पीसीबी इलेक्ट्रोड्सचा वापर करून पाण्याच्या नमुन्यांमध्ये व्हायरल न्यूक्लिक अॅसिडच्या इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सिंगसाठी लांब अॅम्प्लिकॉन अधिक चांगली संवेदनशीलता प्रदान करतात

Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझर आवृत्तीमध्ये CSS साठी मर्यादित समर्थन आहे. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अपडेट केलेला ब्राउझर वापरा (किंवा Internet Explorer मधील सुसंगतता मोड बंद करा). दरम्यान, याची खात्री करण्यासाठी सतत समर्थन, आम्ही शैली आणि JavaScript शिवाय साइट प्रदर्शित करू.
कोविड-19 महामारीच्या सुरुवातीपासून पर्यावरणीय नमुन्यांचे निरीक्षण करण्याच्या महत्त्वाची प्रशंसा केली जात आहे, आणि qPCR-आधारित तंत्र महाग असले तरीही सोन्याचे मानक वापरून निरीक्षणाचे काही प्रयत्न केले जात आहेत. इलेक्ट्रोकेमिकल डीएनए बायोसेन्सर संभाव्य खर्च-प्रभावी प्रदान करू शकतात. कमी आणि मध्यम उत्पन्न असलेल्या देशांमध्ये पर्यावरणीय पाण्याच्या नमुन्यांची देखरेख करण्यासाठी उपाय. या कामात, आम्ही ENIG वापरून, अणकुचीदार तलावाच्या पाण्याच्या नमुन्यांपासून (SARS-CoV-2 साठी लोकप्रिय सरोगेट) वेगळे केलेल्या Phi6 फेजमधून मिळवलेल्या अॅम्प्लिकॉनचे इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्शन दाखवतो. पृष्ठभाग बदल न करता पीसीबी इलेक्ट्रोड पूर्ण करण्यासाठी.लिंग. इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सर प्रतिसाद वेगवेगळ्या लांबीच्या दोन डीएनए तुकड्यांसाठी पूर्णपणे वैशिष्ट्यीकृत होता (\({117}\,\hbox {bp}\)\({503}\,\hbox {bp}\)), आणि मिथिलीन ब्लू (एमबी)-डीएनए परस्परसंवादावर पीसीआर मास्टर मिक्समधील क्षारांचा प्रभाव. आमच्या परिणामांवरून असे दिसून येते की डीएनए तुकड्यांची लांबी इलेक्ट्रोकेमिकल संवेदनशीलता लक्षणीयपणे निर्धारित करते आणि या कामात हे दाखवून देते की पीसीआर उत्पादनांच्या जेल शुद्धीकरणाशिवाय लांब अॅम्प्लिकॉन शोधण्याची क्षमता आहे. पाण्याच्या नमुन्यांच्या स्थितीच्या मोजमापासाठी महत्त्वाचे.व्हायरल लोडसाठी पूर्णपणे स्वयंचलित समाधान चांगले आहे.
जलजन्य विषाणूचा प्रसार 1940 पासून सार्वजनिक आरोग्यासाठी धोका म्हणून ओळखला जातो, पोलिओ आणि हिपॅटायटीस E1 च्या जलजन्य संक्रमणाचा पहिला पुरावा. जागतिक आरोग्य संघटनेने (WHO) मध्यम ते उच्च आरोग्य महत्त्वाच्या अनेक जलजन्य विषाणूजन्य रोगजनकांचे वर्गीकरण केले आहे.2.पारंपारिक विषाणू शोध पद्धती सुवर्ण-मानक qPCR-आधारित तंत्रांवर अवलंबून असतात, जे अत्यंत संवेदनशील आणि विशिष्ट असतात, परंतु महागड्या साधनांचा वापर करून प्रयोगशाळेत चाचणी करण्यासाठी कुशल कर्मचा-यांची आवश्यकता असते. तथापि, कमी आणि मध्यम उत्पन्न असलेल्या देशांमध्ये (LMICs) मर्यादित संसाधनांसह, मानवी पर्यावरणीय पाण्याच्या नमुन्याच्या निरीक्षणापेक्षा नमुना चाचणीला प्राधान्य मिळण्याची शक्यता आहे. त्यामुळे, कमी आणि मध्यम-उत्पन्न असलेल्या देशांमध्ये पाणी आणि सांडपाणी नमुन्यांच्या शाश्वत, रिअल-टाइम देखरेखीसाठी पर्यायी कमी किमतीच्या पद्धती आवश्यक आहेत, कारण उदयोन्मुख रोगाच्या प्रादुर्भावाची पूर्वसूचना म्हणून, त्यामुळे विषाणूच्या साथीच्या गंभीर सामाजिक आर्थिक परिणामांपासून त्यांचे संरक्षण होते. न्यूक्लिक अॅसिडसाठी कमी किमतीचे इलेक्ट्रोकेमिकल बायोसेन्सर या अपूर्ण गरजेसाठी एक आशादायक संभाव्य उपाय देऊ शकतात. यापैकी अनेक डीएनए बायोसेन्सर हे काम करतात की पूरक डीएनए स्ट्रँड इलेक्ट्रोडवर स्थिर असतात. नमुन्यात जुळणारा क्रम असतो तेव्हा पृष्ठभाग आणि संकरित करा. हे नंतर पोटॅशियम आयरन/फेरोसायनाइड सारख्या रेडॉक्स मध्यस्थांचा वापर करून विविध इलेक्ट्रोकेमिकल तंत्राद्वारे सिग्नलमध्ये रूपांतरित केले जाऊ शकते. मिथिलीन ब्लू (एमबी) हा असाच एक रेडॉक्स-सक्रिय रेणू आहे, ज्यामध्ये दुहेरी-असरलेल्या DNA (dsDNA) मध्ये एकल-असरलेल्या DNA5,6 सोबत अधिक विशिष्ट बंधनकारक नसल्याचा अहवाल दिला आहे. MB-DNA कॉम्प्लेक्स तयार करण्यासाठी MBs चे इंटरकॅलेटिंग स्वरूप त्यांना अनेक इलेक्ट्रोकेमिकल DNA मध्ये रेडॉक्स मध्यस्थ म्हणून लोकप्रिय पर्याय बनवते. सेन्सर कॉन्फिगरेशन 5,6,7,8,9. जरी MB ते DNA चे इंटरकॅलेशन अविशिष्ट आहे, आणि या इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सरची विशिष्टता मुख्यत्वे पीसीआर किंवा समतापीय प्रवर्धनासाठी वापरल्या जाणार्‍या प्राइमर्सच्या शुद्धतेवर अवलंबून असते, ते वास्तविक अंमलबजावणीसाठी योग्य आहे. -टाइम इलेक्ट्रोकेमिकल-आधारित क्यूपीसीआर किंवा डीएनए एकाग्रता मापनाला पर्याय म्हणून फ्लूरोसेन्स समतापीय प्रवर्धन 9 .अशाच एका अंमलबजावणीत, वोन एट अल. सोन्याच्या इलेक्ट्रोडच्या पृष्ठभागावर 6-mercapto-1-हेक्सॅनॉल (MCH) सह रिअल-टाइमसाठी बदल करण्यात आला. डिफरेंशियल पल्स व्होल्टॅमेट्री (डीपीव्ही) वापरून एमबीसह पीसीआर अॅम्प्लिकॉनचे मापन 9. इतर प्रकरणांमध्ये, रामिरेझ एट अल. स्क्रीन-प्रिंटेड इलेक्ट्रोडसह एमबी वापरून आरटी-एलएएमपी प्रतिक्रियेद्वारे सांडपाण्यात SARS-CoV-2 शोधणे. प्लॅटिनम इलेक्ट्रोड देखील केले गेले आहेत. प्रतिक्रियांदरम्यान इलेक्ट्रोकेमिकली अॅम्प्लिकॉन शोधण्यासाठी डिझाइन केलेल्या मायक्रोफ्लुइडिक PCR प्लॅटफॉर्ममध्ये सिटू इलेक्ट्रोड्सप्रमाणे वापरले जाते 8 .या सर्व अभ्यासांना इलेक्ट्रोडच्या पृष्ठभागामध्ये बदल आवश्यक आहे, ज्यामुळे या कार्यात्मक इलेक्ट्रोडच्या स्थिरतेसाठी विशेष स्टोरेज आवश्यकतांमुळे उत्पादन आणि ऑपरेटिंग खर्च वाढला आहे.
सरोवराच्या पाण्याच्या नमुन्यांमधील एकाग्र विषाणूजन्य कणांमधून मिळवलेल्या अॅम्प्लिकॉनच्या इलेक्ट्रोकेमिकल शोधासाठी वर्कफ्लोची योजनाबद्ध.
आम्ही अलीकडेच DPV वर आधारित कमी किमतीच्या मुद्रित सर्किट बोर्ड (PCB) इलेक्ट्रोड्ससह SARS-CoV-2 amplicons चे इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सिंग आणि असंशोधित इलेक्ट्रोडच्या पृष्ठभागावरील MB-DNA कॉम्प्लेक्सच्या शोषणामुळे प्रेरित चक्रीय व्होल्टमेट्री (CV) चे प्रात्यक्षिक दाखवले. चालू ११.आम्‍ही नोंदवले आहे की लहान तुकड्यांच्‍या तुलनेत CDC-शिफारस केलेले N1 फॉरवर्ड आणि N2 रिव्हर्स प्राइमर वापरून तयार केलेले लांब DNA तुकडे (N1-N2, \({943}\, \hbox)) यांनी सेन्सर प्रतिसादात चांगली रेखीयता दर्शविली. ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) N1 फॉरवर्ड आणि N1 रिव्हर्स प्राइमर सेट वापरून तयार केले गेले. हे अभ्यास न्यूक्लीज-फ्री पाण्यात तयार केलेल्या DNA dilutions वापरून नोंदवले गेले आहेत. प्लॅटफॉर्मचा वापर SARS-CoV शोधण्यासाठी देखील केला गेला. सिम्युलेटेड सांडपाणी नमुन्यांमध्ये -2 अॅम्प्लिकॉन (SARS-CoV-2 RNA सह एकूण RNA नमुने वाढवून मिळवलेले). अलगाव आणि डाउनस्ट्रीम प्रक्रियेदरम्यान RNA कातरणे संवेदनाक्षम असल्याने, 12,13 या विषम नमुन्याने लांब तुकड्यांचे विस्तार करणे कठीण आहे. त्यामुळे, सांडपाण्यात SARS-CoV-2 amplicon च्या इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सिंगचे प्रात्यक्षिक लहान \(72\,\hbox {bp}\) N1 तुकड्यापुरते मर्यादित आहे.
या कामात, आम्ही फेज Phi6 च्या ENIG PCB-आधारित इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सिंगच्या व्यवहार्यतेची तपासणी केली जे सरोवराच्या पाण्याच्या नमुन्यांपासून (चित्र 1) एकाग्र आणि वेगळे केले आहे. Phi6 फेज आकारात (80-100 nm) SARS-CoV-2 आणि लिपिड मेम्ब्रेन आणि स्पाइक प्रोटीन देखील आहे. या कारणांसाठी, बॅक्टेरियोफेज Phi6 हे SARS-CoV-2 आणि इतर आच्छादित रोगजनक RNA व्हायरससाठी एक लोकप्रिय सरोगेट आहे 14,15. फेज कणांपासून वेगळे केलेले RNA हे cDNA संश्लेषणासाठी टेम्पलेट म्हणून वापरले गेले. PCR ला 117 आणि 503 बेस जोड्यांच्या लांबीचे दोन DNA तुकडे मिळविण्यासाठी. आमच्या मागील कामात \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 तुकड्यांना वाढवण्याचे आव्हान पाहता, आम्ही मध्यवर्ती लांबीच्या तुकड्यांना लक्ष्य करतो (\(117) \,\hbox {bp}\) आणि \(503 \,\hbox {bp}\)), उपलब्ध प्राइमर्सवर आधारित. इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सर प्रतिसादाचा विस्तृत एकाग्रता श्रेणीवर पद्धतशीरपणे अभ्यास करण्यात आला (\({10}\,{ मधील दोन्ही तुकड्यांसाठी \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) ते \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) MB ची उपस्थिती, सेन्सरच्या प्रतिसादावर मिठाचा प्रभाव वर्णित केला गेला आहे आणि स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक मापनांद्वारे क्रॉस-प्रमाणित केला गेला आहे. या कामाचे मुख्य योगदान खालीलप्रमाणे आहेतः
डीएनए तुकड्यांची लांबी आणि नमुन्यातील मीठाची उपस्थिती संवेदनशीलतेवर जोरदार परिणाम करते.आमचे परिणाम असे दर्शवतात की इलेक्ट्रोकेमिकल क्रियाकलाप एमबी, डीएनए आणि व्होल्टॅमेट्रिक प्रतिसादातील सेन्सरच्या परस्परसंवादाच्या वेगवेगळ्या यंत्रणेवर अवलंबून असतो, डीएनए एकाग्रता आणि लांबीवर अवलंबून असते, लांब तुकड्यांमध्ये जास्त संवेदनशीलता दिसून येते, जरी मिठाचा इलेक्ट्रोस्टॅटिक परस्परसंवादांवर नकारात्मक प्रभाव पडतो. एमबी आणि डीएनए.
डीएनए एकाग्रता न बदललेल्या इलेक्ट्रोड्समधील एमबी-डीएनए परस्परसंवादाची यंत्रणा निर्धारित करते आम्ही दाखवतो की एमबी-डीएनए परस्परसंवादाची विविध यंत्रणा डीएनए एकाग्रतेवर अवलंबून असते. डीएनए एकाग्रतेवर कमी प्रमाणात \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox) {l}}}\), आम्ही निरीक्षण केले की इलेक्ट्रोकेमिकल वर्तमान प्रतिसाद प्रामुख्याने इलेक्ट्रोडवरील MB-DNA च्या शोषणाद्वारे निर्धारित केला जातो, तर कमी सांद्रतामध्ये उच्च DNA एकाग्रतेवर, इलेक्ट्रोकेमिकल वर्तमान प्रतिसाद रेडॉक्सच्या स्टेरिक प्रतिबंधाद्वारे निर्धारित केला जातो. डीएनए बेस जोड्यांमध्ये एमबी घालण्यामुळे क्रियाकलाप.
ENIG PCB-आधारित इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सिंग ऑफ व्हायरल न्यूक्लिक अॅसिड्स इन लेक वॉटर सॅम्पल पवई लेक, IIT मुंबई कॅम्पसमधील पाण्याच्या नमुन्यांमधून प्राप्त केलेल्या Phi6-add \(503\,\hbox {bp}\) डीएनए तुकड्यांच्या इलेक्ट्रोकेमिकल शोधाद्वारे निरीक्षणे प्रमाणित करण्यात आली. निकालाचा टप्पा.
अंमलबजावणीची कमी किंमत आणि दीर्घ शेल्फ लाइफसह इलेक्ट्रोडवर पूर्णपणे स्वयंचलित मॉनिटरिंग सिस्टम, ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स किंवा ऍप्टॅमरमध्ये एकत्रीकरणाची क्षमता.
Phage Phi6 हा Cytoviridae कुटुंबातील एक आच्छादित dsRNA विषाणू आहे जो स्यूडोमोनास सिरिंजला संक्रमित करतो. Phi6 फेजचा जीनोम 3 तुकड्यांच्या स्वरूपात अस्तित्वात आहे: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) आणि L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Phi6 फेज एक नॉन-पॅथोजेनिक BSL-1 स्यूडोमोनास स्ट्रेन संक्रमित करत असल्याने, ते वापरणे सुरक्षित आहे. आणि प्रयोगशाळेत सहजपणे वाढवता येते. फेज फि६ आणि त्याचे यजमान स्यूडोमोनास सिरिंगा फेलिक्स डी'हेरेले संदर्भ केंद्र फॉर बॅक्टेरियल व्हायरस, लावल युनिव्हर्सिटी, कॅनडा येथून खरेदी केले गेले (संदर्भ केंद्र कॅटलॉग क्रमांक अनुक्रमे HER-102 आणि HER-1102 आहेत) संदर्भ केंद्राने निर्देशित केल्यानुसार Phi6 फेज आणि त्याचे यजमान पुनरुज्जीवित केले गेले. Phi6 Phi6 ला प्लेट लिसिस आणि इलुशनद्वारे शुद्ध केले गेले आणि \(\ सुमारे 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox} सह अंतिम टायटर्स प्राप्त केले. ml}}\) (प्लेक फॉर्मिंग युनिट्स/ मिलीलीटर). उत्पादकाच्या सूचनेनुसार GenElute™ युनिव्हर्सल टोटल आरएनए प्युरिफिकेशन किट (सिग्मा-अल्ड्रिच) वापरून शुद्ध फेज कणांपासून आरएनए वेगळे केले गेले. थोडक्यात, एक शुद्ध फेज Phi6 निलंबन\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) lysed केले गेले आणि RNA ला रेजिन स्तंभाशी जोडण्यासाठी स्पिन कॉलमवर लायसेट लोड केले गेले. RNA नंतर इल्युशन सोल्युशनमध्ये इल्युट केले जाते \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) किटद्वारे प्रदान केले आहे. \(260\,\hbox {nm}\) वर शोषून RNA च्या एकाग्रतेचा अंदाज लावा. RNA मधील aliquots मध्ये संग्रहित केले गेले. ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) पुढील वापर होईपर्यंत.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA सिंथेसिस किट (बायो -रॅड लॅबोरेटरीज)चा वापर निर्मात्याच्या सूचनांनुसार cDNA संश्लेषणासाठी टेम्पलेट म्हणून केला गेला. थोडक्यात, cDNA संश्लेषण प्रतिक्रियेमध्ये 3 चरण असतात: \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ येथे प्राइमिंग )\({5}\,{\hbox {min} }\) , \({20}\,{\hbox {min}}\) चे रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन \({46}\,{^{\circ) }\hbox {C}}\), आणि रिव्हर्स रेकॉर्डर \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) मध्ये \({1}\,{\hbox {मिनिट) आहे }}\).जेव्हा 1% agarose जेलवर चालवले जाते, तेव्हा cDNA ने अपेक्षित तीन RNA तुकड्यांशी संबंधित तीन बँड दाखवले (डेटा दर्शविला नाही). खालील प्राइमर्सचा वापर 117 आणि 503 bp लांबीच्या दोन DNA तुकड्यांना वाढवण्यासाठी केला गेला, miniPCR® mini8 थर्मल सायकलरमध्ये पीसीआरसाठी टेम्पलेट म्हणून cDNA वापरणे:
\(117\,\hbox {bp}\) आणि \(503\,\hbox {bp}\) चे प्राइमर्स एम सेगमेंटच्या 1476-1575 न्यूक्लियोटाइड्स आणि एल सेगमेंटच्या 458-943 न्यूक्लियोटाइड्स, अनुक्रमे ऍसिडशी संबंधित आहेत. .सर्व प्रवर्धित पीसीआर उत्पादने 1% अॅग्रोज जेलवर इलेक्ट्रोफोरेस केली गेली आणि GeneJET जेल एक्स्ट्रॅक्शन किट (थर्मो फिशर सायंटिफिक) वापरून वाढीव लक्ष्य डीएनए शुद्ध केले गेले.
आयआयटी मुंबई कॅम्पसमधील एक तलाव (पवई तलाव, पवई, मुंबई) फेज कण जोडण्यासाठी वापरला गेला. तलावातील पाणी काढून टाकण्यासाठी \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) पडद्याद्वारे फिल्टर केले गेले. निलंबित कण, आणि नंतर Phi6 फेज जोडले गेले. \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} पैकी \({1}\,{\hbox {ml}}\) जोडा \) ते \({100}\ ,{\hbox {ml}}\) फिल्टर केलेले सरोवराचे पाणी, \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\) मध्ये. एक लहान अलिकट होता प्लेक परख द्वारे व्हायरल लोड मापनासाठी राखीव. आम्ही अणकुचीदार Phi6 विषाणू कण एकाग्र करण्यासाठी दोन भिन्न पद्धती तपासल्या: (1) अॅल्युमिनियम हायड्रॉक्साईड शोषण-पर्जन्य पद्धत, 19 जी पर्यावरणीय नमुन्यांमधून अनेक लिफाफा केलेल्या आरएनए विषाणूंच्या एकाग्रतेसाठी प्रमाणित केली गेली आहे, आणि (२) ) पॉलिथिलीन ग्लायकोल (पीईजी) आधारित विषाणू एकाग्रता पद्धत फ्लड एट अल पासून स्वीकारली गेली.20 .पीईजी-आधारित पद्धतीची पुनर्प्राप्ती कार्यक्षमता अॅल्युमिनियम हायड्रॉक्साईड पद्धतीपेक्षा चांगली असल्याचे आढळल्याने, पीईजी-आधारित पद्धत सरोवराच्या पाण्याच्या नमुन्यांमधून Phi6 कण केंद्रित करण्यासाठी वापरली गेली.
वापरलेली PEG पद्धत खालीलप्रमाणे होती: PEG 8000 आणि \(\hbox {NaCl}\) 8% PEG 8000 आणि \(0.2\,\hbox {M} \) मिळविण्यासाठी Phi6-स्पाइक्ड लेकच्या पाण्याच्या नमुन्यांमध्ये जोडले गेले. \hbox {NaCl}\).नमुने शेकरवर उबवलेले होते\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), नंतर \(4700 \,\hbox {g}\) वर सेंट्रीफ्यूज \({45}\,{\hbox {min}}\) आहे. सुपरनॅटंट टाकून द्या आणि \({1}\,) मध्ये गोळी पुन्हा लावा. {\hbox {ml}}\) त्याच सुपरनाटंटमध्ये. सर्व स्पाइकिंग आणि विषाणू एकाग्रतेचे प्रयोग त्रिगुणांमध्ये केले गेले. एकाग्रतेनंतर, प्लाक परखद्वारे पुनर्प्राप्ती कार्यक्षमतेचे मोजमाप करण्यासाठी एक लहान अलिकट राखून ठेवण्यात आले. RNA पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे वेगळे केले गेले आणि स्पष्ट केले गेले. किट-पुरवलेल्या इल्युशन बफर\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\) मध्ये. RNA एकाग्रता नमुन्यापासून नमुन्यापर्यंत भिन्न असल्याने, \({2}\,{\upmu \ RNA चा hbox {l}}\) नमुन्यांचे cDNA संश्लेषण त्याच्या एकाग्रतेकडे दुर्लक्ष करून तिन्हींसाठी वापरले जाते. cDNA संश्लेषण पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे केले गेले.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA. \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) \(117\,\hbox {bp}\) आणि \(503\,\hbox} वाढवण्यासाठी 35 चक्रांसाठी PCR साठी टेम्पलेट म्हणून वापरले होते. bp}\) तुकडे. हे नमुने “1:1″ म्हणून दर्शविले गेले आहेत, म्हणजे सौम्यता न करता. एक नो-टेम्प्लेट कंट्रोल (NTC) एक नकारात्मक नियंत्रण म्हणून सेट केले गेले होते, तर शुद्ध फेजपासून वेगळे केलेले RNA वापरून संश्लेषित सीडीएनए सेट केले गेले होते. पॉझिटिव्ह कंट्रोल (पीसी) साठी टेम्पलेट म्हणून. क्वांटिटेटिव्ह पीसीआर (क्यूपीसीआर) ब्रिलियंट III अल्ट्रा-फास्ट एसवायबीआर ग्रीन क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स (एजिलेंट टेक्नॉलॉजीज) वापरून स्ट्रॅटाजेन एमएक्स3000पी आरटी-पीसीआर इन्स्ट्रुमेंटमध्ये सादर केले गेले. प्रतिक्रिया पूर्वीप्रमाणे तिप्पट मध्ये सेट केल्या गेल्या. वर्णन केले आहे. सायकल थ्रेशोल्ड (Ct) सर्व नमुन्यांसाठी नोंदवले गेले होते. शिवाय, पातळ केलेले नमुने \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) फिल्टर केलेल्या तलावाच्या पाण्यात 1:100 पातळ केलेले cDNA वापरून होते. \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) 35 चक्रांसाठी PCR. हे नमुने “1:100″ म्हणून दर्शविले जातात.
पीसीबी इलेक्ट्रोड्स व्यावसायिकरित्या उपलब्ध असलेल्या कमी किमतीच्या इलेक्ट्रोलेस निकेल इमर्सन गोल्ड (ENIG) प्रक्रियेचा वापर करून अतिरिक्त सोन्याच्या प्लेटिंगची आवश्यकता न ठेवता तयार केले जातात. ENIG PCB इलेक्ट्रोड तपशील आमच्या मागील कामात तपशीलवार आहेत11. ENIG PCB इलेक्ट्रोडसाठी, पारंपारिक इलेक्ट्रोड साफ करण्याच्या पद्धती जसे की पिरान्हा सोल्यूशन किंवा सल्फ्यूरिक ऍसिड चक्रीय व्होल्टमेट्रीची शिफारस केली जात नाही कारण ते पातळ सोन्याचे थर (जाडी \(\ अंदाजे\) \(100\,\hbox {nm }\)) सोलण्यास कारणीभूत ठरू शकतात आणि प्रवण असलेल्या अंतर्निहित तांब्याचे स्तर उघड करू शकतात. 21, 22, 23, 24, 25. त्यामुळे, IPA ने ओलावलेल्या लिंट-फ्री कापडाने इलेक्ट्रोड्स स्वच्छ करा. चाचणी करावयाचा नमुना \({50}\,{\upmu \hbox {M}} सह उबवलेला होता. }\) MB मध्ये \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) सोपे टाकण्यासाठी. आमच्या मागील कामात , आम्ही निरीक्षण केले की MB एकाग्रता 11 वाढवून सेन्सरची संवेदनशीलता आणि रेखीयता सुधारली गेली आहे .आमच्या आधीच्या कामात नोंदवलेल्या ऑप्टिमायझेशनच्या आधारावर, आम्ही \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB वापरले या अभ्यासात डीएनए एम्बेड करण्यासाठी एकाग्रता. दुहेरी-असरलेल्या DNA (ds-DNA) चे इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्शन अॅनिओनिक किंवा कॅशनिक इंटरकॅलेटर वापरून साध्य केले जाऊ शकते. जरी अ‍ॅनियोनिक इंटरकॅलेटर चांगल्या निवडकतेसह डीएनए शोधतात, त्यांना रात्रभर उष्मायन आवश्यक असते, परिणामी शोधण्याची वेळ जास्त असते. दुसरीकडे, MB सारख्या कॅशनिक इंटरकॅलेटरला ds-DNA6 च्या इलेक्ट्रोकेमिकल तपासणीसाठी कमी उष्मायन वेळा आवश्यक असतात, अंदाजे \({1}\,{\hbox {h}}\). इलेक्ट्रोड\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), नंतर दुसर्या नमुन्यासह पुढे जाण्यापूर्वी, IPA-ओलावलेल्या चिंध्याने साफ करणे.एक मोजमाप. प्रत्येक नमुन्याची 5 भिन्न इलेक्ट्रोडवर चाचणी केली गेली जोपर्यंत अन्यथा सांगितले जात नाही. DPV आणि CV मोजमाप PalmSens Sensit Smart potentiostat वापरून केले गेले होते, आणि PSTrace सॉफ्टवेअर potentiostat कॉन्फिगरेशन आणि डेटा संपादनासाठी वापरले गेले होते, ज्यात पीक चालू गणना समाविष्ट आहे. खालील सेटिंग्ज वापरल्या जातात. DPV आणि CV मोजमापांसाठी:
DPV: समतोल वेळ = \(8\,\hbox {s}\), व्होल्टेज पायरी = \(3\,\hbox {mV}\), पल्स व्होल्टेज = \(25\,\hbox {mV}\) , पल्स कालावधी = \(50\,\hbox {ms}\), स्कॅन दर = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: समतोल वेळ = \(8\,\hbox {s}\), व्होल्टेज पायरी = \(3\,\hbox {mV}\), स्वीप रेट = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ सह संमिश्र डीएनएच्या व्होल्टॅमोग्राम्समधून मिळवलेले शिखर प्रवाह (५०३\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV आणि CV voltammograms ENIG PCB इलेक्ट्रोड \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB DNA सह संमिश्रित (10–\({20}\,{\ hbox {ng च्या एकाग्रतेवर) वर प्राप्त झाले. }/{\upmu \hbox {l}}}\) म्हणजे 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(117\,\hbox {bp}\ ) आणि 0.03 साठी –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(503\,\hbox {bp}\) साठी).प्रतिनिधी व्होल्टॅमोग्राम्स पूरक माहितीमधील आकृती S1 मध्ये दाखवले आहेत. आकृती 2 परिणाम दर्शविते. जेल-प्युरिफाईड पीसीआर उत्पादनांचा वापर करून डीपीव्ही आणि सीव्ही मापन (पीक करंट) चे. सीव्ही मापनांच्या तुलनेत, डीपीव्ही मापन उच्च संवेदनशीलता (डीएनए एकाग्रतेचे कार्य म्हणून वर्तमान) दर्शविते कारण सीव्ही मापनांमधील पार्श्वभूमी कॅपेसिटिव्ह प्रवाह फॅराडिक प्रवाह लपवतात 26 .डेटा बॉक्सप्लॉटमधील प्रत्येक बॉक्ससाठी 5 इलेक्ट्रोड्सचे मोजमाप समाविष्ट आहे. इलेक्ट्रोड-टू-इलेक्ट्रोड भिन्नतेमुळे मापन त्रुटी टाळण्यासाठी सर्व मोजमाप इलेक्ट्रोडचा समान संच वापरतात. डीएनएच्या कमी एकाग्रतेसाठी आम्ही DPV आणि CV मोजलेल्या शिखर प्रवाहांमध्ये वाढती प्रवृत्ती पाहिली. , जास्त काळ (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\\(117) ) खंडाच्या तुलनेत. हे आमच्या मागील कामात नोंदवलेल्या इलेक्ट्रोड शोषणाच्या अपेक्षित ट्रेंडशी सुसंगत आहे. एमबी-डीएनए कॉम्प्लेक्सचे शोषण इलेक्ट्रोडवरील चार्ज ट्रान्सफर सुलभ करते, ज्यामुळे पीक करंट वाढण्यास हातभार लागतो. इतर अभ्यासांनी एमबी-डीएनए इंटरकॅलेशनवर ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड आकार आणि अनुक्रमाचा प्रभाव दर्शविला आहे. 27,28,29,30. ग्वानिन -दोन अॅम्प्लिकॉन (\(117\,\hbox {bp}\) आणि \(503\,\hbox {bp}\)) मध्ये सायटोसिन (GC) सामग्री अंदाजे 50% होती, हे सूचित करते की निरीक्षणामुळे फरक आहे अॅम्प्लिकॉन लांबीपर्यंत. तथापि, उच्च डीएनए एकाग्रतेसाठी (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), \(503\,\hbox {bp}) साठी \) आणि \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) \(117\,\hbox {bp}\) साठी), आम्ही दोन प्रवर्धनांचे निरीक्षण करतो. DPV आणि CV दोन्ही मापांमध्ये सब्सचे शिखर प्रवाह कमी केले जातात. याचे कारण असे की MB संतृप्त होते आणि DNA च्या बेस जोड्यांमध्ये इंटरकॅलेट्स होते, परिणामी MB31,32 मधील रिड्यूसिबल ग्रुपच्या रेडॉक्स क्रियाकलापांचे स्टेरिक प्रतिबंध होते.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(५०३ \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
पीसीआर मास्टर मिक्समध्ये असलेले क्षार एमबी आणि डीएनएमधील इलेक्ट्रोस्टॅटिक परस्परसंवादात व्यत्यय आणतात, म्हणून \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) \({50} \,{\) सोबत जोडून upmu \hbox {M}}\) MB जेल-प्युरिफाईड उत्पादन MB-DNA परस्परसंवादावर मिठाच्या प्रभावाचा अभ्यास करण्यासाठी. आकृती 3 मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, आम्ही पाहिले की उच्च DNA सांद्रता (\(>{2}\,{\) साठी hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) आणि \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) \(117\,\hbox {bp} \) साठी), DPV आणि CV मध्ये मीठ जोडल्याने मोजमापांवर लक्षणीय परिणाम झाला नाही (प्रतिनिधी व्होल्टॅमोग्रामसाठी पूरक माहितीमधील आकृती S2 पहा). तथापि, येथे कमी डीएनए एकाग्रता, मीठ जोडल्याने संवेदनशीलता मोठ्या प्रमाणात कमी होते, परिणामी डीएनए एकाग्रतेसह प्रवाहात कोणतेही महत्त्वपूर्ण बदल होत नाहीत. MB-DNA परस्परसंवाद आणि परस्परसंवादावर मिठाचे असेच नकारात्मक परिणाम यापूर्वी इतर संशोधकांनी नोंदवले आहेत33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) केशन्स डीएनएच्या नकारात्मक फॉस्फेट पाठीच्या कण्याला बांधतात, ज्यामुळे MB आणि DNA मधील इलेक्ट्रोस्टॅटिक परस्परसंवादात अडथळा येतो. उच्च DNA एकाग्रतेवर, रेडॉक्स-सक्रिय एमबीच्या स्टेरिक प्रतिबंधामुळे कमी शिखर प्रवाह होतो, त्यामुळे इलेक्ट्रोस्टॅटिक परस्परसंवाद सेन्सरच्या प्रतिसादावर लक्षणीय परिणाम होत नाही. मुख्य मुद्दा हा आहे की हा बायोसेन्सर उच्च DNA सांद्रता शोधण्यासाठी अधिक योग्य आहे (क्वचित \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) किंवा उच्च), पूर्णतः- पर्यावरणीय पाण्याच्या नमुन्यांच्या स्वयंचलित प्रक्रियेसाठी, जेथे पीसीआर उत्पादनांचे जेल शुद्धीकरण शक्य होणार नाही.
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB सह संमिश्र DNA च्या विविध एकाग्रतेसाठी तरंगलांबी श्रेणी 600–700 \(\hbox {nm}\) साठी शोषण वक्र अंतर्गत क्षेत्र: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) मीठासोबत आणि त्याशिवाय (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) मीठासोबत आणि त्याशिवाय (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB नमुने DNA शी संबंधित DNA सांद्रता नाही.
वरील परिणामांची आणखी पडताळणी करण्यासाठी, आम्ही UV/Vis स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (थर्मो सायंटिफिक मल्टीस्कन GO) वापरून ऑप्टिकल मापन केले, प्रत्येकासाठी \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) नमुने वापरले. मापन. शोषण स्वाक्षरी वाढत्या DNA एकाग्रतेसह कमी होते, जसे की तरंगलांबी श्रेणी \(600\,\hbox {nm}\) ते \(700\,\hbox { साठी शोषण वक्र अंतर्गत क्षेत्राच्या ट्रेंडवरून पाहिले जाऊ शकते. nm}\) , अंजीर 4 मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे (पूरक माहितीमध्ये S3 मध्ये दर्शविलेले शोषण स्पेक्ट्रम). \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox) पेक्षा कमी डीएनए एकाग्रता असलेल्या नमुन्यांसाठी {l}}}\), DNA-युक्त आणि MB-केवळ नमुने (\(503\,\hbox {bp}\ साठी) आणि \(117\,\hbox {bp}\ साठी) मध्ये काही लक्षणीय फरक नव्हता. ) लांबीचे तुकडे), रेडॉक्स-अॅक्टिव्ह एमबीच्या स्टेरिक प्रतिबंधाची अनुपस्थिती दर्शविते. उच्च डीएनए एकाग्रतेवर, आम्ही शोषक सिग्नलमध्ये हळूहळू घट पाहिली आणि मीठाच्या उपस्थितीत शोषकतेमध्ये कमी घट नोंदवली. या परिणामांचे श्रेय आण्विक होते. डीएनए संकरीत बेस स्टॅकिंगसह परस्परसंवाद आणि स्टेरिक प्रतिबंध. आमचे परिणाम MB-DNA इंटरकॅलेशनच्या स्पेक्ट्रोस्कोपिक अभ्यासावरील साहित्यातील अहवालांशी सुसंगत आहेत जे \(\pi\)–\(\pi ^*\) मधील कमी ऊर्जा पातळीशी हायपोक्रोमॅटिटीशी संबंधित आहेत. ) इंटरकॅलेशन लेयर 36, 37, 38 मुळे इलेक्ट्रॉनिक संक्रमण.
फेज Phi6 चे ऍगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस: सरोवराच्या पाण्याच्या नमुन्यांमधून \(117\,\hbox {bp}\) आणि \(503\,\hbox {bp}\) लांबीचे PCR उत्पादने. M-DNA मार्कर;एनटीसी-नो-टेम्प्लेट कंट्रोल, संबंधित अॅम्प्लिकॉन असलेले प्राइमर्स;पीसी सकारात्मक नियंत्रण;1, 2, 3-अनडिल्युटेड (1:1) अणकुचीदार तलावाच्या पाण्याचे नमुने त्रिगुणात. \(503\,\) मध्ये न वापरलेल्या ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्समुळे \(\सुमारे 50\,\hbox {bp}\) वर एक बँड दृश्यमान आहे. hbox {bp}\) लेन.
आम्ही Phi6 फेजसह अणकुचीदार पवई तलावाच्या पाण्याचे नमुने वापरून सेन्सरच्या उपयुक्ततेचे मूल्यमापन केले. फेज-स्पाइक्ड पाण्याच्या नमुन्यांपासून वेगळे केलेले RNA सांद्रता 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), प्युरिफाईड फेज सस्पेंशनपासून वेगळे असताना RNA अंदाजे 1 च्या पुनर्प्राप्ती कार्यक्षमतेसह \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) असण्याचा अंदाज आहे. %.RNA हे cDNA मध्ये उलटे लिप्यंतरण केले गेले आणि PCR आणि qPCR साठी टेम्पलेट म्हणून वापरले गेले. सेन्सरच्या चाचणीपूर्वी अॅग्रोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस (आकृती 5) द्वारे उत्पादनाच्या आकाराची पुष्टी केली गेली. हे नमुने जेल शुद्ध केलेले नाहीत आणि त्यामुळे PCR चे सर्व घटक समाविष्ट आहेत. तसेच स्वारस्यांचे अॅम्प्लिकॉन. qPCR (तक्ता 1) दरम्यान रेकॉर्ड केलेली Ct मूल्ये संबंधित अणकुचीदार पाण्याच्या नमुन्यांमधून विलग केलेल्या RNA च्या एकाग्रतेशी परस्परसंबंध दर्शवितात. Ct मूल्य फ्लोरोसेंट सिग्नलसाठी आवश्यक चक्रांची संख्या दर्शविते. थ्रेशोल्ड किंवा पार्श्वभूमी सिग्नल ओलांडणे. उच्च Ct मूल्ये कमी टेम्प्लेट एकाग्रता दर्शवतात आणि त्याउलट. NTC नमुन्यांची Ct मूल्ये अपेक्षेप्रमाणे जास्त होती. \(\ अंदाजे 3\) Ct मूल्यांमधील फरक सकारात्मक नियंत्रण आणि चाचणी नमुना पुढे सूचित करतो की प्रत्येक चाचणी नमुन्यामध्ये सकारात्मक नियंत्रणाच्या तुलनेत अंदाजे 1% टेम्प्लेट आहे. आम्ही याआधी चर्चा केली आहे की लांब अॅम्प्लिकॉनमुळे अधिक संवेदनशीलता निर्माण होते. विषम पर्यावरणीय नमुन्यांपासून वेगळे केलेल्या लांब तुकड्यांचे प्रवर्धन हे तोटे लक्षात घेता आव्हानात्मक आहे. कमी व्हायरल एकाग्रता आणि आरएनए डिग्रेडेशन. तथापि, आमच्या विषाणू संवर्धन आणि पीसीआर प्रवर्धन प्रोटोकॉलसह, आम्ही इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सिंगसाठी \(503\,\hbox {bp}\) खंड यशस्वीपणे वाढवू शकलो.
आकृती 6 \(503\,\hbox {bp}\) फ्रॅगमेंट अॅम्प्लिकॉनचे इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सर परिणाम दर्शविते, दोन्ही टेम्प्लेट म्हणून undiluted cDNA वापरून (1:1) आणि 100-fold diluted cDNA टेम्पलेट म्हणून (1:100) PCR केले. , NTC आणि PC च्या तुलनेत (प्रतिनिधी व्होल्टॅमोग्रामसाठी पूरक माहितीमधील आकृती S4 पहा). आकृती 6 मधील बॉक्सप्लॉटमधील प्रत्येक बॉक्समध्ये 5 इलेक्ट्रोडवर तीन नमुन्यांची मोजमाप आहे. इलेक्ट्रोडमुळे त्रुटी टाळण्यासाठी सर्व नमुने मोजण्यासाठी समान इलेक्ट्रोड वापरण्यात आले. -ते-इलेक्ट्रोड भिन्नता.सीव्ही मापनांच्या तुलनेत, DPV मोजमाप चाचणी आणि पीसी नमुने NTCs मधून वेगळे करण्यासाठी चांगले रिझोल्यूशन दर्शविते कारण, पूर्वी नमूद केल्याप्रमाणे, फॅराडिक प्रवाह नंतरच्या पार्श्वभूमीतील कॅपेसिटिव्ह प्रवाहांमुळे लपलेले असतात. दीर्घ अँप्लिकॉनसाठी, आम्ही निरीक्षण केले की नकारात्मक नियंत्रण (NTC) चा परिणाम सकारात्मक नियंत्रणाच्या तुलनेत उच्च CV आणि DPV पीक करंट्समध्ये झाला, तर सकारात्मक आणि undiluted चाचणी नमुने DPV पीक करंट्सच्या समान शिखर उंची दर्शवितात. प्रत्येक undiluted (1:1) साठी मोजलेली सरासरी आणि मध्यवर्ती मूल्ये ) चाचणी नमुना आणि पीसी हे एनटीसी नमुन्यासाठी सेन्सर आउटपुटमधून स्पष्टपणे सोडवले जाऊ शकतात, तर 1:100 पातळ केलेल्या नमुन्याचे रिझोल्यूशन कमी उच्चारले जाते. सीडीएनएच्या 100 पट पातळतेसाठी, आम्ही जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस दरम्यान कोणत्याही बँडचे निरीक्षण केले नाही. (आकृती 5 मध्ये लेन दर्शविल्या नाहीत), आणि संबंधित DPV आणि CV शिखर प्रवाह NTC साठी अपेक्षित असलेल्या समान होते. \(117\,\hbox {bp}\) तुकड्यांचे परिणाम पूरक माहितीमध्ये दर्शविले आहेत. नकारात्मक इलेक्ट्रोडवरील फ्री एमबीचे शोषण आणि सिंगल-स्ट्रॅंडेड प्राइमर ऑलिगोन्यूक्लियोटाइडसह एमबीच्या परस्परसंवादामुळे पीसीबी सेन्सरकडून नियंत्रणामुळे इलेक्ट्रोकेमिकल प्रतिसाद प्राप्त झाला. म्हणून, प्रत्येक वेळी नमुन्याची चाचणी केल्यावर, नकारात्मक नियंत्रण चालवणे आवश्यक आहे आणि चाचणी नमुन्याचे पीक प्रवाह नकारात्मक नियंत्रणाद्वारे प्राप्त केलेल्या पीक करंटच्या तुलनेत भिन्न (सापेक्ष) मापन प्राप्त करण्यासाठी 39,40 चाचणी नमुना सकारात्मक किंवा नकारात्मक म्हणून वर्गीकृत करण्यासाठी.
(a) DPV, आणि (b) तलावाच्या पाण्याच्या नमुन्यांमधील \(503\,\hbox {bp}\) तुकड्यांचे इलेक्ट्रोकेमिकल शोधण्यासाठी CV पीक करंट. चाचणी नमुने तीन प्रतिलिपीत मोजले गेले आणि कोणत्याही टेम्पलेट नियंत्रण (NTC) च्या तुलनेत आणि सकारात्मक नियंत्रणे (पीसी).
आमचे निष्कर्ष यूव्ही/व्हिस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर वापरून ऑप्टिकल मोजमापाद्वारे सत्यापित केलेल्या एकाग्रतेसह वेगवेगळ्या डीएनएसाठी वेगवेगळ्या लांबीच्या अॅम्प्लिकॉनसाठी इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सर्सच्या कार्यक्षमतेवर परिणाम करणार्‍या विविध यंत्रणांचे वर्णन करतात. आमची निरीक्षणे हे अंतर्दृष्टी अधोरेखित करतात की डीएनएचे तुकडे \(\ अंदाजे\) पर्यंत लांब असतात. \(500\,\hbox {bp}\) उच्च संवेदनशीलतेसह शोधले जाऊ शकते आणि नमुन्यातील मीठाची उपस्थिती संवेदनशीलता DNA एकाग्रतेवर नाही जी उच्च संवेदनशीलतेवर परिणाम करते (क्वचितच \({\hbox {ng}/{\upmu) \hbox {l}}}\) आणि वरील). या व्यतिरिक्त, आम्ही वेगवेगळ्या प्रकारच्या नमुन्यांच्या प्रभावाची तपासणी केली, ज्यामध्ये मीठ जोडलेले आणि न घालता जेल-प्युरिफाईड अॅम्प्लिकॉन आणि DPV आणि CV मोजमापांमध्ये सरोवराच्या पाण्याचे नमुने जोडणे समाविष्ट आहे.आम्ही निरीक्षण केले की DPV ने चांगले रिझोल्यूशन प्रदान केले आहे, कारण पार्श्वभूमी कॅपेसिटिव्ह करंट देखील CV मोजमाप प्रभावित करते, ते कमी संवेदनशील बनवते.
लांब तुकड्यांचे प्रवर्धन व्हायरल जीनोमिक आरएनएच्या अखंडतेवर अवलंबून असते. अनेक अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की वातावरणातील आरएनएच्या ऱ्हासामुळे आणि विलगीकरणादरम्यान विभक्त होण्याच्या संभाव्यतेमुळे लांब तुकड्यांचे प्रवर्धन नेहमीच कार्यक्षम नसते11,41,42,43,44 .आम्ही पाहिले की PEG-आधारित विषाणू एकाग्रता पद्धत अॅल्युमिनियम हायड्रॉक्साईड-आधारित विषाणू एकाग्रता पद्धतीपेक्षा तलावाच्या पाण्याच्या नमुन्यांमध्ये फेज Phi-6 वर केंद्रित करण्यात अधिक प्रभावी होती. लांब डीएनए तुकड्यांचा शोध घेण्याची क्षमता मल्टीप्लेक्स पीसीआरसाठी आवश्यकतेवर मात करण्यासाठी सिद्ध झाली. एकापेक्षा जास्त लहान लांबीचे टेम्प्लेट वाढवणे आणि क्रॉस-विशिष्टतेची शक्यता कमी करणे.
जैविक नमुने दुर्मिळ आहेत, त्यामुळे चाचणीसाठी किमान नमुने आवश्यक असलेल्या बायोसेन्सरची रचना करणे आवश्यक आहे. या अभ्यासात वापरलेले ENIG PCB इलेक्ट्रोड फक्त \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ आवश्यक आहेत. ) इलेक्ट्रोड्सचे प्रभावी क्षेत्र कव्हर करण्यासाठी चाचणीसाठी नमुने. याव्यतिरिक्त, पुढील नमुन्याचे वितरण करण्यापूर्वी तेच इलेक्ट्रोड साफ केल्यानंतर पुन्हा वापरता येऊ शकते. विस्तारित नमुन्यांना मिथिलीन ब्लू व्यतिरिक्त इतर कोणतेही रसायन जोडण्याची आवश्यकता नाही, जे स्वस्त आहे आणि सामान्यतः वापरले जाणारे रसायन. प्रत्येक इलेक्ट्रोडची निर्मिती करण्यासाठी सुमारे $0.55 (किंवा INR 40) खर्च येतो, हा बायोसेन्सर सध्याच्या शोध तंत्रज्ञानासाठी एक किफायतशीर पर्याय असू शकतो. तक्ता 2 या कामाची तुलना साहित्यात नोंदवलेल्या इतर सेन्सर्सशी दर्शवते. विषम नमुन्यांमधील डीएनए तुकडे.
MB-आधारित इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्शन प्रोटोकॉल पीसीआरच्या विशिष्टतेवर अवलंबून असतात हे लक्षात घेता, या पद्धतीची एक प्रमुख मर्यादा म्हणजे सांडपाणी आणि तलावाचे पाणी किंवा कमी शुद्धतेचे प्राइमर्स वापरणे यासारख्या विषम नमुन्यांमध्ये गैर-विशिष्ट प्रवर्धन करण्याची क्षमता आहे. संवेदनशीलता सुधारण्यासाठी सुधारित ENIG PCB इलेक्ट्रोड वापरून अशुद्ध PCR उत्पादनांचा DNA शोधण्यासाठी इलेक्ट्रोकेमिकल शोध पद्धती, न वापरलेल्या dNTPs आणि प्राइमर्सद्वारे सादर केलेल्या त्रुटी चांगल्या प्रकारे समजून घेणे आणि प्रतिक्रिया परिस्थिती आणि परख प्रोटोकॉल अनुकूल करणे आवश्यक आहे. अतिरिक्त भौतिक-रासायनिक घटक जसे की pH, तापमान आणि बायोलॉजिकल पॅरामीटर्स मापनाची अचूकता सुधारण्यासाठी पाण्याच्या नमुन्याची ऑक्सिजन मागणी (BOD) देखील मोजली जाणे आवश्यक असू शकते.
शेवटी, आम्ही पर्यावरणीय (लेक वॉटर) नमुन्यांमध्ये व्हायरस शोधण्यासाठी कमी किमतीच्या इलेक्ट्रोकेमिकल ENIG PCB सेन्सरचा प्रस्ताव ठेवतो. अचल ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड इलेक्ट्रोड किंवा डीएनए सेन्सिंगसाठी कस्टम सब्सट्रेट्सच्या विपरीत ज्यांना संवेदनशीलता राखण्यासाठी क्रायोजेनिक स्टोरेज आवश्यक आहे, 53,54 आमचे तंत्र सुधारित PCB वापरते. दीर्घ शेल्फ लाइफ असलेले इलेक्ट्रोड आणि विशिष्ट स्टोरेज आवश्यकता नाही आणि म्हणून LMICs मध्ये तैनात स्वयंचलित नमुना प्रक्रियेसह मोजमाप उपायांच्या विकासासाठी योग्य. बायोसेन्सर टार्गेट अॅम्प्लीकॉन्सचा जलद शोध घेण्यासाठी स्वस्त DNA-इंटरकॅलेटिंग रेडॉक्स डाईज (MB) वापरतो. गैर-विशिष्ट प्रवर्धन पर्यावरणीय नमुन्यांमध्‍ये सामायिक MBs ला सिंगल- आणि डबल-स्ट्रँडेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्सच्या गैर-विशिष्ट बंधनामुळे या संवेदन पद्धतीची विशिष्टता कमी करते. म्हणून, या चाचणीची विशिष्टता प्राइमर्स आणि पीसीआर प्रतिक्रिया परिस्थितीच्या अनुकूलतेवर अवलंबून असते. शिवाय, सी.व्ही. आणि चाचणी केलेल्या नमुन्यांमधून प्राप्त झालेल्या DPV पीक करंट्सचा प्रत्येक चाचणीसाठी नकारात्मक नियंत्रण (NTC) कडून मिळालेल्या प्रतिसादांच्या सापेक्ष अर्थ लावला पाहिजे. या कामात सादर केलेल्या इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सर डिझाइन आणि पद्धती पूर्णपणे स्वयंचलित आणि कमी विकसित करण्यासाठी ऑटोसॅम्पलरसह एकत्रित केल्या जाऊ शकतात. -किंमत उपाय जे नमुने गोळा आणि विश्लेषण करू शकतात आणि वायरलेस पद्धतीने परिणाम प्रयोगशाळेत पाठवू शकतात.
कॅशडॉलर, जे. आणि वायमर, एल. पाण्याच्या नमुन्यांमधून विषाणूंच्या प्रारंभिक एकाग्रतेसाठी पद्धती: अलीकडील अभ्यासांचे पुनरावलोकन आणि मेटा-विश्लेषण.जे.Application.microorganism.115, pp. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL जलजन्य विषाणू: सुरक्षित पिण्याच्या पाण्यातील अडथळे.PLoS रोगजनक.11, E1004867 (2015).
श्रेष्ठ, एस. एट अल. कमी आणि मध्यम-उत्पन्न असलेल्या देशांमध्ये कोविड-19 च्या मोठ्या प्रमाणावर देखरेखीसाठी खर्च-प्रभावी सांडपाणी महामारीशास्त्र: आव्हाने आणि संधी. वॉटर 13, 2897 (2021).
पॅलेसेक, ई. आणि बार्टोसिक, एम. न्यूक्लिक अॅसिड इलेक्ट्रोकेमिस्ट्री.केमिकल.रेव्ह.११२, ३४२७–३४८१ (२०१२).
तानी, ए., थॉमसन, एजे अँड बट, जेएन मिथिलीन ब्लू सोन्याच्या सबस्ट्रेट्सवर स्थिर एकल- आणि दुहेरी-असरलेल्या ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्सचा इलेक्ट्रोकेमिकल भेदभाव म्हणून. विश्लेषक 126, 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparison of Cation and Anion Intercalators for Electrochemical Transduction of DNA Hybridization by Long-range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
वोंग, ईएल आणि गुडिंग, जेजे चार्ज ट्रान्सफर डीएनए द्वारे: एक निवडक इलेक्ट्रोकेमिकल डीएनए बायोसेन्सर.अॅनस.केमिकल.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.समवर्ती इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्शन.बायोलॉजिकल सेन्सर.बायोइलेक्ट्रॉनिक्स.24, 2131–2136 (2009) सह रिअल-टाइम PCR मायक्रोफ्लुइडिक डिव्हाइस.
Win, BY et al.DNA.Analist 136, 1573–1579 (2011) सह मिथिलीन ब्लूच्या परस्परसंवादावर आधारित इलेक्ट्रोकेमिकल रिअल-टाइम पीसीआर प्रणालीचा सिग्नलिंग यंत्रणा अभ्यास आणि कार्यप्रदर्शन पडताळणी.
Ramirez-Chavria, RG et al. सांडपाण्याच्या नमुन्यांमध्ये sars-cov-2 शोधण्यासाठी लूप-मध्यस्थ समतापिक प्रवर्धन-आधारित इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सर.जे.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
कुमार, M. et al. PCB इलेक्ट्रोडसह SARS-CoV-2 amplicons चे इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सिंग. सेन्सर सक्रिय झाला आहे.B Chemistry.343, 130169 (2021).
कितामुरा, के., सदामासु, के., मुरामात्सु, एम. आणि योशिदा, एच. सांडपाण्याच्या घन अंशामध्ये SARS-CoV-2 RNA चा कार्यक्षम शोध.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.सांडपाण्यात SARS-CoV-2 शोधण्यासाठी विश्लेषणात्मक पद्धती: प्रोटोकॉल आणि भविष्यातील दृष्टीकोन.TraC ट्रेंडिंग anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. काचेच्या पृष्ठभागावर जमा केलेल्या बाष्पीभवन लाळेच्या थेंबांमध्ये एन्व्हलप्ड बॅक्टेरियोफेज Phi6 (SARS-CoV-2 साठी एक सरोगेट) चे अस्तित्व.science.Rep.10, 1-10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ मुक्त-जीवित अमिबा मध्ये SARS-CoV-2 सरोगेट (Phi6) चा पर्यावरणीय दृढता.जल आरोग्य 20, 83 (2021).
मिंडिच, एल. डबल-स्ट्रँडेड आरएनए बॅक्टेरियोफेज\(\varphi\)६.मायक्रोऑर्गनिझम.मूर.बायोलॉजी.रेव्ह.च्या तीन जीनोमिक तुकड्यांचे अचूक पॅकेजिंग.६३, १४९–१६० (१९९९).
पिर्टीमा, एमजे आणि बॅमफोर्ड, डीएच आरएनए फेज\(\वर्फी\)6 पॅकेजिंग क्षेत्राची दुय्यम रचना.RNA 6, 880–889 (2000).
बोनिला, एन. एट अल. फेजेस ऑन द टॅप - बॅक्टेरियोफेजेसचा प्रयोगशाळा साठा तयार करण्यासाठी एक जलद आणि कार्यक्षम प्रोटोकॉल. PeerJ 4, e2261 (2016).