Хвала вам што сте посетили Натуре.цом. Верзија прегледача коју користите има ограничену подршку за ЦСС. За најбоље искуство, препоручујемо да користите ажурирани прегледач (или искључите режим компатибилности у Интернет Екплорер-у). У међувремену, да бисте осигурали наставак подршке, приказаћемо сајт без стилова и ЈаваСцрипт-а.
Важност праћења узорака животне средине је веома цењена од почетка пандемије ЦОВИД-19, а неки напори за праћење се врше коришћењем златног стандарда, иако су технике засноване на кПЦР скупе. Електрохемијски ДНК биосензори би могли да обезбеде потенцијално исплатив решење за праћење узорака воде из животне средине у земљама са ниским и средњим приходима. У овом раду демонстрирамо електрохемијску детекцију ампликона добијених из Пхи6 фага изолованог из узорака воде језера са шиљцима (популарни сурогат за САРС-ЦоВ-2), користећи ЕНИГ за комплетирање ПЦБ електрода без модификације површине.сек.Одзив електрохемијског сензора је детаљно окарактерисан за два фрагмента ДНК различите дужине (\({117}\,\хбок {бп}\) и \({503}\,\хбок {бп}\)), и ефекат соли у ПЦР мастер мешавинама на интеракције метиленско плаво (МБ)-ДНК. Наши резултати показују да дужина фрагмената ДНК значајно одређује електрохемијску осетљивост и показују у овом раду да је способност детекције дугих ампликона без пречишћавања ПЦР производа гелом важно за ин ситу мерење узорака воде.Потпуно аутоматизовано решење за вирусно оптерећење је добро.
Пренос вируса путем воде познат је као опасност по јавно здравље од 1940-их, са првим доказима о преношењу воденим парализом и хепатитиса Е1. Светска здравствена организација (СЗО) је класификовала неколико вирусних патогена који се преносе водом од умереног до високог здравственог значаја2.Традиционални вирус методе детекције се ослањају на технике засноване на златном стандарду кПЦР, које су веома осетљиве и специфичне, али захтевају квалификовано особље за тестирање у лабораторији користећи скупе инструменте. Међутим, у земљама са ниским и средњим приходима (ЛМИЦ) са ограниченим ресурсима, људски тестирање узорака ће вероватно имати предност над праћењем узорака воде из животне средине. Због тога су потребне алтернативне методе са ниским трошковима за одрживо праћење узорака воде и отпадних вода у реалном времену у земљама са ниским и средњим приходима као рана упозорења на појаву избијања болести, чиме се штите од тешких социоекономских утицаја пандемије вируса. Јефтини електрохемијски биосензори за нуклеинске киселине могли би да обезбеде обећавајуће потенцијално решење за ову неиспуњену потребу. Многи од ових ДНК биосензора функционишу чињеницом да су комплементарни ланци ДНК имобилисани на електроди површине и хибридизују када је одговарајућа секвенца присутна у узорку. Ово се затим може конвертовати у сигнал различитим електрохемијским техникама коришћењем редокс медијатора као што су калијум гвожђе/фероцијанид. Метиленско плаво (МБ) је један такав редокс активан молекул, који има пријављено је да се интеркалирају у дволанчану ДНК (дсДНК) поред свог неспецифичног везивања за једноланчану ДНК5,6. Интеркалирајућа природа МБ за формирање МБ-ДНК комплекса чини их популарним избором као редокс медијаторима у неколико електрохемијских ДНК конфигурације сензора5,6,7,8,9.Иако је интеркалација МБ у ДНК неспецифична, а специфичност овог електрохемијског сензора у великој мери зависи од чистоће прајмера који се користи за ПЦР или изотермно појачање, он је веома погодан за примену стварног -временски електрохемијски базиран кПЦР или флуоресцентна изотермална амплификација као алтернатива мерењу концентрације ДНК 9 .У једној таквој имплементацији, Вон ет ал. Површина златних електрода је модификована са 6-меркапто-1-хексанолом (МЦХ) за реално време мерење ПЦР ампликона са МБ коришћењем диференцијалне пулсне волтаметрије (ДПВ)9. У другим случајевима, Рамирез и сарадници. Детекција САРС-ЦоВ-2 у отпадној води реакцијом РТ-ЛАМП коришћењем МБ са електродама одштампаним екраном. Платинасте електроде су такође користе се као ин ситу електроде у микрофлуидној ПЦР платформи дизајнираној да електрохемијски детектује ампликоне током реакција 8 .Све ове студије захтевају модификацију површине електрода, што подразумева повећане производне и оперативне трошкове због посебних захтева за складиштење за стабилност ових функционализованих електрода.
Шема тока рада за електрохемијску детекцију ампликона добијених од концентрованих вирусних честица у узорцима воде језера.
Недавно смо демонстрирали електрохемијско сенсирање САРС-ЦоВ-2 ампликона са јефтиним електродама на штампаним плочама (ПЦБ) заснованим на ДПВ и цикличној волтаметрији (ЦВ) индукованој адсорпцијом комплекса МБ-ДНК на површини немодификованих електрода) променама у пику струја11.Извештавамо да дужи фрагменти ДНК (Н1-Н2, \({943}\, \хбок) формирани коришћењем Н1 унапред и Н2 реверзних прајмера које препоручује ЦДЦ у поређењу са краћим фрагментима {бп}\)) показују бољу линеарност у одговору сензора (Н1, \(72\,\хбок {бп}\)) формиран коришћењем Н1 напредних и Н1 реверзних прајмера. Ове студије су објављене коришћењем ДНК разблажења припремљених у води без нуклеаза. Платформа је такође коришћена за откривање САРС-ЦоВ -2 ампликона у симулираним узорцима отпадне воде (добијеним додавањем укупних узорака РНК са САРС-ЦоВ-2 РНК). Пошто је РНК подложна смицању током изолације и даље обраде, 12,13 тешко је амплифицирати дуже фрагменте овим хетерогеним узорком. Стога је демонстрација електрохемијског сенсинга САРС-ЦоВ-2 ампликона у отпадној води ограничена на краћи \(72\,\хбок {бп}\) Н1 фрагмент.
У овом раду смо истражили изводљивост електрохемијског сенсинга на бази ЕНИГ ПЦБ-а фага Пхи6 концентрисаног и изолованог из узорака воде језера (слика 1). Пхи6 фаги су упоредиви по величини (80-100 нм) са САРС-ЦоВ-2 и такође имају липидну мембрану и шиљасти протеин. Из ових разлога, бактериофаг Пхи6 је популаран сурогат за САРС-ЦоВ-2 и друге омотане патогене РНК вирусе14,15. РНК изолована из честица фага је коришћена као шаблон за синтезу цДНК, а затим ПЦР за добијање два ДНК фрагмента дужине 117 и 503 пара база. С обзиром на изазов амплификације \(943\,\хбок {бп}\) Н1-Н2 фрагмената у нашем претходном раду, циљамо фрагменте средње дужине (\(117 \,\хбок {бп}\) и \(503 \,\хбок {бп}\)), на основу доступних прајмера. Одзив електрохемијског сензора је систематски проучаван у широком опсегу концентрација (\({10}\,{ \хбок {пг}/{\упму \хбок {л}}}\) до \({20}\, {\хбок {нг}/{\упму \хбок {л}}}\)) За оба фрагмента у присуство МБ, ефекат соли на одзив сензора је окарактерисан и унакрсно потврђен спектрофотометријским мерењима. Главни доприноси овог рада су следећи:
Дужина фрагмента ДНК и присуство соли у узорку снажно утичу на осетљивост.Наши резултати показују да електрохемијска активност зависи од различитих механизама интеракције МБ, ДНК и сензора у волтаметријском одговору, у зависности од концентрације и дужине ДНК, при чему дужи фрагменти показују већу осетљивост, иако со негативно утичу на електростатичке интеракције између МБ и ДНК.
Концентрација ДНК одређује механизам интеракције МБ-ДНК у немодификованим електродама. Показали смо да различити механизми интеракције МБ-ДНК зависе од концентрације ДНК. При концентрацијама ДНК испод мале количине \({\хбок {нг}/{\упму \хбок) {л}}}\), приметили смо да је одговор електрохемијске струје углавном одређен адсорпцијом МБ-ДНК на електроди, док је при нижим концентрацијама При високим концентрацијама ДНК, одговор електрохемијске струје одређен стеричном инхибицијом редокс-а. активност услед уметања МБ између базних парова ДНК.
Електрохемијско испитивање вирусних нуклеинских киселина у узорцима воде језера на бази ЕНИГ ПЦБ-а Опажања су потврђена електрохемијском детекцијом фрагмената ДНК доданих Пхи6 \(503\,\хбок {бп}\) добијених из узорака воде из језера Поваи, ИИТ Мумбаи Цампус Резултат фаг.
Ниска цена имплементације и потенцијал за интеграцију у потпуно аутоматизоване системе за праћење, олигонуклеотиди или аптамери на електродама са дужим роком трајања.
Фаг Пхи6 је омотани дсРНА вирус из породице Цитовиридае који инфицира Псеудомонас сирингае. Геном Пхи6 фага постоји у облику 3 фрагмента: С (\(2.95\,\хбок {Кб}\)), М (\(4.07) \,\хбок {Кб}\)) и Л (\ (6.37\ ,\хбок{Кб}\))16,17. Пошто Пхи6 фаг инфицира непатогени сој БСЛ-1 Псеудомонас, безбедан је за употребу и може се лако узгајати у лабораторији. Пхаге Пхи6 и његов домаћин Псеудомонас сирингае су купљени од Референтног центра за бактеријске вирусе Фелик д'Херелле, Универзитета Лавал, Канада (каталошки бројеви референтног центра су ХЕР-102 и ХЕР-1102, респективно) .Пхи6 фаг и његов домаћин су оживљени према упутствима референтног центра. Фаг Пхи6 је пречишћен лизом плоче и елуцијом да би се добили коначни титри са \(\око 10^{12}\,{\хбок {ПФУ}/\хбок { мл}}\) (јединице које формирају плак/милилитре).РНА је изолована из пречишћених честица фага коришћењем ГенЕлуте™ универзалног комплета за пречишћавање укупне РНК (Сигма-Алдрицх) према упутствима произвођача. Укратко, суспензија пречишћеног фага Пхи6\({ 100}\,{{\упму \хбок {л}}}\) је лизирано и лизат је стављен на спин колону да би се омогућило РНК да се веже за колону смоле. РНК се затим елуира у раствору за елуирање \({ 50}\,{{\упму \хбок {л}}}\) обезбеђен у комплету. Процените концентрацију РНК према апсорбанцији на \(260\,\хбок {нм}\).РНА је ускладиштена у аликвотима у \ ({-80}\,{^{\цирц }\хбок {Ц}}\) до даље употребе.\({2}\,{\упму \хбок {г}}\) иСцрипт комплет за синтезу цДНК (Био -Рад Лабораториес) је коришћен као шаблон за синтезу цДНК према упутствима произвођача. Укратко, реакција синтезе цДНК се састоји од 3 корака: прајминг на \({25}\,{^{\цирц }\хбок {Ц}}\ )\({5}\,{\хбок {мин} }\) , обрнута транскрипција \({20}\,{\хбок {мин}}\) на \({46}\,{^{\цирц }\хбок {Ц}}\), и обрнуто Диктафон је у \({95}\,{^{\цирц }\хбок {Ц}}\) за \({1}\,{\хбок {мин }}\). Када се ради на 1% агарозном гелу, цДНК је показала три траке које одговарају очекивана три РНК фрагмента (подаци нису приказани). Следећи прајмери су коришћени за амплификацију два фрагмента ДНК дужине 117 и 503 бп, коришћење цДНК као шаблона за ПЦР у миниПЦР® мини8 термалном циклусу:
Прајмери за \(117\,\хбок {бп}\) и \(503\,\хбок {бп}\) одговарају 1476-1575 нуклеотида М сегмента и 458-943 нуклеотида Л сегмента, респективно киселих Сви појачани ПЦР производи су подвргнути електрофорези на 1% агарозних гелова, а амплификована циљна ДНК је пречишћена коришћењем ГенеЈЕТ комплета за екстракцију гела (Тхермо Фисхер Сциентифиц).
Језеро у кампусу ИИТ Мумбаи (Поваи Лаке, Поваи, Мумбаи) је коришћено за додавање честица фага. Вода из језера је филтрирана кроз \({5}\,{\упму \хбок {м}}\) мембрану да би се уклонила суспендоване честице, а затим је додат Пхи6 фаг. Додајте \({1}\,{\хбок {мл}}\) од \(10^{6}\,{\хбок {ПФУ}/\хбок {мл}} \) у \( {100}\ ,{\хбок {мл}}\) филтрирану воду језера, у \({4}\,{^{\цирцле}\хбок {Ц}}\). Мали аликвот је био резервисано за мерење вирусног оптерећења помоћу теста плака. Тестирали смо две различите методе за концентрисање честица вируса Пхи6 са шиљцима: (1) метод адсорпције-преципитације алуминијум хидроксида,19 који је потврђен за концентрацију неколико РНК вируса са омотачем из узорака животне средине, и (2) ) Метода концентрације вируса на бази полиетилен гликола (ПЕГ) је прилагођена од Флоод ет ал.20. Пошто је утврђено да је ефикасност опоравка методе засноване на ПЕГ-у боља од оне код методе алуминијум хидроксида, метода заснована на ПЕГ-у је коришћена за концентрисање честица Пхи6 из узорака воде језера.
Коришћена ПЕГ метода је следећа: ПЕГ 8000 и \(\хбок {НаЦл}\) су додати узорцима језерске воде са Пхи6 шиљцима да би се добило 8% ПЕГ 8000 и \(0,2\,\хбок {М} \) \( \ хбок {НаЦл}\).Узорци су инкубирани на шејкеру\({4}\,{^{\цирц }\хбок {Ц}}\)\({4}\,{\хбок {х}}\ ), а затим центрифугиран на \(4700 \,\хбок {г}\) је \({45}\,{\хбок {мин}}\). Одбаците супернатант и ресуспендујте пелет у \({1}\, {\хбок {мл}}\) у истом супернатанту. Сви експерименти са додавањем и концентрацијом вируса су изведени у три примерка. Након концентрације, мали аликвот је резервисан за мерење ефикасности опоравка помоћу теста плака. РНК је изолована како је претходно описано и елуирана у пуферу за елуирање који се испоручује у комплету\({40}\,{\упму \хбок {л}}\). Пошто ће концентрација РНК варирати од узорка до узорка у три примерка, \({2}\,{\упму \ хбок {л}}\) РНК се користи за сва три без обзира на његову концентрацију. цДНК синтеза узорака. Синтеза цДНК је обављена као што је претходно описано.\({1}\,{\упму \хбок {л}}\) цДНК је коришћен као шаблон за \({20}\,{\упму \хбок {л}}\) ПЦР за 35 циклуса за амплификацију \ (117\,\хбок {бп}\) и \(503\,\хбок { бп}\) фрагменти. Ови узорци су представљени као „1:1″, тј. без разблажења. Контрола без шаблона (НТЦ) је постављена као негативна контрола, док је постављена цДНК синтетизована коришћењем РНК изоловане из пречишћеног фага као шаблон за позитивну контролу (ПЦ). Квантитативни ПЦР (кПЦР) је изведен у Стратагене Мк3000П РТ-ПЦР инструменту користећи Бриллиант ИИИ Ултра-Фаст СИБР Греен КПЦР Мастер Мик (Агилент Тецхнологиес). Реакције су постављене у три примерка као и раније описано. Праг циклуса (Цт) је забележен за све узорке. Поред тога, разблажени узорци су \({1}\,{\упму \хбок {л}}\) коришћењем цДНК разблажене 1:100 у филтрираној језерској води као \({20}\,{\упму \хбок {л}}\) ПЦР за 35 циклуса. Ови узорци су представљени као „1:100″.
ПЦБ електроде се производе коришћењем комерцијално доступног јефтиног процеса Елецтролесс Ницкел Иммерсион Голд (ЕНИГ) без потребе за додатним позлаћењем. Спецификације ЕНИГ ПЦБ електрода су детаљно описане у нашем претходном раду11. За ЕНИГ ПЦБ електроде, традиционалне методе чишћења електрода као што су раствор пиране или циклична волтаметрија сумпорне киселине се не препоручују јер могу изазвати љуштење танког златног слоја (дебљине \(\приближно\) \(100\,\хбок {нм }\)) и открити доње слојеве бакра који су склони до корозије 21, 22, 23, 24, 25. Због тога, очистите електроде крпом која не оставља длачице навлаженом ИПА. Узорак који се тестира је инкубиран са \({50}\,{\упму \хбок {М} }\) МБ у \({4}\,{^{\цирц }\хбок {Ц}}\)\({ 1}\,{\хбок {х}}\) за лако уметање. У нашем претходном раду , приметили смо да су осетљивост и линеарност сензора побољшани повећањем концентрације МБ 11 . На основу оптимизација пријављених у нашем ранијем раду, користили смо \({50}\,{\упму \хбок {М}}\) МБ концентрације за уградњу ДНК у ову студију.Електрохемијска детекција дволанчане ДНК (дс-ДНК) се може постићи коришћењем ањонских или катјонских интеркалатора.Иако ањонски интеркалатори детектују ДНК са бољом селективношћу, захтевају инкубацију преко ноћи, што резултира дужим временом детекције. с друге стране, катјонски интеркалатори као што је МБ захтевају краће време инкубације, отприлике \({1}\,{\хбок {х}}\) за електрохемијску детекцију дс-ДНК6. Свако мерење укључује дозирање узорка који се тестира на електрода\({5}\,{{\упму \хбок {л}}}\), затим чишћење крпом навлаженом ИПА, пре него што наставите са другим узорком.једно мерење. Сваки узорак је тестиран на 5 различитих електрода осим ако није другачије наведено. ДПВ и ЦВ мерења су обављена помоћу ПалмСенс Сенсит Смарт потенциостата, а софтвер ПСТраце је коришћен за конфигурацију потенциостата и прикупљање података, укључујући прорачуне вршне струје. Користе се следећа подешавања за ДПВ и ЦВ мерења:
ДПВ: Време равнотеже = \(8\,\хбок {с}\), корак напона = \(3\,\хбок {мВ}\), импулсни напон = \(25\,\хбок {мВ}\), трајање импулса = \(50\,\хбок {мс}\), брзина скенирања = \({20}\,\хбок {мВ/с}\)
ЦВ: Време равнотеже = \(8\,\хбок {с}\), корак напона = \(3\,\хбок {мВ}\), брзина свееп = \({300}\,\хбок {мВ/ с }\)
Вршне струје добијене из волтамограма ДНК сложене са \({50}\,{\упму \хбок {М}}\) МБ: (а) \(503\,\хбок {бп}\) ДПВ , (б) \ (503\,\хбок {бп}\) ЦВ, (ц) \(117\,\хбок {бп}\) ДПВ, (д) \(117\,\хбок {бп}\) ЦВ.
ДПВ и ЦВ волтамограми су добијени на ЕНИГ ПЦБ електродама \({50}\,{\упму \хбок {М}}\) МБ комплексираним са ДНК (у концентрацијама од 10–\({20}\,{\ хбок {нг }/{\упму \хбок {л}}}\), тј. 0,13–\({0,26}\,{\упму \хбок {М}}\) за \(117\,\хбок {бп}\ ) и 0,03 –\({0,06}\,{\упму \хбок {М}}\) за \(503\,\хбок {бп}\)). Репрезентативни волтамограми су приказани на слици С1 у Додатним информацијама. Слика 2 приказује резултате ДПВ и ЦВ мерења (вршна струја) коришћењем ПЦР производа пречишћених гелом. У поређењу са ЦВ мерењима, ДПВ мерења показују већу осетљивост (струја као функција концентрације ДНК) јер позадинске капацитивне струје у ЦВ мерењима сакривају Фарадеове струје 26 .Подаци за сваку кутију у бокплот-у садржи мерења са 5 електрода. Сва мерења користе исти сет електрода да би се избегле грешке у мерењу услед варијација од електроде до електроде. Приметили смо тренд пораста у ДПВ и ЦВ измереним вршним струјама за ниже концентрације ДНК , дужи (\(503\,\хбок {бп}\)) \,\хбок {бп}\ у поређењу са \(117) ) фрагментом. Ово је у складу са очекиваним трендом адсорпције електрода који је приказан у нашем претходном раду. адсорпција МБ-ДНК комплекса олакшава пренос наелектрисања на електроди, што доприноси повећању вршне струје. Друге студије су показале утицај величине и секвенце олигонуклеотида на интеркалацију МБ-ДНК27,28,29,30.Гванин -садржај цитозина (ГЦ) у два ампликона (\(117\,\хбок {бп}\) и \(503\,\хбок {бп}\)) је био приближно 50%, што указује да је запажање разлика због до дужине ампликона. Међутим, за веће концентрације ДНК (\(>{2}\,{\хбок {нг}/{\упму \хбок {л}}}\), за \(503\,\хбок {бп} \) и \( >{10}\,{\хбок {нг}/{\упму \хбок {л}}}\) за \(117\,\хбок {бп}\)), посматрамо два појачања. вршне струје суб-а су смањене и код ДПВ и код ЦВ мерења. То је зато што МБ засићује и интеркалира између базних парова ДНК, што резултира стеричном инхибицијом редокс активности редуктивне групе у МБ31,32.
在存在 \(2\,\хбок {мМ}\) \({\хбок {МгЦл }_2}\): (а) \(503\,\хбок {бп}\) ДПВ, (б) \(503 \,\хбок {бп}\) ЦВ, (ц) \(117\,\хбок {бп}\) ДПВ，(д) \(117\,\хбок {бп}\) ЦВ。
Соли присутне у ПЦР мастер мешавинама ометају електростатичке интеракције између МБ и ДНК, па додавањем \(2\,\хбок {мМ}\) \(\хбок {МгЦл }_2\) са \({50} \,{\ упму \хбок {М}}\) МБ гел пречишћен производ за проучавање утицаја соли на интеракцију МБ-ДНК. Као што је приказано на слици 3, приметили смо да за веће концентрације ДНК (\(>{2}\,{\ хбок {нг}/{\упму \хбок {л}}}\) (503\,\хбок {бп }\) и \(>{10}\,{\хбок {нг}/{\упму \хбок { л}}}\) за \(117\,\хбок {бп} \)), у ДПВ и ЦВ Додавање соли није значајно утицало на мерења (погледајте Слику С2 у Додатним информацијама за репрезентативне волтамограме). Међутим, на ниже концентрације ДНК, додавање соли у великој мери смањује осетљивост, што резултира без значајне промене у струји са концентрацијом ДНК. Слични негативни ефекти соли на интеракције МБ-ДНК и интеркалацију су раније пријавили други истраживачи33,34.\(\хбок {). Мг}^{2+}\) катјони се везују за негативну фосфатну кичму ДНК, чиме ометају електростатичку интеракцију између МБ и ДНК. При вишим концентрацијама ДНК, стерична инхибиција редокс активних МБ доводи до нижих вршних струја, па електростатичке интеракције не утичу значајно на одговор сензора. Кључна ствар је да је овај биосензор погоднији за откривање виших концентрација ДНК (ретко \({\хбок {нг}/{\упму \хбок {л}}}\) или више), за потпуно аутоматизовану обраду узорака воде из животне средине, где пречишћавање ПЦР производа гелом можда није изводљиво.
Подручје испод криве апсорпције за опсег таласних дужина 600–700 \(\хбок {нм}\) за различите концентрације ДНК комплексиране са \({50}\,{\упму \хбок {М}}\) МБ: ( а ) \(503\,\хбок {бп}\) са и без соли (\(2\,\хбок {мМ}\) \(\хбок {МгЦл}_2\)), (б) \( 117\, \хбок {бп}\) са и без соли (\(2\,\хбок {мМ}\) \(\хбок {МгЦл}_2\)).\({0}\,{\хбок {пг}/ {\упму \хбок {л}}}\) Концентрације ДНК које одговарају \({50}\,{\упму \хбок {М}}\) МБ узорцима Нема ДНК.
Да бисмо додатно потврдили горе наведене резултате, извршили смо оптичка мерења помоћу УВ/Вис спектрофотометра (Тхермо Сциентифиц Мултискан ГО), узорци \({50}\,{{\упму \хбок {л}}}\) су коришћени за сваки Мерење. Потпис апсорпције опада са повећањем концентрације ДНК, као што се може видети из тренда површине испод апсорпционе криве за опсег таласних дужина \(600\,\хбок {нм}\) до \(700\,\хбок { нм}\), као што је приказано на слици 4 (апсорпциони спектар приказан на слици С3 у Додатним информацијама). За узорке са концентрацијом ДНК мањом од \({1}\,{\хбок {нг}/{\упму \хбок {л}}}\), није било значајне разлике у усвајању између узорака који садрже ДНК и узорака који садрже само МБ (за \(503\,\хбок {бп}\) и \(117\,\хбок {бп}\) ) дужине фрагмената), што указује на одсуство стеричне инхибиције редокс активног МБ. При вишим концентрацијама ДНК, приметили смо постепено смањење сигнала апсорпције и приметили мање смањење апсорбанције у присуству соли. Ови резултати су приписани молекуларном интеракције и стерична инхибиција са слагањем база у ДНК хибридима. Наши резултати су у складу са извештајима у литератури о спектроскопским студијама интеркалације МБ-ДНК које повезују хипохроматичност са смањеним нивоима енергије у \(\пи\)–\(\пи ^*\ ) електронски прелази услед интеркалације Слојеви 36, 37, 38.
Агарозни гел електрофореза фага Пхи6: ПЦР производи дужине \(117\,\хбок {бп}\) и \(503\,\хбок {бп}\) из узорака воде језера. М-ДНК маркер;НТЦ-но-темплате контрола, прајмери који садрже одговарајуће ампликоне;ПЦ позитивна контрола;1, 2, 3-неразређени (1:1) узорци воде језера у три примерка. Трака је видљива на \(\око 50\,\хбок {бп}\) због неискоришћених олигонуклеотида у \(503\,\) хбок {бп}\) трака.
Процењивали смо корисност сензора користећи узорке воде из језера Поваи са додацима Пхи6 фага. Концентрације РНК изоловане из узорака воде са фагом кретале су се у распону од 15,8–\({19,4}\,{\упму \хбок {г}/\хбок { мл}}\), док је за оне изоловане из пречишћених суспензија фага процењено да је РНК \({1945}\,{\упму \хбок {г}/\хбок {мл}}\) са ефикасношћу опоравка од приближно 1 %.РНА је реверзно транскрибована у цДНК и коришћена као шаблон за ПЦР и кПЦР. Величина производа је потврђена електрофорезом у агарозном гелу (Слика 5) пре тестирања са сензором. Ови узорци нису пречишћени гелом и стога садрже све компоненте ПЦР-а као као и ампликоне од интереса. Показало се да вредности Цт забележене током кПЦР (Табела 1) корелирају са концентрацијом РНК изоловане из одговарајућих узорака воде са шиљцима. Вредност Цт открива број циклуса потребних да би флуоресцентни сигнал премашују праг или позадински сигнал. Веће вредности Цт указују на ниже концентрације шаблона и обрнуто. Цт вредности НТЦ узорака су биле онолико високе колико се очекивало. Разлика у \(\приближно 3\) Цт вредности између позитивна контрола и тест узорак даље показују да сваки тест узорак има приближно 1% шаблона у поређењу са позитивном контролом. Претходно смо дискутовали да дужи ампликони доводе до боље осетљивости. Амплификација дужих фрагмената изолованих из хетерогених узорака животне средине је изазовна с обзиром на недостатке ниске концентрације вируса и разградње РНК. Међутим, са нашим протоколом за обогаћивање вирусом и ПЦР амплификационим протоколом, успели смо да успешно амплифицирамо \(503\,\хбок {бп}\) фрагмент за електрохемијски сенсинг.
Слика 6 приказује резултате електрохемијског сензора ампликона фрагмента \(503\,\хбок {бп}\), оба користећи неразблажену цДНК као шаблон (1:1) и 100 пута разблажену цДНК као шаблон (1:100) изведен ПЦР , у поређењу са НТЦ и ПЦ (погледајте Слику С4 у Додатним информацијама за репрезентативне волтамограме). Свака кутија у дијаграму на слици 6 садржи мерења из три узорка на 5 електрода. Исте електроде су коришћене за мерење свих узорака да би се избегле грешке услед електроде -Варијација на електроду. У поређењу са ЦВ мерењима, ДПВ мерења показују бољу резолуцију да би се разликовали тест и ПЦ узорци од НТЦ јер су, као што је претходно поменуто, Фарадаиц струје скривене због позадинских капацитивних струја у последњем. За дуже ампликоне, приметили смо да негативна контрола (НТЦ) је резултирала већим ЦВ и ДПВ вршним струјама у односу на позитивну контролу, док су позитивни и неразређени тест узорци показали сличне висине вршних струја ДПВ. Измерене средње и средње вредности за сваки неразређен (1:1) ) тест узорак и ПЦ могу се јасно разлучити из излаза сензора за НТЦ узорак, док је резолуција за разблажени узорак 1:100 мање изражена. За 100-струко разблаживање цДНК, нисмо приметили никакве траке током гел електрофорезе (траке нису приказане на слици 5), а одговарајуће ДПВ и ЦВ вршне струје су биле сличне онима које се очекују за НТЦ. Резултати за фрагмент \(117\,\хбок {бп}\) приказани су у Додатним информацијама. Негативни контрола је изазвала електрохемијски одговор од ПЦБ сензора због адсорпције слободног МБ на електроди и интеракције МБ са једноланчаним прајмер олигонуклеотидом. Стога, сваки пут када се узорак тестира, мора се покренути негативна контрола и вршна струја тест узорка у поређењу са вршном струјом добијеном негативном контролом да би се постигло диференцијално (релативно) мерење39,40 да би се тест узорак класификовао као позитиван или негативан.
(а) ДПВ и (б) ЦВ вршна струја за електрохемијску детекцију фрагмената \(503\,\хбок {бп}\) у узорцима воде језера. Узорци за тестирање су мерени у три примерка и упоређени са контролама без шаблона (НТЦ) и позитивне контроле (ПЦ).
Наши налази илуструју различите механизме који утичу на перформансе електрохемијских сензора за ампликоне различите дужине за различите ДНК, са концентрацијама верификованим оптичким мерењима помоћу УВ/Вис спектрофотометра. Наша запажања наглашавају увид да дужи фрагменти ДНК до \(\приближно\) \(500\,\хбок {бп}\) може да се детектује са већом осетљивошћу и да присуство соли у узорку не утиче на осетљивост концентрације ДНК што утиче на већу осетљивост (ретко \({\хбок {нг}/{\упму \хбок {л}}}\) и изнад). Поред тога, истражили смо ефекат различитих типова узорака, укључујући ампликоне пречишћене гелом са и без додане соли, и додавање узорака језерске воде у ДПВ и ЦВ мерењима.Приметили смо да ДПВ обезбеђује бољу резолуцију, пошто позадинска капацитивна струја такође утиче на ЦВ мерење, чинећи га мање осетљивим.
Амплификација дужих фрагмената зависи од интегритета вирусне геномске РНК. Неколико студија је показало да амплификација дужих фрагмената није увек ефикасна због деградације РНК у окружењу и потенцијала за спајање током изолације11,41,42,43,44 Приметили смо да је метода концентрације вируса заснована на ПЕГ била ефикаснија у концентрисању фага Пхи-6 убаченог у узорке воде језера од методе концентрације вируса на бази алуминијум хидроксида. Показало се да је способност детекције дугих ДНК фрагмената превазишла захтев за мултиплекс ПЦР да појача више шаблона краће дужине и смањи могућност унакрсне специфичности.
Биолошки узорци су ретки, тако да постоји потреба да се дизајнира биосензор који захтева минималне узорке за тестирање. ЕНИГ ПЦБ електроде коришћене у овој студији захтевале су само \({5}\,{{\упму \хбок {л}}}\ ) узорци за тестирање како би се покрила ефективна површина електрода. Поред тога, иста електрода се може поново употребити након чишћења пре давања следећег узорка. Појачани узорци не захтевају додавање других хемикалија осим метиленског плавог, које је јефтино и уобичајено коришћена хемикалија. Пошто свака електрода кошта око 0,55 долара (или 40 ИНР) за производњу, овај биосензор може бити исплатива алтернатива постојећим технологијама детекције. Табела 2 показује поређење овог рада са другим сензорима који су дуго пријављени у литератури. ДНК фрагменти у хетерогеним узорцима.
С обзиром на то да се протоколи за електрохемијску детекцију засновани на МБ ослањају на специфичност ПЦР-а, главно ограничење ове методе је потенцијал за неспецифично појачавање у хетерогеним узорцима као што су отпадна вода и вода језера или коришћење прајмера ниске чистоће. Да би се побољшала осетљивост електрохемијске методе детекције за детекцију ДНК непречишћених ПЦР производа коришћењем немодификованих ЕНИГ ПЦБ електрода, неопходно је боље разумети грешке које уносе неискоришћени дНТП и прајмери, као и оптимизовати реакционе услове и протоколе анализе. Додатни физичко-хемијски параметри као што су пХ, температура и биолошки Потреба за кисеоником (БОД) узорка воде ће такође можда морати да се измери да би се побољшала тачност мерења.
У закључку, предлажемо јефтин електрохемијски ЕНИГ ПЦБ сензор за детекцију вируса у узорцима животне средине (вода језера). За разлику од имобилизованих олигонуклеотидних електрода или прилагођених супстрата за ДНК сенсинг који захтевају криогено складиштење да би се одржала осетљивост,53,54 наша техника користи немодификовани ПЦБ електроде са дужим роком трајања и без посебних захтева за складиштење и стога погодне за развој решења за мерење са аутоматизованом обрадом узорака примењеном у ЛМИЦс. Биосензор користи јефтине редокс боје (МБ) које интеркалирају ДНК за брзо откривање циљних ампликона. Неспецифично појачање уобичајен у узорцима животне средине смањује специфичност ове методе сенсинга због неспецифичног везивања МБ за једноланчане и дволанчане олигонуклеотиде. Према томе, специфичност овог теста зависи од оптимизације прајмера и услова ПЦР реакције. Поред тога, ЦВ и ДПВ вршне струје добијене из тестираних узорака треба да се тумаче у односу на одговоре добијене од негативне контроле (НТЦ) за сваки тест. Дизајн и методе електрохемијских сензора представљени у овом раду могу се интегрисати са аутоматским узорцима да би се развила потпуно аутоматизована и ниска -ценовно решење које може да прикупља и анализира узорке и бежично преноси резултате назад у лабораторију.
Цасхдоллар, Ј. & Вимер, Л. Методе за почетну концентрацију вируса из узорака воде: преглед и мета-анализа недавних студија.Ј.Примена.микроорганизам.115, стр. 1-11 (2013).
Галл, АМ, Маринас, БЈ, Лу, И. & Схислер, ЈЛ Вируси који се преносе водом: баријере за сигурну воду за пиће. ПЛоС Патхогенс.11, Е1004867 (2015).
Схрестха, С. ет ал. Епидемиологија отпадних вода за исплативо велико праћење ЦОВИД-19 у земљама са ниским и средњим дохотком: изазови и могућности. Вода 13, 2897 (2021).
Палецек, Е. & Бартосик, М. Нуцлеиц ацид елецтроцхемистри.Цхемицал.Рев.112, 3427–3481 (2012).
Тани, А., Тхомсон, АЈ & Бутт, ЈН Метиленско плаво као електрохемијски дискриминатор једноланчаних и дволанчаних олигонуклеотида имобилисаних на златним супстратима. Аналитичар 126, 1756–1759 (2001).
Вонг, ЕЛ, Ерохкин, П. & Гоодинг, ЈЈ Поређење интеркалатора катјона и ањона за електрохемијску трансдукцију хибридизације ДНК помоћу преноса електрона великог домета.Елецтроцхемистри.цомминицате.6, 648–654 (2004).
Вонг, ЕЛ & Гоодинг, ЈЈ Пренос набоја кроз ДНК: селективни електрохемијски ДНК биосензор.анус.Цхемицал.78, 2138–2144 (2006).
Фанг, ТХ ет ал. ПЦР микрофлуидни уређај у реалном времену са истовременом електрохемијском детекцијом.биолошки сензор.Биоелектроника.24, 2131–2136 (2009).
Вин, БИ ет ал. Проучавање механизма сигнализације и верификација перформанси електрохемијског ПЦР система у реалном времену заснованог на интеракцији метиленског плавог са ДНК. Аналитичар 136, 1573–1579 (2011).
Рамирез-Цхаварриа, РГ ет ал. Петља-посредована изотермна амплификација заснована на електрохемијском сензору за детекцију сарс-цов-2 у узорцима отпадне воде.Ј.Енвиронмент.Цхемицал.Бритаин.10, 107488 (2022).
Кумар, М. ет ал.Електрохемијско сенсинг САРС-ЦоВ-2 ампликона са ПЦБ електродама. Сензор је активиран.Б Цхемистри.343, 130169 (2021).
Китамура, К., Садамасу, К., Мураматсу, М. & Иосхида, Х. Ефикасно откривање САРС-ЦоВ-2 РНК у чврстој фракцији отпадних вода.наука.опште окружење.763, 144587 (2021).
Алигизакис, Н. ет ал. Аналитичке методе за откривање САРС-ЦоВ-2 у отпадним водама: Протокол и будуће перспективе. ТраЦ трендинг анал.Цхемицал.134, 116125 (2020).
Федоренко, А., Гринберг, М., Ореви, Т. & Касхтан, Н. Опстанак бактериофага са омотачем Пхи6 (сурогат за САРС-ЦоВ-2) у испареним капљицама пљувачке депонованим на стакленим површинама.сциенце.Реп.10, 1–10 (2020).
Деи, Р., Длусскаиа, Е. & Асхболт, Њ Еколошка постојаност сурогата САРС-ЦоВ-2 (Пхи6) у слободно живећој амеби.Ј.Здравље воде 20, 83 (2021).
Миндицх, Л. Прецизно паковање три геномска фрагмента дволанчаног РНК бактериофага\(\варпхи\)6.мицроорганисм.Мооре.биологи.Рев.63, 149–160 (1999).
Пирттимаа, МЈ & Бамфорд, Секундарна структура региона паковања ДХ РНК фага\(\варпхи\)6.РНА 6, 880–889 (2000).
Бонилла, Н. ет ал. Фаги на славину – Брз и ефикасан протокол за припрему лабораторијских залиха бактериофага. ПеерЈ 4, е2261 (2016).
Време поста: 27.05.2022