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환경 샘플 모니터링의 중요성은 COVID-19 대유행이 시작된 이래로 매우 높이 평가되었으며 qPCR 기반 기술은 비용이 많이 들지만 일부 모니터링 노력은 황금 표준을 사용하여 수행되고 있습니다. 전기화학 DNA 바이오센서는 잠재적으로 비용 효율적인 저소득 및 중간 소득 국가의 환경 수질 샘플 모니터링을 위한 솔루션. 이 작업에서는 ENIG를 사용하여 스파이크된 호수 물 샘플(SARS-CoV-2에 대한 인기 있는 대체물)에서 분리된 Phi6 파지에서 얻은 앰플리콘의 전기화학적 검출을 시연합니다. 표면 개질 없이 PCB 전극을 완성합니다.전기화학적 센서 반응은 길이가 다른 두 개의 DNA 조각(\({117}\,\hbox {bp}\) 및 \({503}\,\hbox {bp}\))에 대해 철저히 특성화되었으며 메틸렌 블루(MB)-DNA 상호 작용에 대한 PCR 마스터 믹스의 염 효과. 우리의 결과는 DNA 조각의 길이가 전기화학적 민감도를 크게 결정하고 PCR 제품의 겔 정제 없이 긴 앰플리콘을 검출하는 능력이 이 작업에서 입증되었음을 보여줍니다. 물 샘플의 현장 측정에 중요합니다.바이러스 부하에 대한 완전 자동화 솔루션은 좋은 징조입니다.
수인성 바이러스 전파는 1940년대부터 공중 보건 위험으로 알려져 왔으며, 소아마비와 E1형 간염의 수인성 전파에 대한 최초의 증거가 있습니다. 검출 방법은 매우 민감하고 특이적이지만 고가의 장비를 사용하여 실험실에서 테스트하려면 숙련된 인력이 필요한 골드 표준 qPCR 기반 기술에 의존합니다. 그러나 자원이 제한된 저소득 및 중간 소득 국가(LMIC)에서는 인간 샘플 테스트는 환경 용수 샘플 모니터링보다 우선할 가능성이 높습니다. 따라서 저소득 및 중간 소득 국가에서 새로운 질병 발생에 대한 조기 경고로 물 및 폐수 샘플을 지속 가능하고 실시간으로 모니터링하기 위한 대체 저비용 방법이 필요합니다. 따라서 바이러스 대유행의 심각한 사회경제적 영향으로부터 그들을 보호합니다. 핵산에 대한 저비용 전기화학적 바이오센서는 이 미충족 수요에 대한 유망한 잠재적 솔루션을 제공할 수 있습니다. 이러한 DNA 바이오센서 중 다수는 상보적인 DNA 가닥이 전극에 고정되어 있다는 사실에 의해 작동합니다. 샘플에 일치하는 서열이 존재할 때 표면과 혼성화합니다. 이것은 칼륨 철/페로시안화물과 같은 산화환원 매개체를 사용하는 다양한 전기화학적 기술에 의해 신호로 변환될 수 있습니다. 메틸렌 블루(MB)는 이러한 산화환원 활성 분자 중 하나이며, 단일 가닥 DNA5,6에 대한 보다 비특이적인 결합 외에도 이중 가닥 DNA(dsDNA)에 삽입되는 것으로 보고되었습니다. 센서 구성5,6,7,8,9. DNA에 대한 MB의 인터칼레이션은 비특이적이고 이 전기화학 센서의 특이성은 PCR 또는 등온 증폭에 사용되는 프라이머의 순도에 크게 의존하지만 실제 구현에 매우 적합합니다. -시간 전기화학 기반 qPCR 또는 DNA 농도 측정의 대안으로서의 형광 등온 증폭 9 .Won et al. DPV(Differential Pulse Voltammetry)를 사용하여 MB로 PCR 앰플리콘 측정9.다른 경우에는 Ramirez 등. 스크린 인쇄 전극이 있는 MB를 사용하여 RT-LAMP 반응에 의해 폐수에서 SARS-CoV-2 검출. 백금 전극도 반응 8 동안 전기화학적으로 앰플리콘을 감지하도록 설계된 미세유체 PCR 플랫폼에서 현장 전극으로 사용됩니다. 이러한 모든 연구는 전극의 표면 수정이 필요하며, 이는 이러한 기능화된 전극의 안정성을 위한 특수한 저장 요구 사항으로 인해 생산 및 운영 비용이 증가함을 의미합니다.
호수 물 샘플에서 농축된 바이러스 입자로부터 얻은 앰플리콘의 전기화학적 검출을 위한 워크플로의 개략도.
우리는 최근 수정되지 않은 전극의 표면에 MB-DNA 복합체의 흡착에 의해 유도된 DPV 및 순환 전압 전류법(CV)을 기반으로 하는 저비용 인쇄 회로 기판(PCB) 전극으로 SARS-CoV-2 증폭물의 전기화학적 감지를 시연했습니다. 현재11.더 긴 DNA 단편(CDC 권장 N1 정방향 및 N2 역방향 프라이머를 사용하여 형성된 N1-N2, \({943}\, \hbox)는 짧은 단편 {bp}\)에 비해 센서 응답에서 더 나은 선형성을 보였다고 보고합니다. (N1, \(72\,\hbox {bp}\))는 N1 정방향 및 N1 역방향 프라이머 세트를 사용하여 형성되었습니다. 이러한 연구는 뉴클레아제가 없는 물에서 준비된 DNA 희석액을 사용하여 보고됩니다. 플랫폼은 SARS-CoV 검출에도 사용되었습니다. - 시뮬레이션된 폐수 샘플의 2개 앰플리콘(SARS-CoV-2 RNA로 총 RNA 샘플을 스파이킹하여 획득). RNA는 분리 및 다운스트림 처리 중에 전단에 취약하기 때문에12,13 이 이종 샘플로 더 긴 조각을 증폭하기 어렵습니다. 따라서 폐수에서 SARS-CoV-2 앰플리콘의 전기화학적 감지 시연은 더 짧은 \(72\,\hbox {bp}\) N1 조각으로 제한됩니다.
이 작업에서 우리는 호수 물 샘플에서 농축 및 분리된 파지 Phi6의 ENIG PCB 기반 전기화학 감지의 가능성을 조사했습니다(그림 1). Phi6 파지는 크기(80-100nm)가 SARS-CoV-2 및 또한 지질막과 스파이크 단백질을 가지고 있습니다. 이러한 이유로 박테리오파지 Phi6는 SARS-CoV-2 및 기타 외피가 있는 병원성 RNA 바이러스에 대한 인기 있는 대용물입니다14,15. 파지 입자에서 분리된 RNA는 cDNA 합성을 위한 주형으로 사용되었습니다. PCR을 통해 117개 및 503개 염기쌍 길이의 두 DNA 조각을 얻습니다. 이전 작업에서 \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 조각을 증폭하는 문제를 감안할 때 중간 길이 조각(\(117 \,\hbox {bp}\) 및 \(503 \,\hbox {bp}\)), 사용 가능한 프라이머를 기반으로 합니다. 전기화학 센서 응답은 넓은 농도 범위(\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) to \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) MB의 존재, 센서 응답에 대한 염의 영향은 분광 광도계 측정에 의해 특성화되고 교차 검증되었습니다. 이 작업의 주요 기여는 다음과 같습니다.
DNA 조각 길이와 시료 내 염의 존재는 민감도에 큰 영향을 미칩니다.우리의 결과는 전기 화학적 활성이 DNA 농도와 길이에 따라 전압 전류 반응에서 MB, DNA 및 센서의 상호 작용의 다른 메커니즘에 의존한다는 것을 보여줍니다. 더 긴 단편은 더 높은 감도를 나타냅니다. MB와 DNA.
DNA 농도는 수정되지 않은 전극에서 MB-DNA 상호 작용의 메커니즘을 결정합니다. 우리는 MB-DNA 상호 작용의 다른 메커니즘이 DNA 농도에 의존한다는 것을 보여줍니다. 소량의 DNA 농도에서 \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), 우리는 전기화학적 전류 반응이 주로 전극에 대한 MB-DNA의 흡착에 의해 결정되는 반면 낮은 농도에서는 높은 DNA 농도에서 전기화학적 전류 반응은 산화환원의 입체적 억제에 의해 결정됨을 관찰했습니다. DNA 염기쌍 사이의 MB 삽입으로 인한 활성.
Lake Water 샘플에서 바이러스 핵산의 ENIG PCB 기반 전기화학적 감지 관찰 결과는 IIT Mumbai Campus의 Powai Lake 물 샘플에서 얻은 Phi6 추가 \(503\,\hbox {bp}\) DNA 단편의 전기화학적 검출로 검증되었습니다. 결과 파지.
저장 수명이 더 긴 전극의 전자동 모니터링 시스템, 올리고뉴클레오티드 또는 앱타머에 통합할 수 있는 낮은 구현 비용 및 가능성.
Phage Phi6는 Pseudomonas syringae를 감염시키는 Cytoviridae family의 외피가 있는 dsRNA 바이러스입니다. \,\hbox {Kb}\)) 및 L(\(6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Phi6 파지는 비병원성 BSL-1 슈도모나스 균주를 감염시키기 때문에 사용하는 것이 안전합니다. 실험실에서 쉽게 성장할 수 있습니다. Phage Phi6 및 숙주 Pseudomonas syringae는 캐나다 Laval University의 Felix d'Herelle 세균 바이러스 참조 센터에서 구입했습니다(참조 센터 카탈로그 번호는 각각 HER-102 및 HER-1102임). .Phi6 파지 및 그의 숙주는 참조 센터의 지시에 따라 부활시켰다. Phage Phi6는 플레이트 용해 및 용출에 의해 정제되어 \(\약 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (플라크 형성 단위/밀리리터). 제조업체의 지침에 따라 GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit(Sigma-Aldrich)를 사용하여 정제된 파지 입자로부터 RNA를 분리했습니다. 간단히 말해서, 정제된 파지 Phi6 현탁액\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\)을 용해하고 용해물을 스핀 컬럼에 로드하여 RNA가 레진 컬럼에 결합할 수 있도록 했습니다. 그런 다음 RNA는 용출 용액에서 용출됩니다 \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) 키트에서 제공합니다. \(260\,\hbox {nm}\)에서 흡광도로 RNA의 농도를 추정합니다. RNA는 \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) 추가 사용까지.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA 합성 키트(Bio -Rad Laboratories)를 제조업체의 지침에 따라 cDNA 합성을 위한 템플릿으로 사용했습니다. 간단히 말해서, cDNA 합성 반응은 3단계로 구성됩니다: \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\에서 프라이밍 )\({5}\,{\hbox {min} }\) , \({20}\,{\hbox {min}}\)의 역전사: \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) 및 역방향 레코더는 \({1}\,{\hbox {min에 대해 \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)에 있습니다. }}\). 1% 아가로스 겔에서 실행할 때, cDNA는 예상되는 3개의 RNA 단편에 해당하는 3개의 밴드를 나타냈습니다(데이터는 표시되지 않음). 다음 프라이머는 길이가 117 및 503 bp인 2개의 DNA 단편을 증폭하는 데 사용되었습니다. miniPCR® mini8 열 순환기에서 PCR용 템플릿으로 cDNA 사용:
\(117\,\hbox {bp}\) 및 \(503\,\hbox {bp}\)에 대한 프라이머는 각각 M 세그먼트의 1476-1575개 뉴클레오티드와 L 세그먼트의 458-943개 뉴클레오티드에 해당합니다. .모든 증폭된 PCR 산물은 1% agarose gel에서 전기영동하였고 증폭된 target DNA는 GeneJET Gel Extraction Kit(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 정제하였다.
IIT 뭄바이 캠퍼스의 호수(Powai Lake, Powai, Mumbai)는 파지 입자를 추가하는 데 사용되었습니다. 호수 물은 \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) 멤브레인을 통해 여과되어 제거되었습니다. 현탁 입자, 그리고 나서 Phi6 파지가 추가되었습니다. \({1}\,{\hbox {ml}}\) of \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} 추가 \) ~ \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) 여과된 호수 물, \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). 플라크 분석에 의한 바이러스 부하 측정을 위해 예약되었습니다. 스파이크된 Phi6 바이러스 입자를 농축하기 위해 두 가지 다른 방법을 테스트했습니다. (2) ) 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 기반 바이러스 농축 방법은 Flood et al.20 .수산화알루미늄법에 비해 PEG 기반법의 회수효율이 우수하므로 호수물 시료에서 Phi6 입자를 농축하기 위해 PEG법을 사용하였다.
사용된 PEG 방법은 다음과 같습니다: PEG 8000 및 \(\hbox {NaCl}\)를 Phi6 스파이크 호수 샘플에 첨가하여 8% PEG 8000 및 \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\). 샘플을 진탕기에서 배양했습니다\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), 그런 다음 \(4700 \,\hbox {g}\)에서 원심분리하면 \({45}\,{\hbox {min}}\)입니다. 상층액을 버리고 펠릿을 \({1}\, {\hbox {ml}}\) 동일한 상청액에. 모든 스파이킹 및 바이러스 농도 실험은 3중으로 수행되었습니다. 농축 후, 플라크 분석에 의한 회수 효율 측정을 위해 작은 분취량을 남겨두었습니다. RNA는 이전에 설명한 대로 분리되고 용출되었습니다. 키트에서 제공하는 용출 버퍼에서\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). RNA 농도는 샘플마다 3중으로 다르기 때문에 \({2}\,{\upmu \ RNA의 hbox {l}}\)는 농도에 관계없이 세 가지 모두에 사용됩니다. 샘플의 cDNA 합성 cDNA 합성은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA 35주기 동안 \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR의 템플릿으로 사용되어 \(117\,\hbox {bp}\) 및 \(503\,\hbox { bp}\) 단편. 이 샘플은 "1:1", 즉 희석하지 않은 상태로 표시됩니다. 음성 대조군으로 템플릿 없는 대조군(NTC)을 설정하고, 정제된 파지에서 분리한 RNA를 사용하여 합성한 cDNA를 설정했습니다. Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix(Agilent Technologies)를 사용하여 Stratagene Mx3000P RT-PCR 기기에서 정량적 PCR(qPCR)을 수행했습니다. 반응은 이전과 같이 3중으로 설정했습니다. 사이클 임계값(Ct)은 모든 샘플에 대해 기록되었습니다. 또한, 희석된 샘플은 여과된 호수 물에서 1:100으로 희석된 cDNA를 사용하여 \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) 35주기 동안 PCR. 이 샘플은 "1:100"으로 표시됩니다.
PCB 전극은 추가적인 금도금 없이 상업적으로 이용 가능한 저비용 ENIG(Electroless Nickel Immersion Gold) 공정을 사용하여 제작됩니다. ENIG PCB 전극 사양은 이전 작업11에 자세히 설명되어 있습니다. ENIG PCB 전극의 경우 다음과 같은 전통적인 전극 세척 방법 피라냐 용액 또는 황산 순환 전압전류법은 얇은 금층(두께 \(\approx\) \(100\,\hbox {nm }\))을 벗겨내고 쉽게 벗겨지기 쉬운 기본 구리층을 노출시킬 수 있으므로 권장되지 않습니다. 부식 21, 22, 23, 24, 25. 따라서 IPA에 적신 보푸라기가 없는 천으로 전극을 청소하십시오. 테스트할 샘플은 \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) 쉬운 삽입을 위해 \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\)의 MB. 이전 작업에서 , 우리는 MB 농도를 증가시킴으로써 센서의 감도와 선형성이 개선되었음을 관찰했습니다. 11. 이전 작업에서 보고된 최적화를 기반으로 \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\)MB 이중 가닥 DNA(ds-DNA)의 전기화학적 검출은 음이온 또는 양이온 인터칼레이터를 사용하여 달성할 수 있습니다.음이온 인터칼레이터는 더 나은 선택성으로 DNA를 검출하지만 밤새 배양해야 하므로 검출 시간이 길어집니다.On 반면에 MB와 같은 양이온 인터칼레이터는 ds-DNA6의 전기화학적 검출을 위해 약 \({1}\,{\hbox {h}}\) 더 짧은 배양 시간이 필요합니다. 각 측정에는 테스트할 샘플을 electrode\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), 다른 샘플을 진행하기 전에 IPA에 적신 헝겊으로 청소합니다.별도의 언급이 없는 한 각 샘플은 5개의 서로 다른 전극에서 테스트되었습니다. DPV 및 CV 측정은 PalmSens Sensit Smart potentiostat를 사용하여 수행되었으며 PSTrace 소프트웨어는 피크 전류 계산을 포함하여 potentiostat 구성 및 데이터 수집에 사용되었습니다. 다음 설정이 사용됩니다. DPV 및 CV 측정:
DPV: 평형 시간 = \(8\,\hbox {s}\), 전압 단계 = \(3\,\hbox {mV}\), 펄스 전압 = \(25\,\hbox {mV}\) , 펄스 지속 시간 = \(50\,\hbox {ms}\), 스캔 속도 = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: 평형 시간 = \(8\,\hbox {s}\), 전압 단계 = \(3\,\hbox {mV}\), 스윕 속도 = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV 및 CV 전압전류도는 ENIG PCB 전극 \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\)MB(농도 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) 즉 \(117\,\hbox {bp}\ ) 및 0.03에 대해 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) for \(503\,\hbox {bp}\)). 대표적인 전압전류도는 보충 정보의 그림 S1에 나와 있습니다. 그림 2는 결과를 보여줍니다. 겔 정제 PCR 제품을 사용한 DPV 및 CV 측정(피크 전류). CV 측정과 비교하여 DPV 측정은 CV 측정의 배경 용량성 전류가 패러데이 전류를 숨기기 때문에 더 높은 감도(DNA 농도의 함수로서의 전류)를 나타냅니다 26. 데이터 boxplot의 각 상자에는 5개 전극의 측정값이 포함되어 있습니다. 모든 측정값은 동일한 전극 세트를 사용하여 전극 간 변동으로 인한 측정 오류를 방지합니다. DPV 및 CV에서 증가하는 추세를 관찰하고 낮은 DNA 농도에 대한 CV 측정 피크 전류를 관찰했습니다. , 더 긴 (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\와 비교하여 \(117) ) 단편. 이는 이전 작업에서 보고된 전극 흡착의 예상 경향과 일치합니다. MB-DNA 복합체의 흡착은 전극에서 전하 이동을 촉진하여 피크 전류의 증가에 기여합니다. 다른 연구에서는 올리고뉴클레오티드 크기와 서열이 MB-DNA 삽입에 미치는 영향을 보여주었습니다27,28,29,30. 구아닌 - 2개의 앰플리콘(\(117\,\hbox {bp}\) 및 \(503\,\hbox {bp}\))의 시토신(GC) 함량은 약 50%였으며, 이는 관찰 차이가 원인임을 나타냅니다. 그러나 더 높은 DNA 농도(\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), \(503\,\hbox {bp} \) 및 \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) \(117\,\hbox {bp}\))에 대해 두 가지 증폭을 관찰합니다. 서브의 피크 전류는 DPV 및 CV 측정 모두에서 감소합니다. 이것은 MB가 DNA의 염기쌍 사이를 포화 및 삽입하여 MB31,32에서 환원성 그룹의 산화환원 활성을 입체적으로 억제하기 때문입니다.
현재 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl}_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
PCR 마스터 믹스에 존재하는 염은 MB와 DNA 간의 정전기적 상호 작용을 방해하므로 \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\)와 \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB-DNA 상호작용에 대한 염의 영향을 연구하기 위한 MB 겔 정제 제품. hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) 및 \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) for \(117\,\hbox {bp} \)), DPV 및 CV에서 염의 추가는 측정에 큰 영향을 미치지 않았습니다(대표 전압 전류도에 대한 보충 정보의 그림 S2 참조). DNA 농도가 낮으면 소금을 추가하면 감도가 크게 감소하여 DNA 농도에 따른 전류의 큰 변화가 없습니다. MB-DNA 상호 작용 및 삽입에 대한 소금의 유사한 부정적인 영향은 이전에 다른 연구자33,34에 의해 보고되었습니다.\(\hbox { Mg}^{2+}\) 양이온은 DNA의 음의 인산염 백본에 결합하여 MB와 DNA 사이의 정전기적 상호작용을 방해합니다. 센서 응답에 크게 영향을 미치지 않습니다. 핵심은 이 바이오센서가 더 높은 DNA 농도(드물게 \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) 이상)를 감지하는 데 더 적합하다는 것입니다. PCR 산물의 젤 정제가 가능하지 않을 수 있는 환경 용수 샘플의 완전 자동화 처리.
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB와 복잡한 DNA의 다양한 농도에 대한 파장 범위 600–700 \(\hbox {nm}\)에 대한 흡수 곡선 아래 면적: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) 염 유무(\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, 소금이 있거나 없는 \hbox {bp}\) (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB 샘플에 해당하는 DNA 농도 DNA 없음.
위의 결과를 더 확인하기 위해 UV/Vis 분광광도계(Thermo Scientific Multiskan GO)를 사용하여 광학 측정을 수행했으며, 각각에 대해 샘플 \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\)를 사용했습니다. 측정. 파장 범위 \(600\,\hbox {nm}\)에서 \(700\,\hbox { nm}\) , 그림 4(보충 정보의 그림 S3에 표시된 흡수 스펙트럼). DNA 농도가 \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), DNA 함유 샘플과 MB 전용 샘플(\(503\,\hbox {bp}\) 및 \(117\,\hbox {bp}\ ) 길이 조각), 산화환원 활성 MB의 입체적 억제가 없음을 나타냅니다. DNA 농도가 높을수록 흡광도 신호가 점진적으로 감소하는 것을 관찰하고 염이 있을 때 흡광도가 덜 감소하는 것을 관찰했습니다. 이러한 결과는 분자 DNA 하이브리드에서 염기 스태킹과의 상호작용 및 입체 억제. 우리의 결과는 저색소성과 \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) 인터칼레이션 레이어 36, 37, 38로 인한 전자 전이.
파지 Phi6의 아가로즈 겔 전기영동: 호수 물 샘플에서 길이 \(117\,\hbox {bp}\) 및 \(503\,\hbox {bp}\)의 PCR 산물. M-DNA 마커;NTC-no-template 컨트롤, 해당 앰플리콘을 포함하는 프라이머;PC 양성 대조군;1, 2, 3-희석되지 않은(1:1) 호수 물 샘플을 3중으로 첨가했습니다. \(503\,\ hbox {bp}\) 레인.
우리는 Phi6 파지가 첨가된 Powai Lake 물 샘플을 사용하여 센서의 유용성을 평가했습니다. 파지가 첨가된 물 샘플에서 분리된 RNA 농도는 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), 정제된 파지 현탁액에서 분리된 RNA는 복구 효율이 약 1인 \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\)인 것으로 추정되었습니다. %.RNA는 cDNA로 역전사되어 PCR 및 qPCR의 주형으로 사용되었습니다. 제품 크기는 센서로 테스트하기 전에 아가로스 겔 전기영동으로 확인되었습니다(그림 5). 이 샘플은 겔 정제되지 않았으므로 PCR의 모든 구성 요소를 포함합니다. qPCR 동안 기록된 Ct 값(표 1)은 해당 스파이킹된 물 샘플에서 분리된 RNA의 농도와 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다. Ct 값은 형광 신호에 필요한 사이클 수를 나타냅니다. 임계값 또는 배경 신호를 초과합니다. Ct 값이 높을수록 템플릿 농도가 낮고 그 반대도 마찬가지입니다. NTC 샘플의 Ct 값은 예상한 만큼 높았습니다. 양성 대조군과 테스트 샘플은 각 테스트 샘플이 양성 대조군에 비해 약 1%의 템플릿을 가지고 있음을 추가로 나타냅니다. 우리는 이전에 더 긴 앰플리콘이 더 나은 감도로 이어진다고 논의했습니다. 이기종 환경 샘플에서 분리된 더 긴 단편의 증폭은 단점을 고려할 때 도전적입니다. 낮은 바이러스 농도 및 RNA 분해. 그러나 바이러스 농축 및 PCR 증폭 프로토콜을 사용하여 전기화학 감지를 위한 \(503\,\hbox {bp}\) 조각을 성공적으로 증폭할 수 있었습니다.
그림 6은 희석되지 않은 cDNA를 주형으로 사용(1:1)하고 100배 희석된 cDNA를 주형으로 사용(1:100)한 \(503\,\hbox {bp}\) 단편 앰플리콘의 전기화학 센서 결과를 보여줍니다. , NTC 및 PC와 비교(대표적인 볼타모그램에 대한 보충 정보의 그림 S4 참조) -대-전극 변동. CV 측정과 비교하여 DPV 측정은 NTC에서 테스트 및 PC 샘플을 구별하는 더 나은 분해능을 보여줍니다. 이전에 언급한 바와 같이 패러데이 전류는 NTC의 백그라운드 용량성 전류로 인해 숨겨지기 때문입니다. 더 긴 앰플리콘의 경우 다음을 관찰했습니다. 음성 대조군(NTC)은 양성 대조군에 비해 더 높은 CV 및 DPV 피크 전류를 생성한 반면, 양성 및 희석되지 않은 테스트 샘플은 DPV 피크 전류의 유사한 피크 높이를 나타냈습니다. ) 테스트 샘플과 PC는 NTC 샘플의 센서 출력에서 명확하게 분리될 수 있는 반면 1:100 희석된 샘플의 분해능은 덜 뚜렷합니다. cDNA의 100배 희석의 경우 겔 전기영동 동안 어떠한 밴드도 관찰되지 않았습니다. (그림 5에 표시되지 않은 레인), 해당 DPV 및 CV 피크 전류는 NTC에 대해 예상되는 것과 유사했습니다. \(117\,\hbox {bp}\) 조각에 대한 결과는 보충 정보에 나와 있습니다. 컨트롤은 전극에 자유 MB가 흡착되고 MB와 단일 가닥 프라이머 올리고뉴클레오티드의 상호 작용으로 인해 PCB 센서에서 전기화학적 반응을 유도했습니다. 따라서 샘플을 테스트할 때마다 음성 컨트롤을 실행해야 하며 테스트 샘플을 양성 또는 음성으로 분류하기 위해 차동(상대) 측정39,40을 달성하기 위해 음성 대조군에서 얻은 피크 전류와 테스트 샘플의 피크 전류를 비교합니다.
(a) DPV, 및 (b) 호수 물 샘플에서 \(503\,\hbox {bp}\) 단편의 전기화학적 검출을 위한 CV 피크 전류. 테스트 샘플을 3회 측정하고 템플릿이 없는 컨트롤(NTC) 및 양성 대조군(PC).
우리의 연구 결과는 UV/Vis 분광 광도계를 사용하여 광학 측정으로 확인된 농도와 함께 서로 다른 DNA에 대해 서로 다른 길이의 앰플리콘에 대한 전기화학 센서의 성능에 영향을 미치는 서로 다른 메커니즘을 보여줍니다. \(500\,\hbox {bp}\)는 더 높은 감도로 감지할 수 있으며 샘플에 염이 존재해도 더 높은 감도에 영향을 미치지 않는 감도 DNA 농도(드물게 \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) 이상). 또한 염을 첨가하거나 첨가하지 않은 젤 정제 앰플리콘, DPV 및 CV 측정에서 호수 물 시료 첨가를 포함하여 다양한 유형의 시료에 대한 영향을 조사했습니다.백그라운드 용량성 전류도 CV 측정에 영향을 주어 덜 민감하게 만들기 때문에 DPV가 더 나은 분해능을 제공한다는 것을 관찰했습니다.
더 긴 단편의 증폭은 바이러스 게놈 RNA의 무결성에 따라 달라집니다. 여러 연구에 따르면 더 긴 단편의 증폭은 환경에서 RNA의 분해와 격리 중 스플라이싱 가능성으로 인해 항상 효율적인 것은 아닙니다11,41,42,43,44 .수산화알루미늄 기반 바이러스 농축법보다 PEG 기반 바이러스 농축법이 호숫물 시료에 첨가된 Phi-6 파지 농축에 더 효과적임을 관찰하였다. 길이가 더 짧은 여러 템플릿을 증폭하고 교차 특이성의 가능성을 줄입니다.
생물학적 샘플이 부족하여 테스트를 위한 최소한의 샘플이 필요한 바이오 센서를 설계할 필요가 있습니다. 본 연구에 사용된 ENIG PCB 전극은 \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\만 필요했습니다. ) 전극의 유효 면적을 커버하기 위한 테스트용 샘플. 또한, 다음 샘플을 분배하기 전에 동일한 전극을 세척 후 재사용할 수 있습니다. 각 전극의 제조 비용은 약 $0.55(또는 INR 40)이므로 이 바이오센서는 기존 감지 기술에 대한 비용 효율적인 대안이 될 수 있습니다. 표 2는 이 작업을 문헌에 오랫동안 보고된 다른 센서와 비교한 내용을 보여줍니다. 이기종 샘플의 DNA 단편.
MB 기반 전기화학적 검출 프로토콜이 PCR의 특이성에 의존한다는 점을 감안할 때, 이 방법의 주요 한계는 폐수 및 호수 물과 같은 이질적인 샘플에서 또는 저순도 프라이머를 사용하는 비특이적 증폭 가능성입니다. 수정되지 않은 ENIG PCB 전극을 사용하여 정제되지 않은 PCR 산물의 DNA 검출을 위한 전기화학적 검출 방법, 사용되지 않은 dNTP 및 프라이머에 의해 도입된 오류를 더 잘 이해하고 반응 조건 및 분석 프로토콜을 최적화하는 것이 필요합니다. 추가 물리화학적 매개변수(예: pH, 온도 및 생물학적 측정 정확도를 향상시키기 위해 물 시료의 산소 요구량(BOD)도 측정해야 할 수 있습니다.
결론적으로 우리는 환경(호수) 샘플에서 바이러스 검출을 위한 저비용 전기화학 ENIG PCB 센서를 제안합니다. 감도를 유지하기 위해 극저온 저장이 필요한 DNA 감지를 위한 고정화 올리고뉴클레오티드 전극 또는 맞춤형 기판과 달리53,54 우리의 기술은 수정되지 않은 PCB를 사용합니다. 저장 수명이 더 길고 특정 저장 요구 사항이 없으므로 LMIC에 배포된 자동 샘플 처리가 있는 측정 솔루션 개발에 적합합니다. 바이오센서는 저렴한 DNA 삽입 산화환원 염료(MB)를 사용하여 표적 앰플리콘을 신속하게 검출합니다. 비특이적 증폭 환경 샘플에서 흔히 볼 수 있는 단일 가닥 및 이중 가닥 올리고뉴클레오티드에 대한 MB의 비특이적 결합으로 인해 이 감지 방법의 특이성을 감소시킵니다. 따라서 이 테스트의 특이성은 프라이머 및 PCR 반응 조건의 최적화에 따라 달라집니다. 또한 CV 테스트 샘플에서 얻은 DPV 피크 전류는 각 테스트에 대해 음성 대조군(NTC)에서 얻은 응답과 관련하여 해석되어야 합니다. 이 작업에서 제시된 전기화학 센서 설계 및 방법은 자동 샘플러와 통합되어 완전 자동화되고 낮은 -샘플을 수집 및 분석하고 무선으로 결과를 실험실로 다시 전송할 수 있는 비용 솔루션.
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게시 시간: 2022년 5월 27일