Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com.Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts.Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, ieteicams izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai izslēgt saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Tikmēr, lai nodrošinātu turpināsim atbalstu, mēs parādīsim vietni bez stiliem un JavaScript.
Kopš COVID-19 pandēmijas sākuma ir ļoti novērtēta vides paraugu uzraudzības nozīme, un daži monitoringa pasākumi tiek veikti, izmantojot zelta standartu, lai gan uz qPCR balstītas metodes ir dārgas. Elektroķīmiskie DNS biosensori varētu nodrošināt potenciāli rentablu risinājumu. risinājums vides ūdens paraugu monitoringam valstīs ar zemiem un vidējiem ienākumiem. Šajā darbā mēs demonstrējam amplikonu elektroķīmisko noteikšanu, kas iegūti no Phi6 fāga, kas izolēts no ezera ūdens paraugiem (populārs SARS-CoV-2 surogāts), izmantojot ENIG. lai pabeigtu PCB elektrodus bez virsmas modifikācijas.dzimums. Elektroķīmiskā sensora reakcija tika rūpīgi raksturota diviem dažāda garuma DNS fragmentiem (\({117}\,\hbox {bp}\) un \({503}\,\hbox {bp}\)), un sāļu ietekme PCR pamatmaisījumos uz metilēnzilā (MB)-DNS mijiedarbību.Mūsu rezultāti liecina, ka DNS fragmentu garums būtiski nosaka elektroķīmisko jutību un demonstrē šajā darbā, ka spēja noteikt garus amplikonus bez PCR produktu attīrīšanas ar gēlu ir svarīgi ūdens paraugu mērīšanai in situ.Pilnībā automatizēts risinājums vīrusu slodzei liecina par labu.
Vīrusu pārnešana caur ūdeni ir pazīstama kā sabiedrības veselības apdraudējums kopš 20. gadsimta 40. gadiem, un ir pirmie pierādījumi par poliomielīta un E1 hepatīta pārnešanu caur ūdeni.Pasaules Veselības organizācija (PVO) ir klasificējusi vairākus ūdens ceļā pārnēsājamus vīrusu patogēnus, kuriem ir vidēja vai augsta ietekme uz veselību2. Tradicionālais vīruss noteikšanas metodes balstās uz zelta standarta qPCR metodēm, kas ir ļoti jutīgas un specifiskas, bet prasa kvalificētu personālu, lai pārbaudītu laboratorijā, izmantojot dārgus instrumentus.Tomēr valstīs ar zemiem un vidējiem ienākumiem (LMIC) ar ierobežotiem resursiem cilvēku paraugu pārbaudei, visticamāk, būs prioritāte pār vides ūdens paraugu uzraudzību. Tāpēc ir nepieciešamas alternatīvas zemu izmaksu metodes ilgtspējīgai ūdens un notekūdeņu paraugu uzraudzībai reāllaikā valstīs ar zemiem un vidējiem ienākumiem, lai agrīni brīdinātu par jauniem slimību uzliesmojumiem, tādējādi pasargājot tos no vīrusa pandēmijas smagajām sociālekonomiskajām sekām.Lēti nukleīnskābju elektroķīmiskie biosensori varētu būt daudzsološs potenciāls risinājums šai neapmierinātajai vajadzībai.Daudzi no šiem DNS biosensoriem darbojas tāpēc, ka uz elektroda ir imobilizētas komplementāras DNS ķēdes. virsmas un hibridizējas, ja paraugā ir atbilstoša secība. Pēc tam to var pārveidot signālā ar dažādām elektroķīmiskām metodēm, izmantojot redoksmediatorus, piemēram, kālija dzelzi/ferocianīdu. Viena no šādām redoksaktīvajām molekulām ir metilēnzils (MB). ziņots, ka tie interkalējas divpavedienu DNS (dsDNS) papildus nespecifiskākai saistīšanai ar vienpavedienu DNS5,6. MB interkalācijas raksturs, veidojot MB-DNS kompleksus, padara tos par populāru izvēli kā redoksmediatorus vairākās elektroķīmiskās DNS. sensoru konfigurācijas5,6,7,8,9.Lai gan MB interkalācija DNS ir nespecifiska un šī elektroķīmiskā sensora specifika lielā mērā ir atkarīga no PCR vai izotermiskai amplifikācijai izmantoto praimeru tīrības, tas ir labi piemērots reālas -laika elektroķīmiski balstīta qPCR vai fluorescences izotermiskā pastiprināšana kā alternatīva DNS koncentrācijas mērīšanai 9 . Vienā no šādām realizācijām Won et al. Zelta elektrodu virsma tika modificēta ar 6-merkapto-1-heksanolu (MCH) reāllaikā. PCR amplikonu mērīšana ar MB, izmantojot diferenciālo impulsa voltammetriju (DPV)9.Citos gadījumos Ramirez et al.SARS-CoV-2 noteikšana notekūdeņos ar RT-LAMP reakciju, izmantojot MB ar sietspiedes elektrodiem.Ir izmantoti arī platīna elektrodi. izmanto kā in situ elektrodus mikrofluidiskā PCR platformā, kas izstrādāta, lai elektroķīmiski noteiktu amplikonus reakciju laikā 8. Visiem šiem pētījumiem nepieciešama elektrodu virsmas modifikācija, kas nozīmē palielinātas ražošanas un ekspluatācijas izmaksas, jo īpaši uzglabāšanas prasības šo funkcionalizēto elektrodu stabilitātei.
No koncentrētām vīrusu daļiņām ezera ūdens paraugos iegūto amplikonu elektroķīmiskas noteikšanas darbplūsmas shēma.
Mēs nesen parādījām SARS-CoV-2 amplikonu elektroķīmisko noteikšanu ar zemu izmaksu iespiedshēmas plates (PCB) elektrodiem, kuru pamatā ir DPV un cikliskā voltammetrija (CV), ko izraisa MB-DNS kompleksu adsorbcija uz nemodificētu elektrodu virsmas) pīķa izmaiņas. pašreizējais11.Mēs ziņojam, ka garāki DNS fragmenti (N1-N2, \({943}\, \hbox), kas izveidoti, izmantojot CDC ieteiktos N1 priekšējos un N2 reversos primerus, salīdzinot ar īsākiem fragmentiem {bp}\)), uzrādīja labāku sensora atbildes linearitāti. (N1, \(72\,\hbox {bp}\)), kas izveidots, izmantojot N1 priekšējo un N1 reverso praimeru komplektus. Par šiem pētījumiem ziņots, izmantojot DNS atšķaidījumus, kas sagatavoti ūdenī bez nukleāzes. Platforma tika izmantota arī SARS-CoV noteikšanai. -2 amplikoni simulētos notekūdeņu paraugos (iegūti, kopējos RNS paraugus papildinot ar SARS-CoV-2 RNS). Tā kā RNS ir jutīga pret bīdīšanu izolācijas un pakārtotās apstrādes laikā12,13, ar šo neviendabīgo paraugu ir grūti pastiprināt garākus fragmentus. Tāpēc SARS-CoV-2 amplikona elektroķīmiskās noteikšanas demonstrācija notekūdeņos aprobežojas ar īsāku \(72\,\hbox {bp}\) N1 fragmentu.
Šajā darbā mēs pētījām uz ENIG PCB balstītas fāga Phi6 elektroķīmiskās noteikšanas iespējamību, kas koncentrēta un izolēta no ezera ūdens paraugiem (1. att.). Phi6 fāgi pēc izmēra (80-100 nm) ir salīdzināmi ar SARS-CoV-2 un ir arī lipīdu membrāna un smaile proteīns. Šo iemeslu dēļ bakteriofāgs Phi6 ir populārs SARS-CoV-2 un citu apvalkotu patogēno RNS vīrusu surogāts14,15. No fāgu daļiņām izolētu RNS izmantoja kā veidni cDNS sintēzei, kam sekoja PCR, lai iegūtu divus DNS fragmentus, kuru garums ir 117 un 503 bāzes pāri. Ņemot vērā izaicinājumu pastiprināt \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 fragmentus mūsu iepriekšējā darbā, mēs mērķējam uz vidēja garuma fragmentiem (\(117). \,\hbox {bp}\) un \(503 \,\hbox {bp}\)), pamatojoties uz pieejamajiem primeriem. Elektroķīmiskā sensora reakcija tika sistemātiski pētīta plašā koncentrācijas diapazonā (\({10}\,{) \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) uz \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Abiem fragmentiem MB klātbūtne, sāls ietekme uz sensora reakciju ir raksturota un savstarpēji apstiprināta ar spektrofotometriskiem mērījumiem. Šā darba galvenie ieguldījumi ir šādi:
DNS fragmenta garums un sāls klātbūtne paraugā spēcīgi ietekmē jutību.Mūsu rezultāti liecina, ka elektroķīmiskā aktivitāte ir atkarīga no dažādiem MB, DNS un sensora mijiedarbības mehānismiem voltammetriskā reakcijā atkarībā no DNS koncentrācijas un garuma, ar garākiem Fragmentiem ir lielāka jutība, lai gan sāls negatīvi ietekmē elektrostatisko mijiedarbību starp MB un DNS.
DNS koncentrācija nosaka MB-DNS mijiedarbības mehānismu nemodificētos elektrodos Mēs parādām, ka dažādi MB-DNS mijiedarbības mehānismi ir atkarīgi no DNS koncentrācijas. Pie DNS koncentrācijas zem neliela daudzuma \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), mēs novērojām, ka elektroķīmisko strāvas reakciju galvenokārt noteica MB-DNS adsorbcija uz elektroda, savukārt zemākās koncentrācijās Augstās DNS koncentrācijās elektroķīmisko strāvas reakciju noteica redoksa steriskā inhibīcija. aktivitāte, ko izraisa MB ievietošana starp DNS bāzes pāriem.
ENIG uz PCB balstīta vīrusu nukleīnskābju elektroķīmiskā noteikšana ezera ūdens paraugos Novērojumi tika apstiprināti, elektroķīmiski nosakot Phi6 pievienotos \(503\,\hbox {bp}\) DNS fragmentus, kas iegūti no ūdens paraugiem no Powai ezera, IIT Mumbai Campus. Rezultātu fāgs.
Zemas ieviešanas izmaksas un potenciāls integrācijai pilnībā automatizētās uzraudzības sistēmās, oligonukleotīdos vai aptamēros uz elektrodiem ar ilgāku glabāšanas laiku.
Phi6 fāgs ir apvalkots dsRNS vīruss no Cytoviridae dzimtas, kas inficē Pseudomonas syringae. Phi6 fāga genoms pastāv 3 fragmentu veidā: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) un L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Tā kā Phi6 fāgs inficē nepatogēnu BSL-1 Pseudomonas celmu, to var droši lietot. un to var viegli audzēt laboratorijā.Fāga Phi6 un tās saimnieks Pseudomonas syringae tika iegādāti no Felix d'Herelle Baktēriju vīrusu references centra, Lavalas Universitāte, Kanāda (atsauces centra kataloga numuri ir attiecīgi HER-102 un HER-1102) Phi6 fāgs un tā saimnieks tika atdzīvināts saskaņā ar atsauces centra norādījumiem. Phi6 fāgs tika attīrīts ar plāksnes līzi un eluēšanu, lai iegūtu galīgos titrus ar \(\apmēram 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (plāksni veidojošas vienības/ mililitri).RNS tika izolēta no attīrītām fāga daļiņām, izmantojot GenElute™ universālo kopējo RNS attīrīšanas komplektu (Sigma-Aldrich) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Īsumā, attīrīta fāga Phi6 suspensija\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) tika lizēts un lizāts tika ievietots centrifūgas kolonnā, lai ļautu RNS saistīties ar sveķu kolonnu. Pēc tam RNS tiek eluēts eluēšanas šķīdumā \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), ko nodrošina komplekts. Novērtējiet RNS koncentrāciju pēc absorbcijas pie \(260\,\hbox {nm}\).RNS tika uzglabātas alikvotās daļās \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) līdz turpmākai izmantošanai.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNS sintēzes komplekts (Bio -Rad Laboratories) tika izmantota kā veidne cDNS sintēzei, ievērojot ražotāja norādījumus. Īsumā, cDNS sintēzes reakcija sastāv no 3 posmiem: iestrāde pie \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , \({20}\,{\hbox {min}}\) apgrieztā transkripcija pie \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), un otrādi Ierakstītājs atrodas mapē \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) \({1}\,{\hbox {min }}\).Palaižot uz 1% agarozes gēla, cDNS uzrādīja trīs joslas, kas atbilst paredzamajiem trim RNS fragmentiem (dati nav parādīti). Tālāk norādītie praimeri tika izmantoti, lai amplificētu divus DNS fragmentus, kuru garums ir 117 un 503 bp. izmantojot cDNS kā PCR veidni miniPCR® mini8 termiskajā ciklā:
Praimeri \(117\,\hbox {bp}\) un \(503\,\hbox {bp}\) atbilst 1476-1575 M segmenta nukleotīdiem un 458-943 L segmenta nukleotīdiem, attiecīgi skābei. .Visiem pastiprinātajiem PCR produktiem tika veikta elektroforēze uz 1% agarozes gēliem, un amplificētā mērķa DNS tika attīrīta, izmantojot GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
Ezers IIT Mumbai pilsētiņā (Powai Lake, Powai, Mumbai) tika izmantots, lai pievienotu fāgu daļiņas. Ezera ūdens tika filtrēts caur \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) membrānu, lai to noņemtu. suspendētās daļiņas, un pēc tam tika pievienots Phi6 fāgs. Pievienojiet \({1}\,{\hbox {ml}}\) no \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) uz \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) filtrētu ezera ūdeni, \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Neliela alikvota bija rezervēts vīrusu slodzes mērīšanai ar aplikuma testu. Mēs pārbaudījām divas dažādas metodes, lai koncentrētu Phi6 vīrusa daļiņas ar smailēm: (1) alumīnija hidroksīda adsorbcijas-izgulsnēšanas metodi,19 kas ir apstiprināta vairāku apvalku RNS vīrusu koncentrācijai no vides paraugiem, un (2) ) Uz polietilēnglikolu (PEG) balstītā vīrusa koncentrācijas metode tika pielāgota no Flood et al.20 .Tā kā tika konstatēts, ka uz PEG balstītās metodes reģenerācijas efektivitāte ir labāka nekā alumīnija hidroksīda metodei, Phi6 daļiņu koncentrēšanai no ezera ūdens paraugiem tika izmantota uz PEG balstīta metode.
Izmantotā PEG metode bija šāda: PEG 8000 un \(\hbox {NaCl}\) tika pievienoti Phi6 pievienotiem ezera ūdens paraugiem, lai iegūtu 8 % PEG 8000 un \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Paraugi tika inkubēti kratītājā\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), pēc tam centrifugē pie \(4700 \,\hbox {g}\) ir \({45}\,{\hbox {min}}\). Izmetiet supernatantu un atkārtoti suspendējiet granulu \({1}\, {\hbox {ml}}\) vienā un tajā pašā supernatantā. Visi smailes un vīrusa koncentrācijas eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros. Pēc koncentrācijas neliela alikvota tika rezervēta, lai mērītu reģenerācijas efektivitāti ar plāksnīšu testu. RNS tika izolēta, kā aprakstīts iepriekš, un eluēta. komplektā iekļautajā eluēšanas buferī\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Tā kā RNS koncentrācija dažādos paraugos trīs eksemplāros atšķirsies, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) RNS tiek izmantota visiem trim neatkarīgi no tās koncentrācijas cDNS paraugu sintēze.cDNS sintēze tika veikta, kā aprakstīts iepriekš.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNS tika izmantota kā veidne \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR 35 cikliem, lai pastiprinātu \ (117\,\hbox {bp}\) un \(503\,\hbox { bp}\) fragmenti. Šie paraugi ir attēloti kā “1:1”, ti, bez atšķaidīšanas. Kontrole bez šablona (NTC) tika iestatīta kā negatīva kontrole, savukārt cDNS, kas sintezēta, izmantojot RNS, kas izolēta no attīrīta fāga. kā veidni pozitīvai kontrolei (PC). Kvantitatīvā PCR (qPCR) tika veikta Stratagene Mx3000P RT-PCR instrumentā, izmantojot Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Reakcijas tika iestatītas trīs eksemplāros, kā iepriekš. aprakstīts. Cikla slieksnis (Ct) tika reģistrēts visiem paraugiem. Turklāt atšķaidītie paraugi tika \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\), izmantojot cDNS, kas atšķaidīta 1:100 filtrētā ezera ūdenī kā \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR 35 cikliem. Šie paraugi ir attēloti kā “1:100″.
PCB elektrodi ir izgatavoti, izmantojot tirdzniecībā pieejamu zemu izmaksu bezelektroniskā niķeļa iegremdēšanas zelta (ENIG) procesu bez papildu apzeltīšanas.ENIG PCB elektrodu specifikācijas ir detalizēti aprakstītas mūsu iepriekšējā darbā11.ENIG PCB elektrodiem tradicionālās elektrodu tīrīšanas metodes, piemēram, piranjas šķīdums vai sērskābes cikliskā voltammetrija nav ieteicama, jo tie var izraisīt plānā zelta slāņa nolobīšanos (biezums \(\apm.\) \(100\,\hbox {nm }\)) un atklāt apakšējos vara slāņus, kas ir pakļauti. pret koroziju 21, 22, 23, 24, 25. Tāpēc notīriet elektrodus ar drānu bez plūksnām, kas samitrināta ar IPA. Pārbaudāmais paraugs tika inkubēts ar \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB mapē \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) ērtai ievietošanai. Mūsu iepriekšējā darbā , mēs novērojām, ka sensora jutība un linearitāte tika uzlabota, palielinot MB koncentrāciju 11 . Pamatojoties uz optimizācijām, par kurām ziņots mūsu iepriekšējā darbā, mēs izmantojām \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB koncentrācijas, lai iegultu DNS šajā pētījumā.Divpavedienu DNS (ds-DNS) elektroķīmisko noteikšanu var panākt, izmantojot anjonu vai katjonu interkalatorus.Lai gan anjonu interkalatori DNS nosaka ar labāku selektivitāti, tiem nepieciešama inkubācija uz nakti, kā rezultātā noteikšanas laiks ir ilgāks. no otras puses, katjonu interkalatoriem, piemēram, MB, nepieciešams īsāks inkubācijas laiks, aptuveni \({1}\,{\hbox {h}}\), lai elektroķīmiski noteiktu ds-DNS6. Katrs mērījums ietver testējamā parauga izsniegšanu elektrodu\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), pēc tam notīriet ar IPA samitrinātu lupatu, pirms turpināt ar citu paraugu.viens mērījums.Katrs paraugs tika pārbaudīts uz 5 dažādiem elektrodiem, ja vien nav norādīts citādi.DPV un CV mērījumi tika veikti, izmantojot PalmSens Sensit Smart potenciostatu, un PSTrace programmatūra tika izmantota potenciostata konfigurēšanai un datu iegūšanai, tostarp maksimālās strāvas aprēķiniem.Tiek izmantoti šādi iestatījumi. DPV un CV mērījumiem:
DPV: līdzsvara laiks = \(8\,\hbox {s}\), sprieguma solis = \(3\,\hbox {mV}\), impulsa spriegums = \(25\,\hbox {mV}\) , impulsa ilgums = \(50\,\hbox {ms}\), skenēšanas ātrums = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: līdzsvara laiks = \(8\,\hbox {s}\), sprieguma solis = \(3\,\hbox {mV}\), slaucīšanas ātrums = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
Maksimālās strāvas, kas iegūtas no DNS voltammogrammām, kas kompleksā ar \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV un CV voltammogrammas tika iegūtas uz ENIG PCB elektrodiem \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB kompleksā ar DNS (koncentrācijā 10–\({20}\,{\ hbox {ng) }/{\upmu \hbox {l}}}\) ti, 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(117\,\hbox {bp}\ ) un 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(503\,\hbox {bp}\)). Reprezentatīvās voltammogrammas ir parādītas S1 attēlā papildinformācijā. 2. attēlā parādīti rezultāti. DPV un CV mērījumu (maksimālā strāva), izmantojot želeju attīrītus PCR produktus.Salīdzinot ar CV mērījumiem, DPV mērījumi uzrāda lielāku jutību (strāvu kā DNS koncentrācijas funkciju), jo fona kapacitatīvās strāvas CV mērījumos slēpj Faradaic strāvas 26 .The data katrā lodziņā lodziņā ir ietverti mērījumi no 5 elektrodiem.Visos mērījumos tiek izmantots viens un tas pats elektrodu komplekts, lai izvairītos no mērījumu kļūdām, kas radušās elektrodu atšķirību dēļ. Mēs novērojām DPV un CV izmērīto maksimālo strāvu pieauguma tendenci zemākām DNS koncentrācijām. , garāks (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ salīdzinājumā ar \(117) ) fragmentu. Tas atbilst paredzamajai elektrodu adsorbcijas tendencei, par kuru ziņots mūsu iepriekšējā darbā. MB-DNS kompleksa adsorbcija atvieglo lādiņa pārnesi uz elektrodu, kas veicina maksimālās strāvas palielināšanos.Citi pētījumi ir parādījuši oligonukleotīdu lieluma un secības ietekmi uz MB-DNS interkalāciju27,28,29,30.Guanīns -citozīna (GC) saturs divos amplikonos (\(117\,\hbox {bp}\) un \(503\,\hbox {bp}\)) bija aptuveni 50%, kas norāda, ka novērojums Atšķirība ir saistīta ar uz amplikona garumu. Tomēr lielākai DNS koncentrācijai (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), \(503\,\hbox {bp} \) un \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) \(117\,\hbox {bp}\)), mēs novērojam divus pastiprinājumus. substrāvu maksimālās strāvas tiek samazinātas gan DPV, gan CV mērījumos. Tas ir tāpēc, ka MB piesātina un interkalējas starp DNS bāzes pāriem, kā rezultātā MB31,32 reducējamās grupas redoksaktivitāte tiek steriski inhibēta.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
PCR galvenajos maisījumos esošie sāļi traucē elektrostatisko mijiedarbību starp MB un DNS, tāpēc, pievienojot \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) ar \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB ar gēlu attīrīts produkts, lai pētītu sāls ietekmi uz MB-DNS mijiedarbību. Kā parādīts 3. attēlā, mēs novērojām, ka lielākai DNS koncentrācijai (\(>{2}\,{\) hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) un \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) \(117\,\hbox {bp} \)), DPV un CV Sāls pievienošana būtiski neietekmēja mērījumus (skat. S2 attēlu papildinformācijā par reprezentatīvām voltammogrammām). Tomēr plkst. zemākas DNS koncentrācijas, sāls pievienošana ievērojami samazina jutību, kā rezultātā strāva būtiski nemainās ar DNS koncentrāciju. Par līdzīgu sāls negatīvo ietekmi uz MB-DNS mijiedarbību un interkalāciju iepriekš ziņoja citi pētnieki33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) katjoni saistās ar DNS negatīvo fosfātu mugurkaulu, tādējādi kavējot elektrostatisko mijiedarbību starp MB un DNS. Augstākā DNS koncentrācijā redoksaktīvo MB steriskā inhibīcija rada zemākas maksimālās strāvas, tāpēc elektrostatiskā mijiedarbība. būtiski neietekmē sensora reakciju. Galvenais ir tas, ka šis biosensors ir labāk piemērots augstākas DNS koncentrācijas noteikšanai (reti \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) vai augstāka), pilnībā automatizētai vides ūdens paraugu apstrādei, kur PCR produktu attīrīšana ar gēlu var nebūt iespējama.
Laukums zem absorbcijas līknes viļņu garuma diapazonam 600–700 \(\hbox {nm}\) dažādām DNS koncentrācijām, kas kompleksā ar \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) ar un bez sāls (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) ar un bez sāls (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) DNS koncentrācija, kas atbilst \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB paraugiem Nav DNS.
Lai vēl vairāk pārbaudītu iepriekš minētos rezultātus, mēs veicām optiskos mērījumus, izmantojot UV/Vis spektrofotometru (Thermo Scientific Multiskan GO), katram tika izmantoti paraugi \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\). Mērījums. Absorbcijas paraksts samazinās, palielinoties DNS koncentrācijai, kā redzams no laukuma tendences zem absorbcijas līknes viļņu garuma diapazonā \(600\,\hbox {nm}\) līdz \(700\,\hbox { nm}\) , kā parādīts 4. attēlā (absorbcijas spektrs parādīts S3 attēlā papildinformācijā). Paraugiem, kuru DNS koncentrācija ir mazāka par \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), nebija būtiskas atšķirības uztverē starp DNS saturošiem un tikai MB paraugiem (\(503\,\hbox {bp}\) un \(117\,\hbox {bp}\ ) garuma fragmenti), kas norāda uz redoksaktīvā MB steriskas inhibīcijas neesamību. Pie augstākām DNS koncentrācijām mēs novērojām pakāpenisku absorbcijas signāla samazināšanos un konstatējām mazāku absorbcijas samazināšanos sāls klātbūtnē. Šie rezultāti tika attiecināti uz molekulāro ietekmi. mijiedarbība un steriskā inhibīcija ar bāzes sakraušanu DNS hibrīdos. Mūsu rezultāti atbilst literatūrā publicētajiem ziņojumiem par MB-DNS interkalācijas spektroskopiskiem pētījumiem, kas saista hipohromatitāti ar samazinātu enerģijas līmeni \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) elektroniskās pārejas interkalācijas dēļ 36., 37., 38. slānis.
Fāga Phi6 agarozes gēla elektroforēze: PCR produkti ar garumu \(117\,\hbox {bp}\) un \(503\,\hbox {bp}\) no ezera ūdens paraugiem.M-DNS marķieris;NTC bez veidnes kontrole, praimeri, kas satur atbilstošus amplikonus;PC pozitīvā kontrole;1, 2, 3 neatšķaidīti (1:1) ezera ūdens paraugi trīs eksemplāros. Pie \(\apmēram 50\,\hbox {bp}\) ir redzama josla \(503\,\) neizmantoto oligonukleotīdu dēļ. hbox {bp}\) josla.
Mēs novērtējām sensora lietderību, izmantojot Powai ezera ūdens paraugus, kas papildināti ar Phi6 fāgu. RNS koncentrācija, kas izolēta no ūdens paraugiem ar fāgiem, bija robežās no 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), savukārt tie, kas izolēti no attīrītām fāgu suspensijām. RNS tika lēsts kā \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) ar reģenerācijas efektivitāti aptuveni 1 %.RNS tika reversi transkribēta kDNS un izmantota kā veidne PCR un qPCR. Produkta izmērs tika apstiprināts ar agarozes gēla elektroforēzi (5. attēls) pirms testēšanas ar sensoru. Šie paraugi nav attīrīti ar gēlu, un tāpēc tie satur visas PCR sastāvdaļas kā kā arī interesējošie amplikoni. qPCR laikā reģistrētās Ct vērtības (1. tabula) korelē ar RNS koncentrāciju, kas izolēta no attiecīgajiem ūdens paraugiem. Ct vērtība atklāj ciklu skaitu, kas nepieciešams, lai fluorescējošais signāls pārietu. pārsniedz slieksni vai fona signālu. Augstākas Ct vērtības norāda uz zemāku šablona koncentrāciju un otrādi. NTC paraugu Ct vērtības bija tikpat augstas, kā gaidīts. \(\aptuveni 3\) Ct vērtību atšķirība starp pozitīvā kontrole un testa paraugs arī norāda, ka katram testa paraugam ir aptuveni 1% šablona salīdzinājumā ar pozitīvo kontroli. Mēs jau iepriekš esam apsprieduši, ka garāki amplikoni nodrošina labāku jutību. No neviendabīgiem vides paraugiem izolētu garāku fragmentu pastiprināšana ir sarežģīta, ņemot vērā trūkumus. ar zemu vīrusu koncentrāciju un RNS noārdīšanos.Tomēr ar mūsu vīrusa bagātināšanas un PCR pastiprināšanas protokolu mēs varējām veiksmīgi pastiprināt \(503\,\hbox {bp}\) fragmentu elektroķīmiskai noteikšanai.
6. attēlā parādīti \(503\,\hbox {bp}\) fragmenta amplikona elektroķīmiskā sensora rezultāti, izmantojot neatšķaidītu cDNS kā veidni (1:1) un 100 reizes atšķaidītu cDNS kā veidni (1:100), veicot PCR. , salīdzinot ar NTC un PC (par reprezentatīvām voltammogrammām sk. S4 attēlu papildinformācijā).Katrā lodziņā 6. attēla lodziņā ir trīs paraugu mērījumi uz 5 elektrodiem. Lai izvairītos no elektrodu radītām kļūdām, tika izmantoti tie paši elektrodi. - pret elektrodu variāciju.Salīdzinot ar CV mērījumiem, DPV mērījumi uzrāda labāku izšķirtspēju, lai atšķirtu testa un PC paraugus no NTC, jo, kā minēts iepriekš, Faradaic strāvas ir paslēptas fona kapacitatīvo strāvu dēļ pēdējos. Garākiem amplikoniem mēs novērojām, ka negatīvā kontrole (NTC) radīja augstākas CV un DPV maksimālās strāvas salīdzinājumā ar pozitīvo kontroli, turpretim pozitīvajiem un neatšķaidītajiem testa paraugiem bija līdzīgi DPV maksimālo strāvu augstumi. Izmērītās vidējās un vidējās vērtības katram neatšķaidītam (1:1) ) testa paraugu un datoru var skaidri izšķirt no NTC parauga sensora izejas, savukārt 1:100 atšķaidīta parauga izšķirtspēja ir mazāk izteikta. 100-kārtīgam cDNS atšķaidījumam gēla elektroforēzes laikā netika novērotas joslas. (joslas nav parādītas 5. attēlā), un atbilstošās DPV un CV maksimālās strāvas bija līdzīgas tām, kas paredzētas NTC. Fragmenta \(117\,\hbox {bp}\) rezultāti ir parādīti papildinformācijā. kontrole izraisīja elektroķīmisku reakciju no PCB sensora, jo uz elektroda tika adsorbēts brīvais MB un MB mijiedarbojas ar vienpavedienu praimera oligonukleotīdu. Tāpēc katru reizi, kad tiek pārbaudīts paraugs, ir jāveic negatīva kontrole un testa parauga maksimālā strāva salīdzinājumā ar maksimālo strāvu, kas iegūta ar negatīvo kontroli, lai panāktu diferenciālu (relatīvu) mērījumu39,40, lai klasificētu testa paraugu kā pozitīvu vai negatīvu.
(a) DPV un (b) CV maksimālā strāva \(503\,\hbox {bp}\) fragmentu elektroķīmiskai noteikšanai ezera ūdens paraugos. Testa paraugi tika mērīti trīs eksemplāros un salīdzināti ar bezveidnes kontrolēm (NTC) un pozitīvās kontroles (PC).
Mūsu atklājumi ilustrē dažādus mehānismus, kas ietekmē dažādu DNS dažāda garuma amplikonu elektroķīmisko sensoru darbību ar koncentrāciju, kas pārbaudīta ar optiskiem mērījumiem, izmantojot UV/Vis spektrofotometru. Mūsu novērojumi liecina par to, ka garāki DNS fragmenti līdz \(\approx\) \(500\,\hbox {bp}\) var noteikt ar lielāku jutību un ka sāls klātbūtne paraugā nav jutīga DNS koncentrācija, kas ietekmē augstāku jutību (reti \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) un augstāk). Turklāt mēs pētījām dažāda veida paraugu ietekmi, tostarp ar gēlu attīrītu amplikonu ar pievienotu sāli un bez tā, kā arī ezera ūdens paraugu pievienošanu DPV un CV mērījumos.Mēs novērojām, ka DPV nodrošināja labāku izšķirtspēju, jo fona kapacitatīvā strāva ietekmē arī CV mērījumu, padarot to mazāk jutīgu.
Garāku fragmentu amplifikācija ir atkarīga no vīrusa genoma RNS integritātes. Vairāki pētījumi ir parādījuši, ka garāku fragmentu amplifikācija ne vienmēr ir efektīva, jo RNS degradējas vidē un izolācijas laikā ir iespējama splicēšana11,41,42,43,44. Mēs novērojām, ka uz PEG balstītā vīrusa koncentrācijas metode bija efektīvāka fāga Phi-6 koncentrēšanā ezera ūdens paraugos nekā vīrusa koncentrācijas metode, kuras pamatā ir alumīnija hidroksīds. Spēja noteikt garus DNS fragmentus spēja pārvarēt multipleksa PCR nepieciešamību. lai pastiprinātu vairākas īsāka garuma veidnes un samazinātu savstarpējās specifikas iespēju.
Bioloģisko paraugu ir maz, tāpēc ir jāizstrādā biosensors, kura testēšanai nepieciešams minimāls paraugs. Šajā pētījumā izmantotajiem ENIG PCB elektrodiem bija nepieciešams tikai \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) paraugus testēšanai, lai aptvertu elektrodu efektīvo laukumu. Turklāt to pašu elektrodu var izmantot atkārtoti pēc tīrīšanas pirms nākamā parauga izsniegšanas. Pastiprinātajiem paraugiem nav jāpievieno citas ķīmiskas vielas, izņemot metilēnzilo, kas ir lēts un parasti izmanto ķīmisko vielu.Tā kā katra elektroda izgatavošana maksā apmēram USD 0,55 (vai INR 40), šis biosensors var būt rentabla alternatīva esošajām noteikšanas tehnoloģijām. 2. tabulā parādīts šī darba salīdzinājums ar citiem sensoriem, par kuriem jau sen ir ziņots literatūrā. DNS fragmenti neviendabīgos paraugos.
Ņemot vērā, ka uz MB balstīti elektroķīmiskās noteikšanas protokoli ir balstīti uz PCR specifiku, šīs metodes galvenais ierobežojums ir nespecifiskas amplifikācijas iespēja neviendabīgos paraugos, piemēram, notekūdeņos un ezera ūdenī, vai izmantojot zemas tīrības primerus. elektroķīmiskās noteikšanas metodes neattīrītu PCR produktu DNS noteikšanai, izmantojot nemodificētus ENIG PCB elektrodus, ir nepieciešams labāk izprast kļūdas, ko rada neizmantotie dNTP un praimeri, un optimizēt reakcijas apstākļus un testu protokolus. Papildu fizikāli ķīmiskie parametri, piemēram, pH, temperatūra un bioloģiskie parametri var būt nepieciešams izmērīt arī ūdens parauga skābekļa patēriņu (BOD), lai uzlabotu mērījumu precizitāti.
Noslēgumā mēs piedāvājam zemu izmaksu elektroķīmisko ENIG PCB sensoru vīrusu noteikšanai vides (ezera ūdens) paraugos. Atšķirībā no imobilizētiem oligonukleotīdu elektrodiem vai pielāgotiem substrātiem DNS noteikšanai, kam nepieciešama kriogēna uzglabāšana, lai saglabātu jutīgumu,53,54 mūsu tehnikā tiek izmantots nemodificēts PCB. elektrodi ar ilgāku glabāšanas laiku un bez īpašām uzglabāšanas prasībām, tāpēc tie ir piemēroti mērījumu risinājumu izstrādei ar automatizētu paraugu apstrādi, kas izvietota LMIC. Biosensorā tiek izmantotas lētas DNS interkalējošās redokskrāsvielas (MB), lai ātri noteiktu mērķa amplikonus. Nespecifiskā pastiprināšana bieži sastopamais vides paraugos samazina šīs noteikšanas metodes specifiku, jo MB nespecifiski saistās ar vienpavedienu un divpavedienu oligonukleotīdiem.Tāpēc šī testa specifika ir atkarīga no praimeru optimizācijas un PCR reakcijas apstākļiem.Turklāt CV un DPV maksimālās strāvas, kas iegūtas no pārbaudītajiem paraugiem, jāinterpretē attiecībā pret reakcijām, kas iegūtas no negatīvās kontroles (NTC) katram testam. Šajā darbā aprakstītās elektroķīmisko sensoru konstrukcijas un metodes var integrēt ar automātiskajiem paraugu ņēmējiem, lai izstrādātu pilnībā automatizētu un zemu - izmaksu risinājums, kas var savākt un analizēt paraugus un bezvadu režīmā pārsūtīt rezultātus atpakaļ uz laboratoriju.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Metodes sākotnējās koncentrācijas vīrusu no ūdens paraugiem: pārskats un metaanalīze par jaunākajiem pētījumiem.J.Pielietojums.mikroorganisms.115, 1.-11.lpp (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Waterborne viruses: Barriers to safe drinking water.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.Notekūdeņu epidemioloģija izmaksu ziņā efektīvai liela mēroga COVID-19 uzraudzībai valstīs ar zemiem un vidējiem ienākumiem: izaicinājumi un iespējas.Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry. Chemical. Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN. Metilēnzilais kā vienpavedienu un divpavedienu oligonukleotīdu elektroķīmisks diskriminators, kas imobilizēts uz zelta substrātiem. Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ. Kattjonu un anjonu interkalatoru salīdzinājums DNS hibridizācijas elektroķīmiskai transdukcijai ar liela attāluma elektronu pārnesi.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Lādiņa pārnešana caur DNS: selektīvs elektroķīmisks DNS biosensors.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Reāllaika PCR mikrofluidiskā ierīce ar vienlaicīgu elektroķīmisko noteikšanu.bioloģiskais sensors.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. Signalizācijas mehānismu izpēte un veiktspējas pārbaude elektroķīmiskai reāllaika PCR sistēmai, kuras pamatā ir metilēnzilā mijiedarbība ar DNS. Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Cilpas mediēts izotermisks amplifikācijas elektroķīmisks sensors sars-cov-2 noteikšanai notekūdeņu paraugos.J.Vide.Ķīmija.Lielbritānija.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.SARS-CoV-2 amplikonu elektroķīmiskā noteikšana ar PCB elektrodiem.Sensors ir aktivizēts.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Efektīva SARS-CoV-2 RNA noteikšana notekūdeņu cietajā frakcijā.zinātne.vispārējā vide.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al. Analītiskās metodes SARS-CoV-2 noteikšanai notekūdeņos: protokols un nākotnes perspektīvas. TraC tendences anal. Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Survival of the enveloped bacteriophage Phi6 (a surrogate for SARS-CoV-2) in evaporated saliva droplets deponed on glass surfaces.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ SARS-CoV-2 surogāta (Phi6) vides noturība brīvi dzīvojošās amēbās.J.Ūdens veselība 20, 83 (2021).
Mindich, L. Precīza iepakošana trīs genoma fragmentiem divpavedienu RNS bakteriofāga\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, DH RNS fāga\(\varphi\)6 iepakojuma reģiona sekundārā struktūra.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – Ātrs un efektīvs protokols bakteriofāgu laboratorijas krājumu sagatavošanai.PeerJ 4, e2261 (2016).
Izsūtīšanas laiks: 2022. gada 27. maijs