రాండెడ్ RNA బ్యాక్టీరియోఫేజ్\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev. యొక్క మూడు జెనోమిక్ శకలాల ఖచ్చితమైన ప్యాకేజింగ్.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, DH RNA ఫేజ్\(\varphi\)6 ప్యాకేజింగ్ ప్రాంతం యొక్క ద్వితీయ నిర్మాణం.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – బాక్టీరియోఫేజ్‌ల ప్రయోగశాల నిల్వలను సిద్ధం చేయడానికి వేగవంతమైన మరియు సమర్థవంతమైన ప్రోటోకాల్.PeerJ 4, e2261 (2016).