Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, obsługuje CSS w ograniczonym stopniu. Aby uzyskać najlepszą jakość, zalecamy korzystanie ze zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). W międzyczasie, aby zapewnić dalsze wsparcie, będziemy wyświetlać stronę bez stylów i JavaScript.
Znaczenie monitorowania próbek środowiskowych zostało bardzo docenione od początku pandemii COVID-19, a niektóre wysiłki w zakresie monitorowania są prowadzone przy użyciu złotego standardu, chociaż techniki oparte na qPCR są drogie. Elektrochemiczne biosensory DNA mogą zapewnić potencjalnie opłacalne rozwiązanie do monitorowania środowiskowych próbek wody w krajach o niskich i średnich dochodach. W tej pracy demonstrujemy elektrochemiczną detekcję amplikonów uzyskanych z faga Phi6 wyizolowanego z wzbogaconych próbek wody jeziornej (popularny surogat SARS-CoV-2), przy użyciu ENIG do kompletnych elektrod PCB bez modyfikacji powierzchni.płeć. Odpowiedź czujnika elektrochemicznego została dokładnie scharakteryzowana dla dwóch fragmentów DNA o różnej długości (\({117}\,\hbox {bp}\) i \({503}\,\hbox {bp}\)), a wpływ soli w mieszaninach PCR na interakcje błękitu metylenowego (MB)-DNA. Nasze wyniki pokazują, że długość fragmentów DNA znacząco determinuje czułość elektrochemiczną i pokazują w tej pracy, że zdolność do wykrywania długich amplikonów bez oczyszczania żelowego produktów PCR jest ważne dla pomiarów in situ próbek wody.W pełni zautomatyzowane rozwiązanie do usuwania wirusów dobrze wróży.
Przenoszenie wirusów przenoszonych przez wodę jest znane jako zagrożenie dla zdrowia publicznego od lat czterdziestych XX wieku, kiedy to pojawiły się pierwsze dowody przenoszenia przez wodę polio i wirusowego zapalenia wątroby typu E1. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) sklasyfikowała kilka patogenów wirusowych przenoszonych przez wodę o umiarkowanym lub dużym znaczeniu dla zdrowia2. Tradycyjny wirus metody wykrywania opierają się na technikach opartych na złotym standardzie opartych na qPCR, które są bardzo czułe i specyficzne, ale wymagają wykwalifikowanego personelu do testowania w laboratorium przy użyciu drogich urządzeń. Jednak w krajach o niskich i średnich dochodach (LMIC) o ograniczonych zasobach ludzie badanie próbek prawdopodobnie będzie miało pierwszeństwo przed monitorowaniem próbek wody w środowisku. W związku z tym potrzebne są alternatywne, niedrogie metody trwałego monitorowania próbek wody i ścieków w czasie rzeczywistym w krajach o niskich i średnich dochodach jako wczesne ostrzeżenie o pojawiających się ogniskach chorób, chroniąc je w ten sposób przed poważnymi skutkami społeczno-gospodarczymi pandemii wirusa. Tanie elektrochemiczne bioczujniki kwasów nukleinowych mogą stanowić obiecujące potencjalne rozwiązanie tej niezaspokojonej potrzeby. Wiele z tych bioczujników DNA działa dzięki temu, że komplementarne nici DNA są unieruchomione na elektrodzie powierzchni i hybrydyzują, gdy w próbce znajduje się pasująca sekwencja. Można ją następnie przekształcić w sygnał za pomocą różnych technik elektrochemicznych przy użyciu mediatorów redoks, takich jak żelazo/żelazocyjanek potasu. Błękit metylenowy (MB) jest jedną z takich cząsteczek aktywnych redoks, która ma doniesiono, że interkalują do dwuniciowego DNA (dsDNA) oprócz bardziej niespecyficznego wiązania z jednoniciowym DNA5,6. Interkalujący charakter MB w celu utworzenia kompleksów MB-DNA sprawia, że są one popularnym wyborem jako mediatory redoks w kilku elektrochemicznych DNA konfiguracje czujników5,6,7,8,9. Chociaż interkalacja MB do DNA jest niespecyficzna, a specyficzność tego czujnika elektrochemicznego zależy w dużej mierze od czystości starterów użytych do PCR lub amplifikacji izotermicznej, dobrze nadaje się do implementacji rzeczywistych qPCR oparty na elektrochemii lub amplifikacja izotermiczna fluorescencji jako alternatywa dla pomiaru stężenia DNA pomiar amplikonów PCR z MB za pomocą różnicowej woltamperometrii impulsowej (DPV)9. W innych przypadkach Ramirez i wsp. Wykrywanie SARS-CoV-2 w ściekach za pomocą reakcji RT-LAMP przy użyciu MB z elektrodami sitodrukowymi. Elektrody platynowe zostały również stosowane jako elektrody in situ w mikroprzepływowej platformie PCR przeznaczonej do elektrochemicznego wykrywania amplikonów podczas reakcji 8. Wszystkie te badania wymagają modyfikacji powierzchni elektrod, co pociąga za sobą zwiększone koszty produkcji i eksploatacji ze względu na specjalne wymagania dotyczące przechowywania dla stabilności tych funkcjonalizowanych elektrod.
Schemat przebiegu pracy dla elektrochemicznego wykrywania amplikonów uzyskanych ze skoncentrowanych cząstek wirusa w próbkach wody z jeziora.
Niedawno zademonstrowaliśmy elektrochemiczne wykrywanie amplikonów SARS-CoV-2 za pomocą tanich elektrod na płytkach drukowanych (PCB) w oparciu o DPV i cykliczną woltamperometrię (CV) indukowaną przez adsorpcję kompleksów MB-DNA na powierzchni niezmodyfikowanych elektrod) zmiany piku prąd11.Podajemy, że dłuższe fragmenty DNA (N1-N2, \({943}\, \hbox) utworzone przy użyciu zalecanych przez CDC starterów N1 do przodu i N2 do tyłu w porównaniu z krótszymi fragmentami {bp}\)) wykazywały lepszą liniowość w odpowiedzi czujnika (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) utworzone przy użyciu zestawów starterów N1 do przodu i N1 do tyłu. Badania te przedstawiono przy użyciu rozcieńczeń DNA przygotowanych w wodzie wolnej od nukleaz. Platforma została również wykorzystana do wykrycia SARS-CoV -2 amplikony w symulowanych próbkach ścieków (uzyskane przez dodanie próbek całkowitego RNA do próbek RNA SARS-CoV-2). Ponieważ RNA jest podatne na ścinanie podczas izolacji i dalszej obróbki,12,13 trudno jest amplifikować dłuższe fragmenty za pomocą tej heterogenicznej próbki. Dlatego demonstracja elektrochemicznego wykrywania amplikonu SARS-CoV-2 w ściekach jest ograniczona do krótszego \(72\,\hbox {bp}\) fragmentu N1.
W tej pracy zbadaliśmy wykonalność elektrochemicznego wykrywania opartego na PCB ENIG faga Phi6 skoncentrowanego i wyizolowanego z próbek wody jeziora (ryc. 1). Fagi Phi6 są porównywalne pod względem wielkości (80-100 nm) do SARS-CoV-2 i mają również błonę lipidową i białko kolczaste. Z tych powodów bakteriofag Phi6 jest popularnym substytutem SARS-CoV-2 i innych otoczkowych patogennych wirusów RNA14,15. RNA wyizolowany z cząstek faga został użyty jako matryca do syntezy cDNA, a następnie PCR w celu uzyskania dwóch fragmentów DNA o długości 117 i 503 par zasad. Biorąc pod uwagę wyzwanie amplifikacji \(943\,\hbox {bp}\) fragmentów N1-N2 w naszej poprzedniej pracy, celujemy w fragmenty o średniej długości (\(117 \,\hbox {bp}\) i \(503 \,\hbox {bp}\)), w oparciu o dostępne startery. Odpowiedź czujnika elektrochemicznego była systematycznie badana w szerokim zakresie stężeń (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) do \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Dla obu fragmentów w obecność MB, wpływ soli na odpowiedź czujnika został scharakteryzowany i zweryfikowany krzyżowo za pomocą pomiarów spektrofotometrycznych. Główny wkład tej pracy jest następujący:
Długość fragmentu DNA i obecność soli w próbce silnie wpływają na czułość.Nasze wyniki pokazują, że aktywność elektrochemiczna zależy od różnych mechanizmów interakcji MB, DNA i czujnika w odpowiedzi woltamperometrycznej, w zależności od stężenia i długości DNA, przy dłuższych fragmentach wykazują wyższą czułość, chociaż sól ma negatywny wpływ na oddziaływania elektrostatyczne między MB i DNA.
Stężenie DNA determinuje mechanizm oddziaływania MB-DNA w niezmodyfikowanych elektrodach Pokazujemy, że różne mechanizmy oddziaływania MB-DNA zależą od stężenia DNA. Przy stężeniach DNA poniżej niewielkiej ilości \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), zaobserwowaliśmy, że odpowiedź prądu elektrochemicznego była determinowana głównie przez adsorpcję MB-DNA na elektrodzie, podczas gdy przy niższych stężeniach Przy wysokich stężeniach DNA odpowiedź prądu elektrochemicznego była określana przez steryczne hamowanie redoks aktywność spowodowana wstawieniem MB między parami zasad DNA.
ENIG PCB-Based Electrochemical Sensing of Viral Nucleic Acids in Lake Water Samples Obserwacje zostały potwierdzone przez elektrochemiczne wykrywanie fragmentów DNA z dodatkiem Phi6 \(503\,\hbox {bp}\) uzyskanych z próbek wody z jeziora Powai, IIT Mumbai Campus Fag wynikowy.
Niski koszt wdrożenia i możliwość integracji z w pełni zautomatyzowanymi systemami monitorowania, oligonukleotydami lub aptamerami na elektrodach o dłuższym okresie trwałości.
Fag Phi6 jest otoczkowym wirusem dsRNA z rodziny Cytoviridae, który infekuje Pseudomonas syringae. Genom faga Phi6 występuje w postaci 3 fragmentów: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07 \,\hbox {Kb}\)) i L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Ponieważ fag Phi6 infekuje niepatogenny szczep BSL-1 Pseudomonas, jest bezpieczny w użyciu i może być łatwo hodowany w laboratorium. Phage Phi6 i jego żywiciel Pseudomonas syringae zakupiono w Felix d'Herelle Reference Centre for Bacterial Viruses, Laval University, Kanada (numery katalogowe ośrodków referencyjnych to odpowiednio HER-102 i HER-1102) Faga .Phi6 i jego żywiciela ożywiono zgodnie z zaleceniami centrum referencyjnego. Faga Phi6 oczyszczono przez lizę na płytce i elucję, aby uzyskać końcowe miana z \(\około 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (jednostki tworzące łysinki/mililitry). RNA wyizolowano z oczyszczonych cząstek faga przy użyciu zestawu GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, zawiesina oczyszczonego faga Phi6\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) poddano lizie, a lizat załadowano na kolumnę wirówkową, aby umożliwić związanie RNA z kolumną z żywicą. RNA jest następnie eluowane w roztworze do elucji \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) dostarczone w zestawie. Oszacuj stężenie RNA przez absorbancję przy \(260\,\hbox {nm}\).RNA przechowywano w porcjach w \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) do dalszego użycia.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Zestaw do syntezy cDNA iScript (Bio -Rad Laboratories) zastosowano jako matrycę do syntezy cDNA zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, reakcja syntezy cDNA składa się z 3 etapów: priming w \({25}\,{^{\circ}\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min}}\) , odwrotna transkrypcja \({20}\,{\hbox {min}}\) w \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) i odwrotnie Rejestrator jest w \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) przez \({1}\,{\hbox {min }}\). Po uruchomieniu na 1% żelu agarozowym, cDNA pokazało trzy prążki odpowiadające oczekiwanym trzem fragmentom RNA (dane nie pokazane). Następujące startery zostały użyte do amplifikacji dwóch fragmentów DNA o długości 117 i 503 bp, użycie cDNA jako matrycy do PCR w termocyklerze miniPCR® mini8:
Startery dla \(117\,\hbox {bp}\) i \(503\,\hbox {bp}\) odpowiadają odpowiednio 1476-1575 nukleotydom segmentu M i 458-943 nukleotydom segmentu L Wszystkie amplifikowane produkty PCR poddano elektroforezie na 1% żelach agarozowych i oczyszczono zamplifikowany docelowy DNA przy użyciu zestawu GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
Jezioro w kampusie IIT Mumbai (Powai Lake, Powai, Mumbai) zostało użyte do dodania cząstek faga. Wodę z jeziora przefiltrowano przez membranę \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) w celu usunięcia zawieszone cząstki, a następnie dodano faga Phi6. Dodaj \({1}\,{\hbox {ml}}\) z \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) do \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) przefiltrowanej wody z jeziora, w \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). zarezerwowane do pomiaru obciążenia wirusem za pomocą testu łysinek. Przetestowaliśmy dwie różne metody zatężania cząstek wirusa Phi6 z dodatkiem: (1) metoda adsorpcji i wytrącania wodorotlenku glinu, 19 która została zwalidowana pod kątem stężenia kilku otoczkowych wirusów RNA z próbek środowiskowych oraz (2) Metoda stężenia wirusa oparta na glikolu polietylenowym (PEG) została zaadaptowana z Flood et al.20. Ponieważ stwierdzono, że skuteczność odzyskiwania metody opartej na PEG jest lepsza niż metody opartej na wodorotlenku glinu, metodę opartą na PEG zastosowano do zatężania cząstek Phi6 z próbek wody jeziora.
Zastosowano następującą metodę PEG: PEG 8000 i \(\hbox {NaCl}\) dodano do próbek wody jeziora wzbogaconej Phi6, aby uzyskać 8% PEG 8000 i \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Próbki inkubowano na wytrząsarce\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), następnie odwirowany przy \(4700 \,\hbox {g}\) daje \({45}\,{\hbox {min}}\). Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w \({1}\, {\hbox {ml}}\) w tym samym supernatancie. Wszystkie eksperymenty wzbogacania i stężenia wirusa przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Po zatężeniu małą porcję zarezerwowano do pomiaru wydajności odzyskiwania za pomocą testu łysinek. RNA wyizolowano jak opisano wcześniej i eluowano w dostarczonym z zestawem buforze elucyjnym\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\).Ponieważ stężenie RNA będzie zmieniać się w zależności od próbki w trzech powtórzeniach, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) RNA jest używany dla wszystkich trzech niezależnie od jego stężenia Synteza cDNA próbek. Synteza cDNA została przeprowadzona zgodnie z wcześniejszym opisem.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA użyto jako matrycy do \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR przez 35 cykli do amplifikacji \(117\,\hbox {bp}\) i \(503\,\hbox { bp}\). Próbki te są reprezentowane jako „1:1”, tj. bez rozcieńczeń. Kontrola bez matrycy (NTC) została ustawiona jako kontrola negatywna, podczas gdy ustawiono cDNA zsyntetyzowany przy użyciu RNA wyizolowanego z oczyszczonego faga jako matryca dla kontroli pozytywnej (PC). Ilościową PCR (qPCR) przeprowadzono w aparacie Stratagene Mx3000P RT-PCR przy użyciu Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Reakcje przygotowano w trzech powtórzeniach, jak poprzednio opisano. Próg cyklu (Ct) zarejestrowano dla wszystkich próbek. Ponadto rozcieńczone próbki były \({1}\, {\upmu \hbox {l}}\) przy użyciu cDNA rozcieńczonego 1:100 w przefiltrowanej wodzie jeziora jako \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR przez 35 cykli. Te próbki są reprezentowane jako „1:100”.
Elektrody PCB są wytwarzane przy użyciu dostępnego na rynku, niedrogiego procesu ENIG, bez konieczności dodatkowego złocenia. Specyfikacje elektrod ENIG PCB są szczegółowo opisane w naszej poprzedniej pracy11. W przypadku elektrod ENIG PCB tradycyjne metody czyszczenia elektrod, takie jak roztworu piranii lub cyklicznej woltamperometrii kwasu siarkowego nie są zalecane, ponieważ mogą powodować łuszczenie się cienkiej warstwy złota (grubość \(\około\) \(100\,\hbox {nm }\)) i odsłonić leżące poniżej warstwy miedzi, które są podatne na korozję 21, 22, 23, 24, 25. Dlatego oczyść elektrody niestrzępiącą się ściereczką zwilżoną alkoholem izopropylowym. Badana próbka była inkubowana z \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB w \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) dla łatwego wstawiania. W naszej poprzedniej pracy , zaobserwowaliśmy, że czułość i liniowość czujnika uległy poprawie poprzez zwiększenie stężenia MB 11 . Na podstawie optymalizacji zgłoszonych w naszej wcześniejszej pracy użyliśmy \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB w tym badaniu. Elektrochemiczne wykrywanie dwuniciowego DNA (ds-DNA) można osiągnąć za pomocą interkalatorów anionowych lub kationowych. Chociaż interkalatory anionowe wykrywają DNA z lepszą selektywnością, wymagają całonocnej inkubacji, co skutkuje dłuższym czasem wykrywania. z drugiej strony interkalatory kationowe, takie jak MB, wymagają krótszych czasów inkubacji, w przybliżeniu \({1}\,{\hbox {h}}\) do elektrochemicznego wykrywania ds-DNA6. Każdy pomiar obejmuje dozowanie próbki do badania na elektrody\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), a następnie wyczyść szmatką zwilżoną alkoholem izopropylowym, a następnie pobierz kolejną próbkę.jeden pomiar. Każda próbka była testowana na 5 różnych elektrodach, chyba że zaznaczono inaczej. Pomiary DPV i CV przeprowadzono przy użyciu potencjostatu PalmSens Sensit Smart, a do konfiguracji potencjostatu i akwizycji danych, w tym obliczeń prądu szczytowego, wykorzystano oprogramowanie PTrace. Stosowane są następujące ustawienia dla pomiarów DPV i CV:
DPV: Czas równowagi = \(8\,\hbox {s}\), Krok napięcia = \(3\,\hbox {mV}\), Napięcie impulsu = \(25\,\hbox {mV}\) , czas trwania impulsu = \(50\,\hbox {ms}\), częstotliwość skanowania = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Czas równowagi = \(8\,\hbox {s}\), Krok napięcia = \(3\,\hbox {mV}\), Szybkość przemiatania = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
Prądy szczytowe otrzymane z woltamogramów DNA skompleksowanego z \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Woltamogramy DPV i CV uzyskano na elektrodach ENIG PCB \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB w kompleksie z DNA (w stężeniach 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) tj. 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) dla \(117\,\hbox {bp}\ ) i 0,03 –\({0,06}\,{\upmu \hbox {M}}\) dla \(503\,\hbox {bp}\)). Reprezentatywne woltamogramy pokazano na rysunku S1 w informacjach uzupełniających. Rysunek 2 pokazuje wyniki pomiarów DPV i CV (prąd szczytowy) przy użyciu produktów PCR oczyszczonych z żelu. W porównaniu z pomiarami CV, pomiary DPV wykazują wyższą czułość (prąd jako funkcja stężenia DNA), ponieważ pojemnościowe prądy tła w pomiarach CV ukrywają prądy Faradaica 26 . dla każdego pola wykresu pudełkowego zawiera pomiary z 5 elektrod.Wszystkie pomiary wykorzystują ten sam zestaw elektrod, aby uniknąć błędów pomiaru spowodowanych różnicami między elektrodami. Zaobserwowaliśmy rosnący trend w mierzonych prądach szczytowych DPV i CV dla niższych stężeń DNA , dłuższy (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ w porównaniu do \(117) ) fragment. Jest to zgodne z oczekiwanym trendem adsorpcji elektrody opisanym w naszej poprzedniej pracy. adsorpcja kompleksu MB-DNA ułatwia przenoszenie ładunku na elektrodzie, co przyczynia się do wzrostu prądu szczytowego. Inne badania wykazały wpływ wielkości i sekwencji oligonukleotydów na interkalację MB-DNA27,28,29,30. Guanina -cytozyna (GC) zawartość dwóch amplikonów (\(117\,\hbox {bp}\) i \(503\,\hbox {bp}\)) wynosiła około 50%, co wskazuje, że obserwacja Różnica jest spowodowana do długości amplikonu. Jednak dla wyższych stężeń DNA (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), dla \(503\,\hbox {bp} \) i \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) dla \(117\,\hbox {bp}\)), obserwujemy dwa wzmocnienia szczytowe prądy subs są zmniejszone zarówno w pomiarach DPV, jak i CV. Dzieje się tak, ponieważ MB nasyca i interkaluje między parami zasad DNA, co powoduje steryczne hamowanie aktywności redoks redukowalnej grupy w MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl}_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Sole obecne w mastermiksach PCR zakłócają oddziaływania elektrostatyczne między MB i DNA, więc dodając \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) z \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) produkt oczyszczony z żelu MB w celu zbadania wpływu soli na interakcję MB-DNA. Jak pokazano na rycinie 3, zaobserwowaliśmy, że dla wyższych stężeń DNA (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp}\) i \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}} \) dla \ (117 \, \ hbox {bp} \)), w DPV i CV Dodatek soli nie wpłynął znacząco na pomiary (patrz rysunek S2 w informacjach uzupełniających dla reprezentatywnych woltamogramów). Jednak w niższych stężeń DNA, dodanie soli znacznie zmniejsza czułość, nie powodując znaczącej zmiany prądu wraz ze stężeniem DNA. Podobne negatywne skutki soli na interakcje MB-DNA i interkalację zostały wcześniej opisane przez innych badaczy33,34.\(\hbox { Kationy Mg}^{2+}\) wiążą się z ujemnym szkieletem fosforanowym DNA, utrudniając w ten sposób oddziaływanie elektrostatyczne między MB a DNA. Przy wyższych stężeniach DNA steryczne hamowanie MB aktywnych redoks skutkuje niższymi prądami szczytowymi, więc oddziaływania elektrostatyczne nie wpływają znacząco na reakcję czujnika. Kluczową kwestią jest to, że ten biosensor lepiej nadaje się do wykrywania wyższych stężeń DNA (rzadko \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) lub wyższych), do w pełni zautomatyzowanego przetwarzania środowiskowych próbek wody, w których oczyszczanie produktów PCR na żelu może nie być wykonalne.
Pole pod krzywą absorpcji dla zakresu długości fali 600–700 \(\hbox {nm}\) dla różnych stężeń DNA skompleksowanego z \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) zi bez soli (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) z solą i bez (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Stężenia DNA odpowiadające \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB próbki Brak DNA.
Aby dodatkowo zweryfikować powyższe wyniki, wykonaliśmy pomiary optyczne za pomocą spektrofotometru UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), próbki \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) zostały użyte dla każdego Pomiar. Sygnatura absorpcji maleje wraz ze wzrostem stężenia DNA, co widać na podstawie trendu pola pod krzywą absorpcji dla zakresu długości fal \(600\,\hbox {nm}\) do \(700\,\hbox { nm}\) , jak pokazano na ryc. 4 (widmo absorpcji pokazane na ryc. S3 w informacjach uzupełniających). Dla próbek o stężeniach DNA mniejszych niż \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), nie było znaczącej różnicy w pobieraniu między próbkami zawierającymi DNA i tylko z MB (dla \(503\,\hbox {bp}\) i \(117\,\hbox {bp}\ ) długości fragmentów), co wskazuje na brak sterycznej inhibicji redoks-aktywnych MB. Przy wyższych stężeniach DNA obserwowaliśmy stopniowy spadek sygnału absorbancji i odnotowaliśmy mniejszy spadek absorbancji w obecności soli. Wyniki te przypisywano molekularnej interakcje i hamowanie steryczne z układaniem zasad w hybrydach DNA. Nasze wyniki są zgodne z doniesieniami w literaturze na temat badań spektroskopowych interkalacji MB-DNA, które wiążą hipochromatyczność ze zmniejszonymi poziomami energii w \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) przejścia elektronowe spowodowane interkalacją Warstwy 36, 37, 38.
Elektroforeza faga Phi6 w żelu agarozowym: produkty PCR o długości \(117\,\hbox {bp}\) i \(503\,\hbox {bp}\) z próbek wody z jeziora. Marker M-DNA;Kontrola bez matrycy NTC, startery zawierające odpowiednie amplikony;kontrola pozytywna PC;1, 2, 3-nierozcieńczone (1:1) wzbogacone próbki wody z jeziora w trzech powtórzeniach. Pasmo jest widoczne w \(\około 50\,\hbox {bp}\) z powodu niewykorzystanych oligonukleotydów w \(503\,\ pas hbox {bp}\).
Oceniliśmy przydatność czujnika przy użyciu próbek wody z jeziora Powai wzbogaconych fagiem Phi6. Stężenia RNA wyizolowane z próbek wody wzbogaconej fagami wahały się od 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), podczas gdy te wyizolowane z oczyszczonych zawiesin fagów RNA oszacowano na \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) z wydajnością odzyskiwania około 1 %.RNA poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA i użyto jako matrycy do PCR i qPCR. Wielkość produktu potwierdzono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (Rysunek 5) przed testowaniem z czujnikiem. Próbki te nie są oczyszczane z żelu i dlatego zawierają wszystkie składniki PCR, jak jak również interesujących amplikonów. Wykazano, że wartości Ct zarejestrowane podczas qPCR (Tabela 1) korelują ze stężeniem RNA wyizolowanego z odpowiednich wzbogaconych próbek wody. Wartość Ct ujawnia liczbę cykli wymaganych, aby sygnał fluorescencyjny przekraczają próg lub sygnał tła. Wyższe wartości Ct wskazują na niższe stężenia matrycy i odwrotnie. Wartości Ct próbek NTC były tak wysokie, jak oczekiwano. Różnica w \(\ około 3\) wartościach Ct między kontrola pozytywna i próbka testowa wskazują ponadto, że każda próbka testowa zawiera około 1% matrycy w porównaniu z kontrolą pozytywną. Wcześniej omawialiśmy, że dłuższe amplikony prowadzą do lepszej czułości. Amplifikacja dłuższych fragmentów wyizolowanych z heterogenicznych próbek środowiskowych jest trudna, biorąc pod uwagę wady o niskim stężeniu wirusa i degradacji RNA. Jednak dzięki naszemu protokołowi wzbogacania wirusów i amplifikacji PCR byliśmy w stanie z powodzeniem amplifikować fragment \(503\,\hbox {bp}\) do wykrywania elektrochemicznego.
Figura 6 przedstawia wyniki czujnika elektrochemicznego amplikonu fragmentu \(503\,\hbox {bp}\), zarówno przy użyciu nierozcieńczonego cDNA jako matrycy (1:1), jak i 100-krotnie rozcieńczonego cDNA jako matrycy (1:100) przeprowadzonego PCR , w porównaniu z NTC i PC (patrz rysunek S4 w informacjach uzupełniających dla reprezentatywnych woltamogramów). Każde pole na wykresie pudełkowym na rysunku 6 zawiera pomiary z trzech próbek na 5 elektrodach. Te same elektrody zostały użyte do pomiaru wszystkich próbek, aby uniknąć błędów spowodowanych elektrodą -do-elektrody. W porównaniu z pomiarami CV, pomiary DPV wykazują lepszą rozdzielczość, aby odróżnić próbki testowe i PC od NTC, ponieważ, jak wspomniano wcześniej, prądy Faradaica są ukryte z powodu prądów pojemnościowych tła w tych ostatnich. Zaobserwowaliśmy, że w przypadku dłuższych amplikonów kontrola ujemna (NTC) skutkowała wyższymi szczytowymi prądami CV i DPV w stosunku do kontroli pozytywnej, podczas gdy dodatnie i nierozcieńczone próbki testowe wykazywały podobne wysokości szczytowych prądów DPV. Zmierzone wartości średnie i mediany dla każdego nierozcieńczonego (1:1) ) próbkę testową i PC można wyraźnie rozróżnić na wyjściu czujnika dla próbki NTC, podczas gdy rozdzielczość dla próbki rozcieńczonej 1:100 jest mniej wyraźna. Dla 100-krotnego rozcieńczenia cDNA nie zaobserwowaliśmy żadnych prążków podczas elektroforezy żelowej (pasy nie pokazane na rysunku 5), a odpowiadające im prądy szczytowe DPV i CV były podobne do oczekiwanych dla NTC. Wyniki dla fragmentu \ (117 \, \ hbox {bp} \) przedstawiono w informacjach uzupełniających. Negatywny kontrolna wywołała odpowiedź elektrochemiczną z czujnika PCB w wyniku adsorpcji wolnego MB na elektrodzie i interakcji MB z jednoniciowym starterem oligonukleotydowym. Dlatego za każdym razem, gdy badana jest próbka, należy przeprowadzić kontrolę ujemną i prąd szczytowy badanej próbki w porównaniu z prądem szczytowym uzyskanym przez kontrolę ujemną w celu uzyskania pomiaru różnicowego (względnego)39,40 w celu sklasyfikowania badanej próbki jako dodatniej lub ujemnej.
(a) DPV i (b) prąd szczytowy CV do elektrochemicznego wykrywania fragmentów \(503\,\hbox {bp}\) w próbkach wody z jeziora. Próbki testowe mierzono w trzech powtórzeniach i porównywano z kontrolami bez matrycy (NTC) i kontrole pozytywne (PC).
Nasze odkrycia ilustrują różne mechanizmy wpływające na działanie czujników elektrochemicznych dla amplikonów o różnej długości dla różnych DNA, ze stężeniami weryfikowanymi za pomocą pomiarów optycznych za pomocą spektrofotometru UV/Vis. Nasze obserwacje podkreślają spostrzeżenie, że dłuższe fragmenty DNA do \(\około\) \(500\,\hbox {bp}\) można wykryć z wyższą czułością, a obecność soli w próbce nie wpływa na czułość Stężenie DNA, które wpływa na wyższą czułość (rzadko \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) i powyżej). Ponadto zbadaliśmy wpływ różnych rodzajów próbek, w tym amplikonów oczyszczonych z żelu z dodatkiem soli i bez oraz dodania próbek wody z jeziora w pomiarach DPV i CV.Zaobserwowaliśmy, że DPV zapewnia lepszą rozdzielczość, ponieważ prąd pojemnościowy tła wpływa również na pomiar CV, czyniąc go mniej czułym.
Amplifikacja dłuższych fragmentów zależy od integralności wirusowego genomowego RNA. Kilka badań wykazało, że amplifikacja dłuższych fragmentów nie zawsze jest skuteczna ze względu na degradację RNA w środowisku i możliwość splicingu podczas izolacji11,41,42,43,44 Zaobserwowaliśmy, że metoda koncentracji wirusa oparta na PEG była skuteczniejsza w zatężaniu faga Phi-6 dodanego do próbek wody jeziora niż metoda koncentracji wirusa oparta na wodorotlenku glinu. Zdolność do wykrywania długich fragmentów DNA okazała się przezwyciężyć wymagania złożonej reakcji PCR w celu amplifikacji wielu krótszych szablonów i zmniejszenia możliwości krzyżowej specyficzności.
Próbek biologicznych jest niewiele, dlatego istnieje potrzeba zaprojektowania biosensora, który wymaga minimalnej liczby próbek do testów. Elektrody PCB ENIG użyte w tym badaniu wymagały tylko \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) próbki do badania w celu pokrycia efektywnej powierzchni elektrod. Dodatkowo ta sama elektroda może być ponownie użyta po oczyszczeniu przed dozowaniem kolejnej próbki. Zaamplifikowane próbki nie wymagają dodawania żadnych środków chemicznych poza błękitem metylenowym, który jest niedrogim środkiem i powszechnie stosowanych substancji chemicznych. Ponieważ produkcja każdej elektrody kosztuje około 0,55 USD (lub 40 INR), ten bioczujnik może być opłacalną alternatywą dla istniejących technologii wykrywania. Tabela 2 przedstawia porównanie tej pracy z innymi czujnikami opisywanymi w literaturze od dawna Fragmenty DNA w próbkach heterogenicznych.
Biorąc pod uwagę, że protokoły wykrywania elektrochemicznego oparte na MB opierają się na swoistości PCR, głównym ograniczeniem tej metody jest możliwość niespecyficznej amplifikacji w heterogenicznych próbkach, takich jak ścieki i woda z jezior, lub przy użyciu starterów o niskiej czystości. metody detekcji elektrochemicznej do wykrywania DNA nieoczyszczonych produktów PCR przy użyciu niemodyfikowanych elektrod ENIG PCB, konieczne jest lepsze zrozumienie błędów wprowadzanych przez nieużywane dNTP i startery oraz optymalizacja warunków reakcji i protokołów badań. Dodatkowe parametry fizykochemiczne, takie jak pH, temperatura i biologia może być również konieczne zmierzenie zapotrzebowania na tlen (BZT) próbki wody w celu poprawy dokładności pomiaru.
Podsumowując, proponujemy niedrogi elektrochemiczny czujnik PCB ENIG do wykrywania wirusów w próbkach środowiskowych (woda z jeziora). W przeciwieństwie do unieruchomionych elektrod oligonukleotydowych lub niestandardowych podłoży do wykrywania DNA, które wymagają przechowywania w warunkach kriogenicznych w celu utrzymania czułości,53,54 nasza technika wykorzystuje niezmodyfikowane PCB elektrody o dłuższym okresie przydatności do spożycia i bez szczególnych wymagań dotyczących przechowywania, dzięki czemu nadają się do opracowywania rozwiązań pomiarowych z automatycznym przetwarzaniem próbek stosowanych w LMIC. Bioczujnik wykorzystuje niedrogie barwniki redoks interkalujące DNA (MB) do szybkiego wykrywania docelowych amplikonów. Amplifikacja niespecyficzna powszechna w próbkach środowiskowych zmniejsza specyficzność tej metody wykrywania ze względu na niespecyficzne wiązanie MB z jedno- i dwuniciowymi oligonukleotydami. Dlatego specyficzność tego testu zależy od optymalizacji starterów i warunków reakcji PCR. Ponadto CV i DPV prądy szczytowe uzyskane z badanych próbek należy interpretować w odniesieniu do odpowiedzi uzyskanych z kontroli negatywnej (NTC) dla każdego testu. Projekty czujników elektrochemicznych i metody przedstawione w tej pracy można zintegrować z autosamplerami, aby opracować w pełni zautomatyzowany i niski niedrogie rozwiązanie, które może pobierać i analizować próbki oraz bezprzewodowo przesyłać wyniki z powrotem do laboratorium.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Metody wstępnego stężenia wirusów z próbek wody: przegląd i metaanaliza ostatnich badań.J.Application.microorganism.115, s. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Wirusy przenoszone przez wodę: Bariery dla bezpiecznej wody pitnej.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. i wsp. Epidemiologia ścieków w celu efektywnego kosztowo nadzoru nad COVID-19 na dużą skalę w krajach o niskich i średnich dochodach: wyzwania i możliwości. Woda 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Elektrochemia kwasu nukleinowego.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Błękit metylenowy jako elektrochemiczny dyskryminator jedno- i dwuniciowych oligonukleotydów immobilizowanych na podłożach złota. Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparison of Cation and Anion Intercalators for Electrochemical Transduction of DNA Hybridization by Long-Range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Przeniesienie ładunku przez DNA: selektywny elektrochemiczny biosensor DNA.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH i in. Urządzenie mikroprzepływowe do PCR w czasie rzeczywistym z równoczesną detekcją elektrochemiczną. Czujnik biologiczny. Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY i wsp. Badanie mechanizmu sygnalizacji i weryfikacja wydajności systemu elektrochemicznego PCR w czasie rzeczywistym opartego na interakcji błękitu metylenowego z DNA. Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG i wsp. Czujnik elektrochemiczny oparty na amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli do wykrywania sars-cov-2 w próbkach ścieków.J.Środowisko.Chemia.Wielka Brytania.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al. Elektrochemiczne wykrywanie amplikonów SARS-CoV-2 za pomocą elektrod PCB. Czujnik jest aktywowany. B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Skuteczne wykrywanie SARS-CoV-2 RNA we frakcji stałej ścieków.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Analytical Methods for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Przeżycie bakteriofaga otoczkowego Phi6 (surogat SARS-CoV-2) w odparowanych kropelkach śliny osadzonych na szklanych powierzchniach.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Trwałość środowiskowa substytutu SARS-CoV-2 (Phi6) w wolno żyjącej amebie.J.Zdrowie wody 20, 83 (2021).
Mindich, L. Precyzyjne pakowanie trzech fragmentów genomowych dwuniciowego bakteriofaga RNA\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149-160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Struktura drugorzędowa faga DH RNA \ (\ varphi \) 6 region pakowania. RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – Szybki i wydajny protokół przygotowywania zapasów laboratoryjnych bakteriofagów. PeerJ 4, e2261 (2016).
Czas postu: 27-05-2022