Merci fir besicht Nature.com.D'Browserversioun déi Dir benotzt huet limitéiert Ënnerstëtzung fir CSS.Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech en aktualiséierten Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten).An der Tëschenzäit, fir sécherzestellen. weider Ënnerstëtzung, wäerte mir de Site ouni Stiler a JavaScript affichéieren.
D'Wichtegkeet vun der Iwwerwaachung vun Ëmweltproben ass zënter dem Ufank vun der COVID-19 Pandemie immens appréciéiert ginn, an e puer Iwwerwaachungsefforte gi mam Goldstandard ausgefouert, obwuel qPCR-baséiert Techniken deier sinn. Léisung fir d'Iwwerwaachung vun Ëmweltwaasserproben an niddereg- a mëttleren Akommeslänner.An dëser Aarbecht demonstréiere mir d'elektrochemesch Detektioun vun Amplikonen, déi aus Phi6 Phage kritt goufen, isoléiert aus spiked Séi Waasserproben (e populäre Surrogat fir SARS-CoV-2), mat ENIG PCB Elektroden ouni Uewerfläch Modifikatioun komplett.Geschlecht.D'elektrochemesch Sensorreaktioun gouf grëndlech charakteriséiert fir zwee DNA Fragmenter vu verschiddene Längt (\({117}\,\hbox {bp}\) an \({503}\,\hbox {bp}\)), an de Effet vun Salzer an PCR Master Mixen op methylene blo (MB)-DNA Interaktiounen.Eis Resultater weisen, datt d'Längt vun DNA Fragmenter bedeitend d'elektrochemical Empfindlechkeet bestëmmt a beweisen an dëser Aarbecht, datt d'Fähegkeet laang amplicons ouni gel purification vun PCR Produiten z'entdecken ass. wichteg fir in situ Miessung vun Waasser Echantillon.Eng voll automatiséiert Léisung fir viral Belaaschtung ass gutt.
Waterborne Virus Iwwerdroung ass bekannt als eng ëffentlech Gesondheetsrisiko zënter den 1940er Joren, mat den éischte Beweiser fir iwwer Waasser iwwerdroen Iwwerdroung vu Polio an Hepatitis E1. Detektiounsmethoden vertrauen op Gold-Standard qPCR-baséiert Techniken, déi héich sensibel a spezifesch sinn, awer qualifizéiert Personal erfuerderen fir am Labo mat deier Instrumenter ze testen.Allerdéngs an niddereg- a mëttleren Akommeslänner (LMICs) mat limitéierten Ressourcen, Mënsch Echtzäit Iwwerwaachung vu Waasser- an Ofwaasserproben an niddreg- a mëttleren Akommeslänner als fréi Warnunge fir opkommend Krankheetsausbréch, sinn alternativ Low-Cost-Methoden néideg doduerch datt se vun de schwéieren sozioekonomeschen Auswierkunge vun der Viruspandemie schützen.Low-Cost elektrochemesch Biosensoren fir Nukleinsäuren kéinten eng verspriechend potenziell Léisung fir dësen onerfëllte Bedierfnes ubidden.Vill vun dësen DNA Biosensoren funktionnéieren duerch d'Tatsaach datt komplementär DNA Strécke op der Elektrode immobiliséiert sinn. Surface and hybridize when a matching sequence is present in the sample.Dëst kann dann duerch verschidden elektrochemesch Techniken an e Signal ëmgewandelt ginn mat Redoxvermëttler wéi Kalium Eisen/Ferrocyanid.Methylene Blue (MB) is one such redox-active molecule, which has gouf gemellt fir an duebelstrengeg DNA (dsDNA) ze interkaléieren zousätzlech zu senger méi net spezifescher Bindung un eenzegstrengeg DNA5,6. Sensor Configurations5,6,7,8,9.Obwuel d'Interkalatioun vu MB op DNA net spezifesch ass, an d'Spezifizitéit vun dësem elektrochemesche Sensor hänkt haaptsächlech vun der Rengheet vun de Primer of, déi fir PCR oder isothermesch Verstäerkung benotzt ginn, ass et gutt fir d'Ëmsetzung vun echtem -Zäit elektrochemesch-baséiert qPCR oder fluorescence isothermesch amplification als Alternativ zu DNA Konzentratioun Miessung 9 .An engem esou Ëmsetzung, Won et al.D'Uewerfläch vun Gold Elektroden war mat 6-mercapto-1-hexanol (MCH) fir real-Zäit geännert. Miessung vun PCR amplicons mat MB benotzt Differential Pulsatiounsperiod Voltammetrie (DPV)9.An anere Fäll, Ramirez et al.Detection vun SARS-CoV-2 am Ofwaasser duerch RT-LAMP Reaktioun benotzt MB mat Écran-gedréckt electrodes.Platin Elektroden hunn och goufen benotzt wéi in situ Elektroden an engem microfluidic PCR Plattform entworf amplicons während Reaktiounen elektrochemically z'entdecken 8 . All dës Studien verlaangen Uewerfläch Modifikatioun vun der Elektroden, implizéiert erhéicht Produktioun an Betribssystemer Käschten wéinst speziell Stockage Ufuerderunge fir d'Stabilitéit vun dësen funktionaliséiert Elektroden.
Schema vum Workflow fir elektrochemesch Detektioun vun Amplikonen, déi aus konzentréierte virale Partikelen a Séiwaasserproben kritt goufen.
Mir hunn viru kuerzem elektrochemesch Senséierung vu SARS-CoV-2 Amplikone mat Low-Cost Printed Circuit Board (PCB) Elektroden bewisen baséiert op DPV a cyclescher Voltammetrie (CV) induzéiert duerch Adsorptioun vu MB-DNA Komplexen op der Uewerfläch vun onverännert Elektroden ) Ännerungen am Peak aktuell 11.Mir berichten datt méi laang DNA Fragmenter (N1-N2, \({943}\, \hbox) geformt mat den CDC-recommandéierten N1 Forward an N2 Reverse Primer am Verglach mat méi kuerze Fragmenter {bp}\)) besser Linearitéit an der Sensorreaktioun gewisen hunn. ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) geformt mat N1 Forward an N1 Reverse Primer Sets. Dës Studie ginn gemellt mat DNA Verdünnungen, déi an nukleasefräi Waasser virbereet sinn. D'Plattform gouf och benotzt fir SARS-CoV z'entdecken. -2 Amplikonen a simuléierten Ofwaasserproben (kréien duerch Spiking total RNA Echantillon mat SARS-CoV-2 RNA). Well d'RNA ufälleg ass fir ze schneiden wärend der Isolatioun an der Downstream Veraarbechtung,12,13 ass et schwéier méi laang Fragmenter mat dëser heterogener Probe ze verstäerken. Dofir ass d'Demonstratioun vun der elektrochemescher Sensatioun vum SARS-CoV-2 Amplikon am Ofwaasser limitéiert op dat méi kuerz \(72\,\hbox {bp}\) N1 Fragment.
An dëser Aarbecht, ënnersicht mir d'Machbarkeet vun ENIG PCB-baséiert elektrochemesch Sensatioun vun Phage Phi6 konzentréiert an isoléiert aus Séi Waasser Echantillon (Fig. 1). hunn och eng Lipidmembran an e Spikeprotein.Aus dëse Grënn ass Bakteriophage Phi6 e populäre Surrogat fir SARS-CoV-2 an aner enveloped pathogene RNA Virussen14,15.RNA isoléiert aus Phagepartikelen gouf als Schabloun fir cDNA Synthese benotzt gefollegt vun PCR fir zwee DNA Fragmenter vun 117 an 503 Basepairen an der Längt ze kréien.Gen the challenge of amplifying \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 fragments in our previous work, we target intermediate length fragments (\(117) \,\hbox {bp}\) an \(503 \,\hbox {bp}\)), baséiert op verfügbare Primer.D'elektrochemesch Sensorreaktioun gouf systematesch iwwer eng breet Konzentratiounsberäich studéiert (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) bis \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Fir béid Fragmenter an d'Präsenz vu MB, den Effekt vum Salz op d'Sensorreaktioun gouf duerch spektrofotometresch Miessunge charakteriséiert a Kräizvalidéiert. D'Haaptbeiträge vun dëser Aarbecht sinn wéi follegt:
DNA Fragmentlängt an d'Präsenz vu Salz an der Probe beaflossen d'Sensibilitéit staark.Eis Resultater weisen datt d'elektrochemesch Aktivitéit vu verschiddene Mechanismen vun der Interaktioun vu MB, DNA an dem Sensor an der voltammetrescher Äntwert hänkt, ofhängeg vun der DNA Konzentratioun a Längt, mat méi laang Fragmenter weisen méi héich Sensibilitéit, obwuel Salz en negativen Effekt op elektrostatesch Interaktiounen tëscht MB und DNA.
D'DNA Konzentratioun bestëmmt de Mechanismus vun der MB-DNA Interaktioun an onverännert Elektroden Mir weisen datt verschidde Mechanismen vun der MB-DNA Interaktioun vun der DNA Konzentratioun ofhängeg sinn. {l}}}\), hu mir observéiert datt d'elektrochemesch Stroumreaktioun haaptsächlech duerch d'Adsorptioun vu MB-DNA op der Elektrode bestëmmt gouf, während bei méi nidderegen Konzentratioune bei héijen DNA Konzentratioune déi elektrochemesch Stroumreaktioun duerch d'steresch Hemmung vum Redox bestëmmt gouf. Aktivitéit wéinst MB-Insertioun tëscht DNA-Basispaaren.
ENIG PCB-baséiert Electrochemical Sensing vu Viral Nukleinsäuren an Lake Water Samples Resultat Phage.
Niddereg Käschte vun der Implementatioun a Potenzial fir Integratioun a voll automatiséierter Iwwerwaachungssystemer, Oligonukleotiden oder Aptameren op Elektroden mat méi laanger Haltbarkeet.
Phage Phi6 ass en enveloped dsRNA Virus vun der Cytoviridae Famill déi Pseudomonas syringae infizéiert. De Genom vu Phi6 Phage existéiert a Form vun 3 Fragmenter: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) a L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Well de Phi6 Phage en net-pathogene BSL-1 Pseudomonas Stamm infizéiert, ass et sécher ze benotzen a kann einfach am Labo ugebaut ginn.Phage Phi6 and its host Pseudomonas syringae were purchased from the Felix d'Herelle Reference Center for Bacterial Viruses, Laval University, Canada (Reference Center Catalog Numbers are HER-102 and HER-1102, respectively) .Phi6 phage a seng Provider goufen erëmbelieft wéi vun der Referenz center.Phage Phi6 war vun Platen lysis an elution gereinegt Finale titers mat \ (\ ongeféier 10 ^ {12} \, {\ hbox {PFU} / \ hbox {) ml}}\) (Plaqueforming Eenheeten/ Milliliter).RNA gouf aus gereinegten Phagepartikelen isoléiert mat dem GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) no den Instruktioune vum Hiersteller. Kuerz gesot, eng gereinegt Phage Phi6 Suspension\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) gouf lyséiert an d'Lysat gouf op eng Spin-Kolonn gelueden fir datt RNA sech un d'Harzkolonne binde kann.D'RNA gëtt dann an der Elutiounsléisung \({{) 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) vum Kit zur Verfügung gestallt.Estiméiert d'Konzentratioun vu RNA duerch Absorptioun bei \(260\,\hbox {nm}\).RNA gouf an Aliquoten an \ gespäichert. ({-80}\,{^{\circ}\hbox {C}}\) bis weider Gebrauch.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Den iScript cDNA Synthesis Kit (Bio) -Rad Laboratories) gouf als Schabloun fir cDNA Synthese benotzt no den Instruktioune vum Hiersteller. Kuerz gesot, eng cDNA Synthese Reaktioun besteet aus 3 Schrëtt: priming bei \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , ëmgedréint Transkriptioun vun \({20}\,{\hbox {min}}\) bei \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), an ëmgedréint De Recorder ass an \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) fir \({1}\,{\hbox {min. }}\).Wann op engem 1% Agarosegel lafen, huet d'cDNA dräi Bands gewisen, déi zu den erwaarten dräi RNS Fragmenter entspriechen (Daten net gewisen). benotzt cDNA als Schabloun fir PCR an engem miniPCR® mini8 thermesche Cycler:
D'Primer fir \(117\,\hbox {bp}\) an \(503\,\hbox {bp}\) entspriechen 1476-1575 Nukleotiden vum M Segment respektiv 458-943 Nukleotiden vum L Segment, respektiv Säure .All amplified PCR Produite sech op 1% agarose gels electrophoresed, an amplified Zil-DNA gouf mat der GeneJET Gel Extraktioun Kit (Thermo Fisher Wëssenschaftlech) gereinegt.
E Séi um IIT Mumbai Campus (Powai Lake, Powai, Mumbai) gouf benotzt fir Phagepartikelen ze addéieren. D'Séi Waasser gouf duerch eng \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) Membran gefiltert fir ze läschen suspendéiert Partikelen, an dunn gouf de Phi6 Phage derbäigesat. \({1}\,{\hbox {ml}}\) vun \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} derbäisetzen \) op \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) gefiltert Séiwaasser, an \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\).E klengen Aliquot gouf Mir hunn zwou verschidde Methoden getest fir spiked Phi6 Viruspartikelen ze konzentréieren: (1) d'Aluminiumhydroxid-Adsorptioun-Nidderschlagsmethod,19 déi fir d'Konzentratioun vu verschiddene enveloped RNA Viren aus Ëmweltproben validéiert gouf, an (2) ) D'polyethylene glycol (PEG)-baséiert Virus Konzentratioun Method war vun Flood et al ugepasst.20 .Zënter datt d'Erhuelungseffizienz vun der PEG-baséierter Method besser fonnt gouf wéi déi vun der Aluminiumhydroxid-Methode, gouf d'PEG-baséiert Method benotzt fir Phi6-Partikelen aus Séi Waasserproben ze konzentréieren.
D'PEG-Methode, déi benotzt gouf, war wéi follegt: PEG 8000 a \(\hbox {NaCl}\) goufen op Phi6-gespeckte Séi Waasserproben bäigefüügt fir 8% PEG 8000 an \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\). Echantillon goufen op engem Shaker inkubéiert\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), dann centrifugéiert op \(4700 \,\hbox {g}\) ass \({45}\,{\hbox {min}}\).D'Supernatant ewechhuelen an de Pellet resuspendéieren an \({1}\, {\hbox {ml}}\) am selwechte Supernatant.All Spiking- a Viruskonzentratiounsexperimenter goufen an triplicate gemaach.No der Konzentratioun gouf e klengen Aliquot reservéiert fir d'Messung vun der Erhuelungseffizienz duerch Plaque assay.RNA isoléiert wéi virdru beschriwwen an eluéiert am Kit geliwwert Elutiounsbuffer\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\).Zënter datt d'RNA Konzentratioun vu Probe zu Probe an Triplikat variéiert, ass den \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) vun RNA gëtt fir all dräi benotzt onofhängeg vun hirer Konzentratioun cDNA Synthes vun Echantillon.cDNA Synthes gouf gemaach wéi virdrun beschriwwen.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA gouf als Schabloun fir \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR fir 35 Zyklen benotzt fir \ (117\,\hbox {bp}\) an \(503\,\hbox {) bp}\) Fragmenter. Dës Echantillon ginn als "1:1" duergestallt, also ouni Verdünnung. Eng No-Schabloun Kontroll (NTC) gouf als negativ Kontroll opgestallt, während e cDNA synthetiséiert mat RNA isoléiert aus gereinegt Phage opgeriicht gouf. als Schabloun fir eng positiv Kontroll (PC).Quantitative PCR (qPCR) gouf an engem Stratagene Mx3000P RT-PCR Instrument mat Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies) gemaach. beschriwwen.The cycle threshold (Ct) was recorded for all samples.Audit, déi verdënntem Echantillon waren \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) benotzt cDNA verdënntem 1:100 am gefiltert Séi Waasser wéi \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR fir 35 Zyklen. Dës Echantillon ginn als "1:100" duergestallt.
D'PCB Elektroden ginn fabrizéiert mat engem kommerziell verfügbare Low-Cost Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) Prozess ouni de Besoin fir zousätzlech Goldplating.ENIG PCB Elektroden Spezifikatioune sinn an eisem fréiere Work11.Fir ENIG PCB Elektroden, traditionell Elektrodenreinigungsmethoden wéi z. Piranha Léisung oder Schwefelsäure zyklesch Voltammetrie sinn net recommandéiert well se d'Peelung vun der dënnter Goldschicht verursaache kënnen (Dicke \(\approx\) \(100\,\hbox {nm}\)) an déi ënnerierdesch Kupferschichten exponéieren, déi ufälleg sinn zu corrosion 21, 22, 23, 24, 25.Dofir botzen d'Elektroden mat engem flauscheg Stoff befeuchtt mat IPA.D'Probe fir ze testen gouf mat \({50}\,{\upmu \hbox {M} inkubéiert. }\) MB an \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({1}\,{\hbox {h}}\) fir einfach Insertion.An eisem fréiere Wierk , Mir hunn observéiert datt d'Sensibilitéit an d'Linearitéit vum Sensor verbessert goufen duerch d'Erhéijung vun der MB Konzentratioun 11 .Baséiert op Optimisatiounen, déi an eiser fréierer Aarbecht gemellt goufen, hu mir \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB benotzt Konzentratioune fir DNA an dëser Etude ze embed.Electrochemical Detection of double-stranded DNA (ds-DNA) can be achieved using anionic or cationic intercalators.Obwuel anionesch Interkalatoren DNA mat enger besserer Selektivitéit erkennen, erfuerderen se Iwwernuechtungsinkubatioun, wat zu méi laangen Detektiounszäiten resultéiert.Op op der anerer Säit, kationesch Interkalatoren wéi MB erfuerderen méi kuerz Inkubatiounszäiten, ongeféier \({1}\,{\hbox {h}}\) fir elektrochemesch Detektioun vun ds-DNA6. Elektrode\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), dann botzt mat engem IPA-befeuchtte Stoff, ier Dir mat enger anerer Probe weidergeet.eng Moossnam.All Probe gouf op 5 verschidden Elektroden getest, ausser anescht uginn. DPV- a CV-Miessunge goufen mat engem PalmSens Sensit Smart Potentiostat gemaach, an PSTrace Software gouf fir Potentiostatkonfiguratioun an Datenacquisitioun benotzt, dorënner Peakstroumberechnungen. Déi folgend Astellunge gi benotzt. fir DPV an CV Miessunge:
DPV: Gläichgewiicht Zäit = \(8\,\hbox {s}\), Volt Step = \(3\,\hbox {mV}\), Pulsspannung = \(25\,\hbox {mV}\) , Pulsdauer = \(50\,\hbox {ms}\), Scanrate = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Gläichgewiicht Zäit = \(8\,\hbox {s}\), Volt Schrëtt = \(3\,\hbox {mV}\), Sweep Rate = \({300}\,\hbox {mV/ s) }\)
Peakstroum kritt aus Voltammogramme vun DNA komplexéiert mat \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV an CV Voltammogramme goufen op ENIG PCB Elektroden kritt \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB komplexéiert mat DNA (bei Konzentratioune vun 10-\({20}\,{\ hbox {ng) }/{\upmu \hbox {l}}}\) dh 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) fir \(117\,\hbox {bp}\) an 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) fir \(503\,\hbox {bp}\)).Representativ Voltammogramme ginn an der Figur S1 an der Ergänzungsinformatioun gewisen.Figur 2 weist d'Resultater. vun DPV- a CV-Miessungen (Peakstroum) mat gel-gereinigten PCR-Produkter.Am Verglach mat CV-Miessunge weisen DPV-Miessungen méi héich Sensibilitéit (Stroum als Funktioun vun der DNA-Konzentratioun), well d'Hannergrondkapazitivstréim bei CV-Miessungen Faradaesch Stréimunge verstoppen 26 .D'Daten fir all Këscht am Boxplot enthält Miessunge vu 5 Elektroden.All Miessunge benotzen deeselwechte Set vun Elektroden fir Moossfehler wéinst der Elektrode-zu-Elektrode-Variatioun ze vermeiden.Mir hunn e wuessenden Trend an DPV a CV gemoossene Spëtzestréim fir méi niddereg Konzentratioune vun DNA observéiert. , méi laang (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ am Verglach zum \(117) ) Fragment. Dëst ass konsequent mam erwaarten Trend vun der Elektrodenadsorptioun, déi an eisem fréiere Wierk gemellt gouf. d'Adsorptioun vum MB-DNA-Komplex erliichtert de Ladungstransfer op der Elektrode, wat zu der Erhéijung vum Spëtztraum bäidréit.Aner Studien hunn den Effekt vun der Oligonukleotidgréisst an der Sequenz op MB-DNA-Interkalatioun27,28,29,30.D'Guanin gewisen. -Cytosin (GC) Inhalt vun den zwee Amplikonen (\(117\,\hbox {bp}\) an \(503\,\hbox {bp}\))) war ongeféier 50%, wat beweist datt d'Observatioun Den Ënnerscheed ass wéinst zu Amplikonlängt.Awer fir méi héich DNA Konzentratioune (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), fir \(503\,\hbox {bp} \) an \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) fir \(117\,\hbox {bp}\)), beobachten mir zwou Verstäerkungen. Peak Stréimunge vun den Subs sinn a béid DPV an CV Miessunge reduzéiert. Dëst ass well MB saturéiert an intercaléiert tëscht Basispaar vun DNA, wat zu enger sterescher Hemmung vun der Redoxaktivitéit vun der reduzéierbarer Grupp am MB31,32 resultéiert.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Salze präsent an PCR Master Mixen interferéieren mat elektrostateschen Interaktiounen tëscht MB an DNA, also andeems Dir \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) mat \({50} \,{\ derbäigesat) upmu \hbox {M}}\) MB gel-purifizéiert Produkt fir den Effekt vu Salz op MB-DNA Interaktioun ze studéieren. Wéi an der Figur 3 gewisen, hu mir observéiert datt fir méi héich DNA Konzentratioune (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) an \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) fir \(117\,\hbox {bp} \)), an DPV a CV D'Zousätz vu Salz huet d'Miessungen net wesentlech beaflosst (kuckt Figur S2 an Ergänzungsinformatiounen fir representativ Voltammogramme). manner DNA Konzentratioune, d'Zousätzlech vu Salz reduzéiert d'Sensibilitéit staark, wat zu keng bedeitend Ännerung am Stroum mat der DNA Konzentratioun resultéiert. Ähnlech negativ Auswierkunge vu Salz op MB-DNA Interaktiounen an Interkalatioun goufen virdru vun anere Fuerscher gemellt33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) Katione binden un den negativen Phosphat-Réckgrat vun der DNA, doduerch d'elektrostatesch Interaktioun tëscht MB an DNA behënnert. Bei méi héijen DNA Konzentratioune féiert d'steresch Hemmung vun redoxaktiven MBs zu méi nidderegen Spëtzestréim, also elektrostatesch Interaktiounen. d'Sensorreaktioun net wesentlech beaflossen.De Schlësselpunkt ass datt dëse Biosensor besser ass fir méi héich DNA Konzentratioune z'entdecken (selten \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) oder méi héich), fir voll- Automatiséiert Veraarbechtung vun Ëmwelt- Waasser Echantillon, wou Gel Offäll vun PCR Produite vläicht net machbar sinn.
Gebitt ënner der Absorptiounskurve fir d'Wellenlängtberäich 600–700 \(\hbox {nm}\) fir verschidde Konzentratioune vun DNA komplexéiert mat \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a ) \(503\,\hbox {bp}\) mat an ouni Salz (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) mat an ouni Salz (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) DNA Konzentratioune entspriechend \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB Proben Keng DNA.
Fir déi uewe genannte Resultater weider z'iwwerpréiwen, hu mir optesch Miessunge mat engem UV/Vis Spektrofotometer (Thermo Scientific Multiskan GO) gemaach, d'Proben \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) goufen fir all Miessung.D'Absorptiounssignatur fällt mat der Erhéijung vun der DNA Konzentratioun erof, wéi aus dem Trend vun der Géigend ënnert der Absorptiounskurve fir d'Wellenlängtberäich \(600\,\hbox {nm}\) bis op \(700\,\hbox { nm}\), wéi an der Fig. 4 gewisen (Absorptiounsspektrum an der Fig. S3 an der Ergänzungsinformatioun).Fir Proben mat DNA Konzentratioune manner wéi \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), gouf et kee signifikanten Ënnerscheed an der Opnahm tëscht DNA-enthaltende Proben an nëmmen MB Proben (fir \(503\,\hbox {bp}\) an \(117\,\hbox {bp}\ ) Längt Fragmenter), déi d'Feele vun steric inhibition vun redox-aktiv MB besot.Bei méi héich DNA Konzentratioune, observéiert mir eng graduell Ofsenkung vun der absorbance Signal a bemierken eng manner Ofsenkung vun absorbance an der Präsenz vun Salz. Dës Resultater goufen zu molekulare zougeschriwwen. interactions and steric inhibition with base stacking in DNA hybrids.Eis Resultater si konsequent mat Berichter an der Literatur iwwer spektroskopesch Studien vu MB-DNA Interkalatioun, déi Hypochromatizitéit mat reduzéierter Energieniveauen an \(\pi\)-\(\pi ^*\ assoziéieren) ) elektronesch Iwwergäng duerch Interkalatiounsschichten 36, 37, 38.
Agarosegelelektrophorese vu Phage Phi6: PCR-Produkter vun der Längt \(117\,\hbox {bp}\) an \(503\,\hbox {bp}\) aus Séiwaasserproben.M-DNA-Marker;NTC-no-Schabloun Kontroll, Primer mat entspriechend Ampliconen;PC positiv Kontroll;1, 2, 3-onverdünnte (1:1) spiked Séi Waasser Echantillon an triplicate.Eng Band ass ze gesinn bei \(\ongeféier 50\,\hbox {bp}\) wéinst onbenotzten Oligonukleotiden am \(503\,\ hbox {bp}\) lane.
Mir evaluéiert d'Nëtzlechkeet vum Sensor mat Powai Lake Waasserproben, déi mat Phi6 Phage gespickt sinn. ml}}\), während déi aus gereinegt Phagesuspensioune isoléiert goufen. %.RNA gouf ëmgedréint an cDNA transkribéiert an als Schabloun fir PCR an qPCR benotzt.Produktgréisst gouf duerch Agarosegel Elektrophorese bestätegt (Dorënner 5) ier d'Test mam Sensor.Dës Echantillon sinn net gelrengegt an enthalen dofir all Komponente vum PCR wéi D'Ct Wäerter opgeholl während qPCR (Table 1) goufen gewisen mat der Konzentratioun vun RNA isoléiert aus der entspriechend spiked Waasser Echantillon.The Ct Wäert weist d'Zuel vun Zyklen néideg fir de fluorescent Signal ze d'Schwell oder den Hannergrondsignal iwwerschreiden.Héich Ct Wäerter weisen méi niddereg Schablounkonzentratioune a vice versa. D'Ct Wäerter vun den NTC Echantillon waren esou héich wéi erwaart. déi positiv Kontroll an d'Testprobe weist weider datt all Testprobe ongeféier 1% Schabloun am Verglach zum positiven Kontroll huet. Mir hu virdru diskutéiert datt méi laang Amplikonen zu enger besserer Sensibilitéit féieren. Amplifikatioun vu méi laang Fragmenter, déi aus heterogenen Ëmweltproben isoléiert sinn, ass Erausfuerderung mat den Nodeeler. vun gerénger viraler Konzentratioun an der RNA-Degradatioun.Mir konnten awer mat eisem Virusberäicherung a PCR-Verstäerkungsprotokoll de \(503\,\hbox {bp}\) Fragment fir elektrochemesch Sensing erfollegräich amplify.
Figur 6 weist d'elektrochemesch Sensorresultater vum \(503\,\hbox {bp}\) Fragment Amplicon, souwuel mat onverdënntem cDNA als Schabloun (1:1) an 100-fach verdënntem cDNA als Schabloun (1:100) duerchgefouert PCR , am Verglach zu NTC an PC (kuckt Figur S4 an Ergänzungsinformatioun fir representativ Voltammogrammen). All Këscht am Boxplot an der Figur 6 enthält Miessunge vun dräi Proben op 5 Elektroden. -zu-Elektrodevariatioun.Am Verglach mat CV Miessunge weisen DPV Miessunge besser Opléisung fir Test- a PC-Proben vun NTCs z'ënnerscheeden, well, wéi virdru scho gesot, Faradaesch Stréimunge verstoppt sinn wéinst Kapazitiven Hannergrondstroum an der leschter.Fir méi laang Amplikonen hu mir observéiert datt déi negativ Kontroll (NTC) huet zu méi héije CV an DPV Peakstroum par rapport zu der positiver Kontroll gefouert, wärend positiv an onverdünnt Test Echantillon ähnlech Peak Héichten vun DPV Peak Stroum gewisen hunn. ) Testprobe a PC kënne kloer aus dem Sensoroutput fir den NTC-Probe geléist ginn, während d'Resolutioun fir d'1:100 verdünnte Probe manner ausgeschwat ass. (Strecken net an der Figur 5 gewisen), an déi entspriechend DPV- an CV-Speaksstroum waren ähnlech wéi déi fir NTC erwaart. Kontroll huet eng elektrochemesch Reaktioun vum PCB-Sensor induzéiert wéinst der Adsorptioun vu fräiem MB op der Elektrode an der Interaktioun vum MB mam Single-stranded Primer Oligonukleotid. Dofir, all Kéier wann eng Probe getest gëtt, muss eng negativ Kontroll lafen an de Peakstroum vun der Testprobe am Verglach zum Peakstroum kritt vun der negativer Kontroll fir eng differentiell (relativ) Messung z'erreechen39,40 fir den Testprobe als positiv oder negativ ze klassifizéieren.
(a) DPV, an (b) CV Peak Stroum fir elektrochemesch Detektioun vu \(503\,\hbox {bp}\) Fragmenter a Séiwaasserproben. positiv Kontrollen (PC).
Eis Erkenntnisser illustréieren verschidde Mechanismen, déi d'Leeschtung vun elektrochemesche Sensoren fir Amplikone vu verschiddene Längt fir verschidden DNAs beaflossen, mat Konzentratioune verifizéiert duerch optesch Miessunge mat engem UV/Vis Spektrofotometer. \(500\,\hbox {bp}\) ka mat méi héijer Empfindlechkeet festgestallt ginn an datt d'Präsenz vu Salz an der Probe net Sensibilitéit DNA Konzentratioun déi méi héich Sensibilitéit beaflosst (selten \({\hbox {ng}/{\upmu) \hbox {l}}}\) an uewen).Zuusserdeem hu mir den Effet vu verschiddenen Aarte vu Proben ënnersicht, dorënner gel-purifizéiert Amplikonen mat an ouni Zousatz Salz, an Zousatz vu Séiwaasserproben an DPV- a CV-Miessungen.Mir hunn observéiert datt DPV eng besser Opléisung ubitt, well den Hannergrondkapazitiven Stroum och d'CV Miessung beaflosst, wat et manner sensibel mécht.
Verstäerkung vu méi laang Fragmenter hänkt vun der Integritéit vun der viraler genomescher RNA of. Verschidde Studien hu gewisen datt d'Verstäerkung vu méi laang Fragmenter net ëmmer effizient ass wéinst der Degradatioun vun der RNA an der Ëmwelt an dem Potenzial fir Splicing während der Isolatioun11,41,42,43,44 .Mir observéiert datt d'PEG-baséiert Viruskonzentratiounsmethod méi effektiv war fir d'Phage Phi-6 ze konzentréieren, déi an de Séi Waasserproben spiked ass wéi d'Aluminiumhydroxid-baséiert Viruskonzentratiounsmethod. fir verschidde méi kuerz Längt Templates ze verstäerken an d'Méiglechkeet vu Kräizspezifizitéit ze reduzéieren.
Biologesch Echantillon si knapp, sou datt et néideg ass e Biosensor ze designen deen minimal Proben fir Tester erfuerdert. D'ENIG PCB Elektroden, déi an dëser Etude benotzt goufen, erfuerderen nëmmen \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) Echantillon fir Testen déi effektiv Beräich vun den Elektroden ze decken.Zousätzlech kann déiselwecht Elektrode no Botzen erëmbenotzt ginn, ier Dir déi nächst Probe ausginn. Amplifizéiert Proben erfuerderen keng aner Chemikalien wéi Methylenblo, wat e preiswert ass. an allgemeng benotzt chemesch.Well all Elektroden ongeféier $0,55 (oder INR 40) kascht fir ze fabrizéieren, kann dëse Biosensor eng kosteneffektiv Alternativ zu existéierende Detektiounstechnologien sinn. DNA Fragmenter an heterogene Proben.
Virausgesat datt MB-baséiert elektrochemesch Detektiounsprotokoller op d'Spezifizitéit vum PCR vertrauen, ass eng grouss Begrenzung vun dëser Method d'Potenzial fir net-spezifesch Verstäerkung an heterogene Proben wéi Ofwaasser a Séiwaasser oder d'Benotzung vu Low-Purity Primer. Fir d'Sensibilitéit ze verbesseren elektrochemesch Detektiounsmethoden fir DNA Detektioun vun net gereinegt PCR Produkter mat onmodifizéierten ENIG PCB Elektroden, et ass néideg fir Feeler agefouert vun onbenotzten dNTPs a Primer besser ze verstoen, a Reaktiounsbedéngungen an Assayprotokoller ze optimiséieren. Sauerstoffbedarf (BOD) vun der Waasserprobe muss och gemooss ginn fir d'Genauegkeet vun der Messung ze verbesseren.
Als Conclusioun proposéiere mir e bëllegen elektrochemeschen ENIG PCB-Sensor fir Viruserkennung an Ëmwelt- (Séiwaasser) Echantillon. Am Géigesaz zu immobiliséierten Oligonukleotidelektroden oder personaliséierte Substrate fir DNA Sensing déi kryogen Lagerung erfuerderen fir Sensibilitéit z'erhalen,53,54 eis Technik benotzt onverännert PCB Elektroden mat enger méi laanger Haltbarkeet a keng spezifesch Späicherfuerderungen an dofir gëeegent fir d'Entwécklung vu Miessléisungen mat automatiséierter Probeveraarbechtung, déi an LMICs agesat ginn.The biosensor utilizes inexpensive DNA-intercalating redox dyes (MB) for rapid detection of target amplicons.The nonspecific amplification gemeinsam an Ëmwelt Echantillon reduzéiert d'Spezifizitéit vun dëser sensing Method wéinst der nonspezifesch Bindung vun MBs zu Single- an double-stranded oligonucleotides.Dofir hänkt d'Spezifizitéit vun dësem Test op der Optimisatioun vun primers an PCR Reaktioun Konditiounen.Ausserdeem, de CV an DPV Peak Stréimunge vun der getest Echantillon kritt soll relativ zu den Äntwerte vun der negativ Kontroll kritt (NTC) fir all Test interpretéiert ginn. D'elektrochemical Sensor Designs a Methoden presentéiert an dëser Aarbecht kann mat autosamplers integréiert ginn eng voll automatiséiert an niddereg ze entwéckelen. -Käschte Léisung déi Proben sammelen an analyséieren an d'Resultater drahtlos zréck an de Laboratoire iwwerdroen.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Methoden fir initial Konzentratioun vu Viren aus Waasserproben: eng Iwwerpréiwung an Metaanalyse vun rezenten Studien.J.Application.microorganism.115, S. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL.
Shrestha, S. et al.Wastewater epidemiology for cost-effective large-scale surveillance of COVID-19 in low- and middle-income countries: challenges and opportunities.Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nukleinsäure electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427-3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylene blue as an electrochemical discriminator of single- and double-stranded oligonucleotides immobilized on gold substrates.Analyst 126, 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Verglach vun Cation an Anion Intercalators fir Electrochemical Transduction vun DNA Hybridization vun Wäitschoss Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Charge transfer through DNA: a selective electrochemical DNA biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al. Echtzäit PCR microfluidic Apparat mat concurrent electrochemical Detection. biological sensor. Bioelectronics.24, 2131-2136 (2009).
Win, BY et al.Signaling Mechanismus Etude an Leeschtung Verifikatioun vun engem elektrochemeschen Echtzäit PCR System baséiert op der Interaktioun vun methylene blo mat DNA.Analyst 136, 1573-1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Loop-mediated isothermal amplification-baséiert electrochemical Sensor fir Detectioun vun sars-cov-2 an Ofwaasser Echantillon.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Electrochemical sensing of SARS-CoV-2 amplicons with PCB electrodes.The sensor is activated.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Effizient Detektioun vu SARS-CoV-2 RNA an der fester Fraktioun vum Ofwaasser.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Analytical Methods for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Survival of the enveloped bacteriophage Phi6 (a surrogate for SARS-CoV-2) in evaporated saliva droplets deposed on glass surfaces.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Umweltpersistenz vun engem SARS-CoV-2 Surrogat (Phi6) a fräiliewend Amöbe.J.Waasser Gesondheet 20, 83 (2021).
Mindich, L. Präzis Verpakung vun dräi genomesche Fragmenter vun duebelstrengegen RNA Bakteriophage\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Secondary structure of the DH RNA phage\(\varphi\)6 packaging region.RNA 6, 880-889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap - A séier an efficace Protokoll fir Labo Stock vun bacteriophages virbereeden.PeerJ 4, e2261 (2016).
Post Zäit: Mee-27-2022