Spas ji bo seredana Nature.com. Guhertoya geroka ku hûn bikar tînin ji bo CSS-ê piştgirî tixûbdar e. Ji bo ezmûna çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn gerokek nûvekirî bikar bînin (an jî moda lihevhatinê ya di Internet Explorer-ê de qut bikin). Di vê navberê de, ji bo misogerkirina piştgiriya berdewam, em ê malperê bêyî şêwaz û JavaScript nîşan bidin.
Girîngiya şopandina nimûneyên hawîrdorê ji destpêka pandemiya COVID-19 ve pir tê qebul kirin, û hin hewildanên çavdêriyê bi karanîna standarda zêr têne kirin, her çend teknîkên qPCR-based biha ne. Biyosensorên DNA yên elektrokîmyayî dikarin bihayek bikêrhatî peyda bikin. çareserî ji bo şopandina nimûneyên ava hawîrdorê li welatên kêm-dahata navîn.Di vê xebatê de, em tespîta elektrokîmyayî ya amplikonên ku ji Phi6 fagê hatine veqetandin ji nimûneyên ava golê yên tûjkirî (cîgirek populer a SARS-CoV-2), bi karanîna ENIG, destnîşan dikin. ji bo temamkirina elektrodên PCB bêyî guhartina rûyê erdê.cins. Bersiva sensorê elektrokîmyayî bi tevahî ji bo du perçeyên DNA yên bi dirêjahîyên cihêreng (\({117}\,\hbox {bp}\) û \({503}\,\hbox {bp}\)) hate destnîşan kirin, û bandora xwêyên di tevlihevên sereke yên PCR de li ser danûstendinên metîlen şîn (MB)-DNA. Encamên me destnîşan dikin ku dirêjahiya perçeyên DNA bi girîngî hestiyariya elektrokîmyayî diyar dike û di vê xebatê de destnîşan dike ku şiyana tespîtkirina amplikonên dirêj bêyî paqijkirina jelê ya hilberên PCR-ê ye. ji bo pîvandina li cîhê nimûneyên avê girîng e.Çareseriyek bi tevahî otomatîkî ya ji bo barkirina vîrusê baş nîşan dide.
Veguhestina vîrusê ya bi avê ji salên 1940-an vir ve wekî xetereyek tenduristiya gelemperî tê zanîn, digel delîlên yekem ên veguheztina felc û hepatît E1 bi avê ve. Rêxistina Tenduristiyê ya Cîhanê (WHO) çend pathogenên viral ên di nav avê de xwedî girîngiya tenduristiyê ya navîn û bilind dabeş kirin. Vîrûsa kevneşopî rêbazên tespîtkirinê xwe dispêrin teknîkên qPCR-bingeha zêr-standard, ku pir hesas û taybetî ne, lê ji personelên jêhatî hewce dike ku di laboratuarê de bi karanîna amûrên biha biceribîne. Lêbelê, li welatên dahat kêm û navîn (LMIC) yên ku çavkaniyên kêm in, mirov îhtîmal e ku ceribandina nimûneyê pêşî li şopandina nimûneya avê ya hawîrdorê bigire. Ji ber vê yekê, ji bo şopandina domdar, rast-dem a nimûneyên av û ava bermayî li welatên kêm-dahata navîn û wekî hişyariyên zû yên derketinên nexweşî yên derketine, rêbazên alternatîf ên kêm-mesref hewce ne. bi vî awayî wan ji bandorên giran ên sosyo-ekonomîk ên pandemiya vîrusê diparêze. Biosensorsên elektrokîmyayî yên biha yên kêm ên ji bo asîdên nukleîk dikarin çareseriyek potansiyel a hêvîdar ji vê hewcedariya bêserûber re peyda bikin.Gelek ji van biyosensorên DNA bi vê rastiyê dixebitin ku zincîreyên DNA yên temamker li ser elektrodê ne. dema ku rêzek lihevhatî di nimûneyê de hebe, rûdinê û hevber dike. Dûv re ev yek dikare bi teknîkên elektrokîmyayî yên cihêreng bi karanîna navbeynkarên redoksê yên wekî hesin potassium/ferrocyanide veguhezîne sînyalek. Methylene blue (MB) yek molekulek wusa redoks-aktîf e, ku xwedî Hat ragihandin ku di nav ADN-ya dubendî (dsDNA) de ji bilî girêdana wê ya netaybettir a bi ADN-ya yek-zincîre5,6 ve girêdayî ye. Cewhera tevlihevkirina MB-yan ji bo avakirina kompleksên MB-DNA-yê wan dike bijarek populer wekî navbeynkarên redox di gelek DNA-ya elektrokîmyayî de. veavakirinên senzorê5,6,7,8,9. Her çend têkelbûna MB bi DNA re netaybetî ye, û taybetmendiya vê senzorê elektrokîmyayî bi giranî bi paqijiya primerên ku ji bo PCR an zêdekirina îzotermîk têne bikar anîn ve girêdayî ye, ew ji bo pêkanîna rastîn baş e. -QPCR-bingeha elektrokîmyayî an zêdekirina îzotermî ya floransê wekî alternatîfek ji bo pîvandina giraniya DNA 9 .Di yek pêkanînek weha de, Won et al. Rûyê elektrodên zêr ji bo dema rast bi 6-mercapto-1-hexanol (MCH) hate guherandin. pîvandina amplikonên PCR-ê bi MB bi karanîna voltametriya pêlêdana cihêreng (DPV) 9. Di rewşên din de, Ramirez et al. Tespîtkirina SARS-CoV-2 di ava çolê de bi reaksiyona RT-LAMP bi karanîna MB bi elektrodên çapkirî yên ekranê ve hatî bikar anîn. Elektrodên platîn jî hatine wekî elektrodên li cîhê di platformek PCR-ya mîkrofluîdî ya ku ji bo tespîtkirina amplîkonan bi elektrokîmyayî di dema reaksiyonên de hatî çêkirin de têne bikar anîn 8. Hemî van lêkolînan hewceyê guheztina rûyê elektrodê ne, ku tê wateya zêdebûna lêçûnên hilberîn û xebitandinê ji ber hewcedariyên hilanînê yên taybetî ji bo aramiya van elektrodên fonksiyonelkirî.
Skemaya xebatê ya ji bo tespîtkirina elektrokîmyayî ya amplikonên ku ji pariyên vîrusê yên komkirî yên di nimûneyên ava golê de hatine wergirtin.
Me di van demên dawî de hestiyariya elektrokîmyayî ya amplikonên SARS-CoV-2 bi elektrodên desteya çapkirî (PCB) erzan nîşan da ku li ser bingeha DPV û voltametriya çerxîkî (CV) ye ku ji hêla adsorpkirina kompleksên MB-DNA yên li ser rûyê elektrodên neguhêrbar) ve di lûtkeyê de têne guhertin. niha11.Em radigihînin ku perçeyên DNA yên dirêjtir (N1-N2, \({943}\, \hbox) ku bi karanîna primerên N1 pêşnîyar û N2 yên berevajî yên pêşniyarkirî yên CDC-yê hatine çêkirin li gorî perçeyên kurt {bp}\)) di bersiva sensor de xêzek çêtir nîşan didin. (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) bi karanîna koma pêşbirkên N1 û N1 berevajî ve hatî çêkirin. Van lêkolînan bi karanîna dravên DNA yên ku di ava bê nukleaz de hatî amadekirin têne ragihandin.Platform ji bo tespîtkirina SARS-CoV jî hate bikar anîn. -2 amplikon di nimûneyên ava bermayî yên simulkirî de (bi rijandina nimûneyên RNA yên tevahî bi RNA SARS-CoV-2 ve têne wergirtin). Ji ber ku RNA di dema veqetandin û hilberandina jêrîn de ji şilbûnê re guncan e, 12,13 dijwar e ku bi vê nimûneya heterojen perçeyên dirêjtir werin zêdekirin. Ji ber vê yekê, xwenîşandana hestiyariya elektrokîmyayî ya amplikona SARS-CoV-2 di ava çolê de bi perçeya N1 ya kurttir \(72\,\hbox {bp}\) sînorkirî ye.
Di vê xebatê de, me îmkana hîskirina elektrokîmyayî ya li ser bingeha ENIG PCB-ya fagê Phi6 ku ji nimûneyên ava golê hatî veqetandin û veqetandî lêkolîn kir (Hêjî. 1). Fagên Phi6 bi mezinahî (80-100 nm) bi SARS-CoV-2 û di heman demê de parzûnek lîpîd û proteînek spîk jî heye. Ji ber van sedeman, bakteriofage Phi6 ji bo SARS-CoV-2 û vîrusên RNA yên pathogenîk ên din ên pêçandî cîhgirek populer e. PCR ji bo bidestxistina du parçeyên DNA yên bi dirêjahiya 117 û 503 cotên bingehîn. Ji ber ku di xebata xwe ya berê de kêşeya zêdekirina \(943\,\hbox {bp}\) parçeyên N1-N2, em perçeyên dirêjahiya navîn dikin hedef (\(117 \,\hbox {bp}\) û \(503 \,\hbox {bp}\)), li ser bingeha primerên berdest. Bersiva senora elektrokîmyayî bi rêkûpêk li ser navberek giraniya berfireh hate lêkolîn kirin (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) ber \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Ji bo her du perçeyan hebûna MB, bandora xwê ya li ser berteka senzorê ji hêla pîvandinên spektrofotometrik ve hatî destnîşan kirin û derbasdar kirin. Beşdariyên sereke yên vê xebatê wiha ne:
Dirêjahiya perçeya DNA û hebûna xwê ya di nimûneyê de bi xurtî bandorê li hestiyariyê dike.Encamên me destnîşan dikin ku çalakiya elektrokîmyayî bi mekanîzmayên cihêreng ên danûstendina MB, DNA, û senzorê ve girêdayî ye di bersiva voltammetrî de, li gorî hûrbûn û dirêjahiya DNA-yê ve girêdayî ye, bi perçeyên dirêjtir hesasiyeta bilindtir nîşan dide, her çend xwê bandorek neyînî li ser danûstendinên elektrostatîk ên di navbera MB û DNA.
Giraniya DNA mekanîzmaya pêwendiya MB-DNA ya di elektrodên neguhertî de diyar dike. Em destnîşan dikin ku mekanîzmayên cihêreng ên pêwendiya MB-DNA bi giraniya DNA ve girêdayî ye. {l}}}\), me dît ku bersiva niha ya elektrokîmyayî bi giranî ji hêla adsorpkirina MB-DNA ya li ser elektrodê ve hatî destnîşankirin, dema ku di tansiyonên kêmtir de Di tansiyonên DNA yên bilind de, bersiva niha ya elektrokîmyayî ji hêla astengkirina sterîk a redox ve hate destnîşankirin. çalakiya ji ber ketina MB di navbera cotên bingehên DNA de.
ENIG-PCB-Hestkirina Elektrokîmyawî ya Asîdên Nukleîk ên Vîrûs ên Di Nimûneyên Ava Golê de Venêrtin bi vedîtina elektrokîmyayî ya perçeyên DNA yên Phi6-zêdekirî \(503\,\hbox {bp}\) yên ku ji nimûneyên avê ji Gola Powai, Kampusa IIT Mumbai hatine wergirtin ve hatine pejirandin. Encama fagê.
Mesrefa kêm a pêkanînê û potansiyela entegrasyonê di pergalên şopandina bi tevahî otomatîk, oligonukleotîd an aptamerên li ser elektrodên bi refê dirêjtir de ye.
Phage Phi6 vîrusek dsRNA ya dorpêkirî ya ji malbata Cytoviridae ye ku Pseudomonas syringae diêşîne. Genoma fagê Phi6 di forma 3 perçeyan de heye: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07 \,\hbox {Kb}\)) û L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\)) 16,17. Ji ber ku fagê Phi6 cureyek BSL-1 Pseudomonas ne-patojenîk enfeksiyonê dike, karanîna wê ewle ye. û dikare bi hêsanî di laboratuarê de were mezin kirin. Phage Phi6 û mêvandarê wê Pseudomonas syringae ji Navenda Referansê ya Felix d'Herelle ji bo Vîrûsên Bakterî, Zanîngeha Laval, Kanada (hejmarên kataloga navenda referansê, HER-102 û HER-1102 in) hatin kirîn. Phage Phi6 û mêvandarê wê li gorî ku ji hêla navenda referansê ve hatî rêve kirin vejiyan. Phage Phi6 bi lîz û elusyona plakaya hate paqij kirin ku titerên dawîn bi \(\ li ser 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (yekîneyên ku plakê çêdikin/ milîlître). RNA ji pariyên fagê yên safîkirî bi bikaranîna GenElute™ Universal Paqijkirina RNA Kit (Sigma-Aldrich) li gorî talîmatên çêker hate veqetandin. Bi kurtasî, suspensionek Phi6 a fagê ya paqijkirî\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) hate lîzkirin û lîzat li stûnek spin hate barkirin da ku RNA bi stûna rezînê ve girêbide. Dûv re RNA di nav çareya helandinê de tê avêtin \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) ji hêla kîtê ve hatî peyda kirin. Texmîna giraniya ARNyê ji hêla vegirtinê ve li \(260\,\hbox {nm}\). RNA di aliquots de hate hilanîn. ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) heta ku bêtir bikar bînin. -Rad Laboratories) li gorî rêwerzên çêker ji bo senteza cDNA-yê wekî şablonek hate bikar anîn. Bi kurtasî, reaksiyona senteza cDNA ji 3 gavan pêk tê: priming at \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , veguhertina berevajî ya \({20}\,{\hbox {min}}\) li \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), û berevajî tomarker di \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) de ye ji bo \({1}\,{\hbox {min }}\).Dema ku li ser gêlek agarose ya %1 tê xebitandin, cDNA sê bend nîşan da ku li gorî sê perçeyên RNA yên çaverêkirî ne (dane nehatine nîşandan). bikaranîna cDNA wekî şablon ji bo PCR-ê di çerxa germî ya miniPCR® mini8 de:
Destpêkên \(117\,\hbox {bp}\) û \(503\,\hbox {bp}\) bi rêzê ve bi 1476-1575 nukleotîdên beşa M û 458-943 nukleotîdên beşa L re têkildar in. .Hemû hilberên PCR-ê yên zêdekirî li ser gêlên agarozê yên %1 elektroforez kirin, û DNA-ya armancê ya zêdekirî bi karanîna GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific) hate paqij kirin.
Golek li kampusa IIT Mumbai (Gola Powai, Powai, Mumbai) ji bo zêdekirina pariyên fagê hate bikar anîn. Ava golê di parzûnek \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) de hate parzûn kirin da ku were rakirin. perçeyên rawestandî, û paşê Phi6 phage hat zêdekirin. \({1}\,{\hbox {ml}}\) ya \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} lê zêde bike \) ber \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) ava golê parzûnkirî, li \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). ji bo pîvandina barkirina vîrusê ji hêla vekolîna plakê ve hatî veqetandin. Me du awayên cihêreng ceriband da ku pariyên vîrusa Phi6-ê yên tûjkirî berhev bikin: (1) rêbaza adsorption-barînê ya hîdroksîdê aluminiumê,19 ku ji bo berhevkirina çend vîrusên RNA yên dorpêçkirî ji nimûneyên hawîrdorê hatî pejirandin, û (2) ) Rêbaza berhevdana vîrusê ya li ser bingeha polîetîlen glycol (PEG) ji Flood et al.20 .Ji ber ku karbidestiya vegerandina rêbaza PEG-based ji ya rêbaza hîdroksîdê aluminium çêtir hate dîtin, rêbaza PEG-based hate bikar anîn da ku pariyên Phi6 ji nimûneyên ava golê berhev bike.
Rêbaza PEG-ê ku hatî bikar anîn wiha bû: PEG 8000 û \(\hbox {NaCl}\) li nimûneyên ava gola Phi6-spikkirî hatin zêdekirin da ku %8 PEG 8000 û \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Nimûneyên li ser şekerekê hatin înkubakirin\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), paşê li \(4700 \,\hbox {g}\) tê santrîfûjkirin \({45}\,{\hbox {min}}\). Supernatantê biavêje û pelletê ji nû ve li \({1}\, suspension bike, {\hbox {ml}}\) di heman sûpernatantê de. Hemî ceribandinên spiking û berhevkirina vîrus sê caran hatin kirin.Piştî berhevdanê, aliqutek piçûk ji bo pîvandina kargêriya vegerandinê bi ceribandina plakeyê hate veqetandin. RNA wekî ku berê hatî destnîşan kirin hate veqetandin û hate şuştin. di tamponê helandinê de ku bi kîtê tê peyda kirin\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Ji ber ku giraniya RNA dê ji nimûneyek nimûneyek sê caran diguhere, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) ya ARNyê ji bo her sêyan tê bikar anîn bêyî ku mêzekirina wê çêbibe. CDNA senteza nimûneyan pêk hat. Senteza cDNA wekî ku berê hate diyarkirin hate kirin.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA ji bo \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR ji bo 35 dewreyan wekî şablon hate bikar anîn da ku \ (117\,\hbox {bp}\) û \(503\,\hbox { bp}\) perçe. Ev nimûne wek "1:1" tên temsîlkirin, ango bê helandin. Kontrola bê-şablon (NTC) wekî kontrolek neyînî hate saz kirin, di heman demê de cDNAyek ku bi RNA-ya ku ji fagê paqijkirî veqetandî hatî sentez kirin hate saz kirin. wekî şablonek ji bo kontrolek erênî (PC). PCR (qPCR) di amûrek Stratagene Mx3000P RT-PCR de bi karanîna Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Teknolojiyên Agilent) hate kirin. ravekirin.Berdexa çerxê (Ct) ji bo hemî nimûneyan hate tomar kirin. Ji bilî vê, nimûneyên hûrkirî \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) bi kar anîn cDNA ku 1:100 di ava golê de hatî parzûn kirin wek \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR ji bo 35 dewreyan. Ev nimûne wek "1:100" têne nîşandan.
Elektrodên PCB-ê bi karanîna pêvajoyek erzan a bazirganî ya erzan a Zêrê Binavkirina Nîkelê ya Bê Elektrobê (ENIG) bêyî ku hewcedariya zêrê zêrê zêde hebe têne çêkirin. Taybetmendiyên elektrodên PCB yên ENIG di xebata meya berê de bi hûrgulî ne. Çareseriya piranhayê an voltametriya çerxa asîda sulfurîk nayê pêşniyar kirin ji ber ku dibe ku bibe sedema peqandina tebeqeya zêr a zirav (qûrahî \(\nêzîkî\) \(100\,\hbox {nm }\)) û tebeqeyên sifir ên binî yên ku meyldar in eşkere bikin. ji bo korozyonê 21, 22, 23, 24, 25. Ji ber vê yekê, elektrod bi qumaşê bêpiz û bi IPA şilkirî paqij bikin. Nimûneya ku were ceribandin bi \({50}\,{\upmu \hbox {M}) hat înkub kirin. }\) MB di \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({1}\,{\hbox {h}}\) de ji bo têketina hêsan. Di xebata me ya berê de , me dît ku hesasiyet û xêziya senzorê bi zêdekirina konsantasyona MB çêtir bû 11 .Li ser bingeha xweşbîniyên ku di xebata me ya berê de hatine ragihandin, me \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB bikar anî. di vê lêkolînê de ji bo tevlêkirina DNA-yê tansiyonên elektrokîmîmî bi kar tînin. Di vê lêkolînê de tespîtkirina elektrokîmyayî ya ADN-ya du-zindî (ds-DNA) dikare bi karanîna navberkerên anyonîk an kationîk were bidestxistin. Her çend navberkerên anyonîk DNAyê bi hilbijartiyek çêtir tespît bikin jî, ew hewceyî inkubasyona şevekê ne, di encamê de demên tespîtkirinê dirêjtir dibin. ji aliyê din ve, navberkerên kationîk ên mîna MB, ji bo tespîtkirina elektrokîmyayî ya ds-DNA6, bi qasî \({1}\,{\hbox {h}}\) hewceyê demên înkubasyonê kurttir in. elektrod\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), paşê bi çîçeka şilkirî ya IPA-yê paqij bikin, berî ku bi nimûneyek din bidomînin.yek pîvan.Her nimûne li ser 5 elektrodên cuda hate ceribandin heya ku wekî din neyê gotin. Pîvandinên DPV û CV bi karanîna potensiostatek PalmSens Sensit Smart hatin kirin, û nermalava PSTrace ji bo veavakirina potensiostat û wergirtina daneyan, tevî hesabên lûtkeyê yên heyî, hate bikar anîn. Mîhengên jêrîn têne bikar anîn. ji bo pîvandinên DPV û CV:
DPV: Dema hevsengiyê = \(8\,\hbox {s}\), Pêngava voltajê = \(3\,\hbox {mV}\), voltaja pêlê = \(25\,\hbox {mV}\) , dirêjahiya pulsê = \(50\,\hbox {ms}\), rêjeya şopandinê = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Dema hevsengiyê = \(8\,\hbox {s}\), Pêngava voltajê = \(3\,\hbox {mV}\), Rêjeya hilavêtinê = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Herikîna lûtkeyê ku ji voltamogramên ADNya tevlihevkirî bi \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB hatine wergirtin: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Voltamogramên DPV û CV li ser elektrodên ENIG PCB \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB bi DNA-ya tevlihevkirî (bi giraniya 10–\({20}\,{\ hbox {ng) hatin bidestxistin }/{\upmu \hbox {l}}}\) ango 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) ji bo \(117\,\hbox {bp}\ ) û 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) ji bo \(503\,\hbox {bp}\)).Voltamogramên temsîlkar di Figure S1 de di Agahiyên Pêvek de têne xuyang kirin. Xiflteya 2 encaman nîşan dide pîvandinên DPV û CV (hera lûtkeyê) bi karanîna hilberên PCR-ya gêl-paqijkirî bi kar tînin. Li gorî pîvandinên CV, pîvandinên DPV hesasiyetek bilindtir nîşan didin (niha wekî fonksiyona kombûna DNAyê) ji ber ku di pîvandinên CV de herikên kapasîteyên paşerojê herikên Faradaîk vedişêrin 26. Daneyên ji bo her qutiyek di çarçovê de pîvandinên ji 5 elektrod dihewîne. Hemî pîvandin heman koma elektrodê bikar tînin da ku xeletiyên pîvandinê ji ber guheztina elektrod-elektrodê dûr nekevin. Me meylek zêde di tîrêjên lûtkeyê yên DPV û CV de dît ku ji bo giraniya kêmtir DNA , dirêjtir (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ li gorî \(117) ) parçe. Ev yek bi meyla ku tê çaverêkirin a derbirîna elektrodê di xebata me ya berê de hatî ragihandin re hevaheng e. adsorbasyona kompleksa MB-DNA veguheztina barkirinê ya li ser elektrodê hêsan dike, ku ev yek dibe sedema zêdebûna lûtkeya herikîna lûtkeyê. Lêkolînên din bandora mezinahî û rêza oligonukleotidê li ser hevgirtina MB-DNA27,28,29,30 nîşan dan. Guanîn -Naveroka cytosine (GC) ya du amplikonan (\(117\,\hbox {bp}\) û \(503\,\hbox {bp}\)) bi qasî 50% bû, ku nîşan dide ku çavdêrî Cûdahî ji ber ji bo dirêjahiya amplicon. Lê belê, ji bo giraniya DNA ya bilind (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), ji bo \(503\,\hbox {bp} \) û \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ji bo \(117\,\hbox {bp}\)), em du amplifications temaşe dikin. Di pîvandina DPV û CV de herikîna lûtkeyê ya jêrzemînan kêm dibe. Ev ji ber ku MB têr dibe û di navbera cotên bingehîn ên ADNyê de têr dibe, û di encamê de çalakiya redoxê ya koma kêmkirî ya di MB31,32 de asteng dike.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Xwêyên ku di tevlihevên sereke yên PCR de hene, mudaxeleyî danûstendinên elektrostatîk ên di navbera MB û DNA de dikin, ji ber vê yekê \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) bi \({50} \,{\) zêde bikin. upmu \hbox {M}}\) MB hilbera gel-paqijkirî ji bo lêkolîna bandora xwê ya li ser danûstendina MB-DNA. Wekî ku di jimar 3 de tê xuyang kirin, me dît ku ji bo giraniya DNA ya bilindtir (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) û \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) ji bo \(117\,\hbox {bp} \)), di DPV û CV de Zêdekirina xwê bi girîngî bandor li pîvandinê nekir (li Figure S2 di Agahiyên Pêvek de ji bo voltamogramên temsîlî binêre).Lêbelê, li tansiyona ADN-ê kêmtir, lêzêdekirina xwê hesasiyetê pir kêm dike, û di encamê de ti guhertinek girîng di dema niha de bi giraniya DNA re çênabe. Bandorên neyînî yên bi vî rengî yên li ser têkilî û tevhevkirina MB-DNA-yê berê ji hêla lêkolînerên din ve hatine ragihandin33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) kation bi pişta fosfatê ya neyînî ya DNA ve girêdidin, bi vî rengî pêwendiya elektrostatîk a di navbera MB û DNA de asteng dike. Di tansiyonên DNA yên bilind de, astengkirina sterîk a MB-yên redox-aktîf dibe sedema lûtkeya herî kêm, ji ber vê yekê danûstendinên elektrostatîk bi girîngî bandorê li bersiva sensor nake. Xala sereke ev e ku ev biyosensor ji bo tespîtkirina giraniya DNA ya bilind çêtir e (kêm caran \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) an mezintir), ji bo hilberandina bi tevahî otomatîkî ya nimûneyên ava hawîrdorê, ku dibe ku paqijkirina gel a hilberên PCR ne pêkan be.
Qada di bin kêşa vegirtinê de ji bo dirêjahiya pêlê 600–700 \(\hbox {nm}\) ji bo guheztinên cihêreng ên ADN-ya tevlihevkirî bi \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a ) \(503\,\hbox {bp}\) bi xwê û bê xwê (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) bi xwê û bê xwê (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Tîrêjên DNA yên ku bi \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) Nimûneyên MB re têkildar in DNA tune.
Ji bo verastkirina encamên jorîn, me pîvandinên optîkî bi karanîna spektrofotometerek UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO) pêk anîn, nimûneyên \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) ji bo her yekê hatin bikar anîn. Pîvandin. Nîşana vegirtinê bi zêdekirina giraniya ADNyê re kêm dibe, wek ku ji meyla devera li binê kêşana vegirtinê ji bo rêza dirêjahiya pêlê \(600\,\hbox {nm}\) heta \(700\,\hbox { tê dîtin. nm}\) , wek ku di Xiflteya 4-ê de tê xuyang kirin (spektruma vegirtinê di Fig. S3 de di Agahiyên Pêvek de tê nîşandan). {l}}}\), di hilgirtinê de ferqek girîng di navbera nimûneyên DNA-vegirtî û nimûneyên tenê MB de tune bû (ji bo \(503\,\hbox {bp}\) û \(117\,\hbox {bp}\ ) perçeyên dirêj), ku nebûna astengkirina sterîk a MB-ya redoks-aktîf nîşan dide. Di tansiyonên DNA yên bilind de, me kêmbûnek gav bi gav di sînyala vegirtinê de dît û di hebûna xwê de kêmbûnek kêmtir di vegirtinê de destnîşan kir. Ev encam ji molekulî re hatin girêdan. danûstendin û astengkirina sterîk bi stûna bingehê di hîbrîdên ADNyê de. Encamên me bi raporên di wêjeyê de li ser lêkolînên spektroskopî yên tevhevkirina MB-DNA-yê ku hîpokromatîzmê bi kêmbûna asta enerjiyê re di \(\pi\)-\(\pi ^*\ re têkildar in re hevaheng in. ) Veguheztinên elektronîkî yên ji ber navbeynkariya Qatên 36, 37, 38.
Elektroforeza gel agarozê ya fagê Phi6: Berhemên PCR yên dirêjî \(117\,\hbox {bp}\) û \(503\,\hbox {bp}\) ji nimûneyên ava golê. Markera M-DNA;Kontrola NTC-bê-şablon, primerên ku amplikonên têkildar hene;Kontrola erênî ya PC;Nimûneyên ava golê 1, 2, 3-neqilandî (1:1) sê caran tê dîtin. Ji ber oligonukleotîdên nehatine bikaranîn li \(503\,\) bendek li \(\nêzîkî 50\,\hbox {bp}\) xuya dike. hbox {bp}\) rê.
Me karanîna senzorê bi karanîna nimûneyên ava Gola Powai-yê ku bi fagê Phi6 ve hatî qewirandin nirxand. Kêmbûna RNA ya ku ji nimûneyên ava fagê-spîkkirî hatî veqetandin di navbera 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), dema ku yên ji suspensionên fagê yên paqijkirî hatine veqetandin. RNA hate texmîn kirin ku \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) bi karbidestiya vegerandinê bi qasî 1 be. %RNA berevajî li cDNA hate transkripkirin û wekî şablon ji bo PCR û qPCR hate bikar anîn. Mezinahiya hilberê beriya ceribandina bi senzorê bi elektroforez gêla agarose hate piştrast kirin (Wêne 5). Her weha amplikonên balkêş. Nirxên Ct yên ku di dema qPCR-ê de hatine tomar kirin (Table 1) hate destnîşan kirin ku bi giraniya RNA-ya ku ji nimûneyên avê yên pîvazkirî yên têkildar ve hatî veqetandin re têkildar e. Nirxa Ct hejmara çerxên ku ji bo sînyala fluorescentê hewce dike diyar dike. ji bend an sînyala paşerojê derbas bike.Nirxên Ct-yê yên bilind hûrbûna şablonê kêmtir nîşan dide û berevajî. Kontrola erênî û nimûneya ceribandinê bêtir destnîşan dike ku her nimûneya ceribandinê li gorî kontrola erênî bi qasî% 1 şablon heye. Me berê nîqaş kir ku amplikonên dirêjtir dibe sedema hestiyariyek çêtir. Ji ber kêmasiyan zêdekirina perçeyên dirêj ên ku ji nimûneyên hawîrdorê yên heterojen têne veqetandin dijwar e. kêmbûna giraniya vîrusê û hilweşandina RNA. Lêbelê, bi protokola xweya dewlemendkirina vîrus û zêdekirina PCR-ê, me karî bi serfirazî perçeya \(503\,\hbox {bp}\) ji bo hestiyariya elektrokîmyayî zêde bikin.
Figure 6 encamên senzora elektrokîmyayî ya amplikona parçeya \(503\,\hbox {bp}\) nîşan dide, hem cDNA-ya neqilandî wekî şablon (1:1) û hem jî cDNA-ya 100 qatî wekî şablon (1:100) bikar tîne PCR-ê pêk tîne. , li gorî NTC û PC-yê (li Figure S4 di Agahiyên Pêvek de ji bo voltamogramên temsîlî binêre).Her qutiyek di xêznameya 6-an de pîvandinên sê nimûneyan li 5 elektrodê dihewîne. Heman elektrod ji bo pîvandina hemî nimûneyan hatin bikar anîn da ku xeletiyên ji ber elektrodê nebin. Guhertoya -ji-elektrodê re. Li gorî pîvandinên CV, pîvandinên DPV çareseriyek çêtir nîşan didin da ku nimûneyên test û PC-yê ji NTC-yê cuda bikin ji ber ku, wekî ku berê hate behs kirin, herikên Faradaîk ji ber herikên kapasîteyên paşîn ên di ya paşîn de têne veşartin. Ji bo amplikonên dirêjtir, me dît ku Kontrola neyînî (NTC) li gorî kontrola pozîtîf di asta lûtkeya CV û DPV de zêde bû, di heman demê de nimûneyên ceribandinê yên erênî û neqilandî bilindahiyên lûtkeyê yên lûtkeya DPV-ê yên wekhev nîşan dan. Nirxên navîn û navîn ên pîvandî ji bo her yek neqilandî (1:1 ) Nimûneya ceribandinê û PC dikare bi zelalî ji derana senzorê ji bo nimûneya NTC were çareser kirin, di heman demê de çareseriya ji bo nimûneya şilandî ya 1:100 kêmtir eşkere ye. Ji bo 100 qat rijandina cDNA, me di dema elektroforeziya gel de ti bend nedîtin. (rêyên ku di xêza 5-ê de nehatine xuyang kirin), û pêlên lûtkeyê yên DPV û CV yên têkildar mîna yên ku ji bo NTC-yê dihat hêvîkirin bûn. Encamên ji bo perçeya \(117\,\hbox {bp}\) di Agahdariya Pêvek de têne xuyang kirin. Negatîf kontrolê ji senora PCB re bersivek elektrokîmyayî peyda kir ji ber adsorbkirina MB-ya belaş li ser elektrodê û pêwendiya MB bi oligonukleotîdê yekem-zindî re. Ji ber vê yekê, her gava ku nimûneyek tê ceribandin, divê kontrolek neyînî were meşandin û lûtkeya lûtkeya nimûneya testê li gorî lûtkeya ku ji hêla kontrola neyînî ve hatî bidestxistin ji bo bidestxistina pîvanek cûda (relativ)39,40 ku nimûneya ceribandinê wekî erênî an neyînî dabeş bike.
(a) DPV, û (b) lûtkeya niha ya CV ji bo vedîtina elektrokîmyayî ya \(503\,\hbox {bp}\) perçeyên di nimûneyên ava golê de. Nimûneyên ceribandinê sê caran hatin pîvandin û li gorî bê kontrolên şablonê (NTC) û kontrolên erênî (PC).
Vedîtinên me mekanîzmayên cihêreng ên ku bandorê li performansa senzorên elektrokîmyayî dikin ji bo amplikonên bi dirêjiyên cihêreng ên ji bo DNAyên cihêreng destnîşan dikin, digel ku tansiyonên ku ji hêla pîvandinên optîkî ve bi karanîna spektrofotometerek UV/Vis ve hatine verast kirin. Çavdêriyên me têgihîştina ku dirêjtir perçeyên DNA-yê heta \(\nêzîkî\) vedibêjin. \(500\,\hbox {bp}\) dikare bi hesasiyeta bilindtir were tesbît kirin û ku hebûna xwê ya di nimûneyê de hestiyariya DNA ya ku bandorê li hestiyariya bilind nake (kêm caran \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) û li jor). Wekî din, me bandora cûrbecûr nimûneyan lêkolîn kir, di nav de amplikonên paqijkirî yên gelî bi û bê xwêya lêzêdekirî, û zêdekirina nimûneyên ava golê di pîvandinên DPV û CV de.Me dît ku DPV çareseriyek çêtir peyda dike, ji ber ku herika kapasîteyê ya paşîn jî bandorê li pîvana CV dike, û wê kêmtir hesas dike.
Zêdekirina perçeyên dirêj bi yekparebûna RNA-ya genomî ya vîrus ve girêdayî ye. Gelek lêkolînan destnîşan kirin ku zêdekirina perçeyên dirêjtir her gav ne bikêr e ji ber hilweşîna RNA li hawîrdorê û potansiyela jihevketina di dema veqetandinê de11,41,42,43,44. .Me dît ku rêbaza berhevkirina vîrusê ya PEG-ê di berhevkirina fagê Phi-6-ê de ku di nimûneyên ava golê de hatî rijandin ji rêbaza berhevkirina vîrusê ya hîdroksîd a aluminium-ê bi bandortir e. Qabiliyeta tespîtkirina perçeyên dirêj ên DNA-yê îspat kir ku hewcedariya ji bo PCR-ya multiplex derbas dike. ji bo zêdekirina gelek şablonên dirêjahiya kurttir û kêmkirina îhtîmala xaç-taybetmendiyê.
Nimûneyên biyolojîkî kêm in, ji ber vê yekê pêdivî bi sêwirana biyosensorek heye ku ji bo ceribandinê nimûneyên herî kêm hewce dike. Elektrodên PCB yên ENIG ku di vê lêkolînê de têne bikar anîn tenê \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ hewce dike ) Nimûneyên ji bo ceribandinê ji bo vegirtina qada bandorker a elektrodê. Wekî din, heman elektrod dikare piştî paqijkirinê ji nû ve were bikar anîn berî ku nimûneya din were belavkirin. Nimûneyên zêdekirî ji bilî metîlen şîn, ku erzanek e û kîmyewî bi gelemperî tê bikar anîn. Ji ber ku her elektrodek bi qasî 0,55 $ (an 40 INR) lêçûn dike ji bo çêkirinê, ev biyosensor dikare ji teknolojiyên tespîtkirina heyî re bibe alternatîfek biha-bandor. Tablo 2 berawirdkirina vî karî bi senzorên din ên ku di wêjeyê de ji bo dirêj hatine ragihandin nîşan dide. Parçeyên DNA di nimûneyên heterojen de.
Ji ber ku protokolên vedîtina elektrokîmyayî yên li ser bingeha MB xwe dispêre taybetmendiya PCR-ê, sînordariyek sereke ya vê rêbazê potansiyela zêdekirina netaybetî di nimûneyên heterojen ên wekî ava çolê û ava golê de an jî karanîna prîmerên kêm-paqijî ye. Ji bo baştirkirina hestiyariyê Rêbazên vedîtina elektrokîmyayî ji bo vedîtina DNA ya hilberên PCR-ya nepaqijkirî bi karanîna elektrodên ENIG PCB yên neguhêrbar, pêdivî ye ku xeletiyên ku ji hêla dNTP û prîmerên nehatine bikar anîn ve çêtir werin fam kirin, û şert û mercên reaksiyonê û protokolên ceribandinê xweştir bibin. Parametreyên fizîkî-kîmyayî yên din ên wekî pH, germahî û biyolojîkî Pêdivî ye ku hewcedariya oksîjenê (BOD) ya nimûneya avê jî pêdivî ye ku were pîvandin da ku rastbûna pîvandinê baştir bike.
Di encamnameyê de, em ji bo tespîtkirina vîrusê di nimûneyên hawîrdorê (ava golê) de senzorek ENIG PCB-ya elektrokîmyayî ya erzan pêşniyar dikin. Berevajî elektrodên oligonukleotîd ên bêbandor an substratên xwerû yên ji bo hestiyariya DNA-yê ku ji bo domandina hestiyariyê pêdivî bi hilanîna kryojenîk hewce dike, 53,54 teknîka me PCB-ya neguherbar bikar tîne. Elektrodên ku temenê wan dirêjtir e û ne hewcedariyên hilanînê yên taybetî ne û ji ber vê yekê ji bo pêşkeftina çareseriyên pîvandinê bi hilberandina nimûneya otomatîkî ya ku di LMIC-an de têne bicîh kirin guncan e. Biosensor ji bo tespîtkirina bilez a amplikonên armancê boyaxên redox-navbera DNA-ya erzan (MB) bikar tîne. Zêdekirina netaybetî di nimûneyên hawirdorê de hevpar taybetmendiya vê rêbazê hestyariyê kêm dike ji ber girêdana netaybetî ya MB bi oligonukleotîdên yek- û du-zindî re. Ji ber vê yekê, taybetmendiya vê testê bi xweşbîniya primmeran û şertên reaksiyona PCR ve girêdayî ye. Wekî din, CV û herikîna lûtkeya DPV ya ku ji nimûneyên ceribandinê têne wergirtin divê bi bersivên ku ji kontrola neyînî (NTC) ji bo her ceribandinê têne wergirtin werin şîrove kirin. Sêwiran û rêbazên sensorên elektrokîmyayî yên ku di vê xebatê de têne pêşkêş kirin dikarin bi nimûneyên otomatîkî re werin yek kirin da ku amûrek bi tevahî otomatîk û kêm pêşve bibin. -Çareseriya lêçûnê ya ku dikare nimûneyan berhev bike û analîz bike û bi bêtêlê encaman vegerîne laboratîfê.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Rêbazên ji bo berhevdana destpêkê ya vîrusan ji nimûneyên avê: vekolînek û meta-analîzek lêkolînên dawî.J.Application.microorganism.115, rûpel 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Vîrûsên Waterborne: Astengên li ber ava vexwarinê ya ewle. PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Epîdemîolojiya ava çolê ji bo lêçûn-bandor çavdêriya mezin a COVID-19 li welatên dahata kêm û navîn: dijwarî û derfet.Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Elektrokîmyaya asîda nukleîk.Kîmya.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylene blue wekî cudakerek elektrokîmyayî ya oligonukleotîdên yek- û du-zindî yên ku li ser substratên zêr têne neguheztin. Analyst 126, 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparison of Cation and Anion Intercalators for Electrochemical Transduction of DNA Hybridization by Long-Range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Veguheztina barkirinê bi DNA: biosensor.anus.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006) DNAya elektrokîmyayî ya bijartî.
Fang, TH et al. Amûra mîkrofluîdî ya PCR-ya rast-dem bi vedîtina elektrokîmyayî ya hevdem. Sensorê biyolojîkî. Bioelektronîk.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. Lêkolîna mekanîzmaya nîşankirinê û verastkirina performansê ya pergalek PCR-ya rastîn a elektrokîmyayî ya ku li ser bingeha danûstendina methylene blue bi DNA re ye. Analyst 136, 1573-1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al. Sensorek elektrokîmyayî ya li ser bingeha zêdekirina îzotermîk a bi navbeynkar Loop ji bo tespîtkirina sars-cov-2 di nimûneyên ava bermayî de.J.Environment.Chemical.Brîtanya.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al. Heskirina elektrokîmyayî ya amplikonên SARS-CoV-2 bi elektrodên PCB. Sensor tê aktîfkirin.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Tespîtkirina bikêrhatî ya SARS-CoV-2 RNA di perçeya zexm a ava bermayî.science.civîna giştî.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al. Rêbazên Analîtîk ên Ji bo Tespîtkirina SARS-CoV-2 Di Avava Avhewayê de: Protokol û Perspektîfên Pêşerojê.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Rizgarbûna bakteriofajê zerfkirî Phi6 (ji bo SARS-CoV-2 cîgir) di dilopên xwê yên hilmikî yên ku li ser rûyên camê hatine razandin.zanist.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Berdewamiya jîngehê ya surrogatek SARS-CoV-2 (Phi6) di amoeba azad de.J.Tenduristiya Avê 20, 83 (2021).
Mindich, L. Paqijkirina rast a sê perçeyên genomîk ên bakteriofajê yên ARN-ya dubendî\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149-160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Struktura duyemîn a fagê DH RNA\(\varphi\)6 herêma pakkirinê.RNA 6, 880-889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap - Protokolek bilez û bikêrhatî ji bo amadekirina stokên laboratîf ên bakterîofajan. PeerJ 4, e2261 (2016).
Dema şandinê: Gulan-27-2022