Nature.com වෙත පිවිසීම ගැන ඔබට ස්තුතියි.ඔබ භාවිතා කරන බ්රවුසර අනුවාදය CSS සඳහා සීමිත සහයක් ඇත.හොඳම අත්දැකීම සඳහා, අපි ඔබට යාවත්කාලීන බ්රවුසරයක් (හෝ Internet Explorer හි ගැළපුම් ප්රකාරය අක්රිය කරන්න) භාවිතා කරන ලෙස නිර්දේශ කරමු. ඒ අතරතුර, සහතික කිරීමට අඛණ්ඩ සහාය, අපි මෝස්තර සහ JavaScript නොමැතිව වෙබ් අඩවිය පෙන්වමු.
COVID-19 වසංගතයේ ආරම්භයේ සිටම පාරිසරික සාම්පල නිරීක්ෂණය කිරීමේ වැදගත්කම බෙහෙවින් අගය කර ඇති අතර, qPCR මත පදනම් වූ තාක්ෂණික ක්රම මිල අධික වුවද, සමහර නිරීක්ෂණ උත්සාහයන් රන් ප්රමිතිය භාවිතා කරමින් සිදු කෙරේ. විද්යුත් රසායනික DNA ජෛව සංවේදක මගින් ලාභදායී විය හැකිය. අඩු සහ මධ්යම ආදායම් ලබන රටවල පාරිසරික ජල සාම්පල නිරීක්ෂණය කිරීම සඳහා වූ විසඳුම. මෙම කාර්යයේදී, අපි ENIG භාවිතයෙන් උල් සහිත විල් ජල සාම්පලවලින් (SARS-CoV-2 සඳහා ජනප්රිය ආදේශකයක්) හුදකලා කරන ලද Phi6 phage වෙතින් ලබාගත් ඇම්ප්ලිකන් වල විද්යුත් රසායනික හඳුනාගැනීම ප්රදර්ශනය කරමු. මතුපිට වෙනස් කිරීමකින් තොරව PCB ඉලෙක්ට්රෝඩ සම්පූර්ණ කිරීමට.ලිංගිකත්වය.විද්යුත් රසායනික සංවේදක ප්රතිචාරය විවිධ දිග (\({117}\,\hbox {bp}\) සහ \({503}\,\hbox {bp}\)) DNA කොටස් දෙකක් සඳහා හොඳින් සංලක්ෂිත විය. PCR ප්රධාන මිශ්රණයේ ලවණවල බලපෑම මෙතිලීන් නිල් (MB)-DNA අන්තර්ක්රියා මත සිදුවේ. අපගේ ප්රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ DNA කොටස්වල දිග විද්යුත් රසායනික සංවේදිතාව සැලකිය යුතු ලෙස තීරණය කරන අතර PCR නිෂ්පාදනවල ජෙල් පිරිසිදු කිරීමකින් තොරව දිගු ඇම්ප්ලිකන් හඳුනාගැනීමේ හැකියාව මෙම කාර්යයේදී පෙන්නුම් කරන බවයි. ජල සාම්පල ස්ථානීය මිනුම් සඳහා වැදගත් වේ.වෛරස් පැටවීම සඳහා සම්පූර්ණයෙන්ම ස්වයංක්රීය විසඳුමක් හොඳයි.
පෝලියෝ සහ හෙපටයිටිස් E1 ජලයෙන් සම්ප්රේෂණය වන බවට පළමු සාක්ෂිය සමඟින් 1940 ගණන්වල සිට ජලයෙන් සම්ප්රේෂණය වන වෛරස් සම්ප්රේෂණය මහජන සෞඛ්ය උවදුරක් ලෙස හැඳින්වේ. ලෝක සෞඛ්ය සංවිධානය (WHO) මධ්යස්ථ හා ඉහළ සෞඛ්ය වැදගත්කමක් ඇති ජලයෙන් සම්ප්රේෂණය වන වෛරස් රෝග කාරක කිහිපයක් වර්ගීකරණය කර ඇත2. සම්ප්රදායික වෛරස් හඳුනාගැනීමේ ක්රම රන්-සම්මත qPCR-පාදක තාක්ෂණික ක්රම මත රඳා පවතී, ඒවා ඉතා සංවේදී සහ විශේෂිත නමුත් මිල අධික උපකරණ භාවිතයෙන් රසායනාගාරයේදී පරීක්ෂා කිරීමට දක්ෂ පුද්ගලයින් අවශ්ය වේ.කෙසේ වෙතත්, සීමිත සම්පත් සහිත අඩු සහ මධ්යම ආදායම් ලබන රටවල (LMICs) මානව පාරිසරික ජල සාම්පල අධීක්ෂණයට වඩා නියැදි පරීක්ෂණය ප්රමුඛත්වය ගැනීමට ඉඩ ඇත. එබැවින්, නැගී එන රෝග පැතිරීම් පිළිබඳ පූර්ව අනතුරු ඇඟවීම් ලෙස අඩු සහ මධ්යම ආදායම් ලබන රටවල ජලය සහ අපජල සාම්පල තිරසාර, තත්ය කාලීන නිරීක්ෂණය සඳහා විකල්ප අඩු වියදම් ක්රම අවශ්ය වේ. එමගින් වෛරස් වසංගතයේ බරපතල සමාජ ආර්ථික බලපෑම් වලින් ඔවුන්ව ආරක්ෂා කරයි. න්යෂ්ටික අම්ල සඳහා අඩු වියදම් විද්යුත් රසායනික ජෛව සංවේදක මෙම අසම්පූර්ණ අවශ්යතාවයට හොඳ විභව විසඳුමක් සැපයිය හැකිය. මෙම DNA ජෛව සංවේදක බොහෝමයක් ක්රියා කරන්නේ අනුපූරක DNA නූල් ඉලෙක්ට්රෝඩය මත නිශ්චල වී ඇති බැවිනි. නියැදියේ ගැළපෙන අනුක්රමයක් ඇති විට මතුපිට සහ දෙමුහුන් කරන්න. මෙය පසුව පොටෑසියම් යකඩ/ෆෙරෝසයනයිඩ් වැනි රෙඩොක්ස් මැදිහත්කරුවන් භාවිතයෙන් විවිධ විද්යුත් රසායනික ක්රම මගින් සංඥාවක් බවට පරිවර්තනය කළ හැක. මෙතිලීන් නිල් (MB) යනු එවැනි රෙඩොක්ස්-ක්රියාකාරී අණුවකි. තනි කෙඳි DNA5,6 සමඟ වඩාත් නිශ්චිත නොවන බන්ධනයට අමතරව ද්විත්ව නූල් DNA (dsDNA) බවට අන්තර් සම්බන්ධිත බව වාර්තා වී ඇත. MB-DNA සංකීර්ණ සෑදීම සඳහා MB වල අන්තර් සම්බන්ධක ස්වභාවය ඒවා විද්යුත් රසායනික DNA කිහිපයක රෙඩොක්ස් මැදිහත්කරුවන් ලෙස ජනප්රිය තේරීමක් කරයි. සංවේදක වින්යාසයන් 5,6,7,8,9. MB සිට DNA දක්වා අන්තර් සම්බන්ධ කිරීම නිශ්චිත නොවන අතර, මෙම විද්යුත් රසායනික සංවේදකයේ විශේෂත්වය PCR හෝ isothermal විස්තාරණය සඳහා භාවිතා කරන ප්රයිමර්වල සංශුද්ධතාවය මත බොහෝ දුරට රඳා පවතී, එය සැබෑ ක්රියාවට නැංවීම සඳහා හොඳින් ගැලපේ. -කාල විද්යුත් රසායනික මත පදනම් වූ qPCR හෝ ප්රතිදීප්ත සමෝෂ්ණ විස්තාරණය DNA සාන්ද්රණය මැනීම සඳහා විකල්පයක් ලෙස 9 .එවැනි එක් ක්රියාත්මක කිරීමකදී, Won et al. රන් ඉලෙක්ට්රෝඩවල මතුපිට තත්ය කාලීන සඳහා 6-mercapto-1-hexanol (MCH) සමඟ වෙනස් කරන ලදී. අවකල්ය ස්පන්දන වෝල්ටමිතිය (DPV) භාවිතයෙන් MB සමඟ PCR ඇම්ප්ලිකන් මැනීම 9. වෙනත් අවස්ථාවල දී, Ramirez et al. තිර මුද්රිත ඉලෙක්ට්රෝඩ සහිත MB භාවිතයෙන් RT-LAMP ප්රතික්රියාව මගින් අපජලයේ SARS-CoV-2 හඳුනා ගැනීම. ප්ලැටිනම් ඉලෙක්ට්රෝඩ ද සිදු කර ඇත. ප්රතික්රියා වලදී විද්යුත් රසායනිකව ඇම්ප්ලිකන් හඳුනාගැනීම සඳහා නිර්මාණය කර ඇති ක්ෂුද්ර තරල PCR වේදිකාවක ස්ථානීය ඉලෙක්ට්රෝඩවල මෙන් භාවිතා වේ 8 .මෙම අධ්යයනයන් සියල්ලටම ඉලෙක්ට්රෝඩ මතුපිට වෙනස් කිරීම අවශ්ය වන අතර, මෙම ක්රියාකාරී ඉලෙක්ට්රෝඩවල ස්ථායීතාවය සඳහා විශේෂ ගබඩා අවශ්යතා හේතුවෙන් නිෂ්පාදන හා මෙහෙයුම් පිරිවැය වැඩි වේ.
විල් ජල සාම්පලවල සාන්ද්රිත වෛරස් අංශු වලින් ලබාගත් ඇම්ප්ලිකන් විද්යුත් රසායනික හඳුනාගැනීම සඳහා කාර්ය ප්රවාහයේ යෝජනා ක්රමය.
අපි මෑතකදී SARS-CoV-2 ඇම්ප්ලිකන් වල විද්යුත් රසායනික සංවේදනය DPV මත පදනම් වූ අඩු වියදම් මුද්රිත පරිපථ පුවරුව (PCB) ඉලෙක්ට්රෝඩ සහ චක්රීය වෝල්ටමිට්රි (CV) මත පදනම් වූ වෙනස් නොකළ ඉලෙක්ට්රෝඩවල මතුපිට MB-DNA සංකීර්ණවල අධිශෝෂණය මගින් ප්රේරණය කරන ලද වෙනස්වීම් පෙන්නුම් කළෙමු. ධාරාව11.කෙටි කොටස් {bp}\) සමඟ සසඳන විට CDC-නිර්දේශිත N1 ඉදිරියට සහ N2 ප්රතිලෝම ප්රයිමර් භාවිතයෙන් සාදන ලද දිගු DNA කොටස් (N1-N2, \({943}\, \hbox) සංවේදක ප්රතිචාරයේ වඩා හොඳ රේඛීයතාවයක් පෙන්නුම් කළ බව අපි වාර්තා කරමු. (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) N1 ඉදිරි සහ N1 ප්රතිලෝම ප්රයිමර් කට්ටල භාවිතයෙන් සාදන ලදී. මෙම අධ්යයනයන් වාර්තා වන්නේ න්යෂ්ටික රහිත ජලයේ සකස් කරන ලද DNA තනුක භාවිතා කරමිනි. SARS-CoV හඳුනා ගැනීම සඳහා වේදිකාව භාවිතා කරන ලදී. සිමියුලේටඩ් අපජල සාම්පලවල -2 ඇම්ප්ලිකන් (SARS-CoV-2 RNA සමඟ සම්පූර්ණ RNA සාම්පල ස්පයික් කිරීමෙන් ලබා ගනී). හුදකලා කිරීමේදී සහ පහළට සැකසීමේදී RNA කැපීමට ගොදුරු විය හැකි බැවින්, 12,13 මෙම විෂම සාම්පලයෙන් දිගු කොටස් විස්තාරණය කිරීම අපහසුය. එබැවින්, අපජලයේ SARS-CoV-2 ඇම්ප්ලිකන් වල විද්යුත් රසායනික සංවේදනය නිරූපණය කිරීම කෙටි \(72\,\hbox {bp}\) N1 කොටසට සීමා වේ.
මෙම කාර්යයේදී, අපි ENIG PCB මත පදනම් වූ විද්යුත් රසායනික සංවේදනයේ ශක්යතා විමර්ශනය කළෙමු Phage Phi6 සාන්ද්රණය කර විල් ජල සාම්පල වලින් වෙන් කර ඇත (රූපය 1).Phi6 phages ප්රමාණයෙන් (80-100 nm) SARS-CoV-2 හා සැසඳිය හැක. ලිපිඩ පටලයක් සහ ස්පයික් ප්රෝටීනයක් ද ඇත. මෙම හේතූන් නිසා, bacteriophage Phi6 යනු SARS-CoV-2 සඳහා ජනප්රිය ආදේශකයක් වන අතර අනෙකුත් ආවරණය කරන ලද ව්යාධිජනක RNA වෛරස් 14,15. PHage අංශු වලින් හුදකලා වූ RNA cDNA සංස්ලේෂණය සඳහා අච්චුවක් ලෙස භාවිතා කරන ලදී. 117 සහ 503 පාදක යුගල දිග DNA කොටස් දෙකක් ලබා ගැනීමට PCR. අපගේ පෙර කාර්යයේදී \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 කොටස් විස්තාරණය කිරීමේ අභියෝගයට අනුව, අපි අතරමැදි දිග කොටස් (\(117) ඉලක්ක කරමු. \,\hbox {bp}\) සහ \(503 \,\hbox {bp}\)), පවතින ප්රයිමර් මත පදනම්ව. විද්යුත් රසායනික සංවේදක ප්රතිචාරය පුළුල් සාන්ද්රණ පරාසයක් (\({10}\,{) ක්රමානුකූලව අධ්යයනය කරන ලදී. \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) සිට \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) කොටස් දෙකටම MB හි පැවතීම, සංවේදක ප්රතිචාරය මත ලුණු වල බලපෑම වර්ණාවලීක්ෂ ඡායාමිතික මිනුම් මගින් සංලක්ෂිත කර හරස් වලංගු කර ඇත. මෙම කාර්යයේ ප්රධාන දායකත්වය පහත පරිදි වේ:
DNA ඛණ්ඩකයේ දිග සහ නියැදියේ ලුණු තිබීම සංවේදීතාවයට දැඩි ලෙස බලපායි.අපගේ ප්රතිපල පෙන්නුම් කරන්නේ ඩීඑන්ඒ සාන්ද්රණය සහ දිග මත පදනම්ව, වෝල්ටමිතික ප්රතිචාරයේ MB, DNA සහ සංවේදකයේ අන්තර් ක්රියාකාරිත්වයේ විවිධ යාන්ත්රණයන් මත විද්යුත් රසායනික ක්රියාකාරකම් රඳා පවතින බවයි, දිගු කොටස් සමඟ වැඩි සංවේදීතාවයක් පෙන්නුම් කරයි, නමුත් ලුණු අතර විද්යුත් ස්ථිතික අන්තර්ක්රියා කෙරෙහි ඍණාත්මක බලපෑමක් ඇති කරයි. MB සහ DNA.
DNA සාන්ද්රණය වෙනස් නොකළ ඉලෙක්ට්රෝඩවල MB-DNA අන්තර්ක්රියා යාන්ත්රණය තීරණය කරයි MB-DNA අන්තර්ක්රියා වල විවිධ යාන්ත්රණයන් DNA සාන්ද්රණය මත රඳා පවතින බව අපි පෙන්නුම් කරමු. DNA සාන්ද්රණයේදී \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox කුඩා ප්රමාණයකට වඩා අඩුවෙන් {l}}}\), විද්යුත් රසායනික ධාරා ප්රතිචාරය ප්රධාන වශයෙන් තීරණය වන්නේ ඉලෙක්ට්රෝඩය මත MB-DNA අවශෝෂණය කිරීම මගින් බව අපි නිරීක්ෂණය කළ අතර අඩු සාන්ද්රණයකදී ඉහළ DNA සාන්ද්රණයකදී, විද්යුත් රසායනික ධාරා ප්රතිචාරය තීරණය වන්නේ රෙඩොක්ස් හි ස්ටීරික් නිෂේධනය මගිනි. DNA පාදක යුගල අතර MB ඇතුළත් කිරීම හේතුවෙන් ක්රියාකාරකම්.
ENIG PCB මත පදනම් වූ ලේක් ජල සාම්පලවල වෛරස් න්යෂ්ටික අම්ල පිළිබඳ විද්යුත් රසායනික සංවේදනය Powai Lake, IIT මුම්බායි කැම්පස් වෙතින් ජල සාම්පලවලින් ලබාගත් Phi6-එකතු කරන ලද \(503\,\hbox {bp}\) DNA කොටස් විද්යුත් රසායනික හඳුනා ගැනීමෙන් නිරීක්ෂණ වලංගු විය. ප්රතිඵල ෆේජ්.
ක්රියාත්මක කිරීමේ අඩු පිරිවැය සහ සම්පූර්ණ ස්වයංක්රීය අධීක්ෂණ පද්ධති, ඔලිගොනියුක්ලියෝටයිඩ හෝ දිගු කල් පවතින ඉලෙක්ට්රෝඩ මත ඇප්ටැමර් සමඟ ඒකාබද්ධ වීමේ හැකියාව.
Phage Phi6 යනු Pseudomonas syringae ආසාදනය කරන Cytoviridae පවුලේ ආවරණය කරන ලද dsRNA වෛරසයකි. Phi6 phage වල ජෙනෝමය කොටස් 3ක ස්වරූපයෙන් පවතී: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) සහ L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Phi6 phage ව්යාධිජනක නොවන BSL-1 Pseudomonas වික්රියාවක් ආසාදනය කරන බැවින්, එය භාවිතා කිරීම ආරක්ෂිත වේ. සහ රසායනාගාරයේ පහසුවෙන් වගා කළ හැක. Phage Phi6 සහ එහි සත්කාරක Pseudomonas syringae කැනඩාවේ Laval විශ්වවිද්යාලයේ බැක්ටීරියා වෛරස් සඳහා Felix d'Herelle විමර්ශන මධ්යස්ථානයෙන් මිලදී ගන්නා ලදී (යොමු මධ්යස්ථාන නාමාවලිය අංක පිළිවෙලින් HER-102 සහ HER-1102 වේ) .Phi6 phage සහ එහි ධාරකය සමුද්දේශ මධ්යස්ථානය විසින් නියම කරන ලද පරිදි ප්රබෝධමත් කරන ලදී. Phage Phi6 \(\ 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { සමඟින් අවසාන ටයිටර ලබා ගැනීම සඳහා තහඩු ලයිසිස් සහ elution මගින් පිරිසිදු කරන ලදී. මිලි. 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) lysed කර ඇති අතර, RNA දුම්මල තීරුවට බැඳීමට ඉඩ දීම සඳහා ලයිසේට් කැරකෙන තීරුවකට පටවනු ලැබීය. පසුව RNA elution ද්රාවණයෙන් ඉවත් කරනු ලැබේ \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) කට්ටලය මඟින් සපයනු ලැබේ. \(260\,\hbox {nm}\) දී අවශෝෂණය මගින් RNA සාන්ද්රණය තක්සේරු කරන්න. RNA ගබඩා කර ඇත්තේ \ හි ඇල්කොට් වලය. ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) වැඩිදුර භාවිතය තෙක්.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA සංශ්ලේෂණ කට්ටලය (Bio -Rad Laboratories) නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව cDNA සංස්ලේෂණය සඳහා අච්චුවක් ලෙස භාවිතා කරන ලදී. කෙටියෙන්, cDNA සංස්ලේෂණ ප්රතික්රියාවක් පියවර 3 කින් සමන්විත වේ: \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , \({20}\,{\hbox {min}}\) හි ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීම \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), සහ ප්රතිලෝම රෙකෝඩරය \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) තුළ \({1}\,{\hbox {min }}\).1% ඇගරෝස් ජෙල් මත ධාවනය කරන විට, cDNA අපේක්ෂිත RNA කොටස් තුනට අනුරූප වන පටි තුනක් පෙන්නුම් කළේය (දත්ත පෙන්වා නැත). 117 සහ 503 bp දිග DNA කොටස් දෙකක් වර්ධක කිරීමට පහත ප්රාථමික භාවිතා කරන ලදී. miniPCR® mini8 තාප චක්රයක PCR සඳහා අච්චුවක් ලෙස cDNA භාවිතා කිරීම:
\(117\,\hbox {bp}\) සහ \(503\,\hbox {bp}\) සඳහා වන ප්රාථමිකයන් M කොටසේ 1476-1575 නියුක්ලියෝටයිඩ වලට සහ L කොටසේ 458-943 නියුක්ලියෝටයිඩ වලට අනුරූප වේ. .සියලු විස්තාරණය කරන ලද PCR නිෂ්පාදන 1% ඇගරෝස් ජෙල් මත විද්යුත් විච්ඡේදනය කරන ලද අතර, GeneJET Gel නිස්සාරණ කට්ටලය (Thermo Fisher Scientific) භාවිතයෙන් වර්ධක ඉලක්කගත DNA පිරිසිදු කරන ලදී.
IIT මුම්බායි කැම්පස් හි වැවක් (Pawai Lake, Powai, Mumbai) ෆේජ් අංශු එකතු කිරීමට භාවිතා කරන ලදී. විල් ජලය ඉවත් කිරීමට \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) පටලයක් හරහා පෙරන ලදී. අත්හිටුවන ලද අංශු, පසුව Phi6 phage එකතු කරන ලදී. \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} හි \({1}\,{\hbox {ml}}\) එකතු කරන්න \) සිට \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) පෙරන ලද විල් ජලය, \({4}\,{^{\crcle}\hbox {C}}\).කුඩා ඇල්කෝට් එකක් විය සමරු ඵලක විශ්ලේෂණය මගින් වෛරස් බර මැනීම සඳහා වෙන් කර ඇත. උල් වූ Phi6 වයිරස් අංශු සාන්ද්රණය කිරීමට අපි විවිධ ක්රම දෙකක් පරීක්ෂා කළෙමු: (1) ඇලුමිනියම් හයිඩ්රොක්සයිඩ් අවශෝෂණ-වර්ෂාපතන ක්රමය, 19 පාරිසරික සාම්පල වලින් ආවරණය කරන ලද RNA වෛරස් සාන්ද්රණය සඳහා වලංගු කර ඇත, සහ (2) ) පොලිඑතිලීන් ග්ලයිකෝල් (PEG) මත පදනම් වූ වෛරස් සාන්ද්රණ ක්රමය Flood et al වෙතින් අනුවර්තනය කරන ලදී.20 .PEG-පාදක ක්රමයේ ප්රතිසාධන කාර්යක්ෂමතාව ඇලුමිනියම් හයිඩ්රොක්සයිඩ් ක්රමයට වඩා හොඳ බව සොයා ගත් බැවින්, වැව් ජල සාම්පල වලින් Phi6 අංශු සාන්ද්රණය කිරීමට PEG-පාදක ක්රමය භාවිතා කරන ලදී.
භාවිතා කරන ලද PEG ක්රමය පහත පරිදි වේ: 8 % PEG 8000 සහ \(0.2\,\hbox {M} \) \(Phi6-උල් සහිත විල් ජල සාම්පල වෙත PEG 8000 සහ \(\hbox {NaCl}\) එකතු කරන ලදී. \ hbox {NaCl}\).සාම්පල ෂේකර් එකක් මත ඉන්කියුබේට් කර ඇත\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), පසුව \(4700 \,\hbox {g}\) හිදී කේන්ද්රාපසාරී කර ඇත්තේ \({45}\,{\hbox {min}}\) වේ.උපරිනාටකය ඉවතලන්න සහ \({1}\, තුළ පෙත්ත නැවත සවි කරන්න. {\hbox {ml}}\) එකම අධි ප්රවනතාවයේ.සියලු ස්පයිකින් සහ වෛරස් සාන්ද්රණ පරීක්ෂණ ත්රිත්ව සිදු කරන ලදී.සාන්ද්රණයෙන් පසුව, ප්රතිසාධන කාර්යක්ෂමතාව මැනීම සඳහා කුඩා ඇල්කොට් එකක් ඵලක විශ්ලේෂණය මගින් වෙන් කරන ලදී.RNA කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි හුදකලා කරන ලදී. කට්ටලය සැපයූ elution buffer හි\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\).RNA සාන්ද්රණය නියැදියෙන් නියැදියට තුන් ගුණයකින් වෙනස් වන බැවින්, \({2}\,{\upmu \ RNA හි hbox {l}}\) සාම්පල cDNA සාන්ද්රණය නොසලකා තුනටම භාවිතා වේ.cDNA සංස්ලේෂණය කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි සිදු කරන ලදී.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR සඳහා චක්ර 35ක් සඳහා \ (117\,\hbox {bp}\) සහ \(503\,\hbox { සඳහා අච්චුවක් ලෙස භාවිතා කරන ලදී. bp}\) කොටස්.මෙම සාම්පල “1:1″, එනම් තනුක කිරීමකින් තොරව නිරූපනය කෙරේ. සැකිලි රහිත පාලනයක් (NTC) සෘණ පාලනයක් ලෙස සකසා ඇති අතර, පිරිසිදු කරන ලද phage වලින් හුදකලා වූ RNA භාවිතයෙන් cDNA සංස්ලේෂණය කරන ලදී. ධනාත්මක පාලනයක් (PC) සඳහා අච්චුවක් ලෙස.Quantitative PCR (qPCR) Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies) භාවිතයෙන් Stratagene Mx3000P RT-PCR උපකරණයක් තුළ සිදු කරන ලදී. ප්රතික්රියා පෙර පරිදි තුන් ගුණයකින් සකසා ඇත. විස්තර කර ඇත.සියලු සාම්පල සඳහා චක්ර සීමාව (Ct) සටහන් කර ඇත. ඊට අමතරව, තනුක කළ සාම්පල \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) ලෙස පෙරන ලද විල් ජලයේ cDNA තනුක 1:100 භාවිතා කර ඇත. \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) චක්ර 35ක් සඳහා PCR. මෙම සාම්පල “1:100″ ලෙස නිරූපණය කෙරේ.
PCB ඉලෙක්ට්රෝඩ නිපදවා ඇත්තේ අමතර රන් ආලේපනයක් අවශ්ය නොවී වාණිජමය වශයෙන් ලබාගත හැකි අඩු වියදම් විද්යුත් රහිත නිකල් ගිල්වීමේ රන් (ENIG) ක්රියාවලියක් භාවිතා කරමිනි.ENIG PCB ඉලෙක්ට්රෝඩ පිරිවිතර අපගේ පෙර වැඩ වලදී විස්තර කර ඇත11. ENIG PCB ඉලෙක්ට්රෝඩ සඳහා, සම්ප්රදායික ඉලෙක්ට්රෝඩ පිරිසිදු කිරීමේ ක්රම වැනි piranha ද්රාවණය හෝ සල්ෆියුරික් අම්ල චක්රීය වෝල්ටමිට්රි නිර්දේශ නොකරයි. විඛාදනයට 21, 22, 23, 24, 25. එබැවින්, IPA සමඟ තෙත් කරන ලද ලින්ට් රහිත රෙදි කඩකින් ඉලෙක්ට්රෝඩ පිරිසිදු කරන්න. පරීක්ෂා කළ යුතු නියැදිය \({50}\,{\upmu \hbox {M}) }\) \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) තුළ MB. අපගේ පෙර වැඩ වලදී , අපි MB සාන්ද්රණය 11 වැඩි කිරීමෙන් සංවේදකයේ සංවේදිතාව සහ රේඛීයත්වය වැඩි දියුණු කර ඇති බව නිරීක්ෂණය කළෙමු .අපගේ පෙර වැඩ වලදී වාර්තා කරන ලද ප්රශස්තකරණයන් මත පදනම්ව, අපි \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB භාවිතා කළෙමු. මෙම අධ්යයනයේ DNA කාවැද්දීම සඳහා සාන්ද්රණයන්. ද්විත්ව කෙඳි DNA (ds-DNA) විද්යුත් රසායනික හඳුනාගැනීම ඇනොනික් හෝ කැටානික අන්තර් කැලේටර භාවිතයෙන් ලබා ගත හැක. ඇනෝනික් අන්තර්කලේටරයන් වඩා හොඳ තෝරා ගැනීමේ හැකියාවකින් DNA හඳුනා ගත්තද, ඒවාට එක රැයකින් පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කිරීම අවශ්ය වන අතර, එහි ප්රතිඵලයක් ලෙස දිගු හඳුනාගැනීමේ කාලයක් ලැබේ. අනෙක් අතට, MB වැනි කැටායන අන්තර් කැලේටරවලට ds-DNA6 හි විද්යුත් රසායනික හඳුනාගැනීම සඳහා ආසන්න වශයෙන් \({1}\,{\hbox {h}}\) කෙටි ඉන්කියුබේෂන් කාල අවශ්ය වේ. ඉලෙක්ට්රෝඩය\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), පසුව වෙනත් සාම්පලයක් සමඟ ඉදිරියට යාමට පෙර, IPA-තෙතමනය කරන ලද කඩමාල්ලකින් පිරිසිදු කිරීම.එක් මිනුමකි.එක් එක් නියැදිය වෙනත් ඉලෙක්ට්රෝඩ 5ක් මත වෙනත් ආකාරයකින් ප්රකාශ නොකළහොත් පරීක්ෂා කරන ලදී.DPV සහ CV මිනුම් PalmSens Sensit Smart potentiostat භාවිතයෙන් සිදු කරන ලද අතර, PSTrace මෘදුකාංගය උපරිම ධාරා ගණනය කිරීම් ඇතුළුව පොටෙන්ටියෝස්ටැට් වින්යාස කිරීම සහ දත්ත ලබා ගැනීම සඳහා භාවිතා කරන ලදී.පහත සිටුවම් භාවිතා කරනු ලැබේ. DPV සහ CV මිනුම් සඳහා:
DPV: සමතුලිත කාලය = \(8\,\hbox {s}\), වෝල්ටීයතා පියවර = \(3\,\hbox {mV}\), ස්පන්දන වෝල්ටීයතාවය = \(25\,\hbox {mV}\) , ස්පන්දන කාලය = \(50\,\hbox {ms}\), ස්කෑන් අනුපාතය = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: සමතුලිත කාලය = \(8\,\hbox {s}\), Voltage Step = \(3\,\hbox {mV}\), Sweep Rate = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ සමඟ සංකීර්ණ DNA වල වෝල්ටැමෝග්රෑම් වලින් ලබාගත් උපරිම ධාරා (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV සහ CV voltammograms ENIG PCB ඉලෙක්ට්රෝඩ \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB DNA සමඟ සංකීර්ණ (10–\({20}\,{\ hbox {ng සාන්ද්රණයෙන්) ලබා ගන්නා ලදී. }/{\upmu \hbox {l}}}\) එනම් 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) සඳහා \(117\,\hbox {bp}\ ) සහ 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) සඳහා \(503\,\hbox {bp}\)).නියෝජිත වෝල්ටම්මෝග්රෑම් පරිපූරක තොරතුරු වල S1 රූපයේ දැක්වේ.රූපය 2 ප්රතිඵල පෙන්වයි. ජෙල් පිරිපහදු කළ PCR නිෂ්පාදන භාවිතා කරමින් DPV සහ CV මිනුම් (උච්ච ධාරාව) CV මිනුම්වලට සාපේක්ෂව, DPV මිනුම් ඉහළ සංවේදීතාවයක් පෙන්නුම් කරයි (DNA සාන්ද්රණයේ ශ්රිතයක් ලෙස ධාරාව) CV මිනුම්වල පසුබිම් ධාරිත්රක ධාරා ෆැරඩයික් ධාරා සඟවයි 26 .දත්ත පෙට්ටියේ ඇති සෑම පෙට්ටියක් සඳහාම ඉලෙක්ට්රෝඩ 5කින් මිනුම් අඩංගු වේ. ඉලෙක්ට්රෝඩයෙන් ඉලෙක්ට්රෝඩයේ විචලනය හේතුවෙන් මිනුම් දෝෂ මඟහරවා ගැනීම සඳහා සියලුම මිනුම් එකම ඉලෙක්ට්රෝඩ කට්ටලයක් භාවිතා කරයි. DNA සාන්ද්රණය අඩු වීම සඳහා DPV සහ CV මනින ලද උච්ච ධාරා වල වැඩි වීමේ ප්රවණතාවක් අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු. , දිගු (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ හා සසඳන විට \(117) ) ඛණ්ඩනය. මෙය අපගේ පෙර කාර්යයේ වාර්තා කර ඇති ඉලෙක්ට්රෝඩ අවශෝෂණයේ අපේක්ෂිත ප්රවණතාවයට අනුකූල වේ. MB-DNA සංකීර්ණයේ අවශෝෂණය ඉලෙක්ට්රෝඩය මත ආරෝපණ හුවමාරුව පහසු කරයි, එය උපරිම ධාරාව වැඩි කිරීමට දායක වේ. අනෙකුත් අධ්යයනයන් මගින් MB-DNA අන්තර්ක්රියා 27,28,29,30 මත ඔලිගොනියුක්ලියෝටයිඩයේ ප්රමාණය සහ අනුපිළිවෙලෙහි බලපෑම පෙන්නුම් කර ඇත. -සයිටොසීන් (GC) ඇම්ප්ලිකන් දෙකෙහි (\(117\,\hbox {bp}\) සහ \(503\,\hbox {bp}\)) අන්තර්ගතය ආසන්න වශයෙන් 50% ක් වූ අතර, එය නිරීක්ෂණයේ වෙනස නියමිත බව පෙන්නුම් කරයි. ඇම්ප්ලිකන් දිග දක්වා.කෙසේ වෙතත්, ඉහළ DNA සාන්ද්රණය සඳහා (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), \(503\,\hbox {bp} සඳහා \) සහ \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) සඳහා \(117\,\hbox {bp}\)), අපි වර්ධක දෙකක් නිරීක්ෂණය කරමු DPV සහ CV මිනුම් දෙකෙහිම උප වල උච්ච ධාරා අඩු වේ. මෙයට හේතුව MB සන්තෘප්ත වීම සහ DNA වල මූලික යුගල අතර අන්තර් සම්බන්ධ වීමයි, ප්රතිඵලයක් ලෙස MB31,32 හි අඩු කළ හැකි කාණ්ඩයේ රෙඩොක්ස් ක්රියාකාරකම් ස්ටෙරික් නිෂේධනය වේ.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
PCR ප්රධාන මිශ්රණයේ ඇති ලවණ MB සහ DNA අතර විද්යුත් ස්ථිතික අන්තර්ක්රියා වලට බාධා කරයි, එබැවින් \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) සමග \({50} \,{\) එකතු කිරීමෙන් upmu \hbox {M}}\) MB-DNA අන්තර්ක්රියාවට ලුණු වල බලපෑම අධ්යයනය කිරීම සඳහා MB ජෙල් පිරිපහදු කළ නිෂ්පාදනයක් hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) සහ \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) සඳහා \(117\,\hbox {bp} \)), DPV සහ CV හි ලුණු එකතු කිරීම මිනුම් වලට සැලකිය යුතු ලෙස බල නොපායි (නියෝජිත වෝල්ටම්මෝග්රෑම් සඳහා පරිපූරක තොරතුරු වල S2 රූපය බලන්න).කෙසේ වෙතත්, DNA සාන්ද්රණය අඩු වීම, ලුණු එකතු කිරීම සංවේදිතාව බෙහෙවින් අඩු කරයි, DNA සාන්ද්රණය සමඟ ධාරාවෙහි සැලකිය යුතු වෙනසක් සිදු නොවේ. MB-DNA අන්තර්ක්රියා සහ අන්තර් ක්රියා මත ලුණු වල සමාන ඍණාත්මක බලපෑම් වෙනත් පර්යේෂකයන් විසින් කලින් වාර්තා කර ඇත33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) කැටායන DNA වල සෘණ පොස්පේට් කොඳු නාරටිය වෙත බන්ධනය වන අතර එමඟින් MB සහ DNA අතර විද්යුත් ස්ථිතික අන්තර්ක්රියා වලට බාධා ඇති කරයි. වැඩි DNA සාන්ද්රණයකදී, රෙඩොක්ස්-ක්රියාකාරී MB වල ස්ටීරික් නිෂේධනය අඩු උච්ච ධාරා ඇති කරයි, එබැවින් විද්යුත් ස්ථිතික අන්තර්ක්රියා සංවේදක ප්රතිචාරයට සැලකිය යුතු ලෙස බලපාන්නේ නැත. ප්රධාන කරුණ නම් මෙම ජෛව සංවේදකය ඉහළ DNA සාන්ද්රණයන් (කලාතුරකින් \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) හෝ ඊට වැඩි) හඳුනා ගැනීමට වඩාත් සුදුසු වේ. PCR නිෂ්පාදනවල ජෙල් පිරිපහදු කිරීම ශක්ය නොවන පරිසරයේ ජල සාම්පල සම්පූර්ණයෙන්ම ස්වයංක්රීයව සැකසීම සඳහා.
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB සමඟ සංකීර්ණ DNA සාන්ද්රණයන් සඳහා 600–700 \(\hbox {nm}\) තරංග ආයාම පරාසය සඳහා අවශෝෂණ වක්රය යටතේ ප්රදේශය: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) ලුණු සහිත සහ රහිත (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) ලුණු සහිත සහ රහිත (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB සාම්පල වලට අනුරූප වන {\upmu \hbox {l}}}\) DNA සාන්ද්රණය DNA නැත.
ඉහත ප්රතිඵල තවදුරටත් සත්යාපනය කිරීම සඳහා, අපි UV/Vis වර්ණාවලීක්ෂ ඡායාරූපමානය (Thermo Scientific Multiskan GO) භාවිතයෙන් දෘශ්ය මිනුම් සිදු කළෙමු, එක් එක් සඳහා සාම්පල \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) භාවිතා කරන ලදී. මැනීම.DNA සාන්ද්රණය වැඩි වීමත් සමඟ අවශෝෂණ අත්සන අඩු වේ, තරංග ආයාම පරාසය \(600\,\hbox {nm}\) සිට \(700\,\hbox { දක්වා අවශෝෂණ වක්රය යටතේ ඇති ප්රදේශයේ ප්රවණතාවයෙන් දැකිය හැක. nm}\) , රූප සටහන 4 හි පෙන්වා ඇති පරිදි (පරිපූරක තොරතුරු වල S3 හි පෙන්වා ඇති අවශෝෂණ වර්ණාවලිය). \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox ට වඩා අඩු DNA සාන්ද්රණයක් සහිත සාම්පල සඳහා {l}}}\), DNA අඩංගු සහ MB-පමණක් සාම්පල (\(503\,\hbox {bp}\) සහ \(117\,\hbox {bp}\) අතර සැලකිය යුතු වෙනසක් නොතිබුණි. ) දිග කොටස්), රෙඩොක්ස්-ක්රියාකාරී MB හි ස්ටීරික් නිෂේධනයක් නොමැති බව පෙන්නුම් කරයි. වැඩි DNA සාන්ද්රණයකදී, අවශෝෂණ සංඥාවේ ක්රමයෙන් අඩුවීමක් අපි නිරීක්ෂණය කළ අතර ලුණු ඉදිරියේ අවශෝෂණයේ අඩු අඩුවීමක් සටහන් කළෙමු.මෙම ප්රතිඵල අණුකවලට ආරෝපණය කරන ලදී. DNA දෙමුහුන් වල පාදක ස්ටැකිං සමඟ අන්තර්ක්රියා සහ ස්ටෙරික් නිෂේධනය. අපගේ ප්රතිඵල \(\pi\)–\(\pi ^*\ හි අඩු වූ ශක්ති මට්ටම් සමඟ හයිපොක්රොමැටිටි බව සම්බන්ධ කරන MB-DNA අන්තර් සම්බන්ධකයේ වර්ණාවලීක්ෂ අධ්යයනයන් පිළිබඳ සාහිත්යයේ වාර්තාවලට අනුකූල වේ. ) ස්තර 36, 37, 38 අන්තර් සම්බන්ධ කිරීම හේතුවෙන් ඉලෙක්ට්රොනික සංක්රාන්ති.
Phage Phi6 හි ඇගරෝස් ජෙල් විද්යුත් විච්ඡේදනය: විල් ජල සාම්පල වලින් දිග \(117\,\hbox {bp}\) සහ \(503\,\hbox {bp}\) PCR නිෂ්පාදන.M-DNA සලකුණ;NTC-no-template පාලනය, අනුරූප ඇම්ප්ලිකන් අඩංගු ප්රයිමර්;PC ධනාත්මක පාලනය;1, 2, 3-තනුක නොකළ (1:1) උල් සහිත විල් ජල සාම්පල තුන් ගුණයකින්. \(\(\50\,\hbox {bp}\) දී \(503\,\) භාවිතා නොකළ ඔලිගොනියුක්ලියෝටයිඩ හේතුවෙන් පටියක් දිස්වේ. hbox {bp}\) මංතීරුව.
අපි Phi6 phage සමඟ උල් කරන ලද Powai Lake ජල සාම්පල භාවිතයෙන් සංවේදකයේ උපයෝගීතාව ඇගයීමට ලක් කළෙමු. Phage-spiced ජල සාම්පල වලින් හුදකලා වූ RNA සාන්ද්රණය 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { මිලි. %.RNA ප්රතිලෝමව cDNA බවට පරිවර්තනය කර PCR සහ qPCR සඳහා අච්චුවක් ලෙස භාවිතා කරන ලදී. නිෂ්පාදන ප්රමාණය සංවේදකය සමඟ පරීක්ෂා කිරීමට පෙර ඇගරෝස් ජෙල් ඉලෙක්ට්රෝෆොරේසිස් (රූපය 5) මගින් තහවුරු කරන ලදී. මෙම සාම්පල ජෙල් පිරිපහදු කර නොමැති අතර එබැවින් PCR හි සියලුම සංරචක අඩංගු වේ. qPCR (වගුව 1) තුළ වාර්තා කරන ලද Ct අගයන් අනුරූප උල් ජල සාම්පල වලින් හුදකලා වූ RNA සාන්ද්රණය සමඟ සහසම්බන්ධ වන බව පෙන්වා දී ඇත. Ct අගය මගින් ප්රතිදීප්ත සංඥාව සඳහා අවශ්ය චක්ර ගණන හෙළි කරයි. සීමාව හෝ පසුබිම් සංඥාව ඉක්මවයි.ඉහළ Ct අගයන් අඩු සැකිලි සාන්ද්රණයන් පෙන්නුම් කරන අතර අනෙක් අතට. NTC සාම්පලවල Ct අගයන් බලාපොරොත්තු වූ තරමටම ඉහළ අගයක් ගනී. \(\ආසන්න වශයෙන් 3\) Ct අගයන් අතර වෙනස ධනාත්මක පාලනය සහ පරීක්ෂණ නියැදිය තවදුරටත් පෙන්නුම් කරන්නේ ධනාත්මක පාලනයට සාපේක්ෂව සෑම පරීක්ෂණ නියැදියකම දළ වශයෙන් 1% අච්චුවක් ඇති බවයි. දිගු ඇම්ප්ලිකන් වඩා හොඳ සංවේදීතාවයකට තුඩු දෙන බව අපි කලින් සාකච්ඡා කර ඇත්තෙමු. විෂමජාතීය පාරිසරික සාම්පල වලින් හුදකලා වූ දිගු කොටස් විස්තාරණය කිරීම අවාසි සැලකිල්ලට ගනිමින් අභියෝගාත්මක ය. අඩු වෛරස් සාන්ද්රණය සහ RNA ක්ෂය වීම. කෙසේ වෙතත්, අපගේ වෛරස් සුපෝෂණය සහ PCR වර්ධක ප්රොටෝකෝලය සමඟින්, විද්යුත් රසායනික සංවේදනය සඳහා \(503\,\hbox {bp}\) කොටස සාර්ථකව වර්ධක කිරීමට අපට හැකි විය.
රූපය 6, \(503\,\hbox {bp}\) ඛණ්ඩක ඇම්ප්ලිකනයේ විද්යුත් රසායනික සංවේදක ප්රතිඵල පෙන්වයි, තනුක නොකළ cDNA අච්චුව (1:1) ලෙසත්, 100 ගුණයකින් තනුක කළ cDNA අච්චුව ලෙසත් (1:100 ) සිදු කරන ලද PCR ලෙස භාවිත කරයි. , NTC සහ PC හා සසඳන විට (නියෝජිත voltammograms සඳහා පරිපූරක තොරතුරු වල S4 රූපය බලන්න).රූපය 6 හි ඇති පෙට්ටියේ ඇති සෑම පෙට්ටියකම ඉලෙක්ට්රෝඩ 5 ක සාම්පල තුනකින් මිනුම් අඩංගු වේ. ඉලෙක්ට්රෝඩය නිසා ඇති වන දෝෂ මඟහරවා ගැනීම සඳහා සියලුම සාම්පල මැනීමට එම ඉලෙක්ට්රෝඩ භාවිතා කරන ලදී. - සිට ඉලෙක්ට්රෝඩ විචලනය.CV මිනුම් හා සසඳන විට, DPV මිනුම් මගින් පරීක්ෂණ සහ PC සාම්පල NTC වලින් වෙන්කර හඳුනා ගැනීමට වඩා හොඳ විභේදනයක් පෙන්නුම් කරයි, මන්ද කලින් සඳහන් කළ පරිදි, Faradaic ධාරා පසුකාලීන ධාරිත්රක ධාරාවන් හේතුවෙන් සැඟවී ඇත. දිගු ඇම්ප්ලිකන් සඳහා, අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු. සෘණ පාලනය (NTC) ධනාත්මක පාලනයට සාපේක්ෂව ඉහළ CV සහ DPV උපරිම ධාරා ඇති කළ අතර, ධනාත්මක සහ තනුක නොකළ පරීක්ෂණ සාම්පලවල DPV උච්ච ධාරා වල සමාන උච්ච උස පෙන්නුම් කරන ලදී. ) පරීක්ෂණ නියැදිය සහ පරිගණකය NTC නියැදිය සඳහා සංවේදක ප්රතිදානයෙන් පැහැදිලිව විසඳිය හැකි අතර, 1:100 තනුක කළ නියැදිය සඳහා විභේදනය අඩුවෙන් ප්රකාශ වේ. cDNA 100 ගුණයකින් තනුක කිරීම සඳහා, අපි ජෙල් විද්යුත් විච්ඡේදනය අතරතුර කිසිදු පටියක් නිරීක්ෂණය නොකළෙමු. (රූප සටහන 5 හි පෙන්වා නොමැති මංතීරු), සහ අනුරූපී DPV සහ CV උච්ච ධාරා NTC සඳහා බලාපොරොත්තු වූ ඒවාට සමාන විය. \(117\,\hbox {bp}\) ඛණ්ඩය සඳහා ප්රතිඵල පරිපූරක තොරතුරු වල දැක්වේ. සෘණ පාලනය PCB සංවේදකයෙන් ඉලෙක්ට්රෝඩය මත නිදහස් MB අවශෝෂණය වීම සහ MB එක තනි කෙඳි සහිත ප්රයිමර් ඔලිගොනියුක්ලියෝටයිඩ් සමඟ අන්තර්ක්රියා කිරීම හේතුවෙන් විද්යුත් රසායනික ප්රතිචාරයක් ඇති කළේය. එබැවින්, නියැදියක් පරීක්ෂා කරන සෑම අවස්ථාවකම සෘණ පාලනයක් ක්රියාත්මක කළ යුතුය. පරීක්ෂණ නියැදිය ධනාත්මක හෝ සෘණ ලෙස වර්ගීකරණය කිරීම සඳහා අවකල (සාපේක්ෂ) මිනුමක් සාක්ෂාත් කර ගැනීම සඳහා සෘණ පාලනය මගින් ලබාගත් උපරිම ධාරාවට සාපේක්ෂව පරීක්ෂණ නියැදියේ උපරිම ධාරාව.
(a) DPV, සහ (b) විල් ජල සාම්පලවල \(503\,\hbox {bp}\) කොටස් විද්යුත් රසායනික හඳුනාගැනීම සඳහා CV උච්ච ධාරාව. පරීක්ෂණ සාම්පල තුන් ගුණයකින් මනිනු ලබන අතර කිසිදු සැකිලි පාලනයක් (NTC) හා සසඳන ලදී. ධනාත්මක පාලන (PC).
UV/Vis spectrophotometer භාවිතයෙන් දෘශ්ය මිනුම් මගින් සත්යාපනය කරන ලද සාන්ද්රණයන් සමඟ විවිධ DNA සඳහා විවිධ දිග ඇති ඇම්ප්ලිකන් සඳහා විද්යුත් රසායනික සංවේදකවල ක්රියාකාරීත්වයට බලපාන විවිධ යාන්ත්රණයන් අපගේ සොයාගැනීම් මගින් විදහා දක්වයි. අපගේ නිරීක්ෂණ මගින් DNA කොටස් \(\ආසන්න වශයෙන්\) දක්වා දිගු වන තීක්ෂ්ණ බුද්ධිය අවධාරනය කරයි. \(500\,\hbox {bp}\) වැඩි සංවේදීතාවකින් අනාවරණය කර ගත හැකි අතර සාම්පලයේ ලවණ පැවතීම ඉහළ සංවේදීතාවයට බලපාන සංවේදී DNA සාන්ද්රණයක් නොවන බව (කලාතුරකින් \({\hbox {ng}/{\upmu) \hbox {l}}}\) සහ ඉහළ).ඊට අමතරව, අපි ලුණු එකතු කර සහ රහිතව ජෙල් පිරිපහදු කළ ඇම්ප්ලිකන් ඇතුළු විවිධ වර්ගයේ සාම්පලවල බලපෑම සහ DPV සහ CV මිනුම්වල විල් ජල සාම්පල එකතු කිරීම පිළිබඳව විමර්ශනය කළෙමු.පසුබිම් ධාරිත්රක ධාරාව CV මැනීමට ද බලපාන බැවින් DPV වඩා හොඳ විභේදනයක් ලබා දෙන බව අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු, එය අඩු සංවේදී කරයි.
දිගු කොටස්වල විස්තාරණය වෛරස් ජානමය RNA වල අඛණ්ඩතාව මත රඳා පවතී. පරිසරයේ RNA ක්ෂය වීම සහ හුදකලා කිරීමේදී බෙදීමේ හැකියාව හේතුවෙන් දිගු කොටස් විස්තාරණය කිරීම සැමවිටම කාර්යක්ෂම නොවන බව අධ්යයනයන් කිහිපයක් පෙන්වා දී ඇත. .ඇලුමිනියම් හයිඩ්රොක්සයිඩ් මත පදනම් වූ වෛරස් සාන්ද්රණ ක්රමයට වඩා PEG-පාදක වෛරස් සාන්ද්රණ ක්රමය වැව් ජල සාම්පලවල ස්පයික් කරන ලද phage Phi-6 සාන්ද්රණය කිරීමේදී වඩාත් ඵලදායී බව අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු.දිගු DNA කොටස් හඳුනාගැනීමේ හැකියාව මල්ටිප්ලෙක්ස් PCR සඳහා අවශ්යතාවය ජය ගැනීමට සමත් විය. කෙටි දිග සැකිලි කිහිපයක් විස්තාරණය කිරීමට සහ හරස්-විශේෂත්වයේ හැකියාව අඩු කිරීමට.
ජීව විද්යාත්මක සාම්පල හිඟයි, එබැවින් පරීක්ෂණය සඳහා අවම සාම්පල අවශ්ය වන ජෛව සංවේදකයක් සැලසුම් කිරීමේ අවශ්යතාවයක් පවතී.මෙම අධ්යයනයේදී භාවිතා කරන ENIG PCB ඉලෙක්ට්රෝඩ සඳහා අවශ්ය වන්නේ \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) ඉලෙක්ට්රෝඩ වල ඵලදායි ප්රදේශය ආවරණය කිරීම සඳහා පරීක්ෂණ සඳහා සාම්පල.ඊට අමතරව, ඊළඟ නියැදිය බෙදා හැරීමට පෙර එම ඉලෙක්ට්රෝඩයම පිරිසිදු කිරීමෙන් පසු නැවත භාවිතා කළ හැක. විස්තාරණය කරන ලද සාම්පල සඳහා මිල අඩු වන මෙතිලීන් නිල් හැර වෙනත් රසායනික ද්රව්ය එකතු කිරීම අවශ්ය නොවේ. සහ බහුලව භාවිතා වන රසායනිකය.එක් ඉලෙක්ට්රෝඩයක් නිෂ්පාදනය සඳහා ඩොලර් 0.55 (හෝ INR 40) පමණ වැය වන බැවින්, මෙම biosensor දැනට පවතින හඳුනාගැනීමේ තාක්ෂණයට වඩා ලාභදායී විකල්පයක් විය හැක. වගුව 2 මෙම කාර්යය දීර්ඝ කාලයක් තිස්සේ සාහිත්යයේ වාර්තා කර ඇති අනෙකුත් සංවේදක සමඟ සංසන්දනය කරයි. විෂමජාතීය සාම්පලවල DNA කොටස්.
MB මත පදනම් වූ විද්යුත් රසායනික හඳුනාගැනීමේ ප්රොටෝකෝල PCR හි විශේෂත්වය මත රඳා පවතින බැවින්, මෙම ක්රමයේ ප්රධාන සීමාවක් වන්නේ අපජලය සහ විල් ජලය වැනි විෂමජාතීය සාම්පලවල නිශ්චිත නොවන විස්තාරණය කිරීමේ හැකියාව හෝ අඩු සංශුද්ධතාවයේ ප්රාථමිකයන් භාවිතා කිරීමයි. නවීකරණය නොකළ ENIG PCB ඉලෙක්ට්රෝඩ භාවිතයෙන් DNA හඳුනාගැනීම සඳහා විද්යුත් රසායනික හඳුනාගැනීමේ ක්රම, භාවිතයට නොගත් dNTPs සහ ප්රයිමර් මගින් හඳුන්වා දී ඇති දෝෂ වඩාත් හොඳින් අවබෝධ කර ගැනීම සහ ප්රතික්රියා තත්ත්වයන් සහ විශ්ලේෂණ ප්රොටෝකෝල ප්රශස්ත කිරීම අවශ්ය වේ. pH, උෂ්ණත්වය සහ ජීව විද්යාත්මක අතිරේක භෞතික රසායනික පරාමිතීන් මැනීමේ නිරවද්යතාවය වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා ජල සාම්පලයේ ඔක්සිජන් ඉල්ලුම (BOD) ද මැනිය යුතුය.
අවසාන වශයෙන්, අපි පාරිසරික (විල් ජලය) සාම්පලවල වෛරස් හඳුනාගැනීම සඳහා අඩු වියදම් විද්යුත් රසායනික ENIG PCB සංවේදකයක් යෝජනා කරමු. සංවේදිතාව පවත්වා ගැනීම සඳහා ක්රයොජනික් ආචයනය අවශ්ය DNA සංවේදනය සඳහා ප්රතිචක්රීකරණය කළ ඔලිගොනියුක්ලියෝටයිඩ් ඉලෙක්ට්රෝඩ හෝ අභිරුචි උපස්ථර මෙන් නොව, 53,54 අපගේ තාක්ෂණය වෙනස් නොකළ PCB භාවිතා කරයි. දිගු කල් පවතින ඉලෙක්ට්රෝඩ සහ නිශ්චිත ගබඩා අවශ්යතා නොමැති අතර එබැවින් LMIC වල යොදවා ඇති ස්වයංක්රීය නියැදි සැකසුම් සමඟ මිනුම් විසඳුම් සංවර්ධනය කිරීම සඳහා සුදුසු වේ. ජෛව සංවේදකය ඉලක්ක ඇම්ප්ලිකන් වේගයෙන් හඳුනා ගැනීම සඳහා මිල අඩු DNA අන්තර්ක්රියා කරන රෙඩොක්ස් ඩයි (MB) භාවිතා කරයි. නිශ්චිත නොවන විස්තාරණය පාරිසරික සාම්පලවල බහුලව දක්නට ලැබෙන මෙම සංවේදන ක්රමයේ විශේෂත්වය තනි හා ද්විත්ව නූල් ඔලිගොනියුක්ලියෝටයිඩවලට MBs නිශ්චිත නොවන බැඳීම හේතුවෙන් අඩු කරයි. එම නිසා, මෙම පරීක්ෂණයේ විශේෂත්වය ප්රයිමර් සහ PCR ප්රතික්රියා තත්ත්වයන් ප්රශස්ත කිරීම මත රඳා පවතී. ඊට අමතරව, CV සහ පරීක්ෂා කරන ලද සාම්පලවලින් ලබාගත් DPV උච්ච ධාරා එක් එක් පරීක්ෂණය සඳහා ඍණ පාලනයෙන් (NTC) ලබාගත් ප්රතිචාරවලට සාපේක්ෂව අර්ථකථනය කළ යුතුය.මෙම කාර්යයේ ඉදිරිපත් කර ඇති විද්යුත් රසායනික සංවේදක සැලසුම් සහ ක්රම ස්වයංක්රීය සහ අඩු සංවර්ධනයක් සඳහා ස්වයංක්රීය සාම්පල සමඟ ඒකාබද්ධ කළ හැකිය. - සාම්පල එකතු කර විශ්ලේෂණය කර රැහැන් රහිතව ප්රතිඵල නැවත රසායනාගාරයට සම්ප්රේෂණය කළ හැකි පිරිවැය විසඳුම.
Cashdollar, J. & Wymer, L. ජල සාම්පල වලින් වෛරස් වල ආරම්භක සාන්ද්රණය සඳහා ක්රම: මෑත අධ්යයනයන්හි සමාලෝචනය සහ මෙටා විශ්ලේෂණය.Application.microorganism.115, pp. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Waterborne viruses: ආරක්ෂිත පානීය ජලය සඳහා බාධක. PLoS ව්යාධිජනක.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. අඩු සහ මධ්යම ආදායම් ලබන රටවල COVID-19 හි පිරිවැය-ඵලදායී මහා පරිමාණ නිරීක්ෂණ සඳහා අපජල වසංගතවේදය: අභියෝග සහ අවස්ථා. ජලය 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427-3481 (2012).
ටානි, ඒ., තොම්සන්, ඒජේ සහ බට්, ජේඑන් මෙතිලීන් නිල් රන් උපස්ථර මත නිශ්චල කර ඇති තනි සහ ද්විත්ව නූල් ඔලිගොනියුක්ලියෝටයිඩවල විද්යුත් රසායනික වෙනස්කම් කරන්නෙකු ලෙස. විශ්ලේෂක 126, 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ දිගු පරාස ඉලෙක්ට්රෝන හුවමාරුව මගින් DNA දෙමුහුන් විද්යුත් රසායනික සම්ප්රේෂණය සඳහා Cation සහ Anion Intercalators සංසන්දනය කිරීම.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ ආරෝපණය DNA හරහා මාරු කිරීම: තෝරාගත් විද්යුත් රසායනික DNA biosensor.anus.Chemical.78, 2138-2144 (2006).
Fang, TH et al. සමගාමී විද්යුත් රසායනික හඳුනාගැනීම් සහිත තත්ය කාලීන PCR ක්ෂුද්ර තරල උපාංගය. ජීව විද්යාත්මක සංවේදකය.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. DNA සමඟ මෙතිලීන් නිල් අන්තර්ක්රියා කිරීම මත පදනම් වූ විද්යුත් රසායනික තත්ය කාලීන PCR පද්ධතියක සංඥා යාන්ත්රණය අධ්යයනය සහ ක්රියාකාරීත්වය තහවුරු කිරීම. විශ්ලේෂක 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.අපජල සාම්පලවල sars-cov-2 හඳුනාගැනීම සඳහා Loop-මැදිහත් වූ සමෝෂ්ණ විස්තාරණ පදනම් වූ විද්යුත් රසායනික සංවේදකය.J.පරිසරය.රසායනික.බ්රිතාන්යය.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.PCB ඉලෙක්ට්රෝඩ සහිත SARS-CoV-2 ඇම්ප්ලිකන් වල විද්යුත් රසායනික සංවේදනය. සංවේදකය සක්රිය කර ඇත.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. අපජලයේ ඝන කොටසෙහි SARS-CoV-2 RNA කාර්යක්ෂමව හඳුනා ගැනීම.science.general පරිසරය.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.අපද්රව්ය ජලයේ SARS-CoV-2 හඳුනාගැනීම සඳහා විශ්ලේෂණාත්මක ක්රම: ප්රොටෝකෝලය සහ අනාගත ඉදිරිදර්ශන.TraC නැඹුරුවන anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. වීදුරු මතුපිට තැන්පත් කර ඇති වාෂ්පීකරණය කරන ලද කෙල බිංදු වල ආවරණය කරන ලද බැක්ටීරියාභක්ෂක Phi6 (SARS-CoV-2 සඳහා ආදේශකයක්) පැවැත්ම.science.Rep.10, 1-10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ නිදහසේ ජීවත් වන amoeba හි SARS-CoV-2 ආදේශකයක (Phi6) පාරිසරික අඛණ්ඩ පැවැත්ම.J.ජල සෞඛ්ය 20, 83 (2021).
Mindich, L. ද්විත්ව නූල් සහිත RNA බැක්ටීරියෝෆේජ්\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev. ප්රවේණික කොටස් තුනක නිරවද්ය ඇසුරුම්.63, 149-160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, DH RNA phage\(\varphi\)6 ඇසුරුම් කලාපයේ ද්විතියික ව්යුහය.RNA 6, 880-889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap - බැක්ටීරියාභක්ෂක රසායනාගාර තොග සකස් කිරීම සඳහා වේගවත් හා කාර්යක්ෂම ප්රොටෝකෝලයක්.PeerJ 4, e2261 (2016).
පසු කාලය: මැයි-27-2022