Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte ondersteuning voor CSS. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). voortdurende ondersteuning, zullen we de site weergeven zonder stijlen en JavaScript.
Het belang van het monitoren van milieumonsters wordt enorm gewaardeerd sinds het begin van de COVID-19-pandemie, en sommige monitoringinspanningen worden uitgevoerd met behulp van de gouden standaard, hoewel op qPCR gebaseerde technieken duur zijn. Elektrochemische DNA-biosensoren kunnen een potentieel kosteneffectieve oplossing voor het monitoren van milieuwatermonsters in lage- en middeninkomenslanden. In dit werk demonstreren we de elektrochemische detectie van amplicons verkregen uit Phi6-faag geïsoleerd uit verrijkte watermonsters van meren (een populair surrogaat voor SARS-CoV-2), met behulp van ENIG om PCB-elektroden te voltooien zonder oppervlaktemodificatie.geslacht. De reactie van de elektrochemische sensor werd grondig gekarakteriseerd voor twee DNA-fragmenten van verschillende lengte (\({117}\,\hbox {bp}\) en \({503}\,\hbox {bp}\)), en de effect van zouten in PCR-mastermengsels op methyleenblauw (MB)-DNA-interacties. Onze resultaten tonen aan dat de lengte van DNA-fragmenten de elektrochemische gevoeligheid aanzienlijk bepaalt en tonen in dit werk aan dat het vermogen om lange amplicons te detecteren zonder gelzuivering van PCR-producten is belangrijk voor in situ meting van watermonsters.Een volledig geautomatiseerde oplossing voor viral load belooft veel goeds.
Virusoverdracht via water staat al sinds de jaren 40 bekend als een gevaar voor de volksgezondheid, met het eerste bewijs van overdracht van polio en hepatitis E1 via water. detectiemethoden zijn gebaseerd op de gouden standaard op qPCR gebaseerde technieken, die zeer gevoelig en specifiek zijn, maar gekwalificeerd personeel vereisen om in het laboratorium te testen met behulp van dure instrumenten. In lage- en middeninkomenslanden (LMIC's) met beperkte middelen kunnen het testen van monsters heeft waarschijnlijk voorrang op het monitoren van watermonsters in het milieu. Daarom zijn er alternatieve, goedkope methoden nodig voor duurzame, real-time monitoring van water- en afvalwatermonsters in lage- en middeninkomenslanden als vroege waarschuwingen voor opkomende ziekte-uitbraken, waardoor ze worden beschermd tegen de ernstige sociaaleconomische gevolgen van de viruspandemie. Goedkope elektrochemische biosensoren voor nucleïnezuren kunnen een veelbelovende potentiële oplossing bieden voor deze onvervulde behoefte. Veel van deze DNA-biosensoren werken doordat complementaire DNA-strengen op de elektrode zijn geïmmobiliseerd oppervlak en hybridiseren wanneer een overeenkomende sequentie in het monster aanwezig is. Dit kan vervolgens worden omgezet in een signaal door verschillende elektrochemische technieken met behulp van redox-mediatoren zoals kaliumijzer/ferrocyanide. Methyleenblauw (MB) is zo'n redox-actief molecuul, dat er is gemeld dat ze intercaleren in dubbelstrengig DNA (dsDNA) naast de meer niet-specifieke binding aan enkelstrengig DNA5,6. De intercalerende aard van MB's om MB-DNA-complexen te vormen, maakt ze een populaire keuze als redox-mediatoren in verschillende elektrochemische DNA sensorconfiguraties5,6,7,8,9. Hoewel de intercalatie van MB naar DNA niet-specifiek is, en de specificiteit van deze elektrochemische sensor grotendeels afhangt van de zuiverheid van de primers die worden gebruikt voor PCR of isotherme amplificatie, is hij zeer geschikt voor het implementeren van echte -time elektrochemisch gebaseerde qPCR of fluorescentie isotherme amplificatie als alternatief voor DNA-concentratiemeting 9. In een dergelijke implementatie, Won et al. Het oppervlak van gouden elektroden werd gemodificeerd met 6-mercapto-1-hexanol (MCH) voor real-time meting van PCR-amplicons met MB met behulp van differentiële pulsvoltametrie (DPV). gebruikt als in situ elektroden in een microfluïdisch PCR-platform dat is ontworpen om amplicons elektrochemisch te detecteren tijdens reacties 8. Al deze onderzoeken vereisen oppervlaktemodificatie van de elektroden, wat hogere productie- en bedrijfskosten met zich meebrengt vanwege speciale opslagvereisten voor de stabiliteit van deze gefunctionaliseerde elektroden.
Schema van de workflow voor elektrochemische detectie van amplicons verkregen uit geconcentreerde virale deeltjes in watermonsters van meren.
We hebben onlangs elektrochemische detectie van SARS-CoV-2-amplicons gedemonstreerd met goedkope printplaat (PCB)-elektroden op basis van DPV en cyclische voltammetrie (CV) geïnduceerd door adsorptie van MB-DNA-complexen op het oppervlak van ongewijzigde elektroden) veranderingen in piek huidige11.We melden dat langere DNA-fragmenten (N1-N2, \({943}\, \hbox) gevormd met behulp van de door de CDC aanbevolen N1 forward en N2 reverse primers in vergelijking met kortere fragmenten {bp}\)) een betere lineariteit vertoonden in de sensorrespons ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) gevormd met behulp van N1 forward en N1 reverse primersets. Deze onderzoeken zijn gerapporteerd met behulp van DNA-verdunningen bereid in nucleasevrij water. Het platform werd ook gebruikt om SARS-CoV te detecteren -2 amplicons in gesimuleerde afvalwatermonsters (verkregen door totale RNA-monsters te verrijken met SARS-CoV-2-RNA). Aangezien RNA gevoelig is voor afschuiving tijdens isolatie en stroomafwaartse verwerking,12,13 is het moeilijk om langere fragmenten te amplificeren met dit heterogene monster. Daarom is de demonstratie van elektrochemische detectie van SARS-CoV-2-amplicon in afvalwater beperkt tot het kortere \(72\,\hbox {bp}\) N1-fragment.
In dit werk hebben we de haalbaarheid onderzocht van ENIG PCB-gebaseerde elektrochemische detectie van faag Phi6 geconcentreerd en geïsoleerd uit meerwatermonsters (Fig. 1). Phi6-fagen zijn qua grootte (80-100 nm) vergelijkbaar met SARS-CoV-2 en hebben ook een lipidemembraan en een spike-eiwit. Om deze redenen is bacteriofaag Phi6 een populair surrogaat voor SARS-CoV-2 en andere omhulde pathogene RNA-virussen14,15.RNA geïsoleerd uit faagdeeltjes werd gebruikt als een sjabloon voor cDNA-synthese, gevolgd door PCR om twee DNA-fragmenten van 117 en 503 basenparen lang te verkrijgen. Gezien de uitdaging van het amplificeren van \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2-fragmenten in ons eerdere werk, richten we ons op fragmenten van gemiddelde lengte (\(117 \,\hbox {bp}\) en \(503 \,\hbox {bp}\)), gebaseerd op beschikbare primers. De elektrochemische sensorrespons werd systematisch bestudeerd over een breed concentratiebereik (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) naar \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Voor beide fragmenten in de aanwezigheid van MB, is het effect van zout op de sensorrespons gekarakteriseerd en gevalideerd door spectrofotometrische metingen. De belangrijkste bijdragen van dit werk zijn als volgt:
De lengte van het DNA-fragment en de aanwezigheid van zout in het monster hebben een sterke invloed op de gevoeligheid.Onze resultaten laten zien dat elektrochemische activiteit afhangt van verschillende mechanismen van de interactie van MB, DNA en de sensor in de voltammetrische respons, afhankelijk van de DNA-concentratie en -lengte, met langere fragmenten vertonen een hogere gevoeligheid, hoewel zout een negatief effect heeft op elektrostatische interacties tussen MB en DNA.
DNA-concentratie bepaalt het mechanisme van MB-DNA-interactie in ongewijzigde elektroden We laten zien dat verschillende mechanismen van MB-DNA-interactie afhankelijk zijn van DNA-concentratie. Bij DNA-concentraties onder een kleine hoeveelheid \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), zagen we dat de elektrochemische stroomrespons voornamelijk werd bepaald door de adsorptie van MB-DNA op de elektrode, terwijl bij lagere concentraties bij hoge DNA-concentraties de elektrochemische stroomrespons werd bepaald door de sterische remming van redox activiteit als gevolg van MB-insertie tussen DNA-basenparen.
ENIG op PCB gebaseerde elektrochemische detectie van virale nucleïnezuren in watermonsters van het meer Resultaat faag.
Lage implementatiekosten en potentieel voor integratie in volledig geautomatiseerde monitoringsystemen, oligonucleotiden of aptameren op elektroden met een langere houdbaarheid.
Faag Phi6 is een omhuld dsRNA-virus van de Cytoviridae-familie dat Pseudomonas syringae infecteert. Het genoom van Phi6-faag bestaat in de vorm van 3 fragmenten: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07 \,\hbox {Kb}\)) en L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Aangezien de Phi6-faag een niet-pathogene BSL-1 Pseudomonas-stam infecteert, is het veilig om te gebruiken en kan gemakkelijk in het laboratorium worden gekweekt. Faag Phi6 en zijn gastheer Pseudomonas syringae werden gekocht bij het Felix d'Herelle Reference Centre for Bacterial Viruses, Laval University, Canada (catalogusnummers van referentiecentra zijn respectievelijk HER-102 en HER-1102) .Phi6-faag en zijn gastheer werden nieuw leven ingeblazen zoals aangegeven door het referentiecentrum. Faag Phi6 werd gezuiverd door plaatlysis en elutie om uiteindelijke titers te verkrijgen met \(\ongeveer 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (plaquevormende eenheden/milliliter). RNA werd geïsoleerd uit gezuiverde faagdeeltjes met behulp van de GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) volgens de instructies van de fabrikant. In het kort, een gezuiverde faag Phi6-suspensie\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) werd gelyseerd en het lysaat werd op een spinkolom geladen om RNA te laten binden aan de harskolom. Het RNA wordt vervolgens geëlueerd in de elutieoplossing \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) geleverd door de kit. Schat de RNA-concentratie op basis van absorptie op \(260\,\hbox {nm}\).RNA werd opgeslagen in aliquots in \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) tot verder gebruik.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) De iScript cDNA Synthesis Kit (Bio -Rad Laboratories) werd gebruikt als een sjabloon voor cDNA-synthese volgens de instructies van de fabrikant. Kort gezegd bestaat een cDNA-synthesereactie uit 3 stappen: priming op \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , omgekeerde transcriptie van \({20}\,{\hbox {min}}\) op \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), en omgekeerd De recorder staat in \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) voor \({1}\,{\hbox {min }}\). Bij run op een 1% agarosegel vertoonde het cDNA drie banden die overeenkomen met de verwachte drie RNA-fragmenten (gegevens niet getoond). De volgende primers werden gebruikt om twee DNA-fragmenten van 117 en 503 bp lang te amplificeren, cDNA gebruiken als sjabloon voor PCR in een miniPCR® mini8 thermische cycler:
De primers voor \(117\,\hbox {bp}\) en \(503\,\hbox {bp}\) komen overeen met 1476-1575 nucleotiden van het M-segment en 458-943 nucleotiden van het L-segment, respectievelijk zuur Alle geamplificeerde PCR-producten werden geëlektroforeerd op 1% agarosegels en geamplificeerd doel-DNA werd gezuiverd met behulp van de GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
Een meer op de IIT Mumbai-campus (Powai Lake, Powai, Mumbai) werd gebruikt om faagdeeltjes toe te voegen. Het meerwater werd gefilterd door een \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) membraan om gesuspendeerde deeltjes, en vervolgens werd Phi6-faag toegevoegd.Voeg \({1}\,{\hbox {ml}}\) van \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} toe \) naar \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) gefilterd meerwater, in \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). gereserveerd voor virale belastingsmeting door plaque-assay. We hebben twee verschillende methoden getest om verrijkte Phi6-virusdeeltjes te concentreren: (1) de aluminiumhydroxide-adsorptie-precipitatiemethode,19 die is gevalideerd voor de concentratie van verschillende omhulde RNA-virussen uit omgevingsmonsters, en (2) ) De op polyethyleenglycol (PEG) gebaseerde virusconcentratiemethode werd aangepast van Flood et al.20. Aangezien de terugwinningsefficiëntie van de op PEG gebaseerde methode beter bleek te zijn dan die van de aluminiumhydroxidemethode, werd de op PEG gebaseerde methode gebruikt om Phi6-deeltjes uit meerwatermonsters te concentreren.
De gebruikte PEG-methode was als volgt: PEG 8000 en \(\hbox {NaCl}\) werden toegevoegd aan Phi6-verrijkte meerwatermonsters om 8 % PEG 8000 en \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\). Monsters werden geïncubeerd op een shaker\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), daarna gecentrifugeerd bij \(4700 \,\hbox {g}\) is \({45}\,{\hbox {min}}\). Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in \({1}\, {\hbox {ml}}\) in hetzelfde supernatant. Alle spike- en virusconcentratie-experimenten werden in triplo uitgevoerd. Na concentratie werd een klein deel gereserveerd voor meting van de herstelefficiëntie door plaque-assay. RNA werd geïsoleerd zoals eerder beschreven en geëlueerd. in de door de kit geleverde elutiebuffer\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Aangezien de RNA-concentratie van monster tot monster in drievoud zal variëren, is de \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) van RNA wordt gebruikt voor alle drie, ongeacht de concentratie cDNA-synthese van monsters. cDNA-synthese werd uitgevoerd zoals eerder beschreven.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA werd gebruikt als sjabloon voor \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR gedurende 35 cycli om \ (117\,\hbox {bp}\) en \(503\,\hbox { bp}\) fragmenten. Deze monsters worden weergegeven als "1:1", dwz zonder verdunning. Een no-template controle (NTC) werd opgezet als een negatieve controle, terwijl een cDNA gesynthetiseerd met behulp van RNA geïsoleerd uit gezuiverde faag werd opgezet als een sjabloon voor een positieve controle (PC). Kwantitatieve PCR (qPCR) werd uitgevoerd in een Stratagene Mx3000P RT-PCR-instrument met behulp van Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Reacties werden zoals eerder in drievoud opgezet beschreven. De cyclusdrempel (Ct) werd geregistreerd voor alle monsters. Bovendien werden de verdunde monsters \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) met behulp van cDNA 1:100 verdund in gefilterd meerwater als \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR gedurende 35 cycli. Deze monsters worden weergegeven als “1:100″.
De PCB-elektroden worden vervaardigd met behulp van een in de handel verkrijgbare goedkope Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) -proces zonder dat extra vergulding nodig is. ENIG PCB-elektrodespecificaties worden gedetailleerd beschreven in ons eerdere werk 11. Voor ENIG PCB-elektroden, traditionele elektrodereinigingsmethoden zoals piranha-oplossing of cyclische voltametrie met zwavelzuur worden niet aanbevolen, aangezien deze het afbladderen van de dunne goudlaag (dikte \(\ approx\) \(100\,\hbox {nm}\)) kunnen veroorzaken en de onderliggende koperlagen bloot kunnen leggen die gevoelig zijn tegen corrosie 21, 22, 23, 24, 25. Reinig daarom de elektroden met een pluisvrije doek die is bevochtigd met IPA. Het te testen monster is geïncubeerd met \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB in \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) voor eenvoudig invoegen. In ons vorige werk , zagen we dat de gevoeligheid en lineariteit van de sensor werden verbeterd door de MB-concentratie te verhogen 11 . Op basis van optimalisaties gerapporteerd in ons eerdere werk, gebruikten we \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB concentraties om DNA in dit onderzoek in te bedden. Elektrochemische detectie van dubbelstrengs DNA (ds-DNA) kan worden bereikt met behulp van anionische of kationische intercalators. Hoewel anionische intercalators DNA met een betere selectiviteit detecteren, vereisen ze een incubatie gedurende de nacht, wat resulteert in langere detectietijden. aan de andere kant hebben kationische intercalators zoals MB kortere incubatietijden nodig, ongeveer \({1}\,{\hbox {h}}\) voor elektrochemische detectie van ds-DNA6. Bij elke meting wordt het te testen monster op de electrode\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), daarna reinigen met een met IPA bevochtigde doek, alvorens verder te gaan met een ander monster.één meting. Elk monster werd getest op 5 verschillende elektroden, tenzij anders vermeld. DPV- en CV-metingen werden uitgevoerd met behulp van een PalmSens Sensit Smart-potentiostaat en PSTrace-software werd gebruikt voor potentiostaatconfiguratie en data-acquisitie, inclusief piekstroomberekeningen. De volgende instellingen worden gebruikt voor DPV- en CV-metingen:
DPV: Evenwichtstijd = \(8\,\hbox {s}\), Spanningsstap = \(3\,\hbox {mV}\), Pulsspanning = \(25\,\hbox {mV}\) , pulsduur = \(50\,\hbox {ms}\), scansnelheid = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Evenwichtstijd = \(8\,\hbox {s}\), Spanningsstap = \(3\,\hbox {mV}\), Sweep Rate = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Piekstromen verkregen uit voltammogrammen van DNA gecomplexeerd met \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV- en CV-voltammogrammen werden verkregen op ENIG PCB-elektroden \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB gecomplexeerd met DNA (in concentraties van 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) ie 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) voor \(117\,\hbox {bp}\ ) en 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) voor \(503\,\hbox {bp}\)). Representatieve voltammogrammen worden getoond in figuur S1 in aanvullende informatie. Figuur 2 toont de resultaten van DPV- en CV-metingen (piekstroom) met gel-gezuiverde PCR-producten. Vergeleken met CV-metingen vertonen DPV-metingen een hogere gevoeligheid (stroom als een functie van DNA-concentratie) omdat de capacitieve achtergrondstromen in CV-metingen Faraday-stromen verbergen 26 . De gegevens want elke box in de boxplot bevat metingen van 5 elektroden. Alle metingen gebruiken dezelfde set elektroden om meetfouten als gevolg van elektrode-tot-elektrode variatie te voorkomen. We zagen een stijgende trend in DPV en CV gemeten piekstromen voor lagere DNA-concentraties , langer (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ vergeleken met \(117) ) fragment. Dit komt overeen met de verwachte trend van elektrode-adsorptie gerapporteerd in ons vorige werk. adsorptie van het MB-DNA-complex vergemakkelijkt de ladingsoverdracht op de elektrode, wat bijdraagt aan de toename van de piekstroom. Andere studies hebben het effect aangetoond van de grootte en sequentie van oligonucleotiden op MB-DNA-intercalatie27,28,29,30.De guanine -cytosine (GC)-gehalte van de twee amplicons (\(117\,\hbox {bp}\) en \(503\,\hbox {bp}\)) was ongeveer 50%, wat aangeeft dat de waarneming Het verschil te wijten is tot ampliconlengte. Echter, voor hogere DNA-concentraties (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), voor \(503\,\hbox {bp} \) en \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) voor \(117\,\hbox {bp}\)), nemen we twee versterkingen waar. piekstromen van de subs worden verminderd in zowel DPV- als CV-metingen. Dit komt omdat MB verzadigt en intercaleert tussen basenparen van DNA, resulterend in sterische remming van de redoxactiviteit van de reduceerbare groep in MB31,32.
van \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV,(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Zouten aanwezig in PCR-mastermixen interfereren met elektrostatische interacties tussen MB en DNA, dus door \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) toe te voegen met \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB gel-gezuiverd product om het effect van zout op MB-DNA-interactie te bestuderen. Zoals weergegeven in figuur 3, hebben we waargenomen dat voor hogere DNA-concentraties (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp}\) en \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) voor \(117\,\hbox {bp} \)), in DPV en CV De toevoeging van zout had geen significante invloed op de metingen (zie figuur S2 in aanvullende informatie voor representatieve voltammogrammen). lagere DNA-concentraties vermindert de toevoeging van zout de gevoeligheid aanzienlijk, wat resulteert in geen significante verandering in stroom met DNA-concentratie. Soortgelijke negatieve effecten van zout op MB-DNA-interacties en intercalatie zijn eerder gerapporteerd door andere onderzoekers33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) kationen binden aan de negatieve fosfaatruggengraat van DNA, waardoor de elektrostatische interactie tussen MB en DNA wordt belemmerd. Bij hogere DNA-concentraties resulteert sterische remming van redox-actieve MB's in lagere piekstromen, dus elektrostatische interacties hebben geen significante invloed op de sensorrespons. Het belangrijkste punt is dat deze biosensor beter geschikt is om hogere DNA-concentraties te detecteren (zelden \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) of hoger), voor volledig geautomatiseerde verwerking van milieuwatermonsters, waar gelzuivering van PCR-producten mogelijk niet haalbaar is.
Gebied onder de absorptiecurve voor het golflengtebereik 600–700 \(\hbox {nm}\) voor verschillende concentraties DNA gecomplexeerd met \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) met en zonder zout (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) met en zonder zout (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) DNA-concentraties overeenkomend met \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB-monsters Geen DNA.
Om de bovenstaande resultaten verder te verifiëren, hebben we optische metingen uitgevoerd met behulp van een UV/Vis-spectrofotometer (Thermo Scientific Multiskan GO), de monsters \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) werden gebruikt voor elk Meting. De absorptiesignatuur neemt af met toenemende DNA-concentratie, zoals blijkt uit de trend van het gebied onder de absorptiecurve voor het golflengtebereik \(600\,\hbox {nm}\) tot \(700\,\hbox { nm}\), zoals weergegeven in Fig. 4 (absorptiespectrum weergegeven in Fig. S3 in aanvullende informatie). Voor monsters met DNA-concentraties van minder dan \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), was er geen significant verschil in opname tussen DNA-bevattende en MB-only monsters (voor \(503\,\hbox {bp}\) en \(117\,\hbox {bp}\ ) lengtefragmenten), wat wijst op de afwezigheid van sterische remming van redox-actief MB. Bij hogere DNA-concentraties zagen we een geleidelijke afname van het absorptiesignaal en zagen we een kleinere afname van de absorptie in aanwezigheid van zout. Deze resultaten werden toegeschreven aan moleculaire interacties en sterische remming met basenstapeling in DNA-hybriden. Onze resultaten komen overeen met rapporten in de literatuur over spectroscopische studies van MB-DNA-intercalatie die hypochromaticiteit associëren met verlaagde energieniveaus in \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) elektronische overgangen als gevolg van intercalatielagen 36, 37, 38.
Agarosegelelektroforese van faag Phi6: PCR-producten van lengte \(117\,\hbox {bp}\) en \(503\,\hbox {bp}\) uit meerwatermonsters. M-DNA-marker;NTC-no-template-controle, primers die overeenkomstige amplicons bevatten;PC positieve controle;1, 2, 3-onverdunde (1:1) verrijkte meerwatermonsters in drievoud. Er is een band zichtbaar op \(\ongeveer 50\,\hbox {bp}\) vanwege ongebruikte oligonucleotiden in de \(503\,\ hbox {bp}\) baan.
We evalueerden het nut van de sensor met behulp van Powai Lake-watermonsters verrijkt met Phi6-faag. De RNA-concentraties geïsoleerd uit faag-verrijkte watermonsters varieerden van 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), terwijl die geïsoleerd uit gezuiverde faagsuspensies. Het RNA werd geschat op \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) met een herstelefficiëntie van ongeveer 1 %.RNA werd reverse getranscribeerd in cDNA en gebruikt als sjabloon voor PCR en qPCR. De productgrootte werd bevestigd door agarosegelelektroforese (Figuur 5) voorafgaand aan het testen met de sensor. Deze monsters zijn niet gel-gezuiverd en bevatten daarom alle componenten van PCR zoals evenals de amplicons van interesse. De Ct-waarden geregistreerd tijdens qPCR (tabel 1) bleken te correleren met de concentratie van RNA geïsoleerd uit de overeenkomstige verrijkte watermonsters. De Ct-waarde onthult het aantal cycli dat nodig is om het fluorescentiesignaal te laten de drempel of het achtergrondsignaal overschrijden. Hogere Ct-waarden duiden op lagere templateconcentraties en vice versa. De Ct-waarden van de NTC-monsters waren zo hoog als verwacht. Het verschil in \(\ongeveer 3\) Ct-waarden tussen de positieve controle en het testmonster geven verder aan dat elk testmonster ongeveer 1% sjabloon heeft in vergelijking met de positieve controle. We hebben eerder besproken dat langere amplicons leiden tot een betere gevoeligheid. Amplificatie van langere fragmenten geïsoleerd uit heterogene omgevingsmonsters is een uitdaging gezien de nadelen van lage virale concentratie en RNA-afbraak. Met onze virusverrijking en ons PCR-amplificatieprotocol waren we echter in staat om het \(503\,\hbox {bp}\)-fragment met succes te amplificeren voor elektrochemische detectie.
Figuur 6 toont de elektrochemische sensorresultaten van het \(503\,\hbox {bp}\) fragment amplicon, beide met onverdund cDNA als template (1:1) en 100-voudig verdund cDNA als template (1:100) uitgevoerde PCR , vergeleken met NTC en pc (zie figuur S4 in aanvullende informatie voor representatieve voltammogrammen). Elk vak in de boxplot in figuur 6 bevat metingen van drie monsters bij 5 elektroden. Dezelfde elektroden werden gebruikt om alle monsters te meten om fouten als gevolg van elektrode te voorkomen -naar-elektrodevariatie. Vergeleken met CV-metingen, laten DPV-metingen een betere resolutie zien om test- en pc-monsters te onderscheiden van NTC's omdat, zoals eerder vermeld, Faraday-stromen verborgen zijn vanwege capacitieve achtergrondstromen in de laatste. Voor langere amplicons hebben we vastgesteld dat de negatieve controle (NTC) resulteerde in hogere CV- en DPV-piekstromen ten opzichte van de positieve controle, terwijl positieve en onverdunde testmonsters vergelijkbare piekhoogten vertoonden van DPV-piekstromen. De gemeten gemiddelde en mediaanwaarden voor elke onverdunde (1:1 ) testmonster en pc kunnen duidelijk worden onderscheiden van de sensoruitvoer voor het NTC-monster, terwijl de resolutie voor het 1:100 verdunde monster minder uitgesproken is. Voor een 100-voudige verdunning van cDNA hebben we geen banden waargenomen tijdens gelelektroforese (banen niet getoond in figuur 5), en de overeenkomstige DPV- en CV-piekstromen waren vergelijkbaar met die verwacht voor NTC. De resultaten voor het \ (117 \, \ hbox {bp} \) fragment worden getoond in aanvullende informatie. Het negatieve controle veroorzaakte een elektrochemische reactie van de PCB-sensor vanwege de adsorptie van vrij MB op de elektrode en de interactie van de MB met het enkelstrengs primeroligonucleotide. Daarom moet elke keer dat een monster wordt getest een negatieve controle worden uitgevoerd en de piekstroom van het testmonster vergeleken met de piekstroom verkregen door de negatieve controle om een differentiële (relatieve) meting te bereiken39,40 om het testmonster als positief of negatief te classificeren.
(a) DPV, en (b) CV-piekstroom voor elektrochemische detectie van \(503\,\hbox {bp}\) fragmenten in watermonsters van meren. Testmonsters werden in drievoud gemeten en vergeleken met controles zonder sjabloon (NTC) en positieve controles (PC).
Onze bevindingen illustreren verschillende mechanismen die van invloed zijn op de prestaties van elektrochemische sensoren voor amplicons van verschillende lengtes voor verschillende DNA's, met concentraties geverifieerd door optische metingen met behulp van een UV/Vis-spectrofotometer. Onze waarnemingen onderstrepen het inzicht dat langere DNA-fragmenten tot \(\ongeveer\) \(500\,\hbox {bp}\) kan worden gedetecteerd met een hogere gevoeligheid en dat de aanwezigheid van zout in het monster dat niet doet Gevoeligheid DNA-concentratie die een hogere gevoeligheid beïnvloedt (zelden \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) en hoger). Daarnaast hebben we het effect onderzocht van verschillende soorten monsters, waaronder gel-gezuiverde amplicons met en zonder toegevoegd zout, en toevoeging van meerwatermonsters in DPV- en CV-metingen.We hebben vastgesteld dat DPV een betere resolutie bood, aangezien de capacitieve achtergrondstroom ook de CV-meting beïnvloedt, waardoor deze minder gevoelig wordt.
Amplificatie van langere fragmenten hangt af van de integriteit van het virale genomische RNA. Verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat amplificatie van langere fragmenten niet altijd efficiënt is vanwege degradatie van RNA in de omgeving en de mogelijkheid van splicing tijdens isolatie11,41,42,43,44 We hebben vastgesteld dat de op PEG gebaseerde virusconcentratiemethode effectiever was in het concentreren van faag Phi-6 verrijkt in meerwatermonsters dan de op aluminiumhydroxide gebaseerde virusconcentratiemethode. Het vermogen om lange DNA-fragmenten te detecteren, bleek de vereiste voor multiplex-PCR te overwinnen om meerdere sjablonen met een kortere lengte te versterken en de mogelijkheid van kruisspecificiteit te verminderen.
Biologische monsters zijn schaars, dus er is behoefte aan het ontwerpen van een biosensor die minimale monsters nodig heeft om te testen. De ENIG PCB-elektroden die in dit onderzoek werden gebruikt, vereisten alleen \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) monsters voor testen om het effectieve gebied van de elektroden te bedekken.Bovendien kan dezelfde elektrode na reiniging opnieuw worden gebruikt voordat het volgende monster wordt afgegeven.Voorversterkte monsters vereisen geen toevoeging van andere chemicaliën dan methyleenblauw, wat een goedkope en veelgebruikte chemische stof. Aangezien elke elektrode ongeveer $ 0,55 (of INR 40) kost om te vervaardigen, kan deze biosensor een kosteneffectief alternatief zijn voor bestaande detectietechnologieën. Tabel 2 toont een vergelijking van dit werk met andere sensoren die al lang in de literatuur worden vermeld DNA-fragmenten in heterogene monsters.
Aangezien MB-gebaseerde elektrochemische detectieprotocollen afhankelijk zijn van de specificiteit van PCR, is een belangrijke beperking van deze methode het potentieel voor niet-specifieke amplificatie in heterogene monsters zoals afvalwater en meerwater of het gebruik van laagzuivere primers. elektrochemische detectiemethoden voor DNA-detectie van ongezuiverde PCR-producten met behulp van ongewijzigde ENIG PCB-elektroden, is het noodzakelijk om fouten die worden veroorzaakt door ongebruikte dNTP's en primers beter te begrijpen en om reactieomstandigheden en testprotocollen te optimaliseren. Aanvullende fysisch-chemische parameters zoals pH, temperatuur en biologische het zuurstofverbruik (BZV) van het watermonster moet mogelijk ook worden gemeten om de nauwkeurigheid van de meting te verbeteren.
Concluderend stellen we een goedkope elektrochemische ENIG PCB-sensor voor voor virusdetectie in omgevingsmonsters (meerwater). elektroden met een langere houdbaarheid en geen specifieke opslagvereisten en daarom geschikt voor de ontwikkeling van meetoplossingen met geautomatiseerde monsterverwerking die wordt ingezet in LMIC's. De biosensor maakt gebruik van goedkope DNA-intercalerende redoxkleurstoffen (MB) voor snelle detectie van doelamplicons. De niet-specifieke amplificatie gebruikelijk in omgevingsmonsters vermindert de specificiteit van deze detectiemethode vanwege de niet-specifieke binding van MB's aan enkel- en dubbelstrengige oligonucleotiden. Daarom hangt de specificiteit van deze test af van de optimalisatie van primers en PCR-reactieomstandigheden. Bovendien is de CV en DPV-piekstromen verkregen uit de geteste monsters moeten worden geïnterpreteerd in verhouding tot de reacties verkregen uit de negatieve controle (NTC) voor elke test. De elektrochemische sensorontwerpen en -methoden die in dit werk worden gepresenteerd, kunnen worden geïntegreerd met autosamplers om een volledig geautomatiseerde en lage goedkope oplossing die monsters kan verzamelen en analyseren en resultaten draadloos kan terugzenden naar het laboratorium.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Methoden voor initiële concentratie van virussen uit watermonsters: een overzicht en meta-analyse van recente studies.J.Application.microorganism.115, pp. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Watergedragen virussen: belemmeringen voor veilig drinkwater. PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Afvalwaterepidemiologie voor kosteneffectieve grootschalige bewaking van COVID-19 in lage- en middeninkomenslanden: uitdagingen en kansen. Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleïnezuurelektrochemie.Chemical.Rev.112, 3427-3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methyleenblauw als een elektrochemische discriminator van enkel- en dubbelstrengige oligonucleotiden geïmmobiliseerd op gouden substraten. Analist 126, 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Vergelijking van kation- en anion-intercalators voor elektrochemische transductie van DNA-hybridisatie door elektronenoverdracht over lange afstand. Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Ladingsoverdracht via DNA: een selectieve elektrochemische DNA-biosensor.anus.Chemical.78, 2138-2144 (2006).
Fang, TH et al.Realtime PCR-microfluïdisch apparaat met gelijktijdige elektrochemische detectie.biologische sensor.Bioelectronics.24, 2131-2136 (2009).
Win, BY et al. Onderzoek naar signaalmechanismen en prestatieverificatie van een elektrochemisch real-time PCR-systeem op basis van de interactie van methyleenblauw met DNA. Analist 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Loop-gemedieerde isothermische amplificatie-gebaseerde elektrochemische sensor voor detectie van sars-cov-2 in afvalwatermonsters.J.Milieu.Chemisch.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al. Elektrochemische detectie van SARS-CoV-2-amplicons met PCB-elektroden. De sensor is geactiveerd. B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Efficiënte detectie van SARS-CoV-2-RNA in de vaste fractie van afvalwater.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Analytische methoden voor SARS-CoV-2-detectie in afvalwater: protocol en toekomstperspectieven.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Overleven van de omhulde bacteriofaag Phi6 (een surrogaat voor SARS-CoV-2) in verdampte speekseldruppels die op glazen oppervlakken zijn afgezet.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Milieupersistentie van een SARS-CoV-2-surrogaat (Phi6) in vrijlevende amoeben.J.Watergezondheid 20, 83 (2021).
Mindich, L. Nauwkeurige verpakking van drie genomische fragmenten van dubbelstrengs RNA-bacteriofaag\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149-160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Secundaire structuur van de DH RNA faag\(\varphi\)6 verpakkingsregio.RNA 6, 880-889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap - Een snel en efficiënt protocol voor het bereiden van laboratoriumvoorraden bacteriofagen.PeerJ 4, e2261 (2016).
Posttijd: 27 mei 2022