Vă mulțumim că vizitați Nature.com.Versiunea de browser pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS. Pentru cea mai bună experiență, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați modul de compatibilitate în Internet Explorer). Între timp, pentru a vă asigura suport continuu, vom afișa site-ul fără stiluri și JavaScript.
Importanța monitorizării probelor de mediu a fost foarte apreciată încă de la începutul pandemiei de COVID-19, iar unele eforturi de monitorizare sunt efectuate folosind standardul de aur, deși tehnicile bazate pe qPCR sunt costisitoare. Biosenzorii ADN electrochimici ar putea oferi un potențial rentabil. soluție pentru monitorizarea probelor de apă din mediu în țările cu venituri mici și medii. În această lucrare, demonstrăm detectarea electrochimică a ampliconilor obținuți din fagul Phi6 izolat din probele de apă de lac cu vârfuri (un surogat popular pentru SARS-CoV-2), folosind ENIG pentru a completa electrozii PCB fără modificarea suprafeței.sex. Răspunsul senzorului electrochimic a fost caracterizat în detaliu pentru două fragmente de ADN de lungimi diferite (\({117}\,\hbox {bp}\) și \({503}\,\hbox {bp}\)), și efectul sărurilor din amestecurile master PCR asupra interacțiunilor albastru de metilen (MB)-ADN. Rezultatele noastre arată că lungimea fragmentelor de ADN determină în mod semnificativ sensibilitatea electrochimică și demonstrează în această lucrare că capacitatea de a detecta ampliconi lungi fără purificarea pe gel a produselor PCR este important pentru măsurarea in situ a probelor de apă.O soluție complet automatizată pentru încărcătura virală este de bine.
Transmiterea virusului prin apă este cunoscută ca un pericol pentru sănătatea publică încă din anii 1940, odată cu primele dovezi de transmitere prin apă a poliomielitei și hepatitei E1. Organizația Mondială a Sănătății (OMS) a clasificat câțiva agenți patogeni virali din apă cu semnificație pentru sănătate moderată până la ridicată2. Virus tradițional metodele de detectare se bazează pe tehnici bazate pe qPCR standard, care sunt foarte sensibile și specifice, dar necesită personal calificat pentru a testa în laborator folosind instrumente scumpe. Cu toate acestea, în țările cu venituri mici și medii (LMIC) cu resurse limitate, este probabil ca testarea probelor să aibă prioritate față de monitorizarea probelor de apă din mediu. Prin urmare, sunt necesare metode alternative cu costuri reduse pentru monitorizarea durabilă, în timp real, a probelor de apă și apă uzată în țările cu venituri mici și medii, ca avertismente timpurii privind focarele de boli emergente; protejându-i astfel de impacturile socioeconomice severe ale pandemiei virale. Biosenzorii electrochimici cu costuri reduse pentru acizi nucleici ar putea oferi o soluție potențială promițătoare la această nevoie nesatisfăcută. Mulți dintre acești biosenzori ADN funcționează prin faptul că firele de ADN complementare sunt imobilizate pe electrod. suprafață și hibridizează atunci când o secvență de potrivire este prezentă în probă. Acesta poate fi apoi convertit într-un semnal prin diferite tehnici electrochimice folosind mediatori redox, cum ar fi fierul de potasiu/ferocianura. Albastrul de metilen (MB) este una dintre moleculele redox-active, care are S-a raportat că se intercalează în ADN-ul dublu catenar (dsDNA) în plus față de legarea sa mai nespecifică la ADN-ul monocatenar5,6. Natura de intercalare a MB-urilor pentru a forma complexe MB-ADN îi face o alegere populară ca mediatori redox în mai multe ADN electrochimic. configurațiile senzorului5,6,7,8,9.Deși intercalarea MB la ADN este nespecifică, iar specificitatea acestui senzor electrochimic depinde în mare măsură de puritatea primerilor utilizați pentru PCR sau amplificarea izotermă, este foarte potrivit pentru implementarea reală. qPCR bazată pe electrochimic în timp sau amplificarea izotermă cu fluorescență ca alternativă la măsurarea concentrației de ADN 9. Într-o astfel de implementare, Won și colab. Suprafața electrozilor de aur a fost modificată cu 6-mercapto-1-hexanol (MCH) pentru timp real. măsurarea ampliconilor PCR cu MB folosind voltametrie cu impuls diferențial (DPV)9. În alte cazuri, Ramirez și colab.Detecția SARS-CoV-2 în apele uzate prin reacția RT-LAMP folosind MB cu electrozi serigrafiați. Electrozii de platină au fost, de asemenea, utilizate ca electrozi in situ într-o platformă PCR microfluidică concepută pentru a detecta electrochimic ampliconii în timpul reacțiilor 8 .Toate aceste studii necesită modificarea suprafeței electrozilor, implicând costuri de producție și operare crescute datorită cerințelor speciale de depozitare pentru stabilitatea acestor electrozi funcționalizați.
Schema fluxului de lucru pentru detectarea electrochimică a ampliconilor obținuți din particule virale concentrate în probele de apă din lac.
Am demonstrat recent detectarea electrochimică a ampliconilor SARS-CoV-2 cu electrozi de plăci de circuit imprimat (PCB) cu costuri reduse bazați pe DPV și voltametrie ciclică (CV) indusă de adsorbția complecșilor MB-ADN pe suprafața electrozilor nemodificați) modificări ale vârfului curent11.Raportăm că fragmentele de ADN mai lungi (N1-N2, \({943}\, \hbox) s-au format folosind primerii N1 înainte și N2 inversați recomandați de CDC, comparativ cu fragmentele mai scurte {bp}\))) au arătat o liniaritate mai bună în răspunsul senzorului. (N1, \(72\,\hbox {bp}\))) s-a format folosind seturi de primeri N1 înainte și N1 invers. Aceste studii sunt raportate folosind diluții de ADN preparate în apă fără nucleaze. Platforma a fost, de asemenea, utilizată pentru a detecta SARS-CoV -2 ampliconi în probe de apă uzată simulate (obținute prin adăugarea probelor de ARN total cu ARN SARS-CoV-2). Deoarece ARN-ul este susceptibil la forfecare în timpul izolării și procesării în aval,12,13 este dificil să amplificați fragmente mai lungi cu această probă eterogenă. Prin urmare, demonstrarea detectării electrochimice a ampliconului SARS-CoV-2 în apele uzate este limitată la fragmentul mai scurt \(72\,\hbox {bp}\) N1.
În această lucrare, am investigat fezabilitatea detectării electrochimice pe bază de PCB ENIG a fagului Phi6 concentrat și izolat din probele de apă de lac (Fig. 1). Fagii Phi6 sunt comparabili ca dimensiune (80-100 nm) cu SARS-CoV-2 și au, de asemenea, o membrană lipidică și o proteină în vârf. Din aceste motive, bacteriofagul Phi6 este un surogat popular pentru SARS-CoV-2 și alți virusuri ARN patogeni înveliți14,15.ARN izolat din particulele de fagi a fost folosit ca șablon pentru sinteza cADN-ului urmat de PCR pentru a obține două fragmente de ADN cu lungimea de 117 și 503 perechi de baze. Având în vedere provocarea de a amplifica \(943\,\hbox {bp}\) fragmente N1-N2 în lucrarea noastră anterioară, vizam fragmente de lungime intermediară (\(117 \,\hbox {bp}\) și \(503 \,\hbox {bp}\)), pe baza primerilor disponibili. Răspunsul senzorului electrochimic a fost studiat sistematic pe o gamă largă de concentrații (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) la \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Pentru ambele fragmente din prezența MB, efectul sării asupra răspunsului senzorului a fost caracterizat și validat încrucișat prin măsurători spectrofotometrice. Principalele contribuții ale acestei lucrări sunt următoarele:
Lungimea fragmentului de ADN și prezența sării în probă afectează puternic sensibilitatea.Rezultatele noastre arată că activitatea electrochimică depinde de diferite mecanisme de interacțiune dintre MB, ADN și senzorul în răspunsul voltametric, în funcție de concentrația și lungimea ADN-ului, cu fragmente mai lungi, cu o sensibilitate mai mare, deși sarea are un efect negativ asupra interacțiunilor electrostatice dintre MB și ADN.
Concentrația ADN-ului determină mecanismul de interacțiune MB-ADN în electrozii nemodificați. Demonstrăm că diferite mecanisme de interacțiune MB-ADN depind de concentrația ADN-ului. La concentrații de ADN sub o cantitate mică de \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), am observat că răspunsul curent electrochimic a fost determinat în principal de adsorbția ADN-ului MB pe electrod, în timp ce la concentrații mai mici La concentrații mari de ADN, răspunsul curent electrochimic a fost determinat de inhibarea sterica a redox. activitate datorată inserției MB între perechile de baze ADN.
Sensarea electrochimică bazată pe PCB ENIG a acizilor nucleici virali în probele de apă din lac Observațiile au fost validate prin detectarea electrochimică a fragmentelor de ADN adăugate Phi6 \(503\,\hbox {bp}\) obținute din probe de apă din Lacul Powai, campusul IIT Mumbai Fag rezultat.
Cost scăzut de implementare și potențial de integrare în sisteme de monitorizare complet automatizate, oligonucleotide sau aptameri pe electrozi cu termen de valabilitate mai lung.
Phage Phi6 este un virus dsARN învelit din familia Cytoviridae care infectează Pseudomonas syringae. Genomul fagului Phi6 există sub forma a 3 fragmente: S (\(2,95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4,07). \,\hbox {Kb}\)) și L (\ (6,37\ ,\hbox{Kb}\))16,17.Deoarece fagul Phi6 infectează o tulpină nepatogenă BSL-1 Pseudomonas, este sigur de utilizat și poate fi cultivat cu ușurință în laborator. Phage Phi6 și gazda sa Pseudomonas syringae au fost achiziționate de la Centrul de referință pentru virusuri bacteriene Felix d'Herelle, Universitatea Laval, Canada (numerele de catalog ale centrului de referință sunt HER-102 și, respectiv, HER-1102) Fagul Phi6 și gazda sa au fost reînviați conform instrucțiunilor centrului de referință. Fagul Phi6 a fost purificat prin liză pe placă și eluare pentru a obține titruri finale cu \(\aproximativ 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (unități formatoare de plăci/mililitri).ARN a fost izolat din particulele fagilor purificate folosind kitul universal de purificare a ARN total GenElute™ (Sigma-Aldrich) conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, o suspensie Phi6 de fag purificat\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) a fost lizat și lizatul a fost încărcat pe o coloană de rotație pentru a permite ARN-ului să se lege de coloana de rășină. ARN-ul este apoi eluat în soluția de eluție \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) furnizate de kit. Estimați concentrația de ARN prin absorbanță la \(260\,\hbox {nm}\).ARN a fost stocat în alicote în \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) până la o utilizare ulterioară.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Kitul de sinteză iScript cADN (Bio -Rad Laboratories) a fost folosit ca șablon pentru sinteza cADN urmând instrucțiunile producătorului. Pe scurt, o reacție de sinteză cADN constă din 3 pași: amorsare la \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , transcrierea inversă a \({20}\,{\hbox {min}}\) la \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), și invers. Reportofonul este în \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) pentru \({1}\,{\hbox {min }}\).La rulare pe un gel de agaroză 1%, cADN-ul a arătat trei benzi corespunzătoare celor trei fragmente de ARN așteptate (datele nu sunt afișate). Următorii primeri au fost utilizați pentru a amplifica două fragmente de ADN cu lungimea de 117 și 503 bp, folosind cADN ca șablon pentru PCR într-un termociclor miniPCR® mini8:
Primerii pentru \(117\,\hbox {bp}\) și \(503\,\hbox {bp}\) corespund la 1476-1575 nucleotide ale segmentului M și 458-943 nucleotide ale segmentului L, respectiv acid .Toate produsele PCR amplificate au fost supuse electroforezei pe geluri de agaroză 1%, iar ADN-ul țintă amplificat a fost purificat folosind kitul de extracție cu gel GeneJET (Thermo Fisher Scientific).
Un lac din campusul IIT Mumbai (Lacul Powai, Powai, Mumbai) a fost folosit pentru a adăuga particule de fagi. Apa lacului a fost filtrată printr-o membrană \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) pentru a îndepărta particule suspendate, apoi a fost adăugat fagul Phi6. Adăugați \({1}\,{\hbox {ml}}\) din \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) la \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) apă filtrată de lac, în \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). O mică parte a fost rezervat pentru măsurarea încărcăturii virale prin testul plăcii. Am testat două metode diferite de concentrare a particulelor de virus Phi6 cu vârf: (1) metoda de adsorbție-precipitare a hidroxidului de aluminiu,19 care a fost validată pentru concentrația mai multor viruși ARN încapsulați din probe de mediu și (2) ) Metoda de concentrare a virusului pe bază de polietilen glicol (PEG) a fost adaptată de la Flood et al.20 .Deoarece eficiența de recuperare a metodei pe bază de PEG a fost găsită a fi mai bună decât cea a metodei cu hidroxid de aluminiu, metoda pe bază de PEG a fost utilizată pentru a concentra particulele Phi6 din probele de apă de lac.
Metoda PEG utilizată a fost următoarea: PEG 8000 și \(\hbox {NaCl}\) s-au adăugat la probele de apă de lac cu vârf Phi6 pentru a obține 8 % PEG 8000 și \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Probele au fost incubate pe un agitator\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), apoi centrifugat la \(4700 \,\hbox {g}\) este \({45}\,{\hbox {min}}\). Aruncați supernatantul și resuspendați peletul în \({1}\, {\hbox {ml}}\) în același supernatant. Toate experimentele de concentrare și de concentrare a virusului au fost efectuate în trei exemplare. După concentrare, o mică parte a fost rezervată pentru măsurarea eficienței recuperării prin analiza plăcii. ARN a fost izolat așa cum a fost descris anterior și eluat. în tampon de eluție furnizat de trusă\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Deoarece concentrația de ARN va varia de la probă la probă în trei exemplare, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) de ARN este utilizat pentru toate trei, indiferent de concentrația sa. Sinteza de ADNc a probelor. Sinteza de ADNc a fost efectuată așa cum a fost descris anterior.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) ADNc a fost folosit ca șablon pentru \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR pentru 35 de cicluri pentru a amplifica \ (117\,\hbox {bp}\) și \(503\,\hbox { bp}\) fragmente. Aceste probe sunt reprezentate ca „1:1”, adică fără diluare. Un control fără șablon (NTC) a fost configurat ca control negativ, în timp ce un ADNc sintetizat folosind ARN izolat din fagul purificat a fost configurat ca șablon pentru un control pozitiv (PC). PCR cantitativă (qPCR) a fost efectuată într-un instrument Stratagene Mx3000P RT-PCR folosind Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Reacțiile au fost stabilite în trei exemplare ca anterior pragul ciclului (Ct) a fost înregistrat pentru toate probele. În plus, probele diluate au fost \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) folosind cADN diluat 1:100 în apă filtrată de lac ca \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR pentru 35 de cicluri. Aceste mostre sunt reprezentate ca „1:100″.
Electrozii PCB sunt fabricați utilizând un proces de imersie cu aur cu nichel electroless (ENIG) la preț redus, fără a fi nevoie de placare suplimentară cu aur. Specificațiile electrozilor ENIG PCB sunt detaliate în lucrarea noastră anterioară11. Pentru electrozii ENIG PCB, metode tradiționale de curățare a electrozilor, cum ar fi Soluția de piranha sau voltametria ciclică cu acid sulfuric nu sunt recomandate, deoarece pot provoca decojirea stratului subțire de aur (grosime \(\aprox\) \(100\,\hbox {nm }\)) și pot expune straturile de cupru subiacente care sunt predispuse. la coroziune 21, 22, 23, 24, 25. Prin urmare, curățați electrozii cu o cârpă fără scame umezită cu IPA. Proba de testat a fost incubată cu \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB în \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) pentru o inserare ușoară. În munca noastră anterioară , am observat că sensibilitatea și liniaritatea senzorului au fost îmbunătățite prin creșterea concentrației de MB 11 . Pe baza optimizărilor raportate în lucrările noastre anterioare, am folosit \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB concentrații pentru a încorpora ADN-ul în acest studiu.Detecția electrochimică a ADN-ului dublu catenar (ds-DNA) poate fi realizată folosind intercalatori anionici sau cationici. Deși intercalatorii anionici detectează ADN-ul cu o selectivitate mai bună, aceștia necesită incubare peste noapte, ceea ce duce la timpi de detectare mai lungi.On pe de altă parte, intercalatoarele cationice, cum ar fi MB, necesită timpi de incubare mai scurti, aproximativ \({1}\,{\hbox {h}}\) pentru detectarea electrochimică a ds-ADN6. Fiecare măsurătoare implică distribuirea probei care urmează să fie testată pe electrod\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), apoi curățați cu o cârpă umezită cu IPA, înainte de a continua cu o altă probă.o măsurătoare. Fiecare probă a fost testată pe 5 electrozi diferiți, dacă nu se specifică altfel. Măsurătorile DPV și CV au fost efectuate folosind un potențiostat PalmSens Sensit Smart, iar software-ul PSTrace a fost utilizat pentru configurarea potențiostatului și achiziția de date, inclusiv calculele curentului de vârf. Sunt utilizate următoarele setări pentru măsurători DPV și CV:
DPV: Timp de echilibru = \(8\,\hbox {s}\), Pas de tensiune = \(3\,\hbox {mV}\), Tensiune impuls = \(25\,\hbox {mV}\) , durata pulsului = \(50\,\hbox {ms}\), rata de scanare = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Timp de echilibru = \(8\,\hbox {s}\), Pasul de tensiune = \(3\,\hbox {mV}\), Rata de baleiaj = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Curenți de vârf obținuți din voltamograme de ADN complexat cu \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Voltamogramele DPV și CV au fost obținute pe electrozi ENIG PCB \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB complexați cu ADN (la concentrații de 10–\({20}\,{\ hbox {ng). }/{\upmu \hbox {l}}}\) adică 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) pentru \(117\,\hbox {bp}\ ) și 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) pentru \(503\,\hbox {bp}\)). Voltamogramele reprezentative sunt prezentate în Figura S1 din Informații suplimentare. Figura 2 arată rezultatele de măsurători DPV și CV (curent de vârf) folosind produse PCR purificate cu gel. În comparație cu măsurătorile CV, măsurătorile DPV arată o sensibilitate mai mare (curent în funcție de concentrația ADN) deoarece curenții capacitivi de fond în măsurătorile CV ascund curenții Faradaici 26 . pentru fiecare casetă din boxplot conține măsurători de la 5 electrozi. Toate măsurătorile folosesc același set de electrozi pentru a evita erorile de măsurare din cauza variației electrod-la-electrod. Am observat o tendință de creștere a curenților de vârf măsurați DPV și CV pentru concentrații mai mici de ADN , mai lung (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ în comparație cu \(117) ). adsorbția complexului MB-ADN facilitează transferul de sarcină pe electrod, ceea ce contribuie la creșterea curentului de vârf. Alte studii au arătat efectul mărimii și secvenței oligonucleotidelor asupra intercalării MB-ADN27,28,29,30.Guanina -conținutul de citozină (GC) al celor doi ampliconi (\(117\,\hbox {bp}\) și \(503\,\hbox {bp}\)) a fost de aproximativ 50%, indicând faptul că observația Diferența se datorează la lungimea ampliconului. Cu toate acestea, pentru concentrații mai mari de ADN (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), pentru \(503\,\hbox {bp} \) și \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) pentru \(117\,\hbox {bp}\)), observăm două amplificari. Curenții de vârf ai subsecțiilor sunt reduse atât în măsurătorile DPV, cât și în cele ale CV. Acest lucru se datorează faptului că MB se saturează și se intercalează între perechile de baze ale ADN-ului, rezultând inhibarea sterica a activității redox a grupului reductibil din MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Sărurile prezente în amestecurile master PCR interferează cu interacțiunile electrostatice dintre MB și ADN, deci adăugând \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) cu \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) Produs purificat cu gel MB pentru a studia efectul sării asupra interacțiunii MB-ADN. După cum se arată în Figura 3, am observat că pentru concentrații mai mari de ADN (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) și \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) pentru \(117\,\hbox {bp} \)), în DPV și CV Adăugarea de sare nu a afectat în mod semnificativ măsurătorile (a se vedea Figura S2 din Informații suplimentare pentru voltamograme reprezentative). Cu toate acestea, la concentrații mai mici de ADN, adăugarea de sare reduce foarte mult sensibilitatea, ducând la nicio modificare semnificativă a curentului cu concentrația de ADN. Efecte negative similare ale sării asupra interacțiunilor și intercalării MB-ADN au fost raportate anterior de alți cercetători33,34.\(\hbox { Cationii Mg}^{2+}\) se leagă de coloana vertebrală fosfatică negativă a ADN-ului, împiedicând astfel interacțiunea electrostatică dintre MB și ADN. La concentrații mai mari de ADN, inhibarea sterica a MB-urilor active redox duce la curenți de vârf mai mici, astfel încât interacțiunile electrostatice nu afectează în mod semnificativ răspunsul senzorului. Punctul cheie este că acest biosenzor este mai potrivit pentru a detecta concentrații mai mari de ADN (rar \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) sau mai mare), pentru procesarea complet automatizată a probelor de apă din mediu, în cazul în care purificarea cu gel a produselor PCR ar putea să nu fie fezabilă.
Aria de sub curba de absorbție pentru intervalul de lungimi de undă 600–700 \(\hbox {nm}\) pentru diferite concentrații de ADN complexat cu \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) cu și fără sare (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) cu și fără sare (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Concentrațiile de ADN corespunzătoare \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) probe de MB Fără ADN.
Pentru a verifica în continuare rezultatele de mai sus, am efectuat măsurători optice folosind un spectrofotometru UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), probele \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) au fost utilizate pentru fiecare Măsurare. Semnătura de absorbție scade odată cu creșterea concentrației de ADN, așa cum se poate observa din tendința zonei de sub curba de absorbție pentru intervalul de lungimi de undă \(600\,\hbox {nm}\) până la \(700\,\hbox { nm}\), așa cum se arată în Fig. 4 (spectrul de absorbție prezentat în Fig. S3 în Informații suplimentare). Pentru probe cu concentrații de ADN mai mici decât \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), nu a existat nicio diferență semnificativă în absorbție între probele care conțin ADN și cele numai MB (pentru \(503\,\hbox {bp}\) și \(117\,\hbox {bp}\ ) de lungime), indicând absența inhibării sterice a MB redox-activ. La concentrații mai mari de ADN, am observat o scădere treptată a semnalului de absorbanță și am observat o scădere mai mică a absorbanței în prezența sării. Aceste rezultate au fost atribuite moleculare. interacțiunile și inhibarea sterică cu stivuirea bazelor în hibrizii de ADN. Rezultatele noastre sunt în concordanță cu rapoartele din literatura de specialitate privind studiile spectroscopice ale intercalării MB-ADN care asociază hipocromaticitatea cu niveluri reduse de energie în \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) tranziții electronice datorate intercalării Straturile 36, 37, 38.
Electroforeza pe gel de agaroză a fagului Phi6: produse PCR de lungime \(117\,\hbox {bp}\) și \(503\,\hbox {bp}\) din probele de apă de lac. Marker M-DNA;Control NTC fără șablon, primeri care conțin ampliconii corespunzători;control pozitiv PC;1, 2, 3-nediluate (1:1) probe de apă de lac cu vârfuri în trei exemplare. O bandă este vizibilă la \(\aproximativ 50\,\hbox {bp}\) datorită oligonucleotidelor neutilizate din \(503\,\). hbox {bp}\) bandă.
Am evaluat utilitatea senzorului folosind probe de apă din Lacul Powai dotate cu fag Phi6. Concentrațiile de ARN izolate din probele de apă cu vârf de fagi au variat între 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), în timp ce cei izolați din suspensii de fagi purificate. ARN-ul a fost estimat a fi \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) cu o eficiență de recuperare de aproximativ 1 %.ARN a fost transcris invers în ADNc și utilizat ca șablon pentru PCR și qPCR. Mărimea produsului a fost confirmată prin electroforeză pe gel de agaroză (Figura 5) înainte de testarea cu senzorul. Aceste probe nu sunt purificate cu gel și, prin urmare, conțin toate componentele PCR ca precum și ampliconii de interes. Valorile Ct înregistrate în timpul qPCR (Tabelul 1) s-au arătat că se corelează cu concentrația de ARN izolat din probele de apă cu vârf corespunzătoare. Valoarea Ct dezvăluie numărul de cicluri necesare pentru ca semnalul fluorescent să fie transmis depășesc pragul sau semnalul de fundal. Valorile Ct mai mari indică concentrații mai mici ale șablonului și invers. Valorile Ct ale probelor NTC au fost la fel de mari pe cât era de așteptat. Diferența de \(\aproximativ 3\) valori Ct între controlul pozitiv și proba de testare indică în plus că fiecare probă de testat are aproximativ 1% șablon în comparație cu controlul pozitiv. Am discutat anterior că ampliconii mai lungi conduc la o sensibilitate mai bună. Amplificarea fragmentelor mai lungi izolate din probe de mediu eterogene este o provocare, având în vedere dezavantajele de concentrație virală scăzută și degradare a ARN. Cu toate acestea, cu protocolul nostru de îmbogățire a virusului și amplificare prin PCR, am reușit să amplificam cu succes fragmentul \(503\,\hbox {bp}\) pentru detectarea electrochimică.
Figura 6 prezintă rezultatele senzorului electrochimic al fragmentului de amplicon \(503\,\hbox {bp}\), ambele utilizând ADNc nediluat ca șablon (1:1) și ADNc diluat de 100 de ori ca șablon (1:100) efectuată PCR , în comparație cu NTC și PC (vezi Figura S4 din Informații suplimentare pentru voltamograme reprezentative). Fiecare casetă din diagrama de casetă din Figura 6 conține măsurători de la trei probe la 5 electrozi. Aceiași electrozi au fost utilizați pentru a măsura toate probele pentru a evita erorile datorate electrodului. -la variație electrod. În comparație cu măsurătorile CV, măsurătorile DPV arată o rezoluție mai bună pentru a distinge probele de testare și PC de NTC-uri deoarece, așa cum sa menționat anterior, curenții Faradaici sunt ascunși din cauza curenților capacitivi de fond din acestea din urmă. Pentru ampliconii mai lungi, am observat că controlul negativ (NTC) a dus la curenți de vârf CV și DPV mai mari în comparație cu controlul pozitiv, în timp ce probele de testare pozitive și nediluate au arătat înălțimi de vârf similare ale curenților de vârf DPV. Valorile medii și mediane măsurate pentru fiecare nediluat (1:1). ) proba de testare și PC-ul pot fi rezolvate clar de la ieșirea senzorului pentru proba NTC, în timp ce rezoluția pentru proba diluată 1:100 este mai puțin pronunțată. Pentru o diluție de 100 de ori a ADNc, nu am observat nicio bandă în timpul electroforezei pe gel. (benzile nu sunt afișate în Figura 5), iar curenții de vârf DPV și CV corespunzători au fost similari cu cei așteptați pentru NTC. Rezultatele pentru fragmentul \(117\,\hbox {bp}\) sunt afișate în Informații suplimentare. controlul a indus un răspuns electrochimic de la senzorul PCB datorită adsorbției de MB liber pe electrod și interacțiunii MB cu oligonucleotida primer monocatenară. Prin urmare, de fiecare dată când este testată o probă, trebuie efectuat un control negativ și curentul de vârf al probei de testat în comparație cu curentul de vârf obținut de controlul negativ pentru a obține o măsurătoare diferențială (relativă)39,40 pentru a clasifica proba de testat ca pozitivă sau negativă.
(a) DPV și (b) curent de vârf CV pentru detectarea electrochimică a fragmentelor \(503\,\hbox {bp}\) în probele de apă de lac. Probele de testare au fost măsurate în trei exemplare și comparate cu martori fără șablon (NTC) și controale pozitive (PC).
Descoperirile noastre ilustrează diferite mecanisme care afectează performanța senzorilor electrochimici pentru ampliconi de lungimi diferite pentru ADN-uri diferite, cu concentrații verificate prin măsurători optice folosind un spectrofotometru UV/Vis. Observațiile noastre subliniază ideea că fragmentele de ADN mai lungi de până la \(\aprox\) \(500\,\hbox {bp}\) poate fi detectat cu o sensibilitate mai mare și că prezența sării în probă nu influențează Sensibilitatea Concentrația de ADN care afectează o sensibilitate mai mare (rar \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) și mai sus). În plus, am investigat efectul diferitelor tipuri de probe, inclusiv ampliconii purificați cu gel cu și fără sare adăugată și adăugarea de probe de apă de lac în măsurătorile DPV și CV.Am observat că DPV a oferit o rezoluție mai bună, deoarece curentul capacitiv de fundal afectează și măsurarea CV, făcând-o mai puțin sensibilă.
Amplificarea fragmentelor mai lungi depinde de integritatea ARN-ului genomic viral. Mai multe studii au arătat că amplificarea fragmentelor mai lungi nu este întotdeauna eficientă datorită degradării ARN-ului în mediu și a potențialului de îmbinare în timpul izolării11,41,42,43,44. .Am observat că metoda de concentrare a virusului pe bază de PEG a fost mai eficientă în concentrarea fagului Phi-6 adăugat în probele de apă de lac decât metoda de concentrare a virusului pe bază de hidroxid de aluminiu. Capacitatea de a detecta fragmente lungi de ADN s-a dovedit a depăși cerințele pentru PCR multiplex pentru a amplifica mai multe șabloane de lungime mai scurtă și pentru a reduce posibilitatea de specificitate încrucișată.
Probele biologice sunt rare, deci este nevoie de proiectarea unui biosenzor care necesită probe minime pentru testare. Electrozii ENIG PCB utilizați în acest studiu au necesitat doar \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) probe pentru testare pentru a acoperi suprafața efectivă a electrozilor. În plus, același electrod poate fi reutilizat după curățare înainte de a distribui următoarea probă. Probele amplificate nu necesită adăugarea de alte substanțe chimice decât albastrul de metilen, care este un produs ieftin. și substanțe chimice utilizate în mod obișnuit. Deoarece fiecare electrod costă aproximativ 0,55 USD (sau 40 INR) pentru fabricare, acest biosenzor poate fi o alternativă rentabilă la tehnologiile de detectare existente. Fragmente de ADN din probe eterogene.
Având în vedere că protocoalele de detecție electrochimică bazate pe MB se bazează pe specificitatea PCR, o limitare majoră a acestei metode este potențialul de amplificare nespecifică în probe eterogene, cum ar fi apa uzată și apa de lac sau utilizarea primerilor de puritate scăzută. Pentru a îmbunătăți sensibilitatea metode de detectare electrochimică pentru detectarea ADN-ului produselor PCR nepurificate folosind electrozi ENIG PCB nemodificați, este necesar să se înțeleagă mai bine erorile introduse de dNTP și primeri neutilizați și să se optimizeze condițiile de reacție și protocoalele de testare. Parametri fizico-chimici suplimentari, cum ar fi pH-ul, temperatura și biologicul Este posibil să fie necesară măsurarea cererii de oxigen (BOD) a probei de apă pentru a îmbunătăți acuratețea măsurării.
În concluzie, propunem un senzor electrochimic ENIG PCB cu costuri reduse pentru detectarea virusului în probele de mediu (apa lacului). Spre deosebire de electrozii oligonucleotidici imobilizați sau substraturile personalizate pentru detectarea ADN-ului care necesită stocare criogenică pentru a menține sensibilitatea53,54, tehnica noastră folosește PCB nemodificat. electrozi cu o durată de valabilitate mai lungă și fără cerințe specifice de depozitare și, prin urmare, potriviți pentru dezvoltarea de soluții de măsurare cu procesare automată a probelor implementate în LMIC-uri. Biosenzorul utilizează coloranți redox (MB) care intercalează ADN-ul ieftin pentru detectarea rapidă a ampliconilor țintă. Amplificarea nespecifică comună în probele de mediu reduce specificitatea acestei metode de detectare datorită legării nespecifice a MB-urilor la oligonucleotidele monocatenar sau dublu. Prin urmare, specificitatea acestui test depinde de optimizarea primerilor și a condițiilor de reacție PCR. În plus, CV-ul și curenții de vârf DPV obținuți din probele testate trebuie interpretate în raport cu răspunsurile obținute de la controlul negativ (NTC) pentru fiecare test. Designurile și metodele senzorilor electrochimici prezentate în această lucrare pot fi integrate cu autosamplere pentru a dezvolta un sistem complet automatizat și scăzut. - soluție de cost care poate colecta și analiza probe și transmite fără fir rezultatele înapoi la laborator.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Methods for initial concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies.J.Aplicație.microorganism.115, pp. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Virusuri pe bază de apă: Bariere în calea apei potabile sigure.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.Epidemiologia apelor uzate pentru supravegherea la scară largă rentabilă a COVID-19 în țările cu venituri mici și medii: provocări și oportunități.Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Albastru de metilen ca discriminator electrochimic al oligonucleotidelor monocatenar imobilizate pe substraturi de aur. Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparația intercalatorilor de cationi și anioni pentru transducerea electrochimică a hibridizării ADN prin transfer de electroni pe distanță lungă.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Transferul de sarcină prin ADN: un biosenzor ADN electrochimic selectiv.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Dispozitiv microfluidic PCR în timp real cu detecție electrochimică concomitentă.senzor biologic.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. Studiul mecanismului de semnalizare și verificarea performanței unui sistem electrochimic de PCR în timp real bazat pe interacțiunea albastrului de metilen cu ADN. Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG și colab. Senzor electrochimic bazat pe amplificare izotermă mediată de buclă pentru detectarea sars-cov-2 în probele de apă uzată.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Detecție electrochimică a ampliconilor SARS-CoV-2 cu electrozi PCB. Senzorul este activat.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Detectarea eficientă a ARN-ului SARS-CoV-2 în fracția solidă a apei uzate.știință.mediu general.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. și colab. Metode analitice pentru detectarea SARS-CoV-2 în apele reziduale: Protocol și perspective viitoare.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Supraviețuirea bacteriofagului învelit Phi6 (un surogat pentru SARS-CoV-2) în picături de saliva evaporate depuse pe suprafețele de sticlă.știință.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Persistența de mediu a unui surogat SARS-CoV-2 (Phi6) în ameba cu viață liberă.J.Sănătatea apei 20, 83 (2021).
Mindich, L. Ambalare precisă a trei fragmente genomice de bacteriofag ARN dublu catenar\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Secondary structure of the DH ARN phage\(\varphi\)6 package region.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – Un protocol rapid și eficient pentru prepararea stocurilor de laborator de bacteriofagi.PeerJ 4, e2261 (2016).
Ora postării: 27-mai-2022