Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Naudojama naršyklės versija ribotai palaiko CSS. Kad gautumėte geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Tuo tarpu, norėdami užtikrinti toliau palaikome, svetainę rodysime be stilių ir „JavaScript“.
Aplinkos mėginių stebėjimo svarba buvo labai vertinama nuo COVID-19 pandemijos pradžios, o kai kurios stebėjimo pastangos atliekamos naudojant auksinį standartą, nors qPCR pagrįsti metodai yra brangūs. Elektrocheminiai DNR biojutikliai gali būti ekonomiškai efektyvūs. sprendimas, skirtas stebėti aplinkos vandens mėginius mažas ir vidutines pajamas gaunančiose šalyse. Šiame darbe demonstruojame elektrocheminį amplikonų, gautų iš Phi6 fago, išskirto iš ežero vandens mėginių su spygliuočiais (populiarus SARS-CoV-2 pakaitalas), aptikimą naudojant ENIG. užbaigti PCB elektrodus be paviršiaus modifikavimo.lytis. Elektrocheminio jutiklio atsakas buvo kruopščiai apibūdintas dviem skirtingo ilgio DNR fragmentams (\({117}\,\hbox {bp}\) ir \({503}\,\hbox {bp}\)) ir PGR pagrindiniuose mišiniuose esančių druskų poveikis metileno mėlynojo (MB)-DNR sąveikai.Mūsų rezultatai rodo, kad DNR fragmentų ilgis reikšmingai lemia elektrocheminį jautrumą ir šiuo darbu parodo, kad galimybė aptikti ilgus amplikonus be PGR produktų gryninimo geliu yra svarbus vandens mėginių matavimui in situ.Visiškai automatizuotas virusų apkrovos sprendimas yra geras.
Viruso perdavimas per vandenį buvo žinomas kaip pavojus visuomenės sveikatai nuo XX a. ketvirtojo dešimtmečio, kai atsirado pirmieji poliomielito ir hepatito E1 plitimo per vandenį įrodymai. Pasaulio sveikatos organizacija (PSO) klasifikavo keletą vandens pernešamų virusinių patogenų, turinčių vidutinę ar didelę reikšmę sveikatai2. Tradicinis virusas aptikimo metodai priklauso nuo aukso standarto qPCR pagrįstų metodų, kurie yra labai jautrūs ir specifiniai, tačiau reikalauja kvalifikuoto personalo, kad galėtų atlikti tyrimus laboratorijoje naudojant brangius instrumentus. Tačiau mažas ir vidutines pajamas gaunančiose šalyse (LMIC), turinčiose ribotus išteklius, žmonės Tikėtina, kad mėginių tyrimams bus teikiama pirmenybė prieš aplinkos vandens mėginių stebėjimą. Todėl norint užtikrinti tvarų vandens ir nuotekų mėginių stebėjimą realiu laiku mažas ir vidutines pajamas gaunančiose šalyse reikia alternatyvių nebrangių metodų, kurie iš anksto įspėtų apie naujų ligų protrūkius, taip apsaugodami juos nuo didelio socialinio ir ekonominio viruso pandemijos poveikio.Pigūs elektrocheminiai nukleino rūgščių biojutikliai galėtų būti perspektyvus šio nepatenkinto poreikio sprendimas.Daugelis šių DNR biosensorių veikia tuo, kad ant elektrodo imobilizuojamos papildomos DNR grandinės paviršių ir hibridizuojasi, kai mėginyje yra atitinkama seka. Tada tai galima paversti signalu įvairiais elektrocheminiais metodais, naudojant redokso tarpininkus, tokius kaip kalio geležis/ferocianidas. Metileno mėlynasis (MB) yra viena iš tokių redoksą aktyvių molekulių, buvo pranešta, kad jie įsiterpia į dvigrandę DNR (dsDNR), be nespecifiškesnio prisijungimo prie vienos grandinės DNR5,6. Dėl MB interkaliacinio pobūdžio, kad susidarytų MB-DNR kompleksai, jie yra populiarus pasirinkimas kaip redokso tarpininkai keliose elektrocheminėse DNR jutiklių konfigūracijos5,6,7,8,9.Nors MB įsiterpimas į DNR yra nespecifinis, o šio elektrocheminio jutiklio specifiškumas labai priklauso nuo pradmenų, naudojamų PGR ar izoterminiam amplifikacijai grynumo, jis puikiai tinka realizuoti Laiko elektrocheminis qPCR arba fluorescencinis izoterminis amplifikavimas kaip alternatyva DNR koncentracijos matavimui 9 . Viename iš tokių įgyvendinimo būdų Won ir kt. Aukso elektrodų paviršius buvo modifikuotas 6-merkapto-1-heksanoliu (MCH) realiu laiku. PGR amplikonų matavimas su MB naudojant diferencinę impulsų voltamperometriją (DPV)9.Kitais atvejais Ramirez ir kt.SARS-CoV-2 aptikimas nuotekose RT-LAMP reakcija naudojant MB su ekrano atspausdintais elektrodais.Taip pat buvo atlikti platininiai elektrodai. naudojami kaip in situ elektrodai mikrofluidinėje PGR platformoje, skirtoje elektrochemiškai aptikti amplikonus reakcijų metu 8. Visiems šiems tyrimams reikia modifikuoti elektrodų paviršių, o tai reiškia, kad dėl specialių saugojimo reikalavimų šių funkcionalizuotų elektrodų stabilumui padidės gamybos ir eksploatavimo išlaidos.
Amplikonų, gautų iš koncentruotų viruso dalelių ežero vandens mėginiuose, elektrocheminio aptikimo darbo eigos schema.
Neseniai pademonstravome elektrocheminį SARS-CoV-2 amplikonų jutimą su pigiais spausdintinės plokštės (PCB) elektrodais, pagrįstas DPV ir cikline voltamperometrija (CV), kurią sukelia MB-DNR kompleksų adsorbcija ant nemodifikuotų elektrodų paviršiaus) smailės pokyčius. srovė11.Pranešame, kad ilgesni DNR fragmentai (N1-N2, \({943}\, \hbox), suformuoti naudojant CDC rekomenduojamus N1 pirminius ir N2 atvirkštinius pradmenis, palyginti su trumpesniais fragmentais {bp}\)), jutiklio atsakas buvo tiesesnis. (N1, \(72\,\hbox {bp}\)), sudarytas naudojant N1 pirminių ir N1 atvirkštinių pradmenų rinkinius. Šie tyrimai buvo atlikti naudojant DNR skiedimus, paruoštus vandenyje be nukleazės. Platforma taip pat buvo naudojama SARS-CoV aptikti. -2 amplikonai modeliuotuose nuotekų mėginiuose (gautų sumaišius visus RNR mėginius su SARS-CoV-2 RNR). Kadangi RNR gali kirpti izoliacijos ir tolesnio apdorojimo metu12,13, sunku amplifikuoti ilgesnius fragmentus naudojant šį heterogeninį mėginį. Todėl SARS-CoV-2 amplikono elektrocheminio jutimo nuotekose demonstravimas apsiriboja trumpesniu \(72\,\hbox {bp}\) N1 fragmentu.
Šiame darbe ištyrėme ENIG PCB pagrįsto fago Phi6, koncentruoto ir išskirto iš ežero vandens mėginių, elektrocheminio jutimo galimybę (1 pav.). Phi6 fagai savo dydžiu (80-100 nm) yra panašūs į SARS-CoV-2 ir taip pat turi lipidinę membraną ir smaigalio baltymą.Dėl šių priežasčių bakteriofagas Phi6 yra populiarus SARS-CoV-2 ir kitų apvalkalą turinčių patogeninių RNR virusų pakaitalas14,15.Iš fago dalelių išskirta RNR buvo naudojama kaip šablonas cDNR sintezei. PGR, kad gautume du 117 ir 503 bazinių porų ilgio DNR fragmentus. Atsižvelgiant į iššūkį amplifikuoti \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 fragmentus ankstesniame darbe, mes taikome vidutinio ilgio fragmentus (\(117) \,\hbox {bp}\) ir \(503 \,\hbox {bp}\)), remiantis turimais pradmenimis. Elektrocheminis jutiklio atsakas buvo sistemingai tiriamas plačiame koncentracijos diapazone (\({10}\,{) \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) į \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Abiem fragmentams MB buvimas, druskos poveikis jutiklio atsakui buvo apibūdintas ir kryžmiškai patvirtintas spektrofotometriniais matavimais. Pagrindinis šio darbo indėlis yra toks:
DNR fragmento ilgis ir druskos buvimas mėginyje stipriai veikia jautrumą.Mūsų rezultatai rodo, kad elektrocheminis aktyvumas priklauso nuo skirtingų MB, DNR ir jutiklio sąveikos mechanizmų voltamperiniame atsake, priklausomai nuo DNR koncentracijos ir ilgio, o ilgesni Fragmentai rodo didesnį jautrumą, nors druska neigiamai veikia elektrostatinę sąveiką tarp MB ir DNR.
DNR koncentracija lemia MB-DNR sąveikos mechanizmą nemodifikuotuose elektroduose Mes parodome, kad skirtingi MB-DNR sąveikos mechanizmai priklauso nuo DNR koncentracijos. Kai DNR koncentracija yra mažesnė nei nedidelis \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), pastebėjome, kad elektrocheminį srovės atsaką daugiausia nulėmė MB-DNR adsorbcija ant elektrodo, o esant mažesnėms koncentracijoms Esant didelei DNR koncentracijai, elektrocheminį srovės atsaką lėmė sterinis redokso slopinimas. aktyvumas dėl MB įterpimo tarp DNR bazių porų.
ENIG PCB pagrįstas elektrocheminis virusinių nukleorūgščių aptikimas ežero vandens mėginiuose Stebėjimai buvo patvirtinti elektrocheminiu būdu aptikus Phi6 pridėtus \(503\,\hbox {bp}\) DNR fragmentus, gautus iš vandens mėginių iš Powai ežero, IIT Mumbajaus miestelyje. Rezultatų fagas.
Mažos diegimo išlaidos ir galimybė integruoti į visiškai automatizuotas stebėjimo sistemas, oligonukleotidus arba aptamerus ant elektrodų, kurių galiojimo laikas ilgesnis.
Phi6 fagas yra Cytoviridae šeimos apvalkalas dsRNR virusas, užkrečiantis Pseudomonas syringae. Phi6 fago genomas egzistuoja 3 fragmentų pavidalu: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) ir L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Kadangi Phi6 fagas užkrečia nepatogenišką BSL-1 Pseudomonas štamą, jį naudoti saugu ir gali būti lengvai auginami laboratorijoje.Fagas Phi6 ir jo šeimininkas Pseudomonas syringae buvo įsigyti iš Felix d'Herelle bakterinių virusų referencinio centro, Lavalo universiteto, Kanadoje (referencinių centrų katalogo numeriai yra atitinkamai HER-102 ir HER-1102) .Phi6 fagas ir jo šeimininkas buvo atgaivinti, kaip nurodė etaloninis centras. Phi6 fagas buvo išgrynintas plokštelės lizės ir eliuavimo būdu, kad būtų gauti galutiniai titrai su \(\apie 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (apnašas formuojantys vienetai / mililitrai).RNR buvo išskirta iš išgrynintų fagų dalelių, naudojant GenElute™ universalų viso RNR gryninimo rinkinį (Sigma-Aldrich) pagal gamintojo instrukcijas. Trumpai tariant, išgryninta fago Phi6 suspensija\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) buvo lizuojamas, o lizatas buvo įkeltas į sukimo kolonėlę, kad RNR galėtų prisijungti prie dervos kolonėlės. Tada RNR eliuuojama eliuavimo tirpale \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), kurį pateikė rinkinys. Įvertinkite RNR koncentraciją pagal absorbciją ties \(260\,\hbox {nm}\). ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) iki tolesnio naudojimo.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA sintezės rinkinys (Bio -Rad Laboratories) buvo naudojamas kaip šablonas cDNR sintezei, vadovaujantis gamintojo instrukcijomis. Trumpai tariant, cDNR sintezės reakcija susideda iš 3 etapų: pradėjimas \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , atvirkštinė \({20}\,{\hbox {min}}\) transkripcija \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), ir atvirkščiai. Diktofonas yra \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), skirtas \({1}\,{\hbox {min }}\).Paleidus ant 1 % agarozės gelio, cDNR rodė tris juostas, atitinkančias numatomus tris RNR fragmentus (duomenys nerodomi). Šie pradmenys buvo naudojami dviem 117 ir 503 bp ilgio DNR fragmentams amplifikuoti. naudojant cDNR kaip PGR šabloną miniPCR® mini8 terminiame cikle:
\(117\,\hbox {bp}\) ir \(503\,\hbox {bp}\) pradmenys atitinka 1476-1575 M segmento nukleotidus ir 458-943 L segmento nukleotidus, atitinkamai rūgštį .Visiems amplifikuotiems PGR produktams buvo atlikta elektroforezė ant 1% agarozės gelių, o amplifikuota tikslinė DNR buvo išgryninta naudojant GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
Ežeras prie IIT Mumbai miestelio (Powai Lake, Powai, Mumbai) buvo naudojamas fagų dalelėms pridėti. Ežero vanduo buvo filtruojamas per \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) membraną, kad pašalintų suspenduotų dalelių, tada buvo pridėtas Phi6 fagas. Pridėkite \({1}\,{\hbox {ml}}\) iš \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) į \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) filtruotą ežero vandenį, į \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Nedidelė alikvotinė dalis buvo skirtas virusų apkrovai matuoti apnašų tyrimu. Išbandėme du skirtingus metodus, skirtus Phi6 viruso dalelėms koncentruoti: (1) aliuminio hidroksido adsorbcijos-nusodinimo metodą19, kuris buvo patvirtintas kelių apvalkalų RNR virusų koncentracijai iš aplinkos mėginių, ir (2) ) Polietilenglikolio (PEG) pagrindu sukurtas viruso koncentracijos metodas buvo pritaikytas iš Flood ir kt.20 .Kadangi buvo nustatyta, kad PEG metodo regeneravimo efektyvumas yra geresnis nei aliuminio hidroksido metodo, PEG pagrįstas metodas buvo naudojamas Phi6 dalelėms iš ežero vandens mėginių koncentruoti.
Naudotas PEG metodas buvo toks: PEG 8000 ir \(\hbox {NaCl}\) buvo pridėta prie Phi6 prisotintų ežero vandens mėginių, kad būtų gauta 8 % PEG 8000 ir \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Mėginiai buvo inkubuoti purtykloje\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), tada centrifuguojama \(4700 \,\hbox {g}\) yra \({45}\,{\hbox {min}}\). Supernatantą išmeskite ir nuosėdas pakartotinai suspenduokite \({1}\, {\hbox {ml}}\) tame pačiame supernatante. Visi sukrėtimo ir viruso koncentracijos eksperimentai buvo atlikti trimis egzemplioriais. Po koncentracijos nedidelė alikvotinė dalis buvo rezervuota regeneravimo efektyvumui matuoti apnašų tyrimu. RNR buvo išskirta, kaip aprašyta anksčiau, ir eliuuota. komplekte pateiktame eliuavimo buferyje\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Kadangi RNR koncentracija skirtinguose mėginiuose skirsis trimis egzemplioriais, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) RNR naudojama visoms trims nepriklausomai nuo jos koncentracijos mėginių cDNR sintezė.cDNR sintezė buvo atlikta taip, kaip aprašyta anksčiau.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNR buvo naudojamas kaip šablonas \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PGR 35 ciklams, siekiant sustiprinti \ (117\,\hbox {bp}\) ir \(503\,\hbox { bp}\) fragmentai. Šie mėginiai pavaizduoti kaip „1:1“, ty be skiedimo. Kontrolė be šablono (NTC) buvo nustatyta kaip neigiama kontrolė, o cDNR, susintetinta naudojant RNR, išskirtą iš išgryninto fago, buvo nustatyta. kaip teigiamos kontrolės (PC) šablonas. Kiekybinė PGR (qPCR) buvo atlikta Stratagene Mx3000P RT-PCR prietaisu, naudojant Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Reakcijos buvo nustatytos trimis egzemplioriais, kaip ir anksčiau. aprašyta. Ciklo slenkstis (Ct) buvo užregistruotas visiems mėginiams. Be to, atskiesti mėginiai buvo \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) naudojant cDNR, praskiestą filtruotame ežero vandenyje santykiu 1:100 kaip \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PGR 35 ciklams. Šie pavyzdžiai pateikiami kaip "1:100".
PCB elektrodai gaminami naudojant nebrangų Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) procesą, nereikalaujant papildomo paauksavimo.ENIG PCB elektrodų specifikacijos išsamiai aprašytos ankstesniame darbe11.ENIG PCB elektrodams naudojami tradiciniai elektrodų valymo metodai, pvz. piranijos tirpalas arba sieros rūgšties ciklinė voltamperometrija nerekomenduojama, nes dėl jų gali nusilupti plonas aukso sluoksnis (storis \(\apytikriai\) \(100\,\hbox {nm }\)) ir atskleisti apatinius vario sluoksnius, kurie yra linkę iki korozijos 21, 22, 23, 24, 25. Todėl nuvalykite elektrodus nepūkuota šluoste, sudrėkinta IPA. Bandinys, kurį reikia ištirti, buvo inkubuojamas su \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\), kad būtų lengva įterpti. Ankstesniame darbe , pastebėjome, kad padidinus MB koncentraciją pagerėjo jutiklio jautrumas ir tiesiškumas. koncentracijos, kad šiame tyrime būtų įterpta DNR.Elektrocheminį dvigubos grandinės DNR (ds-DNR) aptikimą galima pasiekti naudojant anijoninius arba katijoninius interkalatorius.Nors anijoniniai interkalatoriai aptinka DNR geriau selektyviau, juos reikia inkubuoti per naktį, todėl aptikimo laikas ilgesnis. kita vertus, katijoniniams interkalatoriams, tokiems kaip MB, reikia trumpesnio inkubavimo laiko, maždaug \({1}\,{\hbox {h}}\), kad būtų galima elektrochemiškai aptikti ds-DNR6. Kiekvienas matavimas apima mėginio, kuris bus tiriamas, išdavimą elektrodas\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), tada nuvalykite IPA sudrėkinta šluoste, prieš imdami kitą pavyzdį.vienas matavimas.Kiekvienas mėginys buvo išbandytas su 5 skirtingais elektrodais, jei nenurodyta kitaip.DPV ir CV matavimai buvo atlikti naudojant PalmSens Sensit Smart potenciostatą, o PSTrace programinė įranga buvo naudojama potenciostato konfigūravimui ir duomenų rinkimui, įskaitant didžiausios srovės skaičiavimus. Naudojami šie nustatymai. DPV ir CV matavimams:
DPV: pusiausvyros laikas = \(8\,\hbox {s}\), įtampos žingsnis = \(3\,\hbox {mV}\), impulso įtampa = \(25\,\hbox {mV}\) , impulso trukmė = \(50\,\hbox {ms}\), nuskaitymo dažnis = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Pusiausvyros laikas = \(8\,\hbox {s}\), Įtampos pakopa = \(3\,\hbox {mV}\), Sweep Rate = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
Didžiausios srovės, gautos iš DNR voltammogramų, kompleksuotų su \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV ir CV voltammogramos buvo gautos naudojant ENIG PCB elektrodus \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB kompleksuose su DNR (koncentracijos 10–\({20}\,{\ hbox {ng) }/{\upmu \hbox {l}}}\) ty 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(117\,\hbox {bp}\ ) ir 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(503\,\hbox {bp}\)). Reprezentacinės voltammogramos parodytos papildomos informacijos S1 paveiksle. 2 paveiksle parodyti rezultatai. DPV ir CV matavimų (didžiausios srovės), naudojant geliniu būdu išgrynintus PGR produktus. Palyginti su CV matavimais, DPV matavimai rodo didesnį jautrumą (srovę kaip DNR koncentracijos funkciją), nes CV matavimų foninės talpinės srovės slepia Faradaic sroves 26 . kiekviename langelyje yra 5 elektrodų matavimai. Visiems matavimams naudojamas tas pats elektrodų rinkinys, kad būtų išvengta matavimo klaidų dėl elektrodų skirtumų. Pastebėjome DPV ir CV išmatuotų didžiausių srovių didėjimo tendenciją esant mažesnei DNR koncentracijai , ilgesnis (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\, palyginti su \(117) ) fragmentu. Tai atitinka numatomą elektrodų adsorbcijos tendenciją, aprašytą ankstesniame darbe. MB-DNR komplekso adsorbcija palengvina krūvio perkėlimą ant elektrodo, o tai prisideda prie didžiausios srovės padidėjimo. Kiti tyrimai parodė oligonukleotidų dydžio ir sekos poveikį MB-DNR interkalacijai27,28,29,30.Guaninas -citozino (GC) kiekis dviejuose amplikonuose (\(117\,\hbox {bp}\) ir \(503\,\hbox {bp}\)) buvo maždaug 50%, o tai rodo, kad stebėjimas Skirtumas atsirado dėl iki amplikono ilgio. Tačiau didesnėms DNR koncentracijoms (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), \(503\,\hbox {bp} \) ir \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) \(117\,\hbox {bp}\)), stebime du pastiprinimus DPV ir CV matavimų metu sumažėja didžiausios subsrovių srovės. Taip yra todėl, kad MB prisotina ir įsiterpia tarp DNR bazinių porų, todėl MB31,32 redukuojamosios grupės redoksinis aktyvumas steriškai slopinamas.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
PGR pagrindiniuose mišiniuose esančios druskos trikdo elektrostatinę sąveiką tarp MB ir DNR, todėl pridedant \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) su \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB geliu išgrynintas produktas, skirtas ištirti druskos poveikį MB ir DNR sąveikai. Kaip parodyta 3 paveiksle, pastebėjome, kad esant didesnei DNR koncentracijai (\(>{2}\,{\) hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) ir \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) \(117\,\hbox {bp} \)), DPV ir CV Druskos pridėjimas neturėjo didelės įtakos matavimams (žr. S2 pav. Papildomoje informacijoje apie tipines voltammogramas). mažesnės DNR koncentracijos, druskos pridėjimas labai sumažina jautrumą, todėl srovės stiprumas reikšmingai nepasikeičia atsižvelgiant į DNR koncentraciją. Panašų neigiamą druskos poveikį MB-DNR sąveikai ir interkalacijai anksčiau pranešė kiti tyrinėtojai33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) katijonai jungiasi prie neigiamo DNR fosfato pagrindo ir taip trukdo elektrostatinei sąveikai tarp MB ir DNR. Esant didesnei DNR koncentracijai, sterinis redokso aktyvių MB slopinimas lemia mažesnes didžiausias sroves, todėl elektrostatinė sąveika neturi didelės įtakos jutiklio reakcijai. Svarbiausia yra tai, kad šis biojutiklis geriau tinka aptikti didesnes DNR koncentracijas (retai \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ar didesnes), Visiškai automatizuotam aplinkos vandens mėginių apdorojimui, kai PGR produktų gryninimas geliu gali būti neįmanomas.
Plotas po absorbcijos kreive bangų ilgių diapazone 600–700 \(\hbox {nm}\) įvairių koncentracijų DNR komplekse su \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) su druska ir be druskos (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) su druska ir be druskos (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) DNR koncentracijos, atitinkančios \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB mėginius DNR nėra.
Norėdami toliau patikrinti aukščiau pateiktus rezultatus, atlikome optinius matavimus naudodami UV/Vis spektrofotometrą (Thermo Scientific Multiskan GO), kiekvienam iš jų buvo naudojami mėginiai \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\). Matavimas. Sugerties parašas mažėja didėjant DNR koncentracijai, kaip matyti iš ploto po absorbcijos kreive tendencijos bangų ilgių diapazone \(600\,\hbox {nm}\) iki \(700\,\hbox { nm}\) , kaip parodyta 4 pav. (absorbcijos spektras parodytas S3 pav. Papildomoje informacijoje). Mėginiams, kurių DNR koncentracija mažesnė nei \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), nebuvo reikšmingo pasisavinimo skirtumo tarp DNR turinčių ir tik MB mėginių (\(503\,\hbox {bp}\) ir \(117\,\hbox {bp}\) ) ilgio fragmentai), rodantys, kad redokso aktyvaus MB sterinio slopinimo nėra. Esant didesnei DNR koncentracijai, pastebėjome laipsnišką absorbcijos signalo mažėjimą ir pastebėjome mažesnį absorbcijos sumažėjimą esant druskai. Šie rezultatai buvo priskirti molekulinei sąveika ir sterinis slopinimas su bazių kaupimu DNR hibriduose. Mūsų rezultatai atitinka literatūroje pateiktas ataskaitas apie spektroskopinius MB-DNR interkaliacijos tyrimus, kurie sieja hipochromatiškumą su sumažėjusiu energijos lygiu \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) elektroniniai perėjimai dėl interkalacijos 36, 37, 38 sluoksniai.
Phi6 fago agarozės gelio elektroforezė: \(117\,\hbox {bp}\) ir \(503\,\hbox {bp}\) ilgio PGR produktai iš ežero vandens mėginių.M-DNR žymuo;Kontrolė be šablono NTC, pradmenys, turintys atitinkamų amplikonų;PC teigiama kontrolė;1, 2, 3-neskiestas (1:1) ežero vandens mėginiai su spygliuočiais trimis egzemplioriais. Juosta matoma ties \(\apie 50\,\hbox {bp}\) dėl nepanaudotų oligonukleotidų \(503\,\) hbox {bp}\) juosta.
Jutiklio naudingumą įvertinome naudodami Powai ežero vandens mėginius su Phi6 fagu. RNR koncentracijos, išskirtos iš fagų sukeltų vandens mėginių, svyravo nuo 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), o išskirtos iš išgrynintų fagų suspensijų. Apskaičiuota, kad RNR yra \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\), o atkūrimo efektyvumas yra maždaug 1 %.RNR buvo atvirkštinė transkribuota į cDNR ir naudojama kaip šablonas PGR ir qPGR. Produkto dydis buvo patvirtintas agarozės gelio elektroforeze (5 pav.) Prieš atliekant bandymą su jutikliu. Šie mėginiai nėra išgryninti geliu, todėl juose yra visi PGR komponentai Taip pat dominantys amplikonai. Įrodyta, kad qPCR metu užfiksuotos Ct reikšmės (1 lentelė) koreliuoja su RNR, išskirtos iš atitinkamų vandens mėginių su spygliuočiais, koncentracija. Ct vertė parodo ciklų, reikalingų fluorescenciniam signalui pasiekti, skaičių. viršyti slenkstį arba foninį signalą.Didesnės Ct reikšmės rodo mažesnes šablono koncentracijas ir atvirkščiai.NTC mėginių Ct vertės buvo tokios didelės, kaip ir tikėtasi. \(\apytiksliai 3\) Ct verčių skirtumas tarp teigiama kontrolė ir tiriamasis mėginys taip pat rodo, kad kiekviename tiriamajame mėginyje yra maždaug 1 % šablono, palyginti su teigiama kontrole. Anksčiau aptarėme, kad ilgesni amplikonai padidina jautrumą. Ilgesnių fragmentų, išskirtų iš nevienalyčių aplinkos mėginių, amplifikacija yra sudėtinga, atsižvelgiant į trūkumus mažos viruso koncentracijos ir RNR skilimo. Tačiau su mūsų viruso praturtinimo ir PGR amplifikacijos protokolu mums pavyko sėkmingai amplifikuoti \(503\,\hbox {bp}\) fragmentą elektrocheminiam jutimui.
6 paveiksle parodyti \(503\,\hbox {bp}\) fragmento amplikono elektrocheminio jutiklio rezultatai, naudojant neskiestą cDNR kaip šabloną (1:1), o kaip šabloną 100 kartų praskiestą cDNR (1:100), atliktą PGR. , palyginti su NTC ir PC (žr. S4 paveikslą papildomoje informacijoje apie reprezentatyvias voltammogramas). Kiekviename langelyje 6 paveiksle yra trijų mėginių matavimai, esant 5 elektrodams. Tie patys elektrodai buvo naudojami visiems mėginiams matuoti, kad būtų išvengta klaidų dėl elektrodo. Skirtumas nuo elektrodo iki elektrodo.Palyginti su CV matavimais, DPV matavimai rodo geresnę skiriamąją gebą, kad būtų galima atskirti bandomuosius ir asmeninio kompiuterio pavyzdžius nuo NTC, nes, kaip minėta anksčiau, Faradaic srovės yra paslėptos dėl pastarųjų foninių talpinių srovių. Ilgesnių amplikonų atveju pastebėjome, kad neigiama kontrolė (NTC) lėmė didesnes CV ir DPV didžiausias sroves, palyginti su teigiama kontrole, o teigiami ir neskiesti bandiniai parodė panašų DPV smailių srovių aukštį. Išmatuotos vidutinės ir vidutinės vertės kiekvienam neskiesti (1:1) ) tiriamąjį mėginį ir kompiuterį galima aiškiai atskirti pagal NTC mėginio jutiklio išvestį, o 1:100 praskiesto mėginio skiriamoji geba yra ne tokia ryški. 100 kartų praskiedus cDNR, gelio elektroforezės metu nepastebėjome jokių juostų (juostos neparodytos 5 paveiksle), o atitinkamos DPV ir CV didžiausios srovės buvo panašios į tas, kurių tikimasi NTC. Fragmento \(117\,\hbox {bp}\) rezultatai pateikti papildomoje informacijoje. kontrolė sukėlė elektrocheminį PCB jutiklio atsaką dėl laisvos MB adsorbcijos ant elektrodo ir MB sąveikos su vienos grandinės pradmenų oligonukleotidu. Todėl kiekvieną kartą, kai tiriamas mėginys, turi būti atlikta neigiama kontrolė ir didžiausia tiriamojo mėginio srovė, palyginti su didžiausia srove, gauta naudojant neigiamą kontrolę, kad būtų pasiektas diferencinis (santykinis) matavimas39,40, kad tiriamasis mėginys būtų klasifikuojamas kaip teigiamas arba neigiamas.
(a) DPV ir (b) CV didžiausia srovė, skirta elektrocheminiam \(503\,\hbox {bp}\) fragmentų aptikimui ežero vandens mėginiuose. Bandomieji mėginiai buvo matuojami trimis egzemplioriais ir lyginami su be šablono kontrolėmis (NTC) ir teigiamos kontrolės (PC).
Mūsų išvados iliustruoja skirtingus mechanizmus, turinčius įtakos elektrocheminių jutiklių veikimui skirtingo ilgio amplikonams skirtingoms DNR, o koncentracijos patikrintos optiniais matavimais naudojant UV/Vis spektrofotometrą. Mūsų stebėjimai pabrėžia įžvalgą, kad ilgesni DNR fragmentai iki \(\approx\) \(500\,\hbox {bp}\) galima aptikti esant didesniam jautrumui ir kad druskos buvimas mėginyje nėra jautrus DNR koncentracija, kuri turi įtakos didesniam jautrumui (retai \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ir aukščiau). Be to, ištyrėme įvairių tipų mėginių, įskaitant geliu išgrynintus amplikonus su pridėta druska ir be jos, ir ežero vandens mėginių pridėjimą DPV ir CV matavimuose.Pastebėjome, kad DPV suteikė geresnę skiriamąją gebą, nes foninė talpinė srovė taip pat turi įtakos CV matavimui, todėl jis yra mažiau jautrus.
Ilgesnių fragmentų amplifikacija priklauso nuo viruso genominės RNR vientisumo. Keletas tyrimų parodė, kad ilgesnių fragmentų amplifikacija ne visada yra efektyvi dėl RNR degradacijos aplinkoje ir galimo splaisingo išskyrimo metu11,41,42,43,44 .Pastebėjome, kad PEG pagrindu sukurtas viruso koncentracijos metodas buvo veiksmingesnis koncentruojant fagą Phi-6, esantį ežero vandens mėginiuose, nei aliuminio hidroksido pagrindu sukurtas viruso koncentracijos metodas. Galimybė aptikti ilgus DNR fragmentus įveikė daugkartinio PGR poreikį. sustiprinti kelis trumpesnio ilgio šablonus ir sumažinti kryžminio specifiškumo galimybę.
Biologinių mėginių yra nedaug, todėl reikia sukurti biojutiklį, kuriam tirti reikia minimalių mėginių. Šiame tyrime naudojamiems ENIG PCB elektrodams reikėjo tik \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) mėginiai, skirti tirti, kad būtų padengtas efektyvus elektrodų plotas. Be to, tą patį elektrodą galima pakartotinai panaudoti išvalius prieš išduodant kitą mėginį. Į amplifikuotus mėginius nereikia dėti jokių kitų cheminių medžiagų, išskyrus metileno mėlynąjį, kuris yra nebrangus ir dažniausiai naudojama cheminė medžiaga.Kadangi kiekvieno elektrodo gamyba kainuoja apie 0,55 USD (arba 40 INR), šis biojutiklis gali būti ekonomiškai efektyvi alternatyva esamoms aptikimo technologijoms.2 lentelėje parodytas šio darbo palyginimas su kitais literatūroje aprašytais jutikliais. DNR fragmentai heterogeniniuose mėginiuose.
Atsižvelgiant į tai, kad MB pagrįsti elektrocheminio aptikimo protokolai priklauso nuo PGR specifiškumo, pagrindinis šio metodo apribojimas yra nespecifinio amplifikacijos galimybė heterogeniniuose mėginiuose, tokiuose kaip nuotekos ir ežero vanduo, arba naudojant mažo grynumo pradmenis. elektrocheminiai aptikimo metodai, skirti DNR aptikti neišgrynintus PGR produktus naudojant nemodifikuotus ENIG PCB elektrodus, būtina geriau suprasti nepanaudotų dNTP ir pradmenų daromas klaidas bei optimizuoti reakcijos sąlygas ir tyrimo protokolus. Papildomi fizikiniai ir cheminiai parametrai, tokie kaip pH, temperatūra ir biologiniai Taip pat gali prireikti išmatuoti vandens mėginio deguonies poreikį (BDS), kad būtų pagerintas matavimo tikslumas.
Apibendrinant, siūlome nebrangų elektrocheminį ENIG PCB jutiklį virusų aptikimui aplinkos (ežero vandens) mėginiuose. Skirtingai nuo imobilizuotų oligonukleotidinių elektrodų ar pritaikytų substratų DNR aptikimui, kuriems reikalingas kriogeninis saugojimas, kad būtų išlaikytas jautrumas,53,54 mūsų technikoje naudojamas nemodifikuotas PCB. elektrodai, kurių galiojimo laikas ilgesnis ir nėra specifinių laikymo reikalavimų, todėl tinka matavimo sprendimams su automatizuotu mėginių apdorojimu, įdiegtu LMIC, kurti.Biojutiklis naudoja nebrangius DNR interkaluojančius redokso dažus (MB), kad būtų galima greitai aptikti tikslinius amplikonus.Nespecifinis amplifikavimas dažnas aplinkos mėginiuose sumažina šio jutimo metodo specifiškumą dėl nespecifinio MB prisijungimo prie viengrandžių ir dvigrandžių oligonukleotidų.Todėl šio tyrimo specifiškumas priklauso nuo pradmenų optimizavimo ir PGR reakcijos sąlygų.Be to, CV ir DPV didžiausios srovės, gautos iš tiriamų mėginių, turėtų būti aiškinamos atsižvelgiant į atsakus, gautus iš neigiamos kontrolės (NTC) kiekvienam bandymui. Šiame darbe pateikti elektrocheminių jutiklių dizainai ir metodai gali būti integruoti su automatiniais mėginių ėmikliais, kad būtų sukurtas visiškai automatizuotas ir žemas - kainuojantis sprendimas, galintis rinkti ir analizuoti mėginius ir belaidžiu būdu perduoti rezultatus atgal į laboratoriją.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Pradinės virusų koncentracijos iš vandens mėginių metodai: naujausių tyrimų apžvalga ir metaanalizė.J.Taikymas.mikroorganizmas.115, p. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Vandenyje plintantys virusai: saugaus geriamojo vandens barjerai.PLoS Patogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. ir kt.. Nuotekų epidemiologija, skirta ekonomiškai efektyviam didelio masto COVID-19 stebėjimui mažas ir vidutines pajamas gaunančiose šalyse: iššūkiai ir galimybės. Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nukleino rūgšties elektrochemija. Cheminė. Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN. Metileno mėlynasis kaip elektrocheminis viengrandžių ir dvigrandžių oligonukleotidų, imobilizuotų ant aukso substratų, diskriminatorius. Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Katijonų ir anijonų interkalatorių, skirtų DNR hibridizacijos elektrocheminiam perdavimui ilgo nuotolio elektronų pernešimo būdu, palyginimas.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Krūvio perdavimas per DNR: selektyvus elektrocheminis DNR biosensorius.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH ir kt. Realaus laiko PGR mikrofluidinis prietaisas su vienu metu vykstančiu elektrocheminiu aptikimu.biologinis jutiklis.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY ir kt. Elektrocheminės realaus laiko PGR sistemos, pagrįstos metileno mėlynojo sąveika su DNR, signalizacijos mechanizmo tyrimas ir veikimo patikrinimas. Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Kilpinis izoterminis stiprinimas pagrįstas elektrocheminis jutiklis, skirtas aptikti sars-cov-2 nuotekų mėginiuose.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Elektrocheminis SARS-CoV-2 amplikonų aptikimas PCB elektrodais.Jutiklis suaktyvinamas.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Efektyvus SARS-CoV-2 RNR aptikimas nuotekų kietojoje frakcijoje.mokslas.bendra aplinka.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al. Analitiniai metodai SARS-CoV-2 aptikimui nuotekose: protokolas ir ateities perspektyvos. TraC tendencijų analizė. Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Apgaubto bakteriofago Phi6 (SARS-CoV-2 surogato) išgyvenimas išgaruotuose seilių lašeliuose, nusėdusiuose ant stiklo paviršių.mokslas.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ SARS-CoV-2 surogato (Phi6) išlikimas aplinkoje laisvai gyvenančiose amebose.J.Vandens sveikata 20, 83 (2021).
Mindich, L. Tikslus trijų genominių dvigrandinio RNR bakteriofago fragmentų įpakavimas\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ ir Bamford, Antrinė DH RNR fago\(\varphi\)6 pakavimo regiono struktūra.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – greitas ir efektyvus bakteriofagų laboratorinių atsargų paruošimo protokolas.PeerJ 4, e2261 (2016).
Paskelbimo laikas: 2022-05-27