د Nature.com د لیدلو لپاره مننه. د براوزر نسخه چې تاسو یې کاروئ د CSS لپاره محدود ملاتړ لري. د غوره تجربې لپاره، موږ وړاندیز کوو چې تاسو یو تازه براوزر وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت بند کړئ) په ورته وخت کې، ډاډ ترلاسه کړئ دوامداره ملاتړ، موږ به سایټ پرته له سټایلونو او جاواسکریپټ څخه ښکاره کړو.
د چاپیریال د نمونو د څارنې اهمیت د COVID-19 وبا له پیل راهیسې خورا ستایل شوی، او د څارنې ځینې هڅې د سرو زرو معیارونو په کارولو سره ترسره کیږي، که څه هم د qPCR پر بنسټ تخنیکونه ګران دي. د الکترو کیمیکل DNA بایوسینسر کولی شي د احتمالي لګښت اغیزمن چمتو کړي. په ټيټ او منځني عاید لرونکو هیوادونو کې د چاپیریال د اوبو د نمونو د څارنې لپاره د حل حل. پدې کار کې، موږ د ENIG په کارولو سره د Phi6 phage څخه جلا شوي د سپیک جھیل د اوبو نمونو څخه جلا شوي (د SARS-CoV-2 لپاره یو مشهور سروګیټ) څخه ترلاسه شوي امپلیکون الیکرو کیمیکل کشف په ډاګه کوو. د سطحی ترمیم پرته د PCB الکترودونو بشپړولو لپاره.جنس. د الیکرو کیمیکل سینسر غبرګون په بشپړ ډول د مختلف اوږدوالي دوه DNA ټوټو لپاره مشخص شوی و (\({117}\,\hbox {bp}\)\({503}\,\hbox {bp}\))، او د PCR ماسټر مکسونو کې د مالګې اغیزې په میتیلین نیلي (MB) -DNA متقابل عمل کې. زموږ پایلې ښیې چې د DNA ټوټې اوږدوالی د پام وړ د بریښنا کیمیکل حساسیت ټاکي او پدې کار کې ښودل شوي چې د PCR محصولاتو جیل پاکولو پرته د اوږد امپلیکون کشف کولو وړتیا ده. د اوبو د نمونو په حالت کې اندازه کولو لپاره مهم دی.د ویروس بار لپاره بشپړ اتوماتیک حل ښه بوډ کوي.
د اوبو له لارې د ویروس لیږد د 1940 لسیزې راهیسې د عامې روغتیا د خطر په توګه پیژندل شوی، د پولیو او هیپاتیت E1 د اوبو څخه د لیږد لومړنی شواهدو سره. د روغتیا نړیوال سازمان (WHO) د اوبو څخه ډیری ویروسي ناروغۍ طبقه بندي کړي چې د منځني او لوړ روغتیا اهمیت لري 2. دودیز ویروس د کشف میتودونه د سرو زرو معیاري qPCR پر بنسټ تخنیکونو باندې تکیه کوي، کوم چې خورا حساس او ځانګړي دي، مګر د قیمتي وسایلو په کارولو سره په لابراتوار کې د ازموینې لپاره ماهر پرسونل ته اړتیا لري. په هرصورت، په ټیټ او منځني عاید هیوادونو (LMICs) کې د محدودو سرچینو سره، انسانان د نمونې ازمایښت احتمال لري د چاپیریال د اوبو نمونې نظارت ته لومړیتوب ورکړي. له همدې امله ، په ټیټ او متوسط عاید لرونکو هیوادونو کې د اوبو او فاضله اوبو نمونو دوامداره ، ریښتیني وخت څارنې لپاره د بدیل ټیټ لګښت میتودونو ته اړتیا لیدل کیږي ځکه چې د راپورته کیدونکي ناروغیو خپریدو دمخه خبرداری ، په دې توګه دوی د ویروس پانډیمیک له سخت ټولنیزو اقتصادي اغیزو څخه ساتي. د نیوکلیک اسیدونو لپاره د ټیټ لګښت الیکټرو کیمیکل بایوسینسر کولی شي د دې نه پوره کیدو اړتیا ته د امید وړ احتمالي حل چمتو کړي. ډیری د دې DNA بایوسینسرونه د دې حقیقت له مخې کار کوي چې د DNA بشپړونکي سټینډونه په الیکټروډ کې متحرک دي. سطحه او هایبرډیز کول کله چې په نمونه کې د مطابقت ترتیب شتون ولري. دا بیا د مختلف الیکټرو کیمیکل تخنیکونو په واسطه د ریډکس منځګړیتوبونو لکه پوتاشیم اوسپنې/فیروکیانایډ په کارولو سره په سیګنال بدلیدلی شي. میتیلین نیلي (MB) یو له ورته redox-فعال مالیکول دی چې لري. راپور ورکړل شوی چې په دوه اړخیزه DNA (dsDNA) کې د یو بل ډنډ شوي DNA5,6 سره د دې نور غیر مشخص پابندۍ سربیره. د سینسر تشکیلات 5,6,7,8,9. سره له دې چې د DNA سره د MB متقابل عمل غیر مشخص دی، او د دې الیکرو کیمیکل سینسر ځانګړتیا په لویه کچه د PCR یا isothermal amplification لپاره کارول شوي پرائمرونو په پاکوالي پورې اړه لري، دا د اصلي پلي کولو لپاره مناسب دی. د وخت الیکټرو کیمیکل پراساس qPCR یا فلوروسینس isothermal امپلیفیکیشن د DNA غلظت اندازه کولو لپاره د بدیل په توګه 9 . په ورته پلي کولو کې ، Won et al. د سرو زرو الیکټروډ سطح د ریښتیني وخت لپاره د 6-mercapto-1-hexanol (MCH) سره تعدیل شوې. د ډیفرنشل پلس ولټامیټري (DPV) په کارولو سره د MB سره د PCR امپلیکون اندازه کول 9. په نورو حالتونو کې ، Ramirez et al. د RT-LAMP عکس العمل په واسطه په فاضله اوبو کې د SARS-CoV-2 کشف کول د سکرین چاپ شوي الیکټروډونو سره د MB په کارولو سره. پلاتین الکترودونه هم ترسره شوي. د مایکرو فلوایډیک PCR پلیټ فارم کې د سیټو الیکټروډونو په څیر کارول کیږي چې د عکس العمل په جریان کې د الیکټرو کیمیکل ډول امپلیکون کشف کولو لپاره ډیزاین شوی 8 . دا ټولې مطالعې د الیکټروډونو سطحې ترمیم ته اړتیا لري ، د دې فعال شوي الیکټروډونو ثبات لپاره د ځانګړي ذخیره کولو اړتیاو له امله د تولید او عملیاتي لګښتونو زیاتوالی معنی لري.
د جھیل د اوبو په نمونو کې د متمرکز ویروس ذراتو څخه ترلاسه شوي امپلیکونونو الیکرو کیمیکل کشف لپاره د کاري فلو سکیمیک.
موږ پدې وروستیو کې د SARS-CoV-2 امپلیکونونو الیکرو کیمیکل سینسنګ د ټیټ لګښت چاپ شوي سرکټ بورډ (PCB) الکترودونو سره د DPV او سایکلیک ولټامیټري (CV) پراساس د غیر ترمیم شوي الیکټروډونو په سطحه د MB-DNA کمپلیکسونو جذبولو لخوا هڅول شوي ) په چوکۍ کې بدلونونه ښودلي. اوسنی11.موږ راپور ورکوو چې د DNA اوږدې ټوټې (N1-N2, \({943}\, \hbox) د CDC لخوا وړاندیز شوي N1 فارورډ او N2 ریورس پریمرونو په کارولو سره رامینځته شوي د لنډو برخو په پرتله {bp}\)) د سینسر غبرګون کې غوره خطي ښودلې. (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) د N1 فارورډ او N1 ریورس پریمر سیټونو په کارولو سره رامینځته شوی. دا مطالعات د نیوکلیز څخه پاکو اوبو کې چمتو شوي DNA کمولو په کارولو سره راپور شوي. پلیټ فارم د SARS-CoV کشف کولو لپاره هم کارول شوی و. -2 د فاضله اوبو په نمونو کې امپلیکون (د SARS-CoV-2 RNA سره د ټولو RNA نمونو د سپکولو له لارې ترلاسه شوي) .ځکه چې RNA د انزوا او لاندې پروسس کولو په جریان کې د شین کولو لپاره حساس دی، 12,13 د دې متفاوت نمونې سره د اوږدې ټوټې پراخول ستونزمن کار دی. له همدې امله، په فاضله اوبو کې د SARS-CoV-2 amplicon د الکترو کیمیکل سینسنګ مظاهره د لنډ \(72\,\hbox {bp}\) N1 ټوټې پورې محدوده ده.
په دې کار کې، موږ د ENIG PCB پر بنسټ د فیز Phi6 د الیکرو کیمیکل سینسنګ امکانات وڅیړل او د جهيل د اوبو نمونو څخه جلا شوي (انځور 1). Phi6 فاجونه د اندازې (80-100 nm) سره د SARS-CoV-2 سره د پرتلې وړ دي. د لپید جھلی او سپک پروټین هم لري. د دې دلیلونو لپاره، باکتریوفیج Phi6 د SARS-CoV-2 او نورو پوښل شوي رنځجنیک RNA ویروسونو 14,15 لپاره یو مشهور سروګیټ دی. RNA د فیز ذرات څخه جلا شوی د cDNA ترکیب لپاره د نمونې په توګه کارول کیده. PCR په اوږدوالي کې د 117 او 503 بیس جوړه دوه DNA ټوټې ترلاسه کولو لپاره. زموږ په تیرو کار کې د N1-N2 ټوټې پراخولو ننګونې ته په پام سره، موږ د منځني اوږدوالی ټوټې په نښه کوو (\(117) \,\hbox {bp}\) او \(503 \,\hbox {bp}\))، د شته پرائمرونو پراساس. د الیکرو کیمیکل سینسر غبرګون په سیستماتیک ډول د پراخه غلظت سلسلې کې مطالعه شوی (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) ته \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) د دواړو برخو لپاره د MB شتون، د سینسر په ځواب کې د مالګې اغیز مشخص شوی او د سپیکٹرو فوټومیټریک اندازه کولو لخوا تایید شوی. د دې کار اصلي ونډې په لاندې ډول دي:
د DNA ټوټې اوږدوالی او په نمونه کې د مالګې شتون حساسیت په کلکه اغیزه کوي.زموږ پایلې ښیي چې الیکټرو کیمیکل فعالیت د MB، DNA، او سینسر د متقابل عمل مختلف میکانیزمونو پورې اړه لري، د ولټامیتریک غبرګون کې د DNA غلظت او اوږدوالی پورې اړه لري، د اوږدې ټوټې سره لوړ حساسیت ښیي، که څه هم مالګه د الیکټروسټاټیک تعامل په اړه منفي اغیزه لري. MB او DNA.
د DNA غلظت په غیر تعدیل شوي الیکټروډونو کې د MB-DNA متقابل عمل میکانیزم ټاکي موږ وښیو چې د MB-DNA متقابل عمل مختلف میکانیزمونه د DNA غلظت پورې اړه لري. د DNA غلظت د لږ مقدار څخه ښکته \ {l}}}\)، موږ ولیدل چې د الکترو کیمیکل اوسنی غبرګون په عمده توګه په الکتروډ کې د MB-DNA جذبولو لخوا ټاکل شوی و، پداسې حال کې چې په ټیټ غلظت کې د DNA لوړ غلظت کې، د الکترو کیمیکل اوسنی غبرګون د ریډکس د سټیریک مخنیوی لخوا ټاکل شوی و. د DNA اساس جوړو ترمنځ د MB داخلولو له امله فعالیت.
د جهيل د اوبو په نمونو کې د ويروسي نيوکليک اسيدونو د ENIG PCB پر بنسټ د الکترو کيمياوي حساسيت دا مشاهدې د Phi6-اضافه شوي \(503\,\hbox {bp}\) DNA ټوټې د پووای جهيل، IIT ممبۍ کیمپس څخه د اوبو له نمونو څخه ترلاسه شوي د الکترو کیمیکل کشف لخوا تایید شوي. د پایلې مرحله.
د پلي کولو ټیټ لګښت او په بشپړ ډول اتوماتیک نظارت سیسټمونو کې د ادغام احتمال ، oligonucleotides یا aptamers په الکترودونو کې د اوږد شیلف ژوند سره.
Phage Phi6 د Cytoviridae د کورنۍ یو پوښل شوی dsRNA ویروس دی چې په Pseudomonas syringae اخته کوي. د Phi6 phage جینوم د دریو برخو په بڼه شتون لري: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\))، M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) او L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\)) 16,17. څرنګه چې د Phi6 فیز یو غیر رنځونکی BSL-1 Pseudomonas فشار اخته کوي، د کارولو لپاره خوندي دی. او په لابراتوار کې په اسانۍ سره کرل کیدی شي. Phage Phi6 او د هغې کوربه Pseudomonas syringae د باکتریا ویروسونو لپاره د فیلیکس d'Herelle حواله مرکز، لاوال پوهنتون، کاناډا څخه اخیستل شوي (د حوالې مرکز کتلاګ شمیرې په ترتیب سره HER-102 او HER-1102 دي) Phi6 Phage او د هغې کوربه د حوالې مرکز لخوا لارښوونې سره سم بیا راژوندي شوي. Phage Phi6 د پلیټ لیسز او ایلیوشن لخوا پاک شوی ترڅو د \(\ شاوخوا 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox} سره وروستی ټیکر ترلاسه کړي. ml}}\) (پلاک جوړونکي واحدونه/ ملی لیټرونه).RNA د تولید کونکي لارښوونو سره سم د GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) په کارولو سره د پاک شوي فیز ذرات څخه جلا شوی و. 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) lysed شوی و او lysate په سپن کالم کې بار شوی و ترڅو RNA ته اجازه ورکړي چې د رال کالم سره وصل شي .بیا RNA د ایولوشن محلول کې ایستل کیږي \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) د کټ لخوا چمتو شوی. د RNA غلظت د جذب په واسطه په \(260\,\hbox {nm}\) کې اټکل کړئ. RNA په aliquots کې ذخیره شوی و. ({-80}\,{^{\circ}\hbox {C}}\) تر بل کارونې پورې.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) د iScript cDNA ترکیب کټ (Bio -Rad لابراتوارونه) د جوړونکي لارښوونو سره سم د cDNA ترکیب لپاره د یوې نمونې په توګه کارول کیده. په لنډه توګه، د cDNA ترکیب عکس العمل په 3 مرحلو مشتمل دی: لومړی په \({25}\,{^{\circ}\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , د \({20}\,{\hbox {min}}\) په \({46}\,{^{\circ) کې د نقل نقل }\hbox {C}}\)، او ریورس ریکارډر په \({95}\,{^{\circ}\hbox {C}}\) د \({1}\,{\hbox {min) لپاره دی }}\).کله چې په 1% agarose جیل چلول کیږي، cDNA درې بانډونه وښودل چې د اټکل شوي دریو RNA ټوټې سره مطابقت لري (ډیټا نه ښودل شوي). لاندې پرائمرونه د 117 او 503 bp اوږدوالي دوه DNA ټوټې پراخولو لپاره کارول شوي، په miniPCR® mini8 حرارتي سایکلر کې د PCR لپاره د نمونې په توګه د cDNA کارول:
د \(117\,\hbox {bp}\) او \(503\,\hbox {bp}\) لپاره پرائمرونه په ترتیب سره د M برخې د 1476-1575 نیوکلیوټایډونو او د L برخې 458-943 نیوکلیوټایډونو سره مطابقت لري. .ټول پراخ شوي PCR محصولات په 1٪ agarose جیلونو الیکٹروفورس شوي وو، او پراخ شوی هدف DNA د GeneJET جیل استخراج کټ (Thermo Fisher Scientific) په کارولو سره پاک شوی و.
د IIT ممبۍ کیمپس کې یو جهيل (Powai Lake, Powai, Mumbai) د فیز ذرات اضافه کولو لپاره کارول کیده. د جهيل اوبه د \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) جھلی له لارې فلټر شوي ترڅو لرې شي. تعلیق شوي ذرات، او بیا Phi6 فیز اضافه شول. د \({1}\,{\hbox {ml}}\) د \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} اضافه کړئ \) ته \({100}\ ,{\hbox {ml}}\) فلټر شوي جهيل اوبه، په \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\) کې. یو کوچنی الکوت و. د پلاک assay په واسطه د ویروس بار اندازه کولو لپاره ساتل شوي. موږ د سپک شوي Phi6 ویروس ذرات متمرکز کولو لپاره دوه مختلف میتودونه ازمویل: (1) د المونیم هایدروکسایډ جذب کولو - باران میتود، 19 چې د چاپیریال نمونو څخه د ډیری پوښل شوي RNA ویروسونو غلظت لپاره تایید شوی، او (2)) د پولیتیلین ګلایکول (PEG) پر بنسټ د ویروس غلظت میتود د سیلاب او نور څخه تطابق شوی.20 .ځکه چې د PEG-based میتود د بیا رغونې موثریت د المونیم هایدروکسایډ میتود په پرتله ښه وموندل شو، د PEG-based میتود د جهيل د اوبو نمونو څخه د Phi6 ذرات متمرکز کولو لپاره کارول کیده.
د PEG میتود په لاندې ډول کارول شوی و: PEG 8000 او \(\hbox {NaCl}\) د 8٪ PEG 8000 او \(0.2\,\hbox {M} \) ترلاسه کولو لپاره د Phi6-spiced جهيل اوبو نمونو کې اضافه شوي \ hbox {NaCl}\. نمونې په شیکر کې اچول شوې وې\({4}\,{^{\circ}\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ )، بیا په \(4700 \,\hbox {g}\) کې سنټرفیوج شوی \({45}\,{\hbox {min}}\) دی. سپرناټینټ پریږدئ او په \({1}\, {\hbox {ml}}\) په ورته سپرناټینټ کې. ټولې سپیکینګ او د ویروس غلظت تجربې په درې اړخیزه توګه ترسره شوې. د غلظت وروسته، یو کوچنی الیکوټ د پلاک assay په واسطه د بیا رغونې موثریت اندازه کولو لپاره ساتل شوی و. RNA جلا شوی و لکه څنګه چې مخکې تشریح شوی او روښانه شوی. په کټ کې چمتو شوي الیوشن بفر\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\).ځکه چې د RNA غلظت به له نمونې څخه نمونې ته په درې اړخیزه توګه توپیر ولري، \({2}\,{\upmu \ د RNA hbox {l}}\) د ټولو دریو لپاره کارول کیږي پرته لدې چې د هغې غلظت په پام کې نیولو سره د نمونو cDNA ترکیب ترسره شي. cDNA ترکیب لکه څنګه چې مخکې تشریح شوی و. د \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR لپاره د 35 دورې لپاره د ټیمپلیټ په توګه کارول شوی ترڅو پراخ شي \ (117\,\hbox {bp}\) او \(503\,\hbox { bp}\) ټوټې. دا نمونې د "1: 1″ په توګه ښودل شوي، د بیلګې په توګه پرته له کمولو څخه. A no-template control (NTC) د منفي کنټرول په توګه تنظیم شوی و، پداسې حال کې چې د RNA په کارولو سره یو cDNA ترکیب شوی د پاک شوي فیز څخه جلا شوی. د مثبت کنټرول (PC) لپاره د یوې نمونې په توګه. کمیتي PCR (qPCR) په سټراټیجین Mx3000P RT-PCR وسیله کې د بریلینټ III الټرا فاسټ SYBR شنه QPCR ماسټر مکس (Agilent ټیکنالوژۍ) په کارولو سره ترسره شو. بیان شوي. د سایکل حد (Ct) د ټولو نمونو لپاره ثبت شوی و. سربیره پردې، ککړ شوي نمونې \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) د cDNA په کارولو سره د 1:100 په فلټر شوي جهيل اوبو کې ککړ شوي. \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR د 35 دورو لپاره. دا نمونې د "1:100″ په توګه ښودل شوي.
د PCB الیکټروډونه په سوداګریزه توګه شتون لري د ټیټ لګښت الیکټرو لیس نکل عمیق سرو زرو (ENIG) پروسې په کارولو سره جوړ شوي دي پرته له دې چې اضافي سرو زرو ته اړتیا ولري. د پرانها محلول یا د سلفوریک اسید سایکلیک ولټامیټري سپارښتنه نه کیږي ځکه چې دوی کولی شي د سرو زرو د پتلي طبقې د خلاصیدو لامل شي (د ضخامت \(\nm }\)) او د مسو لاندې پرتونه افشا کړي چې زیانمن دي. 21, 22, 23, 24, 25. نو له دې امله، الکترودونه د لینټ څخه پاک ټوکر سره پاک کړئ چې د IPA سره لندبل شوي. هغه نمونه چې ازموینه کیږي د \({50}\,{\upmu\hbox {M}) سره مینځل شوي. }\) MB په \({4}\,{^{\circ}\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) د اسانه داخلولو لپاره. زموږ په پخواني کار کې ، موږ ولیدل چې د سینسر حساسیت او خطيتوب د 11 MB غلظت په زیاتولو سره ښه شوی و. زموږ په پخوانیو کارونو کې د راپور شوي اصلاح پراساس، موږ \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB کاروو. په دې څیړنه کې د DNA د ځای په ځای کولو غلظت. د ډبل سټنډ شوي DNA (ds-DNA) الیکټرو کیمیکل کشف د انیونک یا کیټینیک انټرکلیټرونو په کارولو سره ترلاسه کیدی شي. که څه هم انیونک انټرکلیټرونه د غوره انتخاب سره DNA کشف کوي ، دوی د شپې انکیوبیشن ته اړتیا لري چې په پایله کې د کشف وخت اوږد وي. له بلې خوا، د کیشنیک انټرکلیټرونه لکه MB د ds-DNA6 الکترو کیمیکل کشف لپاره نږدې د انکیوبیشن لنډ وخت ته اړتیا لري، نږدې \({1}\,{\hbox {h}}\) په هره اندازه کې د نمونې توزیع کول شامل دي چې ازمول کیږي. الیکټروډ\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\)، بیا د IPA لندبل شوي غالۍ سره پاکول، مخکې له دې چې د بلې نمونې سره پرمخ لاړ شي.یوه اندازه. هره نمونه په 5 مختلف الیکټروډونو کې ازمول شوې وه پرته لدې چې بل ډول وویل شي. د DPV او CV اندازه کول د پام سینس حساس سمارټ پوټینټیوسټټ په کارولو سره ترسره شوي، او د PSTrace سافټویر د potentiostat ترتیب او ډیټا استملاک لپاره کارول شوی و، په شمول د لوړ اوسني محاسبې. لاندې ترتیبات کارول کیږي. د DPV او CV اندازه کولو لپاره:
DPV: د توازن وخت = \(8\,\hbox {s}\), ولتاژ مرحله = \(3\,\hbox {mV}\), د نبض ولتاژ = \(25\,\hbox {mV}\), د نبض موده = \(50\,\hbox {ms}\), د سکین کچه = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: د توازن وخت = \(8\,\hbox {s}\)، د ولتاژ مرحله = \(3\,\hbox {mV}\)، د سویپ نرخ = \({300}\,\hbox {mV/s) }\)
د DNA د ولټاموگرامونو څخه ترلاسه شوي لوړ جریان د \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV او CV ولټاموګرامونه د ENIG PCB الکترودونو \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB د DNA سره پیچلي شوي (په 10–\({20}\,{\ hbox {ng غلظت کې) ترلاسه شوي }/{\upmu \hbox {l}}}\) یعنی 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) د \(117\,\hbox {bp}\) او 0.03 لپاره –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) د \(503\,\hbox {bp}\) لپاره. نمایندګي ولټاموګرامونه په اضافي معلوماتو کې په S1 شکل کې ښودل شوي. شکل 2 پایلې ښیې. د جیل پاک شوي PCR محصولاتو په کارولو سره د DPV او CV اندازه کول (د اوسني لوړ حد). په بکسپلوټ کې د هر بکس لپاره د 5 الیکټروډونو اندازه شامله ده. ټولې اندازې د الیکټروډونو ورته سیټ کاروي ترڅو د الیکټروډ څخه تر الیکټروډ توپیر له امله د اندازه کولو غلطیو څخه مخنیوی وشي. موږ د DNA د ټیټ غلظت لپاره د DPV او CV اندازه شوي لوړ جریان کې زیاتوالی لیدلی. , اوږد (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ د \(117) ) ټوټې په پرتله. دا زموږ په تیرو کارونو کې راپور شوي د الیکټروډ جذب متوقع رجحان سره مطابقت لري. د MB-DNA کمپلیکس جذب په الیکټروډ کې د چارج لیږد اسانه کوي، کوم چې د لوړ اوسني لوړوالي سره مرسته کوي. نورو څیړنو د MB-DNA انټرکلیشن باندې د اولیګونیوکلیوټایډ اندازې او ترتیب اغیزه ښودلې ده 27,28,29,30. ګوانین - د دوه امپلیکونونو (\(117\,\hbox {bp}\) او \(503\,\hbox {bp}\)) منځپانګه نږدې 50٪ وه، دا په ګوته کوي چې د مشاهدې توپیر له امله دی. په هرصورت، د لوړ DNA غلظت لپاره (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), د \(503\,\hbox {bp}) لپاره \) او \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) د \(117\,\hbox {bp}\)) لپاره، موږ دوه پراخوالی ګورو. د فرعي جریانونو لوړ جریان په DPV او CV دواړو اندازه کولو کې کم شوي دي. دا ځکه چې MB د DNA د اساس جوړه جوړه او مینځ ته راځي چې په پایله کې د MB31,32 کې د کمیدو وړ ګروپ ریډکس فعالیت سټیریک مخنیوی کوي.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
د PCR ماسټر مکسونو کې موجود مالګې د MB او DNA ترمنځ د الکتروسټټیک تعامل سره مداخله کوي، نو د \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) سره \({50} \,{\) اضافه کولو سره. upmu \hbox {M}}\) MB جیل پاک شوی محصول د MB-DNA تعامل باندې د مالګې اغیزې مطالعه کولو لپاره. لکه څنګه چې په 3 شکل کې ښودل شوي، موږ ولیدل چې د لوړ DNA غلظت لپاره (\(>{2}\,{\) hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) او \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) د \(117\,\hbox {bp} \)) لپاره، په DPV او CV کې د مالګې اضافه کول په اندازه کولو کې د پام وړ اغیزه نده کړې (د نمایندګۍ ولټاموگرامونو لپاره په اضافي معلوماتو کې S2 شکل وګورئ). د DNA غلظت ټیټ وي، د مالګې اضافه کول خورا حساسیت کموي، په پایله کې د DNA غلظت سره په اوسني کې د پام وړ بدلون نه راځي. د MB-DNA تعامل او تعامل باندې د مالګې ورته منفي اغیزې مخکې د نورو څیړونکو لخوا راپور شوي 33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) کیشنونه د DNA منفي فاسفیټ شاته هډوکي سره تړلي دي، په دې توګه د MB او DNA تر منځ د الیکټروسټیک تعامل مخه نیسي. د DNA په لوړ غلظت کې، د redox-active MBs سټراټیټ مخنیوی د ټیټ لوړ پوړ جریانونو په پایله کې پایله کوي، نو الیکټروسټاټیک تعاملات د سینسر غبرګون د پام وړ اغیزه نه کوي. مهم ټکی دا دی چې دا بایوسینسر د لوړ DNA غلظت موندلو لپاره غوره دی (په ندرت سره \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) یا لوړ) د چاپیریال د اوبو نمونو بشپړ اتومات پروسس کولو لپاره، چیرې چې د PCR محصولاتو جیل پاکول ممکن ممکن نه وي.
د DNA د مختلفو غلظتونو لپاره د 600-700 د طول موج د حد لپاره د جذب منحني ساحه د \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB سره پیچلې شوې: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) له مالګې سره او پرته (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) له مالګې سره او پرته (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) د DNA غلظت \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB نمونې نه DNA.
د پورته پایلو د لا تصدیق کولو لپاره، موږ د UV/Vis spectrophotometer (Thermo Scientific Multiskan GO) په کارولو سره نظری اندازه ترسره کړه، نمونې \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) د هر یو لپاره کارول شوي. اندازه کول. د جذب نښه د DNA غلظت په زیاتوالي سره کمیږي، لکه څنګه چې د موج اوږدوالی سلسلې \(600\,\hbox {nm}\) ته \(700\,\hbox} لپاره د جذب منحني ساحې له رجحان څخه لیدل کیدی شي. nm}\)، لکه څنګه چې په 4 شکل کې ښودل شوي (د جذب سپیکٹرم په شکل S3 کې په اضافي معلوماتو کې ښودل شوی). {l}}}\)، د DNA لرونکی او MB یوازې نمونو (د \(503\,\hbox {bp}\) او \(117\,\hbox {bp}\ لپاره) تر مینځ په اخستلو کې کوم مهم توپیر نه و. ) اوږدوالی ټوټې)، د redox-active MB د سټیریک مخنیوی نشتوالی په ګوته کوي. د لوړ DNA غلظت کې، موږ د جذب سیګنال کې تدریجي کمښت ولید او د مالګې په شتون کې د جذب کمښت یادونه وکړه. دا پایلې مالیکولر ته منسوب شوي. د DNA هایبرډونو کې د بیس سټیکینګ سره تعامل او سټیریک مخنیوی. زموږ پایلې د MB-DNA انټرکالیشن سپیکٹروسکوپي مطالعاتو په ادبیاتو کې د راپورونو سره مطابقت لري چې په \(\pi\)-\(\pi ^*\) کې د کمې انرژي کچې سره هایپوکرومیټیت تړاو لري ) برقی لیږدونه د منځګړیتوب پرتونو له امله 36, 37, 38.
Agarose gel electrophoresis of Phage Phi6: د PCR محصولات اوږدوالی \(117\,\hbox {bp}\) او \(503\,\hbox {bp}\) د جهيل د اوبو له نمونو څخه.M-DNA مارکر؛NTC-no-template کنټرول، پرائمرونه چې ورته امپلیکون لري؛د کمپیوټر مثبت کنټرول؛1, 2, 3-بې رنګه (1:1) د جهيل د اوبو نمونې په درې اړخیزه بڼه. یو بند په \(\(50\,\hbox {bp}\) کې د غیر استعمال شوي اولیګونیوکلیوټایډونو له امله په \(503\,\) کې لیدل کیږي. hbox {bp}\) لین.
موږ د سینسر کارونې ارزونه وکړه د Powai Lake د اوبو نمونو په کارولو سره چې د Phi6 phage سره سپک شوي دي. د RNA غلظت د فیز سپیک شوي اوبو نمونو څخه جلا شوی د 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox} پورې اړه لري. ml}}\)، پداسې حال کې چې د پاک شوي فیز تعلیق څخه جلا شوي RNA اټکل شوی و \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) د رغولو موثریت سره نږدې 1 %.RNA په cDNA کې نقل شوی او د PCR او qPCR لپاره د نمونې په توګه کارول شوی. د محصول اندازه د سینسر سره ازموینې دمخه د اګروز جیل الیکٹروفورسس (5 شکل) لخوا تایید شوې وه. دا نمونې جیل پاکې ندي او له همدې امله د PCR ټولې برخې لري. همدارنګه د ګټو امپلیکون. د Ct ارزښتونه چې د qPCR (جدول 1) په جریان کې ثبت شوي د RNA د غلظت سره تړاو لري چې د ورته سپیک شوي اوبو نمونو څخه جلا شوي. د Ct ارزښت د فلوروسینټ سیګنال لپاره اړین دورې ښیي. د حد یا شالید سیګنال څخه تجاوز وکړئ. د Ct لوړ ارزښتونه د ټیټ ټیمپلیټ غلظت په ګوته کوي او برعکس. د NTC نمونو د Ct ارزښتونه څومره چې تمه کیده لوړه وه. د Ct ارزښتونو ترمنځ توپیر مثبت کنټرول او د ازموینې نمونه نور په ګوته کوي چې د هرې ازموینې نمونه د مثبت کنټرول په پرتله نږدې 1٪ نمونه لري. موږ دمخه بحث وکړ چې اوږد امپلیکون د غوره حساسیت لامل کیږي. د زیانونو په پام کې نیولو سره د متفاوت چاپیریال نمونو څخه جلا شوي اوږده ټوټو پراخول ننګونه ده. د ټیټ ویروس غلظت او د RNA تخریب. په هرصورت، زموږ د ویروس بډایه کولو او د PCR امپلیفیکیشن پروتوکول سره، موږ وکولای شو چې د الکترو کیمیکل سینسنګ لپاره \(503\,\hbox {bp}\) ټوټه په بریالیتوب سره پراخه کړو.
شکل 6 د (503\,\hbox {bp}\) ټوټې امپلیکون د الکترو کیمیکل سینسر پایلې ښیي، دواړه د ټیمپلیټ (1:1) په توګه غیر منحل شوي cDNA کاروي او 100-fold diluted cDNA د ټیمپلیټ په توګه (1:100) ترسره شوي PCR. ، د NTC او PC په پرتله (د نمایندګۍ ولټاموګرامونو لپاره په ضمیمه معلوماتو کې شکل S4 وګورئ) په 6 شکل کې د بکسپلوټ هر بکس په 5 الیکټروډونو کې د دریو نمونو اندازه لري. ورته الیکټروډونه د ټولو نمونو اندازه کولو لپاره کارول شوي ترڅو د الیکټروډ له امله د غلطیو مخه ونیسي. د الکتروډ تغیرات. د CV اندازه کولو په پرتله، د DPV اندازه کول د ازموینې او PC نمونو د NTCs څخه توپیر کولو لپاره غوره حل ښیي ځکه چې لکه څنګه چې مخکې یادونه وشوه، فارادیک جریان په وروستي کې د شالید ظرفیتي جریانونو له امله پټ شوي. د اوږد امپلیکونونو لپاره، موږ ولیدل چې د منفي کنټرول (NTC) په پایله کې د مثبت کنټرول په پرتله د لوړ CV او DPV لوړ جریان رامینځته شوی ، پداسې حال کې چې مثبت او غیر منحل شوي ازموینې نمونې د DPV د چوټي جریانونو ورته لوړ لوړوالی ښیې. د ازموینې نمونه او PC د NTC نمونې لپاره د سینسر محصول څخه په واضح ډول حل کیدی شي ، پداسې حال کې چې د 1:100 کم شوي نمونې لپاره ریزولوشن لږ څرګند دی. د cDNA د 100-fold کمولو لپاره ، موږ د جیل الیکٹروفورسیس په جریان کې هیڅ بانډ ونه لیدل. (لاینونه چې په 5 شکل کې ندي ښودل شوي)، او اړونده DPV او CV لوړ جریان د NTC لپاره تمه شوي ورته ورته وو. د \(117\,\hbox {bp}\) ټوټې لپاره پایلې په اضافي معلوماتو کې ښودل شوي. منفي کنټرول د PCB سینسر څخه د الکتروډ کې د وړیا MB جذبولو او د واحد سټریډ پریمر اولیګونیوکلیوټایډ سره د MB تعامل له امله د الیکټرو کیمیکل غبرګون رامینځته کړی. له همدې امله ، هرکله چې نمونه ازموینه کیږي ، منفي کنټرول باید پرمخ یوړل شي او د ازموینې نمونې لوړ اوسني په پرتله د منفي کنټرول لخوا ترلاسه شوي د 39,40 توپیر (نسباتي) اندازه کولو لپاره ترلاسه شوي ترڅو د ازموینې نمونه مثبت یا منفي طبقه بندي کړي.
(a) DPV، او (b) د سی وی د کرنټ کرنټ د الیکټرو کیمیکل کشف لپاره د جھیل د اوبو په نمونو کې د \(503\,\hbox {bp}\) ټوټې. د ازموینې نمونې په درې اړخیزه اندازه اندازه شوې او د هیڅ ټیمپلیټ کنټرول (NTC) سره پرتله شوي او مثبت کنټرولونه (PC).
زموږ موندنې مختلف میکانیزمونه په ګوته کوي چې د مختلف DNAs لپاره د مختلف اوږدوالي امپلیکونونو لپاره د الیکټرو کیمیکل سینسرونو فعالیت اغیزه کوي ، غلظت د UV/Vis سپیکٹرو فوټومیټر په کارولو سره د نظری اندازه کولو لخوا تایید شوی. زموږ مشاهدې هغه بصیرت روښانه کوي چې د DNA ټوټې تر \(\ نږدې\) پورې اوږدیږي. \(500\,\hbox {bp}\) د لوړ حساسیت سره کشف کیدی شي او دا چې په نمونه کې د مالګې شتون د DNA غلظت حساسیت نه کوي چې په لوړ حساسیت اغیزه کوي (په ندرت سره \({\hbox {ng}/{\upmu) \hbox {l}}}\) او پورته). سربيره پردې، موږ د بيلابيلو ډولونو د نمونو اغيزې څيړلې، په شمول د جېل پاک شوي امپليکون په شمول د مالګې پرته او پرته، او د DPV او CV اندازه کولو کې د جهيل د اوبو نمونو اضافه کول.موږ ولیدل چې DPV غوره ریزولوشن چمتو کړی ، ځکه چې د شالید ظرفیت اوسني هم د CV اندازه کولو اغیزه کوي ، دا لږ حساس کوي.
د اوږدې ټوټو پراخول د ویروس جینومیک RNA په بشپړتیا پورې اړه لري. یو شمیر څیړنو ښودلې چې د اوږدې ټوټو پراخول په چاپیریال کې د RNA د تخریب او د جلا کیدو په وخت کې د جلا کیدو احتمال له امله تل اغیزمن نه وي 11,41,42,43,44 .موږ ولیدل چې د PEG پر بنسټ د ویروس غلظت میتود د المونیم هایدروکسایډ میشته ویروس غلظت میتود په پرتله د جهيل د اوبو په نمونو کې د فاج Phi-6 په تمرکز کولو کې خورا مؤثره و. د څو لنډ اوږدوالی ټیمپلیټونو پراخول او د کراس ځانګړتیا احتمال کمول.
بیولوژیکي نمونې کمې دي، نو د بایو سینسر ډیزاین کولو ته اړتیا ده چې د ازموینې لپاره لږترلږه نمونې ته اړتیا ولري. په دې څیړنه کې کارول شوي د ENIG PCB الکترودونه یوازې اړتیا لري \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) د ازموینې لپاره نمونې چې د الیکټروډ مؤثره ساحه پوښي. سربیره پردې، ورته الیکټروډ د بلې نمونې توزیع کولو دمخه د پاکولو وروسته بیا کارول کیدی شي. پراخ شوي نمونې د میتیلین نیلي پرته بل کوم کیمیاوي اضافه کولو ته اړتیا نلري، کوم چې ارزانه دی. او په عام ډول کارول کیمیاوي. څرنګه چې هر الیکټروډ د جوړولو لپاره شاوخوا $ 0.55 (یا 40 روپۍ) لګښت لري، دا بایوسینسر د موجوده کشف ټیکنالوژیو لپاره یو ارزانه بدیل کیدی شي. په متضاد نمونو کې د DNA ټوټې.
د دې په پام کې نیولو سره چې د MB-based الیکټرو کیمیکل کشف پروتوکولونه د PCR په ځانګړتیاو تکیه کوي، د دې میتود یو لوی محدودیت د متضاد نمونو لکه فاضله اوبو او د جهيل اوبه یا د ټیټ پاکوالي پرائمرونو په کارولو کې د غیر مشخص لوړولو احتمال دی. د نه بدلیدونکي ENIG PCB الکترودونو په کارولو سره د ناپاکو شوي PCR محصولاتو د DNA کشف کولو لپاره د الیکټرو کیمیکل کشف میتودونه ، دا اړینه ده چې د نه کارول شوي dNTPs او پریمرونو لخوا معرفي شوي غلطیو باندې ښه پوه شي ، او د عکس العمل شرایطو او د پروتوکولونو د ارزونې لپاره. د اوبو نمونې د اکسیجن تقاضا (BOD) ممکن د اندازه کولو دقت ښه کولو لپاره هم اندازه کولو ته اړتیا ولري.
په پایله کې، موږ د چاپیریال (د جهيل اوبو) نمونو کې د ویروس کشف کولو لپاره د ټیټ لګښت الیکټرو کیمیکل ENIG PCB سینسر وړاندیز کوو. د DNA سینس کولو لپاره غیر متحرک اولیګونیوکلیوټایډ الیکټروډونه یا دودیز سبسټریټونه چې د حساسیت ساتلو لپاره کریوجینک ذخیره ته اړتیا لري ، 53,54 زموږ تخنیک غیر ترمیم شوي PCB کاروي. الیکټروډونه د اوږد شیلف ژوند سره او د ذخیره کولو ځانګړي اړتیاوې نلري او له همدې امله په LMICs کې ځای پرځای شوي اتومات نمونې پروسس کولو سره د اندازه کولو حلونو پراختیا لپاره مناسب دي. بایوسینسر ارزانه DNA - انټرکلیټینګ ریډوکس رنګونه (MB) د هدف امپلیکون ګړندي کشف لپاره کاروي. غیر مشخص پراخه کول د چاپیریال په نمونو کې عام د دې سینس کولو میتود ځانګړتیا کموي ځکه چې د MBs د واحد او دوه اړخیزه اولیګونیوکلیوټایډونو سره د غیر مشخص پابندۍ له امله کموي. له همدې امله د دې ازموینې ځانګړتیا د پریمرونو او PCR عکس العمل شرایطو په اصلاح پورې اړه لري. سربیره پردې ، CV او د ازمول شوي نمونو څخه ترلاسه شوي DPV لوړ جریان باید د هرې ازموینې لپاره د منفي کنټرول (NTC) څخه ترلاسه شوي ځوابونو سره سم تشریح شي. پدې کار کې وړاندې شوي د الیکټرو کیمیکل سینسر ډیزاین او میتودونه د اتوماتیک او ټیټ تولید لپاره د آټوسیمپلر سره مدغم کیدی شي. - د لګښت حل چې کولی شي نمونې راټول او تحلیل کړي او په بې سیم ډول پایلې بیرته لابراتوار ته لیږدوي.
Cashdollar, J. & Wymer, L. د اوبو له نمونو څخه د ویروسونو د لومړني غلظت لپاره میتودونه: د وروستیو مطالعاتو بیاکتنه او میټا تحلیل.Application.microorganism.115، مخ 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL د اوبو څخه پیدا شوي ویروسونه: د څښاک پاکو اوبو ته خنډونه. PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Wastewater epidemiology د لګښت اغیزمن لوی پیمانه څارنې لپاره د COVID-19 په ټیټ او متوسط عايد لرونکو هیوادونو کې: ننګونې او فرصتونه. اوبه 13، 2897 (2021).
پالیسیک، ای او بارتوسیک، ایم نیوکلیک اسید الکترکیمیا.کیمیاوي. ریو.112، 3427–3481 (2012).
تاني، A.، تومسن، AJ او بټ، JN میتیلین نیلي د الیکټرو کیمیکل تبعیض په توګه د واحد او دوه اړخیزو اولیګونیوکلیوټایډونو په توګه چې د سرو زرو په فرعي برخو کې متحرک شوي. شنونکي 126، 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ د اوږد واټن الیکترون لیږد لخوا د DNA هایبرډیزیشن د بریښنایی کیمیاوي لیږد لپاره د Cation او Anion Intercalators پرتله کول.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
وانګ، EL او ګوډینګ، JJ د DNA له لارې د چارج لیږد: یو انتخابي الیکټرو کیمیکل DNA biosensor.anus.Chemical.78، 2138-2144 (2006).
Fang, TH et al. په ریښتیني وخت کې PCR مایکرو فلوایډیک وسیله چې د ورته بریښنایی کیمیکل کشف. بیولوژیکي سینسر سره. بایو الیکترونیک.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. د سیګنالینګ میکانیزم مطالعه او د DNA سره د میتیلین نیلي متقابل عمل پراساس د بریښنایی کیمیکل ریښتیني وخت PCR سیسټم فعالیت تصدیق. شنونکي 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chovarria, RG et al.Loop-mediated isothermal amplification-based electrochemical sensor for sars-cov-2 د فاضله اوبو په نمونو کې کشف.J.چاپیریال.کیمیاوي.برطانیه.10، 107488 (2022).
کمار، M. et al. د PCB الکترودونو سره د SARS-CoV-2 امپلیکونونو الکترو کیمیکل احساس کول. سینسر فعال شوی.B کیمیا.343، 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. د فاضله اوبو په جامد برخو کې د SARS-CoV-2 RNA موثر کشف. 763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al. په فاضله اوبو کې د SARS-CoV-2 کشف کولو لپاره تحلیلي میتودونه: پروتوکول او راتلونکي لید.TraC رجحان مقعد. کیمیکل. 134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. د باکتریا فاج Phi6 (د SARS-CoV-2 لپاره یو سروګیټ) د شیشې په سطحو کې زیرمه شوي په تبخیر شوي لعاب څاڅکو کې بقا.10، 1-10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ د SARS-CoV-2 سرود (Phi6) په آزاد ژوند کې د چاپیریال دوام امیبا.د اوبو روغتیا 20، 83 (2021).
Mindich, L. دقیق بسته بندي د درې جینومیک ټوټو دوه اړخیزه RNA باکتریوفیج\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63، 149-160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, د DH RNA فیز ثانوي جوړښت\(\varphi\)6 بسته بندۍ سیمه.RNA 6, 880-889 (2000).
Bonilla, N. et al. Phages on the Tap – د باکتریوفیجز لابراتوار ذخیره چمتو کولو لپاره یو ګړندی او موثر پروتوکول. PeerJ 4, e2261 (2016).
د پوسټ وخت: می-27-2022