Terima kasih kerana melawati Nature.com.Versi penyemak imbas yang anda gunakan mempunyai sokongan terhad untuk CSS.Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan penyemak imbas yang dikemas kini (atau matikan mod keserasian dalam Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan memaparkan tapak tanpa gaya dan JavaScript.
Kepentingan memantau sampel alam sekitar telah sangat dihargai sejak permulaan pandemik COVID-19, dan beberapa usaha pemantauan sedang dilakukan menggunakan piawaian emas, walaupun teknik berasaskan qPCR adalah mahal. Biosensor DNA elektrokimia boleh memberikan yang berpotensi kos efektif penyelesaian untuk memantau sampel air alam sekitar di negara berpendapatan rendah dan sederhana. Dalam kerja ini, kami menunjukkan pengesanan elektrokimia amplikon yang diperoleh daripada Phi6 phage yang diasingkan daripada sampel air tasik berduri (pengganti popular untuk SARS-CoV-2), menggunakan ENIG untuk melengkapkan elektrod PCB tanpa pengubahsuaian permukaan.jantina. Tindak balas sensor elektrokimia telah dicirikan secara menyeluruh untuk dua serpihan DNA yang berbeza panjang (\({117}\,\hbox {bp}\) dan \({503}\,\hbox {bp}\)), dan kesan garam dalam campuran induk PCR pada interaksi metilena biru (MB)-DNA. Keputusan kami menunjukkan bahawa panjang serpihan DNA secara signifikan menentukan sensitiviti elektrokimia dan menunjukkan dalam kerja ini bahawa keupayaan untuk mengesan amplikon panjang tanpa penulenan gel produk PCR adalah penting untuk pengukuran in situ sampel air.Penyelesaian automatik sepenuhnya untuk viral load memberi petanda dengan baik.
Penghantaran virus bawaan air telah dikenali sebagai bahaya kesihatan awam sejak tahun 1940-an, dengan bukti pertama penularan bawaan air polio dan hepatitis E1. Pertubuhan Kesihatan Sedunia (WHO) telah mengklasifikasikan beberapa patogen virus bawaan air dengan kepentingan kesihatan sederhana hingga tinggi2.Virus tradisional kaedah pengesanan bergantung pada teknik berasaskan qPCR standard emas, yang sangat sensitif dan khusus, tetapi memerlukan kakitangan mahir untuk menguji di makmal menggunakan instrumen mahal. Walau bagaimanapun, di negara berpendapatan rendah dan sederhana (LMIC) dengan sumber terhad, manusia ujian sampel berkemungkinan akan diutamakan berbanding pemantauan sampel air alam sekitar.Oleh itu, kaedah kos rendah alternatif diperlukan untuk pemantauan masa nyata air dan sampel air buangan yang mampan di negara berpendapatan rendah dan sederhana sebagai amaran awal tentang wabak penyakit yang baru muncul, dengan itu melindungi mereka daripada kesan sosioekonomi yang teruk akibat pandemik virus.Biosensor elektrokimia kos rendah untuk asid nukleik boleh menyediakan penyelesaian berpotensi yang menjanjikan untuk keperluan yang tidak dapat dipenuhi ini. Kebanyakan biosensor DNA ini berfungsi dengan fakta bahawa untaian DNA pelengkap dialihkan pada elektrod permukaan dan hibrid apabila jujukan padanan hadir dalam sampel. Ini kemudiannya boleh ditukar menjadi isyarat melalui pelbagai teknik elektrokimia menggunakan mediator redoks seperti besi kalium/ferrocyanide. Methylene blue (MB) ialah salah satu molekul aktif redoks sedemikian, yang mempunyai telah dilaporkan berinterkalasi menjadi DNA untai dua (dsDNA) sebagai tambahan kepada pengikatannya yang lebih tidak spesifik kepada DNA untai tunggal5,6. Sifat interkalasi MB untuk membentuk kompleks MB-DNA menjadikannya pilihan popular sebagai mediator redoks dalam beberapa DNA elektrokimia. konfigurasi sensor5,6,7,8,9. Walaupun interkalasi MB kepada DNA adalah tidak spesifik, dan kekhususan sensor elektrokimia ini bergantung pada ketulenan primer yang digunakan untuk PCR atau penguatan isoterma, ia sangat sesuai untuk melaksanakan -masa qPCR berasaskan elektrokimia atau amplifikasi isoterma pendarfluor sebagai alternatif kepada pengukuran kepekatan DNA 9 .Dalam satu pelaksanaan sedemikian, Won et al. Permukaan elektrod emas telah diubah suai dengan 6-mercapto-1-heksanol (MCH) untuk masa nyata pengukuran amplikon PCR dengan MB menggunakan voltammetri nadi pembezaan (DPV)9.Dalam kes lain, Ramirez et al.Pengesanan SARS-CoV-2 dalam air sisa melalui tindak balas RT-LAMP menggunakan MB dengan elektrod bercetak skrin.Elektrod platinum juga telah digunakan seperti elektrod in situ dalam platform PCR mikrobendalir yang direka untuk mengesan amplikon secara elektrokimia semasa tindak balas 8 . Kesemua kajian ini memerlukan pengubahsuaian permukaan elektrod, membayangkan peningkatan kos pengeluaran dan operasi disebabkan oleh keperluan penyimpanan khas untuk kestabilan elektrod berfungsi ini.
Skema aliran kerja untuk pengesanan elektrokimia amplikon yang diperoleh daripada zarah virus pekat dalam sampel air tasik.
Kami baru-baru ini telah menunjukkan penderiaan elektrokimia bagi amplikon SARS-CoV-2 dengan elektrod papan litar bercetak (PCB) kos rendah berdasarkan DPV dan voltammetri kitaran (CV) yang disebabkan oleh penjerapan kompleks MB-DNA pada permukaan elektrod yang tidak diubah suai ) perubahan kemuncak. semasa11.Kami melaporkan bahawa serpihan DNA yang lebih panjang (N1-N2, \({943}\, \hbox) yang terbentuk menggunakan primer N1 ke hadapan dan N2 terbalik yang disyorkan CDC berbanding dengan serpihan yang lebih pendek {bp}\)) menunjukkan kelinearan yang lebih baik dalam tindak balas sensor ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) dibentuk menggunakan set primer N1 ke hadapan dan N1 terbalik. Kajian ini dilaporkan menggunakan pencairan DNA yang disediakan dalam air bebas nuklease. Platform ini juga digunakan untuk mengesan SARS-CoV -2 amplikon dalam sampel air sisa simulasi (diperolehi dengan menambah jumlah sampel RNA dengan RNA SARS-CoV-2). Memandangkan RNA terdedah kepada ricih semasa pengasingan dan pemprosesan hiliran,12,13 adalah sukar untuk menguatkan serpihan yang lebih panjang dengan sampel heterogen ini. Oleh itu, demonstrasi penderiaan elektrokimia amplikon SARS-CoV-2 dalam air sisa dihadkan kepada serpihan N1 \(72\,\hbox {bp}\) yang lebih pendek.
Dalam kerja ini, kami menyiasat kemungkinan penderiaan elektrokimia berasaskan ENIG PCB bagi faj Phi6 yang tertumpu dan diasingkan daripada sampel air tasik (Rajah 1). juga mempunyai membran lipid dan protein spike.Atas sebab-sebab ini, bacteriophage Phi6 ialah pengganti popular untuk SARS-CoV-2 dan virus RNA patogenik berselubung lain14,15.RNA yang diasingkan daripada zarah fag telah digunakan sebagai templat untuk sintesis cDNA diikuti oleh PCR untuk mendapatkan dua serpihan DNA dengan panjang 117 dan 503 pasangan asas. Memandangkan cabaran untuk menguatkan \(943\,\hbox {bp}\) serpihan N1-N2 dalam kerja kami sebelum ini, kami menyasarkan serpihan panjang pertengahan (\(117 \,\hbox {bp}\) dan \(503 \,\hbox {bp}\)), berdasarkan primer yang tersedia. Tindak balas sensor elektrokimia telah dikaji secara sistematik dalam julat kepekatan yang luas (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) kepada \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Untuk kedua-dua serpihan dalam kehadiran MB, kesan garam pada tindak balas sensor telah dicirikan dan disahkan silang oleh ukuran spektrofotometri. Sumbangan utama kerja ini adalah seperti berikut:
Panjang serpihan DNA dan kehadiran garam dalam sampel sangat mempengaruhi sensitiviti.Keputusan kami menunjukkan bahawa aktiviti elektrokimia bergantung pada mekanisme interaksi MB, DNA, dan sensor yang berbeza dalam tindak balas voltammetrik, bergantung kepada kepekatan dan panjang DNA, dengan Fragmen yang lebih panjang menunjukkan kepekaan yang lebih tinggi, walaupun garam mempunyai kesan negatif terhadap interaksi elektrostatik antara MB dan DNA.
Kepekatan DNA menentukan mekanisme interaksi MB-DNA dalam elektrod yang tidak diubah suai Kami menunjukkan bahawa mekanisme interaksi MB-DNA yang berbeza bergantung pada kepekatan DNA. Pada kepekatan DNA di bawah sejumlah kecil \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), kami mendapati bahawa tindak balas arus elektrokimia terutamanya ditentukan oleh penjerapan MB-DNA pada elektrod, manakala pada kepekatan yang lebih rendah Pada kepekatan DNA yang tinggi, tindak balas arus elektrokimia ditentukan oleh perencatan sterik redoks. aktiviti disebabkan oleh kemasukan MB antara pasangan asas DNA.
Penderiaan Elektrokimia Berasaskan PCB ENIG Asid Nukleik Viral dalam Sampel Air Tasik Pemerhatian telah disahkan oleh pengesanan elektrokimia serpihan DNA \(503\,\hbox {bp}\) tambah Phi6 yang diperoleh daripada sampel air dari Tasik Powai, Kampus IIT Mumbai Hasil phage.
Kos pelaksanaan yang rendah dan berpotensi untuk disepadukan ke dalam sistem pemantauan automatik sepenuhnya, oligonukleotida atau aptamer pada elektrod dengan jangka hayat yang lebih lama.
Phage Phi6 ialah virus dsRNA yang diselubungi keluarga Cytoviridae yang menjangkiti Pseudomonas syringae. Genom Phi6 phage wujud dalam bentuk 3 serpihan: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) dan L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Memandangkan Phi6 phage menjangkiti strain BSL-1 Pseudomonas bukan patogen, ia selamat digunakan dan boleh ditanam dengan mudah di makmal.Phage Phi6 dan hosnya Pseudomonas syringae telah dibeli daripada Pusat Rujukan Felix d'Herelle untuk Virus Bakteria, Universiti Laval, Kanada (nombor katalog pusat rujukan ialah HER-102 dan HER-1102, masing-masing) .Phi6 phage dan perumahnya telah dihidupkan semula seperti yang diarahkan oleh pusat rujukan.Phage Phi6 telah disucikan dengan lisis plat dan elusi untuk mendapatkan titer akhir dengan \(\kira-kira 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (unit pembentuk plak/ mililiter).RNA telah diasingkan daripada zarah fag yang telah disucikan menggunakan Kit Pemurnian RNA Total GenElute™ (Sigma-Aldrich) mengikut arahan pengilang. Secara ringkas, suspensi Phi6 phage yang telah disucikan\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) telah dilisekan dan lisat dimuatkan pada lajur putaran untuk membolehkan RNA terikat pada lajur resin .RNA kemudiannya dielusikan dalam larutan elusi \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) yang disediakan oleh kit. Anggarkan kepekatan RNA melalui penyerapan pada \(260\,\hbox {nm}\).RNA disimpan dalam aliquot dalam \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) sehingga digunakan selanjutnya.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Kit Sintesis cDNA iScript (Bio -Rad Laboratories) telah digunakan sebagai templat untuk sintesis cDNA mengikut arahan pengilang. Secara ringkas, tindak balas sintesis cDNA terdiri daripada 3 langkah: penyebuan pada \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , transkripsi terbalik \({20}\,{\hbox {min}}\) pada \({46}\,{^{\circular }\hbox {C}}\), dan terbalik Perakam berada dalam \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) untuk \({1}\,{\hbox {min }}\).Apabila dijalankan pada gel agarose 1%, cDNA menunjukkan tiga jalur sepadan dengan jangkaan tiga serpihan RNA (data tidak ditunjukkan). Primer berikut digunakan untuk menguatkan dua serpihan DNA dengan panjang 117 dan 503 bp, menggunakan cDNA sebagai templat untuk PCR dalam kitar terma miniPCR® mini8:
Primer untuk \(117\,\hbox {bp}\) dan \(503\,\hbox {bp}\) sepadan dengan 1476-1575 nukleotida segmen M dan 458-943 nukleotida segmen L, masing-masing asid .Semua produk PCR yang dikuatkan telah dielektroforesis pada 1% gel agarosa, dan DNA sasaran yang diperkuat telah ditulenkan menggunakan Kit Pengekstrakan Gel GeneJET (Thermo Fisher Scientific).
Sebuah tasik di kampus IIT Mumbai (Tasik Powai, Powai, Mumbai) digunakan untuk menambah zarah fag. Air tasik itu ditapis melalui membran \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) untuk dialih keluar zarah terampai, dan kemudian Phi6 phage telah ditambah. Tambahkan \({1}\,{\hbox {ml}}\) daripada \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) kepada \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) air tasik yang ditapis, dalam \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\).Aliquot kecil ialah dikhaskan untuk pengukuran beban virus melalui ujian plak. Kami menguji dua kaedah berbeza untuk menumpukan zarah virus Phi6 berduri: (1) kaedah penjerapan-pemendakan aluminium hidroksida,19 yang telah disahkan untuk kepekatan beberapa virus RNA yang diselubungi daripada sampel persekitaran, dan (2) ) Kaedah kepekatan virus berasaskan polietilena glikol (PEG) telah diadaptasi daripada Flood et al.20 .Oleh kerana kecekapan pemulihan kaedah berasaskan PEG didapati lebih baik daripada kaedah aluminium hidroksida, kaedah berasaskan PEG digunakan untuk menumpukan zarah Phi6 daripada sampel air tasik.
Kaedah PEG yang digunakan adalah seperti berikut: PEG 8000 dan \(\hbox {NaCl}\) telah ditambah ke dalam sampel air tasik berpancang Phi6 untuk mendapatkan 8 % PEG 8000 dan \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Sampel telah diinkubasi pada shaker\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), kemudian disentrifugasi pada \(4700 \,\hbox {g}\) ialah \({45}\,{\hbox {min}}\).Buang supernatan dan gantung semula pelet dalam \({1}\, {\hbox {ml}}\) dalam supernatan yang sama.Semua eksperimen spiking dan kepekatan virus dilakukan dalam tiga kali ganda.Selepas kepekatan, aliquot kecil dikhaskan untuk pengukuran kecekapan pemulihan melalui ujian plak.RNA telah diasingkan seperti yang diterangkan dan dielusikan sebelum ini dalam penimbal elusi yang dibekalkan kit\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\).Oleh kerana kepekatan RNA akan berbeza dari sampel ke sampel dalam tiga kali ganda, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) RNA digunakan untuk ketiga-tiganya tanpa mengira kepekatannya sintesis cDNA sampel. Sintesis cDNA telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA telah digunakan sebagai templat untuk \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR untuk 35 kitaran untuk menguatkan \ (117\,\hbox {bp}\) dan \(503\,\hbox { bp}\) serpihan. Sampel ini diwakili sebagai “1:1″, iaitu tanpa pencairan. Kawalan tanpa templat (NTC) telah ditetapkan sebagai kawalan negatif, manakala cDNA yang disintesis menggunakan RNA yang diasingkan daripada fag yang telah dimurnikan telah disediakan sebagai templat untuk kawalan positif (PC). PCR Kuantitatif (qPCR) telah dilakukan dalam instrumen Stratagene Mx3000P RT-PCR menggunakan Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Reaksi telah disediakan dalam tiga kali ganda seperti sebelum ini diterangkan.Ambang kitaran (Ct) direkodkan untuk semua sampel. Selain itu, sampel yang dicairkan adalah \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) menggunakan cDNA dicairkan 1:100 dalam air tasik yang ditapis sebagai \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR untuk 35 kitaran. Sampel ini diwakili sebagai “1:100″.
Elektrod PCB dibuat menggunakan proses Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) kos rendah yang boleh didapati secara komersial tanpa memerlukan penyaduran emas tambahan.Spesifikasi elektrod ENIG PCB diperincikan dalam kerja kami sebelum ini11.Untuk elektrod ENIG PCB, kaedah pembersihan elektrod tradisional seperti larutan piranha atau voltammetri kitaran asid sulfurik tidak digalakkan kerana ia boleh menyebabkan pengelupasan lapisan emas nipis (ketebalan \(\approx\) \(100\,\hbox {nm }\)) dan mendedahkan lapisan kuprum di bawahnya yang terdedah kepada kakisan 21, 22, 23, 24, 25.Oleh itu, bersihkan elektrod dengan kain bebas lin yang dibasahkan dengan IPA.Sampel yang akan diuji telah diinkubasi dengan \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB dalam \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) untuk sisipan mudah.Dalam kerja kami sebelum ini , kami memerhatikan bahawa kepekaan dan kelinearan penderia telah dipertingkatkan dengan meningkatkan kepekatan MB 11 . Berdasarkan pengoptimuman yang dilaporkan dalam kerja terdahulu kami, kami menggunakan \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB kepekatan untuk membenamkan DNA dalam kajian ini.Pengesanan elektrokimia DNA untai dua (ds-DNA) boleh dicapai menggunakan interkalator anionik atau kationik.Walaupun interkalator anionik mengesan DNA dengan selektiviti yang lebih baik, ia memerlukan pengeraman semalaman, menghasilkan masa pengesanan yang lebih lama.Hidup sebaliknya, interkalator kationik seperti MB memerlukan masa pengeraman yang lebih pendek, lebih kurang \({1}\,{\hbox {h}}\) untuk pengesanan elektrokimia ds-DNA6. Setiap pengukuran melibatkan pengeluaran sampel untuk diuji pada elektrod\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), kemudian bersihkan dengan kain lap lembap IPA, sebelum meneruskan dengan sampel lain.satu ukuran. Setiap sampel telah diuji pada 5 elektrod berbeza melainkan dinyatakan sebaliknya. Pengukuran DPV dan CV dilakukan menggunakan potensiostat Pintar PalmSens Sensit, dan perisian PSTrace digunakan untuk konfigurasi potensiostat dan pemerolehan data, termasuk pengiraan arus puncak. Tetapan berikut digunakan untuk ukuran DPV dan CV:
DPV: Masa Keseimbangan = \(8\,\hbox {s}\), Langkah Voltan = \(3\,\hbox {mV}\), Voltan Nadi = \(25\,\hbox {mV}\) , tempoh nadi = \(50\,\hbox {ms}\), kadar imbasan = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Masa Keseimbangan = \(8\,\hbox {s}\), Langkah Voltan = \(3\,\hbox {mV}\), Kadar Sapuan = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
Arus puncak diperoleh daripada voltammogram DNA yang dikomplekskan dengan \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Voltammogram DPV dan CV diperolehi pada elektrod ENIG PCB \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB yang dikomplekskan dengan DNA (pada kepekatan 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) iaitu 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) untuk \(117\,\hbox {bp}\ ) dan 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) untuk \(503\,\hbox {bp}\)).Voltammogram perwakilan ditunjukkan dalam Rajah S1 dalam Maklumat Tambahan. Rajah 2 menunjukkan keputusan bagi pengukuran DPV dan CV (arus puncak) menggunakan produk PCR yang ditulenkan gel. Berbanding dengan pengukuran CV, pengukuran DPV menunjukkan kepekaan yang lebih tinggi (arus sebagai fungsi kepekatan DNA) kerana arus kapasitif latar belakang dalam pengukuran CV menyembunyikan arus Faradaic 26 .Data untuk setiap kotak dalam boxplot mengandungi ukuran daripada 5 elektrod. Semua ukuran menggunakan set elektrod yang sama untuk mengelakkan ralat pengukuran disebabkan oleh variasi elektrod-ke-elektrod. Kami memerhatikan peningkatan aliran dalam DPV dan arus puncak terukur CV untuk kepekatan DNA yang lebih rendah. , lebih panjang (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ berbanding dengan \(117) ) serpihan. Ini selaras dengan aliran jangkaan penjerapan elektrod yang dilaporkan dalam kerja kami sebelum ini. penjerapan kompleks MB-DNA memudahkan pemindahan cas pada elektrod, yang menyumbang kepada peningkatan arus puncak.Kajian lain telah menunjukkan kesan saiz dan jujukan oligonukleotida pada interkalasi MB-DNA27,28,29,30. Guanin -cytosine (GC) kandungan dua amplikon (\(117\,\hbox {bp}\) dan \(503\,\hbox {bp}\)) adalah kira-kira 50%, menunjukkan bahawa pemerhatian Perbezaan adalah disebabkan kepada panjang amplikon.Walau bagaimanapun, untuk kepekatan DNA yang lebih tinggi (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), untuk \(503\,\hbox {bp} \) dan \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) untuk \(117\,\hbox {bp}\)), kita perhatikan dua amplifikasi. arus puncak subs dikurangkan dalam kedua-dua ukuran DPV dan CV. Ini kerana MB tepu dan interkalate antara pasangan asas DNA, mengakibatkan perencatan sterik aktiviti redoks kumpulan boleh dikurangkan dalam MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Garam yang terdapat dalam campuran induk PCR mengganggu interaksi elektrostatik antara MB dan DNA, jadi dengan menambahkan \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) dengan \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) Produk ditulenkan gel MB untuk mengkaji kesan garam pada interaksi MB-DNA. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3, kami memerhatikan bahawa untuk kepekatan DNA yang lebih tinggi (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) dan \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) untuk \(117\,\hbox {bp} \)), dalam DPV dan CV Penambahan garam tidak menjejaskan ukuran dengan ketara (lihat Rajah S2 dalam Maklumat Tambahan untuk voltammogram perwakilan). Walau bagaimanapun, pada kepekatan DNA yang lebih rendah, penambahan garam sangat mengurangkan kepekaan, menyebabkan tiada perubahan ketara dalam arus dengan kepekatan DNA. Kesan negatif garam yang serupa pada interaksi dan interkalasi MB-DNA telah dilaporkan sebelum ini oleh penyelidik lain33,34.\(\hbox { Kation Mg}^{2+}\) mengikat kepada tulang belakang fosfat negatif DNA, dengan itu menghalang interaksi elektrostatik antara MB dan DNA. Pada kepekatan DNA yang lebih tinggi, perencatan sterik MB redoks-aktif menghasilkan arus puncak yang lebih rendah, jadi interaksi elektrostatik tidak menjejaskan tindak balas penderia dengan ketara. Perkara utama ialah biosensor ini lebih sesuai untuk mengesan kepekatan DNA yang lebih tinggi (jarang \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) atau lebih tinggi), untuk pemprosesan sepenuhnya sampel air persekitaran secara automatik, di mana penulenan gel produk PCR mungkin tidak dapat dilaksanakan.
Kawasan di bawah lengkung penyerapan untuk julat panjang gelombang 600–700 \(\hbox {nm}\) untuk pelbagai kepekatan DNA yang dikomplekskan dengan \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) dengan dan tanpa garam (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) dengan dan tanpa garam (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Kepekatan DNA yang sepadan dengan \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) sampel MB Tiada DNA.
Untuk mengesahkan lagi keputusan di atas, kami melakukan pengukuran optik menggunakan spektrofotometer UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), sampel \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) telah digunakan untuk setiap Pengukuran. Tandatangan penyerapan berkurangan dengan peningkatan kepekatan DNA, seperti yang boleh dilihat daripada arah aliran kawasan di bawah lengkung penyerapan untuk julat panjang gelombang \(600\,\hbox {nm}\) kepada \(700\,\hbox { nm}\) , seperti ditunjukkan dalam Rajah 4 (spektrum penyerapan ditunjukkan dalam Rajah S3 dalam Maklumat Tambahan). Untuk sampel dengan kepekatan DNA kurang daripada \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), tidak terdapat perbezaan yang ketara dalam pengambilan antara sampel yang mengandungi DNA dan MB sahaja (untuk \(503\,\hbox {bp}\) dan \(117\,\hbox {bp}\ ) serpihan panjang), menunjukkan ketiadaan perencatan sterik MB redoks-aktif. Pada kepekatan DNA yang lebih tinggi, kami memerhatikan penurunan beransur-ansur dalam isyarat penyerapan dan mencatatkan penurunan yang lebih rendah dalam penyerapan dengan kehadiran garam. Keputusan ini dikaitkan dengan molekul interaksi dan perencatan sterik dengan susunan asas dalam hibrid DNA. Keputusan kami konsisten dengan laporan dalam literatur mengenai kajian spektroskopi interkalasi MB-DNA yang mengaitkan hipokromatik dengan tahap tenaga yang berkurangan dalam \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) peralihan elektronik akibat interkalasi Lapisan 36, 37, 38.
Elektroforesis gel agarose bagi Phi6: Produk PCR panjang \(117\,\hbox {bp}\) dan \(503\,\hbox {bp}\) daripada sampel air tasik. Penanda M-DNA;Kawalan tanpa templat NTC, primer yang mengandungi amplikon yang sepadan;Kawalan positif PC;1, 2, 3-tidak dicairkan (1:1) sampel air tasik berduri dalam tiga kali ganda. Jalur kelihatan pada \(\kira-kira 50\,\hbox {bp}\) disebabkan oleh oligonukleotida yang tidak digunakan dalam \(503\,\ hbox {bp}\) lorong.
Kami menilai utiliti penderia menggunakan sampel air Tasik Powai yang dicucuk dengan Phi6 phage. Kepekatan RNA yang diasingkan daripada sampel air yang dicucuk fag adalah antara 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), manakala yang diasingkan daripada ampaian phage yang telah dimurnikan RNA dianggarkan \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) dengan kecekapan pemulihan lebih kurang 1 %.RNA telah ditranskripsi terbalik ke dalam cDNA dan digunakan sebagai templat untuk PCR dan qPCR. Saiz produk telah disahkan oleh elektroforesis gel agarose (Rajah 5) sebelum ujian dengan sensor. Sampel ini tidak ditulenkan gel dan oleh itu mengandungi semua komponen PCR sebagai serta amplikon yang diminati. Nilai Ct yang direkodkan semasa qPCR (Jadual 1) ditunjukkan berkorelasi dengan kepekatan RNA yang diasingkan daripada sampel air pancang yang sepadan. Nilai Ct mendedahkan bilangan kitaran yang diperlukan untuk isyarat pendarfluor kepada melebihi ambang atau isyarat latar belakang. Nilai Ct yang lebih tinggi menunjukkan kepekatan templat yang lebih rendah dan begitu juga sebaliknya. Nilai Ct sampel NTC adalah setinggi yang dijangkakan. Perbezaan dalam nilai \(\lebih kurang 3\) Ct antara kawalan positif dan sampel ujian seterusnya menunjukkan bahawa setiap sampel ujian mempunyai kira-kira 1% templat berbanding dengan kawalan positif. Kami sebelum ini telah membincangkan bahawa amplikon yang lebih panjang membawa kepada kepekaan yang lebih baik. Penguatan serpihan yang lebih panjang diasingkan daripada sampel persekitaran heterogen adalah mencabar memandangkan kelemahan kepekatan virus yang rendah dan degradasi RNA. Walau bagaimanapun, dengan pengayaan virus dan protokol amplifikasi PCR kami, kami berjaya menguatkan serpihan \(503\,\hbox {bp}\) untuk penderiaan elektrokimia.
Rajah 6 menunjukkan keputusan penderia elektrokimia bagi amplikon serpihan \(503\,\hbox {bp}\), kedua-duanya menggunakan cDNA tidak cair sebagai templat (1:1) dan 100 kali ganda cDNA dicairkan sebagai templat (1:100 ) dilakukan PCR , berbanding NTC dan PC (lihat Rajah S4 dalam Maklumat Tambahan untuk voltammogram perwakilan). Setiap kotak dalam boxplot dalam Rajah 6 mengandungi ukuran daripada tiga sampel pada 5 elektrod. Elektrod yang sama digunakan untuk mengukur semua sampel untuk mengelakkan ralat disebabkan oleh elektrod variasi -kepada-elektrod.Berbanding dengan ukuran CV, pengukuran DPV menunjukkan resolusi yang lebih baik untuk membezakan sampel ujian dan PC daripada NTC kerana, seperti yang dinyatakan sebelum ini, arus Faradaic tersembunyi disebabkan oleh arus kapasitif latar belakang. Untuk amplikon yang lebih panjang, kami memerhatikan bahawa kawalan negatif (NTC) menghasilkan arus puncak CV dan DPV yang lebih tinggi berbanding dengan kawalan positif, manakala sampel ujian positif dan tidak cair menunjukkan ketinggian puncak arus puncak DPV yang sama. Nilai min dan median yang diukur bagi setiap tidak cair (1:1). ) sampel ujian dan PC boleh diselesaikan dengan jelas daripada output sensor untuk sampel NTC, manakala resolusi untuk sampel dicairkan 1:100 kurang jelas. Untuk pencairan 100 kali ganda cDNA, kami tidak melihat sebarang jalur semasa elektroforesis gel (lorong tidak ditunjukkan dalam Rajah 5), dan arus puncak DPV dan CV yang sepadan adalah serupa dengan yang dijangkakan untuk NTC. Keputusan untuk serpihan \(117\,\hbox {bp}\) ditunjukkan dalam Maklumat Tambahan. Negatif kawalan menyebabkan tindak balas elektrokimia daripada penderia PCB disebabkan oleh penjerapan MB bebas pada elektrod dan interaksi MB dengan primer oligonukleotida utas tunggal. Oleh itu, setiap kali sampel diuji, kawalan negatif mesti dijalankan dan arus puncak sampel ujian berbanding arus puncak yang diperolehi oleh kawalan negatif untuk mencapai ukuran pembezaan (relatif)39,40 untuk mengklasifikasikan sampel ujian sebagai positif atau negatif.
(a) DPV, dan (b) arus puncak CV untuk pengesanan elektrokimia serpihan \(503\,\hbox {bp}\) dalam sampel air tasik. Sampel ujian diukur dalam tiga kali ganda dan dibandingkan dengan tiada kawalan templat (NTC) dan kawalan positif (PC).
Penemuan kami menggambarkan mekanisme berbeza yang mempengaruhi prestasi penderia elektrokimia untuk amplikon dengan panjang yang berbeza untuk DNA yang berbeza, dengan kepekatan yang disahkan oleh pengukuran optik menggunakan spektrofotometer UV/Vis. Pemerhatian kami menggariskan pandangan bahawa serpihan DNA yang lebih panjang sehingga \(\approx\) \(500\,\hbox {bp}\) boleh dikesan dengan kepekaan yang lebih tinggi dan kehadiran garam dalam sampel tidak kepekatan DNA Kepekaan yang menjejaskan kepekaan yang lebih tinggi (jarang sekali \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) dan ke atas).Selain itu, kami menyiasat kesan pelbagai jenis sampel, termasuk amplikon yang ditulenkan gel dengan dan tanpa garam tambahan, dan penambahan sampel air tasik dalam pengukuran DPV dan CV.Kami mendapati bahawa DPV memberikan resolusi yang lebih baik, kerana arus kapasitif latar belakang juga mempengaruhi pengukuran CV, menjadikannya kurang sensitif.
Penguatan serpihan yang lebih panjang bergantung kepada integriti RNA genom virus. Beberapa kajian telah menunjukkan bahawa penguatan serpihan yang lebih panjang tidak selalunya cekap disebabkan oleh degradasi RNA dalam persekitaran dan potensi untuk penyambungan semasa pengasingan11,41,42,43,44 .Kami mendapati bahawa kaedah kepekatan virus berasaskan PEG adalah lebih berkesan dalam menumpukan phage Phi-6 spike dalam sampel air tasik berbanding kaedah kepekatan virus berasaskan aluminium hidroksida. Keupayaan untuk mengesan serpihan DNA yang panjang terbukti dapat mengatasi keperluan untuk PCR multipleks untuk menguatkan berbilang templat panjang yang lebih pendek dan mengurangkan kemungkinan kekhususan silang.
Sampel biologi adalah terhad, jadi terdapat keperluan untuk mereka bentuk biosensor yang memerlukan sampel minimum untuk ujian. Elektrod PCB ENIG yang digunakan dalam kajian ini hanya memerlukan \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) sampel untuk ujian untuk meliputi kawasan berkesan elektrod. Selain itu, elektrod yang sama boleh digunakan semula selepas dibersihkan sebelum mengeluarkan sampel seterusnya. Sampel yang dikuatkan tidak memerlukan penambahan sebarang bahan kimia selain metilena biru, yang merupakan bahan yang murah dan bahan kimia yang biasa digunakan.Oleh kerana setiap elektrod berharga kira-kira $0.55 (atau INR 40) untuk dihasilkan, biosensor ini boleh menjadi alternatif kos efektif kepada teknologi pengesanan sedia ada. Jadual 2 menunjukkan perbandingan kerja ini dengan penderia lain yang dilaporkan dalam literatur untuk jangka masa yang lama. Serpihan DNA dalam sampel heterogen.
Memandangkan protokol pengesanan elektrokimia berasaskan MB bergantung pada kekhususan PCR, batasan utama kaedah ini ialah potensi untuk penguatan tidak spesifik dalam sampel heterogen seperti air sisa dan air tasik atau menggunakan primer ketulenan rendah. Untuk meningkatkan kepekaan kaedah pengesanan elektrokimia untuk pengesanan DNA produk PCR yang tidak disucikan menggunakan elektrod ENIG PCB yang tidak diubah suai, adalah perlu untuk lebih memahami ralat yang diperkenalkan oleh dNTP dan primer yang tidak digunakan, dan untuk mengoptimumkan keadaan tindak balas dan protokol ujian. Parameter fizikokimia tambahan seperti pH, suhu dan biologi permintaan oksigen (BOD) sampel air juga mungkin perlu diukur untuk meningkatkan ketepatan pengukuran.
Sebagai kesimpulan, kami mencadangkan penderia PCB ENIG elektrokimia kos rendah untuk pengesanan virus dalam sampel persekitaran (air tasik). elektrod dengan jangka hayat yang lebih lama dan tiada keperluan penyimpanan khusus dan oleh itu sesuai untuk pembangunan penyelesaian pengukuran dengan pemprosesan sampel automatik yang digunakan dalam LMIC. Biosensor menggunakan pewarna redoks (MB) interkalasi DNA yang murah untuk pengesanan pantas amplikon sasaran. Penguatan tidak spesifik biasa dalam sampel persekitaran mengurangkan kekhususan kaedah penderiaan ini disebabkan oleh pengikatan tidak spesifik MB kepada oligonukleotida bertali tunggal dan dua. Oleh itu, kekhususan ujian ini bergantung pada pengoptimuman primer dan keadaan tindak balas PCR. Selain itu, CV dan arus puncak DPV yang diperoleh daripada sampel yang diuji hendaklah ditafsirkan secara relatif kepada tindak balas yang diperoleh daripada kawalan negatif (NTC) untuk setiap ujian. Reka bentuk dan kaedah penderia elektrokimia yang dibentangkan dalam kerja ini boleh disepadukan dengan autosamplers untuk membangunkan automatik sepenuhnya dan rendah. -penyelesaian kos yang boleh mengumpul dan menganalisis sampel dan menghantar hasil secara wayarles kembali ke makmal .
Cashdollar, J. & Wymer, L. Kaedah untuk kepekatan awal virus daripada sampel air: kajian semula dan meta-analisis kajian terkini.J.Aplikasi.mikroorganisma.115, ms 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Virus bawaan air: Halangan kepada air minuman yang selamat.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.Epidemiologi air sisa untuk pengawasan berskala besar COVID-19 yang kos efektif di negara berpendapatan rendah dan sederhana: cabaran dan peluang.Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Elektrokimia asid nukleik.Kimia.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylene blue sebagai diskriminator elektrokimia bagi oligonukleotida bertali tunggal dan dua yang tidak bergerak pada substrat emas. Penganalisis 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Perbandingan Interkalator Kation dan Anion untuk Transduksi Elektrokimia Hibridisasi DNA oleh Pemindahan Elektron Jarak Jauh.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Pemindahan caj melalui DNA: biosensor DNA elektrokimia terpilih.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Peranti mikrobendalir PCR masa nyata dengan pengesanan elektrokimia serentak.penderia biologi.Bioelektronik.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. Kajian mekanisme isyarat dan pengesahan prestasi sistem PCR masa nyata elektrokimia berdasarkan interaksi biru metilena dengan DNA. Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Penderia elektrokimia berasaskan penguatan isoterma pengantara gelung untuk pengesanan sars-cov-2 dalam sampel air sisa.J.Alam Sekitar.Kimia.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Penderiaan elektrokimia bagi amplikon SARS-CoV-2 dengan elektrod PCB. Penderia diaktifkan.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Pengesanan cekap RNA SARS-CoV-2 dalam pecahan pepejal air sisa.sains.persekitaran am.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Kaedah Analitikal untuk Pengesanan SARS-CoV-2 dalam Air Sisa: Protokol dan Perspektif Masa Depan.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Kemandirian bakteria Phi6 yang diselubungi (pengganti untuk SARS-CoV-2) dalam titisan air liur tersejat yang dimendapkan pada permukaan kaca.sains.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Kegigihan alam sekitar pengganti SARS-CoV-2 (Phi6) dalam amoeba yang hidup bebas.J.Kesihatan Air 20, 83 (2021).
Mindich, L. Pembungkusan tepat bagi tiga serpihan genomik bakteria RNA beruntai dua\(\varphi\)6.mikroorganisma.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Struktur sekunder DH RNA phage\(\varphi\)6 kawasan pembungkusan.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – Protokol yang pantas dan cekap untuk menyediakan stok makmal bakteriofaj.PeerJ 4, e2261 (2016).
Masa siaran: Mei-27-2022