Gratias tibi ago pro adire Nature.com.The versio navigatri quam uteris limitata subsidia pro CSS. Optima experientia commendamus te ut navigatro renovato uteris (vel convenientiae modum averte in Penitus Rimor). Interea ut cures continua subsidia, situm sine stylis et JavaScript ostendemus.
Momentum vigilantiae speciminum environmental magni aestimatum est ab initio pandemiae CVID-XIX, et quaedam magna opera exercentur utens vexillum auri, quamvis ars qPCR-substructio pretiosa sint. Electrochemical DNA biosensores potentialiter sumptus efficaces possunt praebere. solutionem pro vigilantia exemplaria aquarum environmentalium in regionibus humilibus et mediis reditibus. In hoc opere demonstramus detectionem electrochemicam amplicons a Phi6 phage factam a exemplorum aquarum spicatarum lacuum segregatorum (in vicaria populari SARS-CoV-2), utendo ENIG. perficere PCB electrodes sine summa immutatione.sex. Sensoris electrochemici responsio per DNA fragmenta duo diversarum longitudinum (\({117}\,\hbox {bp}\) et \({503}\, \hbox {bp}\)) et \hbox effectum salium in PCR magister miscet methylene caeruleo (MB)-DNA interactiones. Proventus nostri ostendunt longitudinem DNA fragmentorum sensum electronicochemicum signanter determinare et in hoc opere demonstrare facultatem diuturnos amplicons deprehendendi sine gel purgatione PCR productorum esse. momenti in situ mensurae aquae exempla.Solutio plene automated pro onere virali bene incedit.
Transmissio virus Waterborne in aleam sanitatis publicae notum est ab annis 1940, cum primis testimoniis transmissionis polionis et hepatitis waterborne E1. Organizatio mundana Salus (WHO) aliquot pathogenas aquatorum virales mediae ad altae sanitatis significationem 2.Traditional virus indicavit. Modi deprehendendi nituntur artificiis aureis qPCR-fundatis, quae valde sensibilis et specificae sunt, sed peritos personas requirunt ad probandum in officina instrumentorum pretiosarum utentium. Quamquam in regionibus ignobilibus et mediis reditibus (LMICs) cum limitibus facultatibus humanis. exempli probatio probabilis est praecellere super aquae environmental exemplum vigilantia. Ergo, alternae rationes low-cost necessariae sunt ad sustinendum, real-time magnae aquae et vastitatis exempla in regionibus humilibus et mediis reditibus sicut praematura admonitiones morborum emergentium tumentes; ita eos a gravibus impulsus socialium oeconomicorum viri pandemic.Low-cost biosensores electrochemici pro acida nucleica praebere posse solutionem potentialem huic incommodo necessariae. Multae ex his DNA biosensoribus laborant eo quod DNA fila complementaria in electrode immobiles sunt. superficies et hybridize cum seriei congruens adest in sample. Hoc ergo in signum converti potest variis technicis electronicis utentes mediatores redox ut potassium ferri/ferrocyanide. Methylene caeruleus (MB) est tale moleculum redox-activum, quod habet. relata intercalato in DNA subductis DNA (dsDNA) praeter suum magis non specificae ligamen ad DNA5, subductis DNA5, 6. Naturae MBs intercalatae ad complexiones MB-DNA formandas eos facit popularem electionem tamquam mediatores redox in pluribus DNA electrochemicis. Etsi intercalatio MB ad DNA non specifica est, et proprietas huius sensoris electrochemici late dependet a puritate primariorum adhibitorum per amplificationem PCR vel isothermal, bene convenit ad realem exsequendam. -time electrochemico-substructio qPCR seu fluorescens amplificatio isothermal ut jocus DNA mensurae concentrationis 9 . In una talis exsecutio, Vincta et al. Superficies electrodes auri cum 6-mercapto-1-hexanolo (MCH) mutata est. mensuratio PCR amplicons cum MB differentiali pulsus voltammetriae (DPV) 9. In aliis casibus, Ramirez et al.Detection of SARS-CoV-2 in wastewater by RT-LAMP reactione utens MB cum electrodes screen impresso.Platinum electrodes etiam fuisse uti in situ electrodes in microfluidico PCR suggestu ad electrochemice amplicons per reactiones deprehendere destinato 8 . Omnia horum studiorum superficies modificationem electronicorum requirunt, quasi auctae productionis et operandi sumptibus ob specialia repositionis requisita pro stabilitate horum electrodum officiatorum.
Schematica operis progressionis pro deprehensione amplicons electrochemici consecuti a particulis viralibus contractis in exemplis aquae lacubus.
Nuper demonstravimus sensum electrochemicum de SARS-CoV-2 amplicons cum parvo pretio impresso tabulae ambitus (PCB) electrodes innixas in DPV et cyclica voltammetria (CV) inducta adsorptione complexorum MB-DNA super superficiem electrodes immodificatae) mutationes in apicem current11.Renunciamus fragmenta longiora DNA (N1-N2, \({943}\, \hbox) formasse utentes CDC-commendati N1 et N2 primores e conversos cum fragmentis brevioribus {bp}\)) meliores in responsionis sensoris linearitate praebuisse. (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) adhibitis N1 ante et N1 e diverso primario propositis. Haec studia referuntur utens DNA dilutions parata in nucleaseo-free water. In suggestu etiam ad deprehendendum SARS-CoV usus est. -2 amplicons in exemplis vastitatis simulatis (exceptis spicarum summarum RNA cum SARS-CoV-2 RNA).Since RNA tonsuram in solitario et amni processus, 12.13 difficile est ampliare fragmenta longiora cum hoc exemplo heterogeneo. Itaque demonstratio sentiendi electrochemici SARS-CoV-2 amplicon in wastewater contrahitur ad breviorem \(72\,\hbox {bp}\) N1 fragmentum.
In hoc opere investigavimus facundiam ENIG PCB fundatam sentiendi electrochemicam phage Phi6 unitae et separatae e lacu aquae exemplorum (fig. 1). Phi6 phages magnitudine (80-100 um) comparatae sunt ad SARS-CoV-2 et etiam membranam lipidam et spicam protein. Ob has causas, bacteriophage Phi6 surrogata vulgaris est pro SARS-CoV-2 et alia vitiata a particulis phagenis involucra virus14,15.RNA PCR ut duo DNA fragmenta 117 et 503 base paria in longitudine obtineant. Provocatio ad amplificandum \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 fragmentorum in opere praecedenti, fragmenta intermedia scopo (\(117) \,\hbox {bp}\) et \(503 \,\hbox {bp}\)), in promptu primers. Electrochemical sensoris responsio systematice studuit per amplam intentionem range (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) ad \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Utraque fragmenta in praesentia MB, effectus salis in responsionis sensoriis ab mensuris spectrophotometricis notatis et transversis convalescit. Praecipuae huius operis contributiones sunt hae:
Fragmentum tan- dna et praesentia salis in sample sensibilitatem vehementer afficiunt.Proventus nostri demonstrant actionem electrochemicam a diversis machinationibus pendere commercii MB, DNA, sensorem in responsione voltammetrica, secundum intentionem et longitudinem DNA, cum Fragmentis longioribus sensibilem altiorem ostendunt, quamvis sal effectum negativum habeat in interactionibus electrostaticarum MB and DNA.
DNA concentratio mechanism MB-DNA determinat de commercio in electrodes immodificato. Demonstremus varias machinationes ex MB-DNA commercio pendere ab DNA concentration.At DNA concentrationes infra parvam quantitatem \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), animadvertimus responsionem hodiernam electrochemicam ab adsorptione MB-DNA in electronico maxime determinatam esse, cum in inferioribus concentrationibus Ad collectiones altas DNA, responsum currente electrochemicum ab inhibitione redox stericis determinatum est. actio ob MB intermissionem inter DNA basin paria.
ENIG PCB-Substructio Electrochemica Sensus Viralis Nucleici Acidorum in Lacu Aquarum Exemplaria In observationes electrochemicae detectionis Phi6-additae \(503\,\hbox {bp}\) DNA fragmenta ex Powai Lake, IIT Mumbai Campi recepta. Proventus phage.
Minimum sumptus exsecutionis et potentiae ad integrationem in systemata vigilantia plene automated, oligonucleotides vel aptamers in electrodes cum pluteo vita longiore.
Phage Phi6 est virus dsRNA involutum cytoviridae familiae quae Pseudomonas syringae inficit. Genus Phi6 phage exstat in specie 3 fragmentorum: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) et L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\)))16,17. Cum Phi6 phage non pathogenicum BSL-1 Pseudomonas cantilenam inficit, tutum est uti. facile crevit in laboratorio.Phage Phi6 et eius exercitus Pseudomonas syringae emptae sunt a Felice d'Herelle Reference Centre pro Viruses Bacterial, Universitas Laval, Canada (reference centri catalogi numeri sunt HER-102 et HER-1102, respective) .Phi6 phage et ejus exercitus a centro referente recreati sunt. Phage Phi6 per laminam lysin purgata et elutione ad finales titeros cum \(\circiter 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox {{\hbox} ml}}\) (plaque formans unitates/ millilitra) .RNA a phage purgatae particulis separatus utens RNA Purificationis Ornamentorum GenElute™ Universalis (Sigma-Aldrich) iuxta instructiones fabricantis. Brevis, phage purgata suspensionis\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) lysatus erat, et lysatus in columnam nentam onustus erat, ut RNA ligaretur ad columnam resinae .The RNA tunc solutione elutionis elucebat \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) cautum a kit. Estimate intentionem RNA by absorbance at \(260\,\hbox {nm}\).RNA in aliquots in \\ ({-80}\,{^{\circ}\hbox {C}}\) usque ad ulteriorem usum.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Synthesis Ornamentum iScriptum cDNA (Bio -Rad Laboratories) usus est ut exemplum cDNA synthesis quae sequebantur instructiones fabricantium. Brevis, cDNA synthesis reactionis consistit ex 3 gradibus: priming apud \({25}\,{^{\circ}\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\), e transumpto \({20}\,{\hbox {min}}\) ad \({46}\,{^{\circ. }\hbox {C}}\), et vicissim Commentarius in \({95}\,{^{\circ.}\hbox {C}}\) pro \({1}\,{\hbox {min }}\).Quando in 1% agaroso gel currunt, cDNA ostendit tres phalangas tria RNA fragmenta (notitia not exhibita) respondentes. Sequentes primi usi sunt ad duo DNA fragmenta ampliandas 117 et 503 bp in longitudine; usus cDNA ad templates PCR in miniPCR® mini8 cycli thermarum:
Primarii pro \(117\, \hbox {bp}\) et \(503\hbox {bp}\) correspondent 1476-1575 nucleotidis segmenti M et 458-943 nucleotidis segmenti L, acidi respective. . Omnes ampliati PCR producti in 1% agarosae nes electrophorae erant, et scopum DNA ampliatum purificatum est utens Ornamentum GeneJET gel extractionis (Thermo Fisher Scientificum).
Lacus ad IIT Mumbai campus (Powai Lake, Powai, Mumbai) particulas phage addere solebat. Lacus aqua per \({5}\, {\upmu \hbox {m}}\) membranam ad removendum erat. particulis suspensis, ac deinde Phi6 phage addita est. Adde \({1}\,{\hbox {ml}}\) ex \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) ad \({100}\ ,{\hbox {ml}}\) Aqua lacus eliquata, in \({4}\,{^{\circulo}\hbox {C}}\). Mensuratio oneris viralis conservata per tabulam assay. Probavimus duos varios modos contrahere particulas virus spicatum Phi6: (1) aluminium hydroxidum adsorptionis praecipitationis methodum,19 quae convalescit ob unionem plurium virus RNA involutarum e exemplaribus environmentalibus, et (2) ) polyethylene glycol (PEG) -substructio virium concentrationis methodi a Diluvio et al.20 . Cum efficacia recuperandi methodi PEG fundatae melior inventa est quam methodus hydroxidis aluminii, methodo PEG fundata adhibita ad colligendas particulas Phi6 e lacu aquae exemplorum.
PEG methodo adhibita haec erat: PEG 8000 et \(\hbox {NaCl}\) additae sunt exemplorum aquarum ad lacum Phi6-spicatum ad obtinendum 8% PEG 8000 et \(0.2\,\hbox {M} \) \( \hbox {NaCl}\).{\hbox {NaCl}\).{\hbox {NaCl}\). ) , dein centrifuga \(4700 \,\hbox {g}\) est \({45}\,{\hbox {min}}\). {\hbox {ml}}\) in eodem supernatant. Omnia spicula et experimenta concentratio virus triplicata fiebant. Post intentionem parva aliquot servata est ad efficientiam recuperationis mensurae per tabulam assay.RNA separata est sicut prius descripta et eluctata. in ornamentum elutionis quiddam\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\).Cum RNA concentratio variat a sample ad specimen in triplicatum, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) RNA adhibita pro omnibus tribus cujuscumque intentionis cDNA synthesis emplaminum facta est.cDNA synthesis fiebat ut antea descriptus est.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA usus est ut Formula \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR pro 35 circuitus ad amplificandum \ (117\, \hbox {bp}\) ac \(503\hbox { bp}\) fragmenta. Haec exemplaria "1:1″, id est sine dilution. A nulla potestate templata (NTC) in potestate negativa erecta sunt, cum cDNA usus RNA separatim a phage purgato perstringitur) erecta est. sicut specimen pro potestate positiva (PC).Quantitative PCR (qPCR) fiebat in stratagene Mx3000P RT-PCR instrumento adhibito splendidissimo III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Reactiones in triplicata sicut antea positae sunt. descriptus. Limen cycli (Ct) ad omnia exempla.In additionibus dilutiorum exempla sunt \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) usus cDNA dilutus 1:100 in aqua lacus eliquata \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR pro 35 cyclis. Exempla haec repraesentantur ut "1100".
Electrodes PCB fabricantur utentes commercium in promptu humili-cost Electroless Nickel Immersionem Aurum (ENIG) processum sine necessitate additi auri plating. ENIG PCB electrodes specificationes in praecedente opere nostro explicatae sunt 11. Electrodes enim ENIG PCB, electrode emundandi methodi traditionales quales piranha solutio vel acidi sulphurici voltammetriae cyclici non commendatae sunt, cum graciles stratis auri tenui (prox\) \(100\, \hbox {nm}\)) decoriare possint et stratis aeris procliviis subiacentes exponunt. ad corrosionem 21, 22, 23, 24, 25. Electrodes igitur munda linteolo linteo IPA madefacto. Specimen probandi incubatum \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB in \({4}\,{^{\circ.}\hbox {C}}\)\({1}\,{\hbox {h}}\) pro facili insertione. animadvertimus sensitivum et linearitatem sensoris augendo MB concentratio 11 . Ex optimizationibus relatis in opere nostro priore usi sumus \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB concentratione in DNA in hoc study embed. Electrochemica detectio duplicis subductis DNA (ds-DNA) effici potest utentes intercalatores anionicos vel cationicos. Etsi anionici intercalatores DNA melius selectivam deprehendunt, pernoctare incubationem requirunt, in longiore deprehendendi tempore. altera vero, intercalatores cationici ut MB exigunt incubationem breviorem tempora, circiter \({1}\,{\hbox {h}}\) ad detectionem electrochemicae ds-DNA6. Mensuratio- nis inducit specimen in probatione dispensandum. electrode\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), deinde purgans pannum IPA madefactum, antequam cum alio specimen procedat.una mensura. Unumquodque specimen probatum est in 5 diversis electrodes nisi aliud est.DPV et CV mensurae factae sunt utens PalmSens Sensit Smart potentiostat, et software PSTrace usus est ad figurationem et informationem potentiostat acquisitionis, inter apicem currentis calculations. Sequentes occasus adhibentur. ad DPV et CV mensuras;
DPV: Aequilibrium Tempus = \(8\,\hbox{s}\), Voltage Step = \(3\,\hbox {mV}\), Pulsus intentione = \(25\,\hbox {mV}\), venae durationis = \(50\,\hbox {ms}\), scan rate = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Aequilibrium Tempus = \(8\,\hbox{s}\), Voltage Step = \(3\,\hbox {mV}\), Verre Rate = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
Excursus apicem nactus e voltammogrammis DNA complexis \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV et CV voltammogrammata in electrodes EIG PCB \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB complexa cum DNA (concentionibus 10-\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) ie 0.13-\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) pro \(117\,\hbox {bp}\ ) and 0.03 -\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) pro \(503\,\hbox {bp}\)). Repraesentativa voltammogrammata in Figura S1 in Accessiones Informationes ostenduntur. Figura 2 eventus ostendit de DPV et CV mensurarum (cacumen currente) utens gel-purificatum PCR productorum. Compared ad CV mensuras, DPV mensuras altiorem sensum (pro functione currentis DNA concentration) ostendunt quia curricula capacitiva in CV mensuras occultant excursus Paradaici 26 . Notitia nam unaquaeque capsula in capsula mensuras ab 5 electrodes continet. Omnes mensurationes eadem serie electrodis utuntur ad vitandas errores mensurarum ob variationem electrode-ad electrodis. In DPV et CV incrementum in DPV et CV apicem currentium mensuratum observavimus ad concentrationes inferiores DNA. , longior (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ ad \(117)) fragment. Hoc congruit cum expectationi inclinationis electronici adsorptionis relatae in opere priore nostro. adsorptionem complexi MB-DNA faciliorem reddit curam translationis in electrode, quae ad incrementum cacumen hodiernum confert. Alia studia ostenderunt effectum magnitudinis oligonucleotide et sequentiam in MB-DNA intercalationem 27, 28, 29,30. guaninam. -cytosine (GC) contentum duorum ampliconum (\(117\,\hbox {bp}\) et \(503\,\hbox {bp}\)) erat circiter L%, indicans observationem differentiam debitam. ad amplicon longitudinem. Sed pro superioribus DNA concentratione (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), pro \(503\,\hbox {bp} \) et \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) pro \(117\,\hbox {bp}\)), duas amplificationes The currentes subs apicem in mensuris tam DPV quam CV reducuntur. Hoc est, quod MB inter base paria DNA saturat et intercalat, inde in inhibitione steric activitatis redox coetus reducibilis in MB31,32.
\(2\hbox{mM}\)\({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Salis in PCR praesentes inter MB et DNA interventus intermixti intermixti sunt, ita addendo \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) cum \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB productum gel-puratum ad studium salis effectum in MB-DNA interaction. Ut in Figura 3, animadvertimus altiores DNA concentrationes (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\hbox {bp }\) & \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) pro \(117\,\hbox {bp} \)), in DPV et CV Additio salis mensuras non signanter afficit (vide Figure S2 in Supplementis Information voltammograms repraesentativis). Sed ad inferiores DNA concentrationes, additio salis sensum valde minuit, ex nullo significante mutatione currenti cum DNA concentration. Similis effectus negativus salis in interactiones MB-DNA et intercalationes ab aliis inquisitoribus 33, 34.\(\hbox Mg}^{2+}\) cationes obstringunt ad phosphatem narum narum DNA negativae, impediendo commercium electrostaticum inter MB et DNA. In altioribus DNA concentratione, inhibitionis stericarum MBs redox-activarum proventuum in cacumine currentium inferiorum, sic interationes electrostaticae non signanter tangunt responsionem sensorem. Praecipuum hoc biosensoris aptius est ad collectiones superiores DNA deprehendendas (raro \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) seu superior); ad plene processus Automated exemplaria aquarum environmental, ubi gel purificatio pcr productorum fieri non potest.
Area sub curva effusione pro necem 600-700 \(\hbox {nm}\) variis concentratione DNA implicata \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a ) \(503\,\hbox {bp}\) cum et sine sale (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) cum et sine sale (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) concentrationes DNA respondentes \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB exemplaria No DNA.
Ad ulteriores proventus comprobandum, mensuras opticas utentes UV/Vis spectrophotometris (Thermo Scientific Multiskan GO), exempla \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) adhibita sunt pro singulis Mensuratio. Subscriptio decrescit effusio cum DNA retrahitur augendo, ut videri potest ex inclinatio areae sub absorptione curvae pro aequalitate range \(600\, \hbox {nm}\) ad \(700\,\hbox { nm}\), ut in Fig. 4 (defusio spectri in Fig. S3 in Informationis supplementariis exhibitus). Exempla enim cum DNA concentratione minus quam \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), nulla notabilis differentia in sumptio inter DNA continens et MB-modo exempla (pro \(503\,\hbox {bp}\) et \(117\,\hbox {bp}\ ) longitudinis fragmenta) absentiam inhibitionis stericae redox-activae MB. Ad collectiones superiores DNA significans decre- tionem sensim in signo absorbance et notando minorem decre- tionem in absorbance coram salt. Hi eventus hypotheticis attribuebantur. interactiones et inhibitiones stericae cum basi positis in DNA hybrids. Eventus noster consentaneum est cum relationibus in litteris de studiis spectroscopicis MB-DNA intercalationis, quae hypochromatica socia cum energia reducta in gradus \(\pi\)-\(\pi ^**\ ) Transitus electronici ob intercalationem laminis 36, 37, 38 .
Agarosis gel electrophoresis phage Phi6: PCR producta longitudinis \(117\,\hbox {bp}\) et \(503\,\hbox {bp}\) ex lacu aquae exempla.M-DNA titulum;NTC-no-template control, primers continentes amplicons correspondentes;PC imperium positivum;1, 2, 3-merus (1:1) lacus aquae spicatae exempla in triplicata. Grex conspicitur in \(\circiter 50,\hbox {bp}\) ob oligonucleotidas insuetas in \(503\,\ hbox {bp}\) lane.
Appensavimus utilitatem sensoris utentis Powai Lacus aquae specimina cum Phi6 phage fixa. The RNA concentrationes separatim a phage-spicatae aquae speciminibus ab 15.8-\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml }}\), dum eae phage suspensiones abalienantur, aestimatum est RNA \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) efficaciam recuperandi proxime 1 %.RNA in cDNA transscriptum erat et pro exemplo PCR et qPCR.Product magnitudo adhibita confirmata est ab agaroso gel electronico (Figura 5) ante experimentum cum sensore. Haec exemplaria non gel purificantur et ideo omnes partes PCR continent sicut itemque amplicons of interest.The Ct valores scripti in qPCR (Tabula 1) monstrati sunt correlativionem RNA separatam e samples aquae spicatae respondentibus. Valor Ct indicat numerum cyclorum ad signum fluorescentium requisitum. limen vel curriculum signum excedunt.Higher Ct valores indicant concentrationes templates inferiores et e converso.The Ct valores NTC exemplorum tam altae sunt quam expectatae. Differentia in \(\proxime 3\) Ct valores inter imperium positivum et specimen experimentum amplius indicat unumquemque specimen probationis circa 1% exemplatum comparari cum potestate positiva. Antea disputavimus longiora amplicons ad meliorem sensum ducere. Amplificatio longiorum fragmenta ab heterogeneis environmental exemplaribus separata ab incommodis datis provocare est. de intentione viralis humilis et degradationis RNA. Sed, cum auctum ac per amplificationem protocollum virus, feliciter ampliare potuimus fragmentum ad sentiendum electrochemicum \(503\,\hbox {bp}\).
Figura 6 ostendit eventum sensorem electrochemici fragmenti amplicon \(503\,\hbox {bp}\) meri cDNA in utens ut template (1:1) et 100 plica cDNA ut templates (1100) peractis PCR. comparata NTC et PC (vide Figure S4 in Accessiones Information voltammograms repraesentativa). Unaquaeque capsula in capsa in Figura 6 mensuras continet ex tribus exemplis ad 5 electrodes. Eaedem electrodes omnia exemplaria metiri solebant ad vitandos errores ex electrode -to-electrode variation. Comparatae ad CV mensuras, DPV mensuras melius solutionem ostendunt ad experimenta et PC exemplaria ab NTCs distinguenda, quia, ut ante dictum est, flumina Faradaici latent ob excursus capacitivos in hac parte. Nam iam amplicons, animadvertimus. imperium negativum (NTC) in altioribus CV et DPV currentibus cacuminis relativis ad imperium positivum consecutum, cum exempla positivi et mera examinis instar cacuminis cacuminis DPV currentium cacumina demonstraverunt. Mensurae mediae et medianae valores pro singulis meracius (1:1 ) specimen specimen et PC e sensore pro NTC specimen clare resolvi possunt, resolutio pro 1:100 mixti exempli minus pronunciata est. Nam C-plica dilutio cDNA non servavimus vincula aliqua inter electrophoresis gel. (Vices non in Figura V ostenduntur), et currentes apicem DPV et CV respondentes similes illis exspectantibus pro NTC. Eventus pro \(117\,\hbox {bp}\) fragmentum in Accessiones Informationes exhibentur. Negative imperium induxit responsionem electrochemicam a sensore PCB propter adsorptionem liberae MB in electrode et commercio MB cum primario oligonucleotide uno subductis. Ergo quoties specimen probatum est, imperium negativum currendum est et. apicem currenti experimenti comparati ad apicem currenti comparatum imperium negativum consequi differentialem (relativam) mensurae39,40 ad indicandam specimen specimen pro positivo vel negativo.
(a) DPV, et (b) CV apicem currentis ad detectionem electrochemicae \(503\,\hbox {bp}\) fragmentorum in aqua lacuum exemplaria. Testimoniorum exempla in triplicata sunt mensurata et nullis imperiorum (NTC) et exemplaribus comparata positive controls (PC).
Inventiones variae machinae quae sensoriis electrochemicis perficiendis illustrant pro ampliconibus diversarum longitudinum pro diversis DNAs, cum intentionibus rectificatis per mensuras opticas utens UV/Vis spectrophotometer. Observationes inveniunt perceptionem quae longiora DNA fragmentis usque ad \(\proxum\) \(500\,\hbox {bp}\) cum superiore sensu deprehendi posse et praesentiam salis in sample non sensitivum DNA concentratio quae sensitivum altiorem afficit (raro \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) et supra). Praeterea effectum diversorum generum exemplorum investigavimus, amplicons gel-purgatum cum sale et sine addito, ac praeter lacus aquae exempla in mensuris DPV et CV.Animadvertimus DPV melius solutionem praebuisse, quia curriculum capacitivum curriculi etiam CV mensurationem afficit, eamque minus sensibilem facit.
Ampliatio longiorum fragmentorum ab integritate genomicorum RNA viralis pendet. Studiorum plurium ostendimus amplificationem fragmentorum longiorum non semper efficacem esse ob deformitatem RNA in ambitu ac potentia scindendi per segregationem 11,41,42,43,44. . Animadvertimus PEG-substructum virum concentratio methodi efficaciorem fuisse in concentu phage Phi-6 spicati in exemplaria aquatica lacum quam aluminium hydroxido-substructio virium concentrationis methodi. Facultas detegendi longa DNA fragmenta superandi postulationem multiplex PCR probatum est. ut multiplices formulas breviores amplificare et facultatem crucis-specificationis minuere.
Exempla biologica vix sunt, ideo opus est biosensorem designare quae minima exemplaria ad probandum requirit. Electrodes ENIG PCB in hoc studio tantum requiri \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) exemplaria ad experimentum ad aream efficacem electrodes tegenda.Additionally, eadem electrode reddi potest post purgationem ante solutionem proximam sample.Amplified exemplaria additamenta alicuius oeconomiae praeter methylenum caeruleum non requirunt, quod vilis est. et communiter chemica. Cum singulae electrode circa $0.55 (vel INR 40) ad fabricandum constet, hic biosensor jocus sumptus efficax esse potest ad detectionem technologiarum existentium. Table 2 comparationem huius operis cum aliis sensoriis relatam in litteris diuturnis ostendit. DNA fragmenta in exemplis heterogeneis.
Dato quod MB-substructio detectionis protocolla electrochemicae nititur specificitati PCR, maior limitatio huius methodi est potentia ad non specialem amplificationem in exemplis heterogeneis, sicut aquae vastitatis et lacus vel utens low-puritatis primers. deprehensio modos electrochemici ad DNA detectionem inpurificatorum PCR productorum utentium immodificato ENIG PCB electrodes, necesse est ut errores ab insuetis dNTPs et primariis inductis melius intelligat, et condiciones reactionis optimize ac protocols tentare. Additionales parametri physicochemici ut pH, temperies, et biologicum oxygenii postulationem aquae exempli (BOD) etiam mensurari oportet ut accurationem mensurae emendare possit.
Demum proponimus sensorem ENIG PCB sumptum electrochemicum pro virus detectionis in in environmental (aqua lacis) exemplaria. Dissimile immobilis oligonucleotide electrodes seu consuetudo subiecta pro DNA sentiendi quae requirunt repositiones cryogenicas ad sensum conservandum, 53,54 technicis nostris utitur immodificatis PCB electrodes cum pluteo vita longiore et nullis exigentiis repositionis specificae ideoque aptae solutionum mensurarum cum automated processui specimen in LMICs explicavit. Biosensor insumptuosus utitur DNA intercalando redox colores (MB) ad deprehensionem scopo amplicons. communis in speciminibus environmental proprietatem huius sentiendi methodi redigit ob ligationem MBs non specificae ad oligonucleotides, et subductis oligonucleotidis. Ideo proprietas huius testi dependet ab optimae primariorum ac PCR reactionis conditionibus. Praeterea CV. et DPV currentium apicem ex probatis exemplis impetratis interpretari debent relativa responsa a potestate negativa (NTC) pro unoquoque test. Electrochemici sensoria consilia et methodi in hoc opere praesentati cum autosamplaribus ad plene automated et humilem enucleandum possunt. -cost solutio quae exempla colligere et analysi ac wirelessly transmittere eventus ad officinam potest.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Methodi ad concentratio initialium virus ex aqua exemplorum: recensio et meta-analysis studiorum recentium.Application.microorganism.115, pp. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Virus Waterborne: Claustra ad aquam tuta bibens. PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.Wastewater epidemiologiam pro gratuita magna-scala in custodia covid-19 in regionibus humilibus et mediis reditibus: provocationes et occasiones. Aqua 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Acidum nuclei electrochemisticum.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylene caeruleus ut discriminator electrochemici simplices et oligonucleotides substratae mebiles auro substratae.Analyst 126, 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparison of Cation and Anion Intercalators for Electrochemical Transduction of DNA Hybridization by Long-Range Electron Transfer. Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Praecipe translatio per DNA: electram electram DNA biosensor.anus.Chemical.78, 2138-2144 (2006).
Fang, TH et al.Real-time PCR machinae microfluidicae cum concursu electrochemico detectioni. biologico sensore.Bioelectronics.24, 2131-2136 (2009).
Vince, BY et al. Signa mechanismum studio et perficiendi verificationis electrochemici reali temporis PCR systematis innixum commercio methylenae caeruleae cum DNA.Analyst 136, 1573-1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al. Loop-mediatus isothermal amplificatio substructio sensoris electrochemici ad detectionem sars-cov-2 in vastitate exempli.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Electrochemicum sentiendi SARS-CoV-2 amplicons cum PCB electrodes. Sensorem reducitur. B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Efficient detectio of SARS-CoV-2 RNA in solida fractione wastewater.science.general environment. 763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Analytica Methodi SARS-CoV-2 Detectio in Wastewater: Protocollum et Future Perspectivae. TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Superstes bacteriophagi Phi6 involutae (surrogata pro SARS-CoV-2) in stillicidiis salivae evaporatis in superficiebus vitreis depositis.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Environmentalis pervicacia in vicaria SARS-CoV-2 (Phi6) in amoeba libero viventium.Aquae Medicae 20, 83 (2021).
Mindich, L. Accusa fasciculus trium fragmentorum genomicorum RNA bacteriophagi duplex subductis(\varphi\)6.microorganismus. Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Secundae structurae structurae DH RNA phage(\varphi\) 6 fasciculi region.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages in Tap – Protocollum ieiunium et efficax ad nervos bacteriophagorum laboratorium parandum. PeerJ 4, e2261 (2016).
Post tempus: May-27-2022