សូមអរគុណសម្រាប់ការចូលមើល Nature.com.កំណែកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលអ្នកកំពុងប្រើមានកម្រិតគាំទ្រសម្រាប់ CSS។ សម្រាប់បទពិសោធន៍ដ៏ល្អបំផុត យើងសូមណែនាំឱ្យអ្នកប្រើកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលបានអាប់ដេត (ឬបិទរបៀបភាពត្រូវគ្នានៅក្នុង Internet Explorer) ក្នុងពេលជាមួយគ្នានេះ ដើម្បីធានាថា បន្តការគាំទ្រ យើងនឹងបង្ហាញគេហទំព័រដោយគ្មានរចនាប័ទ្ម និង JavaScript។
សារៈសំខាន់នៃការត្រួតពិនិត្យសំណាកបរិស្ថានត្រូវបានកោតសរសើរយ៉ាងខ្លាំងចាប់តាំងពីការចាប់ផ្តើមនៃជំងឺរាតត្បាត COVID-19 ហើយកិច្ចខិតខំប្រឹងប្រែងត្រួតពិនិត្យមួយចំនួនកំពុងត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើស្តង់ដារមាស បើទោះបីជាបច្ចេកទេសដែលមានមូលដ្ឋានលើ qPCR មានតម្លៃថ្លៃក៏ដោយ។ ឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា DNA អេឡិចត្រូគីមីអាចផ្តល់នូវការចំណាយដ៏មានប្រសិទ្ធិភាព។ ដំណោះស្រាយសម្រាប់ការត្រួតពិនិត្យសំណាកទឹកបរិស្ថានក្នុងប្រទេសដែលមានចំណូលទាប និងមធ្យម។ ក្នុងការងារនេះ យើងបង្ហាញពីការរកឃើញអេឡិចត្រូលីត្រនៃ amplicons ដែលទទួលបានពី Phi6 phage ដាច់ដោយឡែកពីសំណាកទឹកបឹងដែលរីករាលដាល (ជាពពោះជំនួសដ៏ពេញនិយមសម្រាប់ SARS-CoV-2) ដោយប្រើ ENIG ដើម្បីបំពេញអេឡិចត្រូត PCB ដោយគ្មានការកែប្រែផ្ទៃ។sex. ការឆ្លើយតបរបស់ឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាអេឡិចត្រូគីមីត្រូវបានកំណត់លក្ខណៈយ៉ាងហ្មត់ចត់សម្រាប់បំណែក DNA ពីរដែលមានប្រវែងខុសៗគ្នា (\({117}\,\hbox {bp}\) និង \({503}\,\hbox {bp}\)) និង ឥទ្ធិពលនៃអំបិលនៅក្នុងល្បាយមេ PCR លើអន្តរកម្មនៃមេទីលីនពណ៌ខៀវ (MB)-DNA ។ លទ្ធផលរបស់យើងបង្ហាញថាប្រវែងនៃបំណែក DNA កំណត់យ៉ាងសំខាន់នូវភាពប្រែប្រួលនៃអេឡិចត្រូគីមី និងបង្ហាញនៅក្នុងការងារនេះថា សមត្ថភាពក្នុងការរកឃើញ amplicons វែងដោយគ្មានការបន្សុតជែលនៃផលិតផល PCR គឺ សំខាន់សម្រាប់ការវាស់ស្ទង់ទីតាំងនៃសំណាកទឹក។ដំណោះស្រាយដោយស្វ័យប្រវត្តិយ៉ាងពេញលេញសម្រាប់ការផ្ទុកមេរោគបានយ៉ាងល្អ។
ការចម្លងមេរោគតាមទឹកត្រូវបានគេស្គាល់ថាជាគ្រោះថ្នាក់ដល់សុខភាពសាធារណៈចាប់តាំងពីទសវត្សរ៍ឆ្នាំ 1940 ជាមួយនឹងភស្តុតាងដំបូងនៃការឆ្លងជំងឺស្វិតដៃជើង និងជំងឺរលាកថ្លើមប្រភេទ E1។ អង្គការសុខភាពពិភពលោក (WHO) បានចាត់ថ្នាក់មេរោគឆ្លងតាមទឹកជាច្រើនដែលមានសារៈសំខាន់ចំពោះសុខភាព 2.Traditional virus វិធីសាស្ត្ររាវរកពឹងផ្អែកលើបច្ចេកទេសដែលមានមូលដ្ឋានលើ qPCR ស្តង់ដារមាស ដែលមានភាពរសើបខ្លាំង និងជាក់លាក់ ប៉ុន្តែត្រូវការបុគ្គលិកជំនាញដើម្បីធ្វើតេស្តនៅក្នុងបន្ទប់ពិសោធន៍ដោយប្រើឧបករណ៍ថ្លៃៗ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ នៅក្នុងប្រទេសដែលមានចំណូលទាប និងមធ្យម (LMICs) ដែលមានធនធានមានកម្រិត មនុស្ស ការធ្វើតេស្តគំរូទំនងជាមានអាទិភាពជាងការត្រួតពិនិត្យសំណាកទឹកបរិស្ថាន។ ដូច្នេះហើយ វិធីសាស្រ្តផ្សេងទៀតដែលមានតម្លៃទាបគឺចាំបាច់សម្រាប់ការត្រួតពិនិត្យប្រកបដោយនិរន្តរភាព និងពេលវេលាពិតប្រាកដនៃសំណាកទឹក និងទឹកសំណល់នៅក្នុងប្រទេសដែលមានចំណូលទាប និងមធ្យម ជាការព្រមានដំបូងនៃការផ្ទុះឡើងនៃជម្ងឺ។ ដោយហេតុនេះការពារពួកគេពីផលប៉ះពាល់សេដ្ឋកិច្ចសង្គមធ្ងន់ធ្ងរនៃការរាតត្បាតនៃមេរោគ។ ឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាអេឡិចត្រូគីមីតម្លៃទាបសម្រាប់អាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកអាចផ្តល់នូវដំណោះស្រាយដ៏មានសក្តានុពលចំពោះតម្រូវការដែលមិនមានតម្រូវការនេះ។ ឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា DNA ទាំងនេះជាច្រើនដំណើរការដោយការពិតដែលថាខ្សែ DNA បំពេញបន្ថែមត្រូវបាន immobilized នៅលើអេឡិចត្រូត ផ្ទៃ និងបង្កាត់នៅពេលដែលលំដាប់ដែលត្រូវគ្នាមានវត្តមាននៅក្នុងគំរូ។ នេះអាចត្រូវបានបំប្លែងទៅជាសញ្ញាដោយបច្ចេកទេសអេឡិចត្រូគីមីផ្សេងៗ ដោយប្រើឧបករណ៍សម្រុះសម្រួល redox ដូចជាប៉ូតាស្យូមដែក/ferrocyanide.Methylene blue (MB) គឺជាម៉ូលេគុលសកម្ម redox មួយប្រភេទដែលមាន ត្រូវបានគេរាយការណ៍ថាបញ្ចូលទៅក្នុង DNA ខ្សែទ្វេ (dsDNA) បន្ថែមពីលើការចងមិនជាក់លាក់របស់វាទៅនឹង DNA5,6. លក្ខណៈអន្តរកាលនៃ MBs ដើម្បីបង្កើតជាស្មុគស្មាញ MB-DNA ធ្វើឱ្យពួកគេក្លាយជាជម្រើសដ៏ពេញនិយមជាអ្នកសម្រុះសម្រួល redox នៅក្នុង DNA electrochemical ជាច្រើន។ ការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា 5,6,7,8,9.ទោះបីជាអន្តរកាលនៃ MB ទៅ DNA គឺមិនជាក់លាក់ក៏ដោយ និងភាពជាក់លាក់នៃឧបករណ៏អេឡិចត្រូគីមីនេះពឹងផ្អែកភាគច្រើនទៅលើភាពបរិសុទ្ធនៃ primers ដែលប្រើសម្រាប់ PCR ឬ isothermal amplification ប៉ុន្តែវាសមល្អសម្រាប់ការអនុវត្តជាក់ស្តែង។ -time electrochemical-based qPCR ឬ fluorescence isothermal amplification ជាជម្រើសមួយសម្រាប់ការវាស់កំហាប់ DNA 9 .នៅក្នុងការអនុវត្តបែបនេះ Won et al.ផ្ទៃនៃអេឡិចត្រូតមាសត្រូវបានកែប្រែជាមួយនឹង 6-mercapto-1-hexanol (MCH) សម្រាប់ពេលវេលាជាក់ស្តែង ការវាស់ស្ទង់ PCR amplicons ជាមួយ MB ដោយប្រើឌីផេរ៉ង់ស្យែល voltammetry ជីពចរ (DPV)9. ក្នុងករណីផ្សេងទៀត Ramirez et al.Detection of SARS-CoV-2 នៅក្នុងទឹកសំណល់ដោយប្រតិកម្ម RT-LAMP ដោយប្រើ MB ជាមួយនឹងអេឡិចត្រូតអេក្រង់។ អេឡិចត្រូតផ្លាទីនក៏មានផងដែរ។ ប្រើដូចជាអេឡិចត្រូតនៅក្នុងកន្លែងនៅក្នុងវេទិកា microfluidic PCR ដែលត្រូវបានរចនាឡើងដើម្បីរកឱ្យឃើញអេឡិចត្រូត amplicons ក្នុងអំឡុងពេលប្រតិកម្ម 8
គ្រោងការណ៍នៃលំហូរការងារសម្រាប់ការរកឃើញអេឡិចត្រូគីមីនៃ amplicons ដែលទទួលបានពីភាគល្អិតមេរោគប្រមូលផ្តុំនៅក្នុងគំរូទឹកបឹង។
ថ្មីៗនេះយើងបានបង្ហាញការចាប់សញ្ញាអេឡិចត្រូគីមីនៃ SARS-CoV-2 amplicons ជាមួយនឹងបន្ទះសៀគ្វីបោះពុម្ពតម្លៃទាប (PCB) អេឡិចត្រូតដោយផ្អែកលើ DPV និង voltammetry រង្វិល (CV) ដែលបណ្តាលមកពីការស្រូបយកស្មុគស្មាញ MB-DNA នៅលើផ្ទៃនៃអេឡិចត្រូតដែលមិនបានកែប្រែ) ការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងកំពូល បច្ចុប្បន្ន ១១.យើងរាយការណ៍ថាបំណែក DNA វែងជាង (N1-N2, \({943}\, \hbox) បានបង្កើតឡើងដោយប្រើ CDC-recommended N1 forward and N2 reverse primers បើប្រៀបធៀបជាមួយបំណែកខ្លីជាង {bp}\)) បានបង្ហាញលីនេអ៊ែរល្អប្រសើរជាងមុននៅក្នុងការឆ្លើយតបរបស់ឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) បង្កើតឡើងដោយប្រើ N1 forward និង N1 reverse primer sets។ ការសិក្សាទាំងនេះត្រូវបានរាយការណ៍ដោយប្រើការរំលាយ DNA ដែលត្រូវបានរៀបចំនៅក្នុងទឹកដែលគ្មាននុយក្លេអែ។ វេទិកានេះក៏ត្រូវបានប្រើដើម្បីរកមើល SARS-CoV ផងដែរ។ -2 amplicons នៅក្នុងសំណាកទឹកសំណល់ដែលបានក្លែងធ្វើ (ទទួលបានដោយការបង្កើនសំណាក RNA សរុបជាមួយ SARS-CoV-2 RNA)។ ចាប់តាំងពី RNA ងាយនឹងកាត់ចេញកំឡុងពេលដាច់ពីគ្នា និងដំណើរការចុះក្រោម 12,13 វាពិបាកក្នុងការពង្រីកបំណែកដែលវែងជាងនេះជាមួយនឹងសំណាកដែលខុសពីគ្នានេះ។ ដូច្នេះ ការបង្ហាញអំពីអេឡិចត្រូគីមីនៃ SARS-CoV-2 amplicon នៅក្នុងទឹកសំណល់ត្រូវបានកំណត់ត្រឹមបំណែក \(72\,\hbox {bp}\) N1 ខ្លីជាង។
នៅក្នុងការងារនេះ យើងបានស៊ើបអង្កេតលទ្ធភាពនៃការចាប់សញ្ញាអេឡិចត្រូគីមីដែលមានមូលដ្ឋានលើ ENIG PCB នៃ phage Phi6 ដែលប្រមូលផ្តុំ និងដាច់ដោយឡែកពីសំណាកទឹកបឹង (រូបភាពទី 1)។Phages Phi6 គឺមានទំហំប្រៀបធៀប (80-100 nm) ទៅ SARS-CoV-2 និង ក៏មានភ្នាស lipid និងប្រូតេអ៊ីន spike។ សម្រាប់ហេតុផលទាំងនេះ bacteriophage Phi6 គឺជាការពពោះជំនួសដ៏ពេញនិយមសម្រាប់ SARS-CoV-2 និងមេរោគ RNA បង្កជំងឺផ្សេងទៀតដែលរុំព័ទ្ធដោយមេរោគ RNA 14,15.RNA ដែលដាច់ដោយឡែកពីភាគល្អិត phage ត្រូវបានគេប្រើជាគំរូសម្រាប់ការសំយោគ cDNA អមដោយ PCR ដើម្បីទទួលបានបំណែក DNA ពីរនៃ 117 និង 503 គូជាមូលដ្ឋានក្នុងប្រវែង។ ដោយមើលឃើញបញ្ហាប្រឈមនៃការពង្រីក \(943\,\hbox {bp}\) បំណែក N1-N2 នៅក្នុងការងារមុនរបស់យើង យើងកំណត់គោលដៅនៃបំណែកប្រវែងមធ្យម (\(117 \,\hbox {bp}\) និង \(503 \,\hbox {bp}\)) ដោយផ្អែកលើ primers ដែលមាន។ ការឆ្លើយតបរបស់ឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាអេឡិចត្រូគីមីត្រូវបានសិក្សាជាប្រព័ន្ធលើជួរកំហាប់ធំទូលាយ (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) ទៅ \({20}\, {\hbox {ng}/\upmu \hbox {l}}}\)) សម្រាប់បំណែកទាំងពីរនៅក្នុង វត្តមានរបស់ MB ឥទ្ធិពលនៃអំបិលលើការឆ្លើយតបរបស់ឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាត្រូវបានកំណត់ និងឆ្លងកាត់សុពលភាពដោយការវាស់វែង spectrophotometric ។ ការរួមចំណែកសំខាន់នៃការងារនេះមានដូចខាងក្រោម៖
ប្រវែងបំណែក DNA និងវត្តមាននៃអំបិលនៅក្នុងគំរូប៉ះពាល់យ៉ាងខ្លាំងដល់ភាពប្រែប្រួល។លទ្ធផលរបស់យើងបង្ហាញថាសកម្មភាពអេឡិចត្រូគីមីអាស្រ័យទៅលើយន្តការផ្សេងគ្នានៃអន្តរកម្មនៃ MB, DNA និងឧបករណ៍ចាប់សញ្ញានៅក្នុងការឆ្លើយតប voltammetric អាស្រ័យលើការផ្តោតអារម្មណ៍ DNA និងប្រវែងជាមួយនឹងបំណែកវែងជាងនេះបង្ហាញពីភាពប្រែប្រួលខ្ពស់ទោះបីជាអំបិលមានឥទ្ធិពលអវិជ្ជមានលើអន្តរកម្មអេឡិចត្រូស្ទិចរវាង MB និង DNA ។
កំហាប់ DNA កំណត់យន្តការនៃអន្តរកម្ម MB-DNA នៅក្នុងអេឡិចត្រូតដែលមិនអាចកែប្រែបាន យើងបង្ហាញថាយន្តការផ្សេងគ្នានៃអន្តរកម្ម MB-DNA អាស្រ័យលើកំហាប់ DNA ។ នៅកំហាប់ DNA នៅខាងក្រោមចំនួនតូចមួយនៃ \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) យើងបានសង្កេតឃើញថា ការឆ្លើយតបនៃចរន្តអេឡិចត្រូគីមីត្រូវបានកំណត់ជាចម្បងដោយការស្រូបយក MB-DNA នៅលើអេឡិចត្រូត ខណៈពេលដែលកំហាប់ទាបនៅកំហាប់ DNA ខ្ពស់ ការឆ្លើយតបនៃចរន្តអេឡិចត្រូគីមីត្រូវបានកំណត់ដោយការទប់ស្កាត់ស្តេរិចនៃ redox សកម្មភាពដោយសារតែការបញ្ចូល MB រវាងគូមូលដ្ឋាន DNA ។
ENIG PCB-based Electrochemical Sensing of Viral Nucleic Acids in Lake Water Samples ការសង្កេតត្រូវបានធ្វើឱ្យមានសុពលភាពដោយការរកឃើញអេឡិចត្រូគីមីនៃ Phi6-added \(503\,\hbox {bp}\) បំណែក DNA ដែលទទួលបានពីសំណាកទឹកពីបឹង Powai, IIT Mumbai Campus លទ្ធផល phage ។
ការចំណាយទាបនៃការអនុវត្ត និងសក្តានុពលសម្រាប់ការរួមបញ្ចូលទៅក្នុងប្រព័ន្ធត្រួតពិនិត្យដោយស្វ័យប្រវត្តិពេញលេញ oligonucleotides ឬ aptamers នៅលើអេឡិចត្រូតជាមួយនឹងអាយុកាលធ្នើយូរជាងនេះ។
Phage Phi6 គឺជាមេរោគ dsRNA នៃគ្រួសារ Cytoviridae ដែលឆ្លងមេរោគ Pseudomonas syringae។ ហ្សែនរបស់ Phi6 phage មានក្នុងទម្រង់ជាបំណែក 3៖ S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) និង L (\(6.37\ ,\hbox{Kb}\)) 16,17.ចាប់តាំងពី Phi6 phage ឆ្លងមេរោគ BSL-1 Pseudomonas strain ដែលមិនបង្កជំងឺ នោះវាមានសុវត្ថិភាពក្នុងការប្រើប្រាស់ ហើយអាចដាំដុះបានយ៉ាងងាយស្រួលនៅក្នុងមន្ទីរពិសោធន៍។Phage Phi6 និងម៉ាស៊ីន Pseudomonas syringae ត្រូវបានទិញពីមជ្ឈមណ្ឌលយោង Felix d'Herelle សម្រាប់មេរោគបាក់តេរី សាកលវិទ្យាល័យ Laval ប្រទេសកាណាដា (លេខកាតាឡុកមជ្ឈមណ្ឌលយោងគឺ HER-102 និង HER-1102 រៀងគ្នា) .Phi6 phage និងម៉ាស៊ីនរបស់វាត្រូវបានរស់ឡើងវិញតាមការណែនាំដោយមជ្ឈមណ្ឌលយោង។Phage Phi6 ត្រូវបានបន្សុតដោយ plate lysis និង elution ដើម្បីទទួលបាន titers ចុងក្រោយជាមួយ \(\ប្រហែល 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (បន្ទះបង្កើតជាឯកតា/មីលីលីត្រ)។RNA ត្រូវបានញែកចេញពីភាគល្អិត phage បន្សុតដោយប្រើ GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) យោងតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត។និយាយដោយសង្ខេប ការព្យួរ phage Phi6 បន្សុត\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) ត្រូវបាន lysed ហើយ lysate ត្រូវបានផ្ទុកនៅលើជួរឈរបង្វិល ដើម្បីអនុញ្ញាតឱ្យ RNA ចងភ្ជាប់ជាមួយជួរឈរជ័រ។ បន្ទាប់មក RNA ត្រូវបាន eluted នៅក្នុងដំណោះស្រាយ elution \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) ផ្តល់ដោយកញ្ចប់។ ប៉ាន់ស្មានកំហាប់ RNA ដោយការស្រូបនៅ \(260\,\hbox {nm}\)។ RNA ត្រូវបានរក្សាទុកក្នុង aliquots ក្នុង \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) រហូតដល់ការប្រើប្រាស់បន្តទៀត។\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) កញ្ចប់សំយោគ iScript cDNA (Bio -Rad Laboratories) ត្រូវបានប្រើជាគំរូសម្រាប់ការសំយោគ cDNA តាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត។ និយាយដោយសង្ខេប ប្រតិកម្មសំយោគ cDNA មាន 3 ជំហាន៖ priming at \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\), ប្រតិចារឹកបញ្ច្រាសនៃ \({20}\,{\hbox {min}}\) នៅ \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) និងបញ្ច្រាស ឧបករណ៍ថតគឺនៅក្នុង \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) សម្រាប់ \({1}\,{\hbox {min ។ ការប្រើប្រាស់ cDNA ជាគំរូសម្រាប់ PCR នៅក្នុងម៉ាស៊ីនកំដៅ miniPCR® mini8៖
ថ្នាំ primers សម្រាប់ \(117\,\hbox {bp}\) និង \(503\,\hbox {bp}\) ត្រូវគ្នាទៅនឹង nucleotides 1476-1575 នៃផ្នែក M និង 458-943 nucleotides នៃផ្នែក L រៀងគ្នាអាស៊ីត ផលិតផល PCR ដែលត្រូវបានពង្រីកទាំងអស់ត្រូវបាន electrophoresed នៅលើ 1% agarose gels ហើយ DNA គោលដៅដែលបានពង្រីកត្រូវបានបន្សុតដោយប្រើ GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific) ។
បឹងមួយនៅបរិវេណ IIT Mumbai (បឹង Powai, Powai, Mumbai) ត្រូវបានប្រើដើម្បីបន្ថែមភាគល្អិត phage ។ ទឹកបឹងត្រូវបានត្រងតាមរយៈភ្នាស \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) ដើម្បីយកចេញ ភាគល្អិតដែលផ្អាក ហើយបន្ទាប់មក Phi6 phage ត្រូវបានបន្ថែម។ បន្ថែម \({1}\,\hbox {ml}}\) នៃ \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) ទៅ \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) ត្រងទឹកបឹង ក្នុង \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\) aliquot តូចមួយគឺ បម្រុងទុកសម្រាប់ការវាស់វែងផ្ទុកមេរោគដោយ plaque assay។ យើងបានសាកល្បងវិធីសាស្រ្តពីរផ្សេងគ្នាដើម្បីប្រមូលផ្តុំភាគល្អិតមេរោគ Phi6 កើនឡើង៖ (1) វិធីសាស្ត្រស្រូបយកអាលុយមីញ៉ូមអ៊ីដ្រូសែន - ទឹកភ្លៀង 19 ដែលត្រូវបានផ្ទៀងផ្ទាត់សម្រាប់ការប្រមូលផ្តុំនៃមេរោគ RNA ស្រោមសំបុត្រជាច្រើនពីគំរូបរិស្ថាន និង (2)) វិធីសាស្ត្រប្រមូលផ្តុំមេរោគដែលមានមូលដ្ឋានលើ polyethylene glycol (PEG) ត្រូវបានកែសម្រួលពី Flood et al ។20 .ចាប់តាំងពីប្រសិទ្ធភាពនៃការស្តារឡើងវិញនៃវិធីសាស្ត្រដែលមានមូលដ្ឋានលើ PEG ត្រូវបានគេរកឃើញថាប្រសើរជាងវិធីសាស្ត្រអាលុយមីញ៉ូមអ៊ីដ្រូសែន វិធីសាស្ត្រដែលមានមូលដ្ឋានលើ PEG ត្រូវបានប្រើដើម្បីប្រមូលផ្តុំភាគល្អិត Phi6 ពីគំរូទឹកបឹង។
វិធីសាស្ត្រ PEG ដែលប្រើមានដូចខាងក្រោម៖ PEG 8000 និង \(\hbox {NaCl}\) ត្រូវបានបន្ថែមទៅសំណាកទឹកបឹង Phi6-spiked ដើម្បីទទួលបាន 8% PEG 8000 និង \(0.2\,\hbox {M} \) \( \hbox {NaCl}\) គំរូត្រូវបាន incubed នៅលើ shaker មួយ\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ) បន្ទាប់មក centrifuged នៅ \(4700 \,\hbox {g}\) គឺ \({45}\, \hbox {min}}\)។ បោះបង់ supernatant ហើយផ្អាកគ្រាប់ឡើងវិញក្នុង \({1}\, {\hbox {ml}}\) នៅក្នុង supernatant ដូចគ្នា។ រាល់ការពិសោធន៍កំហាប់ spiking និង virus ត្រូវបានអនុវត្តជា triplicate។ បន្ទាប់ពីការប្រមូលផ្តុំ aliquot តូចមួយត្រូវបានបម្រុងទុកសម្រាប់ការវាស់វែងប្រសិទ្ធភាពនៃការស្តារឡើងវិញដោយ plaque assay.RNA ត្រូវបានញែកដាច់ពីគេដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន និង eluted នៅក្នុង kit-supplied elution buffer\({40}\, {\upmu \hbox {l}}\)) ចាប់តាំងពីកំហាប់ RNA នឹងប្រែប្រួលពីគំរូមួយទៅគំរូក្នុង triplicate នោះ \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) នៃ RNA ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ទាំងបីដោយមិនគិតពីការប្រមូលផ្តុំ cDNA របស់វា សំយោគនៃ samples.cDNA ត្រូវបានអនុវត្តដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន។\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA ត្រូវបានប្រើជាគំរូសម្រាប់ \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR សម្រាប់ 35 វដ្តដើម្បីពង្រីក \(117\,\hbox {bp}\) និង \(503\,\hbox { bp}\) fragments.គំរូទាំងនេះត្រូវបានតំណាងថាជា “1:1″ ពោលគឺដោយគ្មានការរំលាយ។ ការគ្រប់គ្រងគ្មានគំរូ (NTC) ត្រូវបានបង្កើតឡើងជាការគ្រប់គ្រងអវិជ្ជមាន ខណៈពេលដែល cDNA សំយោគដោយប្រើ RNA ដាច់ដោយឡែកពី phage ត្រូវបានបង្កើតឡើង ជាគំរូសម្រាប់ការគ្រប់គ្រងជាវិជ្ជមាន (PC)។ PCR បរិមាណ (qPCR) ត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុងឧបករណ៍ Stratagene Mx3000P RT-PCR ដោយប្រើ Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies)។ ប្រតិកម្មត្រូវបានបង្កើតឡើងជាបីដងដូចពីមុន បានពិពណ៌នា។ កម្រិតវដ្ត (Ct) ត្រូវបានកត់ត្រាសម្រាប់សំណាកទាំងអស់។ លើសពីនេះ សំណាកដែលពនឺគឺ \({1}\, {\upmu \hbox {l}}\) ដោយប្រើ cDNA ពនឺ 1:100 នៅក្នុងទឹកបឹងដែលបានត្រងជា \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR សម្រាប់ 35 វដ្ត។ គំរូទាំងនេះត្រូវបានតំណាងជា “1:100″។
អេឡិចត្រូត PCB ត្រូវបានប្រឌិតដោយប្រើប្រាស់ដំណើរការដែលមានតម្លៃថោក Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) ដែលអាចរកទិញបានដោយមិនចាំបាច់ប្រើមាសបន្ថែម។ លក្ខណៈបច្ចេកទេសនៃអេឡិចត្រូត PCB ENIG ត្រូវបានរៀបរាប់លម្អិតនៅក្នុងការងារពីមុនរបស់យើង 11. សម្រាប់អេឡិចត្រូត ENIG PCB វិធីសាស្ត្រសម្អាតអេឡិចត្រូតបែបប្រពៃណីដូចជា ដំណោះស្រាយ piranha ឬ sulfuric acid cyclic voltammetry មិនត្រូវបានណែនាំទេព្រោះវាអាចបណ្តាលឱ្យរបកនៃស្រទាប់មាសស្តើង (កម្រាស់ \(\approx\) \(100\,\hbox {nm }\)) និងលាតត្រដាងស្រទាប់ទង់ដែងក្រោមដែលងាយនឹងកើតមាន។ ទៅនឹងការ corrosion 21, 22, 23, 24, 25។ ដូច្នេះហើយ សម្អាតអេឡិចត្រូតដោយក្រណាត់គ្មានជាតិសរសៃដែលមានសំណើមជាមួយ IPA ។ គំរូដែលត្រូវធ្វើតេស្តត្រូវបាន incubated ជាមួយ \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB ក្នុង \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,\hbox {h}}\) ដើម្បីងាយស្រួលបញ្ចូល។នៅក្នុងការងារពីមុនរបស់យើង យើងបានសង្កេតឃើញថា ភាពប្រែប្រួល និងលីនេអ៊ែរនៃឧបករណ៏ត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងដោយការបង្កើនកំហាប់ MB 11 ។ ដោយផ្អែកលើការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពដែលបានរាយការណ៍នៅក្នុងការងារមុនរបស់យើង យើងបានប្រើ \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB ការប្រមូលផ្តុំដើម្បីបង្កប់ DNA នៅក្នុងការសិក្សានេះ។ ការរកឃើញអេឡិចត្រូគីមីនៃ DNA ខ្សែទ្វេ (ds-DNA) អាចសម្រេចបានដោយប្រើ anionic ឬ cationic intercalators។ ទោះបីជា intercalators anionic រកឃើញ DNA ជាមួយនឹងការជ្រើសរើសកាន់តែប្រសើរក៏ដោយ ក៏ពួកគេត្រូវការ incubation ពេញមួយយប់ ដែលបណ្តាលឱ្យមានពេលវេលារកឃើញយូរជាងនេះ។ ម៉្យាងវិញទៀត ឧបករណ៍បំប្លែងស៊ីអ៊ីយ៉ូតដូចជា MB ត្រូវការរយៈពេលភ្ញាស់ខ្លីជាង ប្រហែល \({1}\,\hbox {h}}\) សម្រាប់ការរកឃើញអេឡិចត្រូគីមីនៃ ds-DNA6។ ការវាស់វែងនីមួយៗពាក់ព័ន្ធនឹងការចែកចាយគំរូដែលត្រូវធ្វើតេស្តនៅលើ អេឡិចត្រូត\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) បន្ទាប់មកសម្អាតដោយកន្សែងដែលមានសំណើមដោយ IPA មុនពេលបន្តជាមួយគំរូផ្សេងទៀត។ការវាស់វែងមួយ។ គំរូនីមួយៗត្រូវបានសាកល្បងលើអេឡិចត្រូតចំនួន 5 ផ្សេងគ្នា លើកលែងតែមានការបញ្ជាក់ផ្សេងពីនេះប៉ុណ្ណោះ។ ការវាស់ស្ទង់ DPV និង CV ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ PalmSens Sensit Smart potentiostat ហើយកម្មវិធី PSTrace ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធ potentiostat និងការទិញទិន្នន័យ រួមទាំងការគណនាចរន្តខ្ពស់បំផុត។ ការកំណត់ខាងក្រោមត្រូវបានប្រើប្រាស់ សម្រាប់ការវាស់វែង DPV និង CV៖
DPV: ពេលវេលាលំនឹង = \(8\,\hbox {s}\), ដំណាក់កាលវ៉ុល = \(3\,\hbox {mV}\), វ៉ុលជីពចរ = \(25\,\hbox {mV}\), រយៈពេលជីពចរ = \(50\,\hbox {ms}\), អត្រាស្កេន = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV៖ ពេលវេលាលំនឹង = \(8\,\hbox {s}\), Voltage Step = \(3\,\hbox {mV}\), Sweep Rate = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
ចរន្តកំពូលដែលទទួលបានពីវ៉ុលតាម៉ូក្រាមនៃ DNA ស្មុគស្មាញជាមួយ \({50}\,\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV ។
DPV និង CV voltammograms ត្រូវបានទទួលនៅលើអេឡិចត្រូត ENIG PCB \({50}\,\upmu \hbox {M}}\) MB ស្មុគស្មាញជាមួយ DNA (នៅកំហាប់ 10–\({20}\, hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) ពោលគឺ 0.13–\({0.26}\, {\upmu \hbox {M}}\) សម្រាប់ \(117\,\hbox {bp}\) និង 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) សម្រាប់ \(503\,\hbox {bp}\)).វ៉ុលតាំម៉ូក្រាមតំណាងត្រូវបានបង្ហាញក្នុងរូបភាព S1 នៅក្នុងព័ត៌មានបន្ថែម។ រូបភាពទី 2 បង្ហាញលទ្ធផល នៃការវាស់វែង DPV និង CV (peak current) ដោយប្រើផលិតផល PCR ដែលបន្សុតដោយជែល។ បើប្រៀបធៀបទៅនឹងការវាស់វែង CV ការវាស់វែង DPV បង្ហាញពីភាពប្រែប្រួលខ្ពស់ (បច្ចុប្បន្នជាមុខងារនៃកំហាប់ DNA) ដោយសារតែចរន្ត capacitive ផ្ទៃខាងក្រោយក្នុងការវាស់វែង CV លាក់ចរន្ត Faradaic 26 .ទិន្នន័យ សម្រាប់ប្រអប់នីមួយៗនៅក្នុងប្រអប់មានរង្វាស់ពី 5 អេឡិចត្រូត។ ការវាស់វែងទាំងអស់ប្រើសំណុំអេឡិចត្រូតដូចគ្នា ដើម្បីជៀសវាងកំហុសក្នុងការវាស់វែង ដោយសារការប្រែប្រួលនៃអេឡិចត្រូតទៅអេឡិចត្រូត។ យើងបានសង្កេតឃើញនិន្នាការកើនឡើងនៅក្នុង DPV និង CV ដែលវាស់ចរន្តខ្ពស់បំផុតសម្រាប់ការប្រមូលផ្តុំ DNA ទាប។ , យូរជាងនេះ (\(503\,\hbox {bp}\)) \\,\hbox {bp}\ បើប្រៀបធៀបទៅនឹង \(117)) បំណែក។ នេះគឺស្របទៅនឹងនិន្នាការដែលរំពឹងទុកនៃការស្រូបយកអេឡិចត្រូតដែលបានរាយការណ៍នៅក្នុងការងារពីមុនរបស់យើង។ adsorption នៃ MB-DNA complex ជួយសម្រួលដល់ការផ្ទេរបន្ទុកលើអេឡិចត្រូត ដែលរួមចំណែកដល់ការកើនឡើងនៃចរន្តកំពូល។ ការសិក្សាផ្សេងទៀតបានបង្ហាញពីឥទ្ធិពលនៃទំហំ និងលំដាប់នៃ oligonucleotide លើ MB-DNA intercalation27,28,29,30.The guanine -cytosine (GC) មាតិកានៃ amplicons ពីរ (\(117\,\hbox {bp}\) និង \(503\,\hbox {bp}\)) គឺប្រហែល 50% ដែលបង្ហាញថាការសង្កេតភាពខុសគ្នាគឺដោយសារតែ ដល់ប្រវែងអំពែក។ ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយ សម្រាប់កំហាប់ DNA ខ្ពស់ (\(>{2}\, \hbox {ng}/\upmu \hbox {l}}}\), សម្រាប់ \(503\,\hbox {bp}) \) និង \(>{10}\,{\hbox {ng}/\upmu \hbox {l}}}\) សម្រាប់ \(117\,\hbox {bp}\)) យើងសង្កេតឃើញការពង្រីកពីរ ចរន្តកំពូលនៃ subs ត្រូវបានកាត់បន្ថយទាំងក្នុង DPV និង CV វាស់។ នេះគឺដោយសារតែ MB ឆ្អែត និង intercalates រវាងគូមូលដ្ឋាននៃ DNA ដែលបណ្តាលឱ្យមានការរារាំងស្តេរ៉ូអ៊ីតនៃសកម្មភាព redox នៃក្រុមកាត់បន្ថយក្នុង MB31,32 ។
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV ។
អំបិលដែលមានវត្តមាននៅក្នុងល្បាយមេ PCR រំខានដល់អន្តរកម្មអេឡិចត្រូស្ទិករវាង MB និង DNA ដូច្នេះដោយបន្ថែម \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) ជាមួយ \({50} \,\ upmu \hbox {M}}\) MB gel-purified ផលិតផលដើម្បីសិក្សាពីឥទ្ធិពលនៃអំបិលលើអន្តរកម្ម MB-DNA។ ដូចដែលបានបង្ហាញក្នុងរូបភាពទី 3 យើងសង្កេតឃើញថាសម្រាប់ការប្រមូលផ្តុំ DNA ខ្ពស់ (\(>{2}\,\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) និង \(>{10}\, \hbox {ng}/\upmu \hbox { l}}}\) សម្រាប់ \(117\,\hbox {bp} \)) នៅក្នុង DPV និង CV ការបន្ថែមអំបិលមិនប៉ះពាល់យ៉ាងខ្លាំងដល់ការវាស់វែងទេ (សូមមើលរូបភាព S2 នៅក្នុងព័ត៌មានបន្ថែមសម្រាប់ voltammograms តំណាង)។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ នៅ កំហាប់ DNA ទាប ការបន្ថែមអំបិលកាត់បន្ថយភាពប្រែប្រួលយ៉ាងខ្លាំង ដែលបណ្តាលឱ្យមិនមានការផ្លាស់ប្តូរគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុងចរន្តជាមួយនឹងការផ្តោតអារម្មណ៍ DNA ។ ផលប៉ះពាល់អវិជ្ជមានស្រដៀងគ្នានៃអំបិលលើអន្តរកម្ម MB-DNA និង intercalation ត្រូវបានរាយការណ៍ពីមុនដោយអ្នកស្រាវជ្រាវផ្សេងទៀត33,34។\(\hbox { Mg}^{2+}\) cations ភ្ជាប់ទៅនឹងឆ្អឹងខ្នងផូស្វាតអវិជ្ជមាននៃ DNA ដោយហេតុនេះរារាំងអន្តរកម្មអេឡិចត្រូស្ទិករវាង MB និង DNA។ នៅកំហាប់ DNA ខ្ពស់ ការទប់ស្កាត់ស្តេរីកនៃ MBs redox-active បណ្តាលឱ្យមានចរន្តខ្ពស់បំផុតទាប ដូច្នេះអន្តរកម្មអេឡិចត្រូស្ទិក មិនប៉ះពាល់ដល់ការឆ្លើយតបរបស់ឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាខ្លាំងនោះទេ។ ចំណុចសំខាន់គឺថា biosensor នេះគឺសមស្របជាងក្នុងការរកឃើញកំហាប់ DNA ខ្ពស់ (កម្រ \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ឬខ្ពស់ជាងនេះ), សម្រាប់ពេញលេញ- ដំណើរការដោយស្វ័យប្រវត្តិនៃគំរូទឹកបរិស្ថាន ដែលការបន្សុតជែលនៃផលិតផល PCR ប្រហែលជាមិនអាចទៅរួចនោះទេ។
តំបន់នៅក្រោមខ្សែកោងស្រូបយកសម្រាប់ជួររលក 600–700 \(\hbox {nm}\) សម្រាប់កំហាប់ផ្សេងៗនៃ DNA ដែលស្មុគស្មាញជាមួយ \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) ដោយមាន និងគ្មានអំបិល (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) ដោយមាន និងគ្មានអំបិល (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) ការប្រមូលផ្តុំ DNA ដែលត្រូវគ្នានឹង \({50}\, {\upmu \hbox {M}}\) គំរូ MB គ្មាន DNA ។
ដើម្បីផ្ទៀងផ្ទាត់លទ្ធផលខាងលើបន្ថែមទៀត យើងបានធ្វើការវាស់វែងអុបទិកដោយប្រើឧបករណ៍វាស់កាំរស្មី UV/Vis spectrophotometer (Thermo Scientific Multiskan GO) គំរូ \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) ត្រូវបានប្រើសម្រាប់នីមួយៗ ការវាស់វែង។ ហត្ថលេខាស្រូបយកថយចុះជាមួយនឹងការបង្កើនកំហាប់ DNA ដូចដែលអាចមើលឃើញពីនិន្នាការនៃផ្ទៃក្រោមខ្សែកោងស្រូបយកសម្រាប់ជួររលក \(600\,\hbox {nm}\) ទៅ \(700\,\hbox { nm}\) ដូចបង្ហាញក្នុងរូបទី 4 (វិសាលគមស្រូបទាញបង្ហាញក្នុងរូប S3 ក្នុងព័ត៌មានបន្ថែម)។សម្រាប់គំរូដែលមានកំហាប់ DNA តិចជាង \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) មិនមានភាពខុសប្លែកគ្នាខ្លាំងក្នុងការទទួលយករវាងគំរូដែលមាន DNA និង MB- only (សម្រាប់ \(503\,\hbox {bp}\) និង \(117\,\hbox {bp}\ ) បំណែកប្រវែង) ដែលបង្ហាញពីអវត្តមាននៃការទប់ស្កាត់ស្តេរីចនៃ redox-active MB. នៅកំហាប់ DNA ខ្ពស់ យើងបានសង្កេតឃើញការថយចុះបន្តិចម្តងៗនៃសញ្ញាស្រូបទាញ ហើយបានកត់សម្គាល់ការថយចុះនៃការស្រូបចូលតិចជាងមុននៅក្នុងវត្តមាននៃអំបិល។ លទ្ធផលទាំងនេះត្រូវបានសន្មតថាជាម៉ូលេគុល អន្តរកម្ម និងការទប់ស្កាត់ steric ជាមួយនឹងការដាក់ជង់មូលដ្ឋាននៅក្នុង DNA hybrids។ លទ្ធផលរបស់យើងគឺស្របជាមួយនឹងរបាយការណ៍នៅក្នុងអក្សរសិល្ប៍ស្តីពីការសិក្សាវិចារណកថានៃ MB-DNA intercalation ដែលភ្ជាប់ hypochromaticity ជាមួយនឹងកម្រិតថាមពលថយចុះនៅក្នុង \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) អន្តរកាលអេឡិចត្រូនិចដោយសារតែអន្តរកាលស្រទាប់ 36, 37, 38 ។
Agarose gel electrophoresis នៃ phage Phi6: ផលិតផល PCR នៃប្រវែង \(117\,\hbox {bp}\) និង \(503\,\hbox {bp}\) ពីសំណាកទឹកបឹង។ M-DNA marker;ការគ្រប់គ្រង NTC-no-template, primers ដែលមាន amplicons ដែលត្រូវគ្នា;ការត្រួតពិនិត្យវិជ្ជមានរបស់កុំព្យូទ័រ;1, 2, 3- undiluted (1:1) សំណាកទឹកបឹងដែលហៀរចេញជា triplicate.A band អាចមើលឃើញនៅ \(\aout 50\,\hbox {bp}\) ដោយសារតែ oligonucleotides ដែលមិនបានប្រើនៅក្នុង \(503\,\ hbox {bp}\) ផ្លូវ។
យើងបានវាយតម្លៃឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាដោយប្រើសំណាកទឹកបឹង Powai កើនឡើងជាមួយ Phi6 phage។ ការប្រមូលផ្តុំ RNA ដាច់ដោយឡែកពីសំណាកទឹក phage-spiked មានចាប់ពី 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\) ខណៈពេលដែលវាដាច់ដោយឡែកពីការព្យួរ phage ដែលបន្សុត RNA ត្រូវបានគេប៉ាន់ស្មានថាជា \({1945}\, {\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) ជាមួយនឹងប្រសិទ្ធភាពនៃការស្តារឡើងវិញប្រហែល 1 %RNA ត្រូវបានចម្លងបញ្ច្រាសទៅជា cDNA ហើយប្រើជាគំរូសម្រាប់ PCR និង qPCR។ ទំហំផលិតផលត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយ agarose gel electrophoresis (រូបភាពទី 5) មុនពេលធ្វើតេស្តជាមួយឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា។ គំរូទាំងនេះមិនត្រូវបានបន្សុតដោយជែល ដូច្នេះហើយមានសមាសធាតុទាំងអស់នៃ PCR ជា ក៏ដូចជា amplicons នៃការចាប់អារម្មណ៍។ តម្លៃ Ct ដែលត្រូវបានកត់ត្រាក្នុងអំឡុងពេល qPCR (តារាងទី 1) ត្រូវបានបង្ហាញទាក់ទងទៅនឹងកំហាប់នៃ RNA ដាច់ដោយឡែកពីសំណាកទឹកដែលកើនឡើងដែលត្រូវគ្នា។ តម្លៃ Ct បង្ហាញពីចំនួនវដ្តដែលត្រូវការសម្រាប់សញ្ញា fluorescent ដើម្បី លើសពីកម្រិតចាប់ផ្ដើម ឬសញ្ញាផ្ទៃខាងក្រោយ។ តម្លៃ Ct ខ្ពស់ជាងបង្ហាញពីការប្រមូលផ្តុំគំរូទាប និងផ្ទុយមកវិញ។ តម្លៃ Ct នៃគំរូ NTC គឺខ្ពស់ដូចការរំពឹងទុក។ ភាពខុសគ្នានៅក្នុងតម្លៃ \(\ ប្រហែល 3\) Ct រវាង ការត្រួតពិនិត្យវិជ្ជមាន និងគំរូតេស្តបញ្ជាក់បន្ថែមថាគំរូតេស្តនីមួយៗមានគំរូប្រហែល 1% បើប្រៀបធៀបទៅនឹងការត្រួតពិនិត្យវិជ្ជមាន។ យើងបានពិភាក្សាពីមុនថា amplicons យូរជាងនេះនាំទៅរកភាពប្រែប្រួលកាន់តែប្រសើរ។ ការពង្រីកបំណែកវែងជាងដាច់ដោយឡែកពីគំរូបរិស្ថានផ្សេងៗគ្នាគឺមានបញ្ហាប្រឈមដោយសារគុណវិបត្តិ។ នៃកំហាប់មេរោគទាប និងការរិចរិល RNA ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ជាមួយនឹងការបង្កើនមេរោគ និងពិធីការពង្រីក PCR របស់យើង យើងអាចពង្រីកបំណែក \(503\,\hbox {bp}\) ដោយជោគជ័យសម្រាប់ការចាប់សញ្ញាអេឡិចត្រូគីមី។
រូបភាពទី 6 បង្ហាញពីលទ្ធផលឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាអេឡិចត្រូគីមីនៃ \(503\,\hbox {bp}\) បំណែកអំព្លីខុន ទាំងការប្រើ cDNA ដែលមិនរលាយជាគំរូ (1:1) និង 100 ដង cDNA ជាគំរូ (1:100) បានអនុវត្ត PCR បើប្រៀបធៀបទៅនឹង NTC និង PC (សូមមើលរូបភាព S4 នៅក្នុងព័ត៌មានបន្ថែមសម្រាប់ voltammograms តំណាង។ -to-electrode variation.បើប្រៀបធៀបទៅនឹងការវាស់វែង CV ការវាស់វែង DPV បង្ហាញពីដំណោះស្រាយប្រសើរជាងមុនក្នុងការបែងចែកគំរូតេស្ត និង PC ពី NTCs ពីព្រោះដូចដែលបានរៀបរាប់ពីមុន ចរន្ត Faradaic ត្រូវបានលាក់ដោយសារតែចរន្ត capacitive ផ្ទៃខាងក្រោយ។ សម្រាប់ amplicons វែងជាង យើងសង្កេតឃើញថា ការត្រួតពិនិត្យអវិជ្ជមាន (NTC) បណ្តាលឱ្យមានចរន្តកំពូល CV និង DPV ខ្ពស់ទាក់ទងទៅនឹងការត្រួតពិនិត្យវិជ្ជមាន ចំណែកឯសំណាកតេស្តវិជ្ជមាន និងដែលមិនរំលាយបានបង្ហាញពីកម្ពស់ខ្ពស់បំផុតនៃចរន្តកំពូល DPV ។ តម្លៃមធ្យមដែលបានវាស់វែង និងតម្លៃមធ្យមសម្រាប់ undiluted នីមួយៗ (1:1 ) គំរូសាកល្បង និងកុំព្យូទ័រអាចត្រូវបានដោះស្រាយយ៉ាងច្បាស់ពីលទ្ធផលឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាសម្រាប់គំរូ NTC ខណៈពេលដែលដំណោះស្រាយសម្រាប់សំណាកដែលពនឺក្នុង 1:100 គឺមិនសូវមានការបញ្ចេញសំឡេងទេ។ ចំពោះការរំលាយ 100 ដងនៃ cDNA យើងមិនបានសង្កេតឃើញខ្សែណាមួយក្នុងអំឡុងពេល gel electrophoresis (ផ្លូវមិនត្រូវបានបង្ហាញក្នុងរូបភាពទី 5) ហើយចរន្តកំពូល DPV និង CV ដែលត្រូវគ្នាគឺស្រដៀងគ្នាទៅនឹងអ្វីដែលរំពឹងទុកសម្រាប់ NTC។ លទ្ធផលសម្រាប់បំណែក \(117\,\hbox {bp}\) ត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុងព័ត៌មានបន្ថែម។ អវិជ្ជមាន ការគ្រប់គ្រងបណ្តាលឱ្យមានការឆ្លើយតបគីមីគីមីពីឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា PCB ដោយសារតែការស្រូបយក MB ដោយឥតគិតថ្លៃនៅលើអេឡិចត្រូតនិងអន្តរកម្មនៃ MB ជាមួយ oligonucleotide primer ខ្សែតែមួយ។ ដូច្នេះរាល់ពេលដែលគំរូត្រូវបានសាកល្បង ការត្រួតពិនិត្យអវិជ្ជមានត្រូវតែដំណើរការ ហើយ ចរន្តកំពូលនៃគំរូតេស្តប្រៀបធៀបទៅនឹងចរន្តកំពូលដែលទទួលបានដោយការត្រួតពិនិត្យអវិជ្ជមាន ដើម្បីសម្រេចបាននូវការវាស់វែងឌីផេរ៉ង់ស្យែល (ទាក់ទង) 39,40 ដើម្បីចាត់ថ្នាក់គំរូតេស្តជាវិជ្ជមាន ឬអវិជ្ជមាន។
(a) DPV, និង (b) CV peak current for electrochemical detection of \(503\,\hbox {bp}\) fragments in lake water samples. គំរូតេស្តត្រូវបានវាស់ជាបីដង ហើយប្រៀបធៀបទៅនឹងគ្មានការគ្រប់គ្រងគំរូ (NTC) និង ការត្រួតពិនិត្យវិជ្ជមាន (PC) ។
ការរកឃើញរបស់យើងបង្ហាញពីយន្តការផ្សេងៗគ្នាដែលជះឥទ្ធិពលដល់ដំណើរការឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាអេឡិចត្រូគីមីសម្រាប់ amplicons ដែលមានប្រវែងខុសៗគ្នាសម្រាប់ DNA ផ្សេងៗគ្នា ដោយមានការប្រមូលផ្តុំដែលត្រូវបានផ្ទៀងផ្ទាត់ដោយការវាស់វែងអុបទិកដោយប្រើ UV/Vis spectrophotometer។ ការសង្កេតរបស់យើងបញ្ជាក់ពីការយល់ដឹងថាបំណែក DNA វែងជាងរហូតដល់ \(\approx\) \(500\,\hbox {bp}\) អាចត្រូវបានរកឃើញដោយមានភាពរសើបខ្ពស់ ហើយថាវត្តមាននៃអំបិលក្នុងគំរូមិនមានភាពរសើបកំហាប់ DNA ដែលប៉ះពាល់ដល់ភាពប្រែប្រួលខ្ពស់ (កម្រ \({\ hbox {ng}/\upmu \hbox {l}}}\) និងខ្ពស់ជាងនេះ)។លើសពីនេះទៀត យើងបានស៊ើបអង្កេតលើឥទ្ធិពលនៃគំរូផ្សេងៗ រួមទាំងអំពែកដែលបន្សុតដោយជែលដោយមាន និងគ្មានអំបិល និងការបន្ថែមសំណាកទឹកបឹងនៅក្នុងការវាស់វែង DPV និង CV។យើងបានសង្កេតឃើញថា DPV ផ្តល់នូវដំណោះស្រាយប្រសើរជាងមុន ដោយសារចរន្ត capacitive ផ្ទៃខាងក្រោយក៏ប៉ះពាល់ដល់ការវាស់វែង CV ផងដែរ ដែលធ្វើឱ្យវាមានភាពរសើបតិច។
ការពង្រីកបំណែកវែងជាងអាស្រ័យលើភាពសុចរិតនៃ RNA ហ្សែនរបស់មេរោគ។ ការសិក្សាជាច្រើនបានបង្ហាញថាការពង្រីកបំណែកដែលវែងជាងនេះមិនតែងតែមានប្រសិទ្ធភាពទេដោយសារតែការរិចរិលនៃ RNA នៅក្នុងបរិស្ថាន និងសក្តានុពលសម្រាប់ការបំបែកកំឡុងពេលឯកោ 11,41,42,43,44 យើងសង្កេតឃើញថា វិធីសាស្ត្រប្រមូលផ្តុំមេរោគដែលមានមូលដ្ឋានលើ PEG មានប្រសិទ្ធភាពជាងក្នុងការប្រមូលផ្តុំ phage Phi-6 កើនឡើងនៅក្នុងសំណាកទឹកបឹង ជាងវិធីសាស្ត្រប្រមូលផ្តុំមេរោគដែលមានមូលដ្ឋានលើអាលុយមីញ៉ូមអ៊ីដ្រូអុកស៊ីត។ សមត្ថភាពក្នុងការរកឃើញបំណែក DNA វែងបានបង្ហាញឱ្យឃើញដើម្បីយកឈ្នះលើតម្រូវការសម្រាប់ multiplex PCR ដើម្បីពង្រីកគំរូប្រវែងខ្លីជាច្រើន និងកាត់បន្ថយលទ្ធភាពនៃភាពជាក់លាក់ឆ្លងកាត់។
សំណាកជីវសាស្រ្តគឺខ្វះខាត ដូច្នេះចាំបាច់ត្រូវរចនា biosensor ដែលត្រូវការគំរូតិចតួចបំផុតសម្រាប់ការធ្វើតេស្ត។ អេឡិចត្រូត ENIG PCB ដែលប្រើក្នុងការសិក្សានេះទាមទារតែ \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) សំណាកសម្រាប់ធ្វើតេស្តដើម្បីគ្របដណ្តប់លើផ្ទៃដែលមានប្រសិទ្ធភាពនៃអេឡិចត្រូត។ លើសពីនេះ អេឡិចត្រូតដដែលអាចប្រើឡើងវិញបានបន្ទាប់ពីសម្អាតមុនពេលចែកចាយសំណាកបន្ទាប់។ សំណាកដែលពង្រីកមិនតម្រូវឱ្យមានការបន្ថែមសារធាតុគីមីក្រៅពីមេទីលីនពណ៌ខៀវ ដែលជាតម្លៃថោក និងជាសារធាតុគីមីដែលប្រើជាទូទៅ។ ដោយសារអេឡិចត្រូតនីមួយៗមានតម្លៃប្រហែល $0.55 (ឬ INR 40) ដើម្បីផលិត ឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា biosensor នេះអាចជាជម្រើសដ៏មានប្រសិទ្ធភាពមួយចំពោះបច្ចេកវិទ្យារាវរកដែលមានស្រាប់។ តារាងទី 2 បង្ហាញពីការប្រៀបធៀបការងារនេះជាមួយឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាផ្សេងទៀតដែលបានរាយការណ៍នៅក្នុងអក្សរសិល្ប៍អស់រយៈពេលជាយូរ បំណែក DNA នៅក្នុងគំរូផ្សេងៗគ្នា។
ដោយសារពិធីការរកឃើញអេឡិចត្រូគីមីដែលមានមូលដ្ឋានលើ MB ពឹងផ្អែកលើភាពជាក់លាក់នៃ PCR ការកំណត់សំខាន់នៃវិធីសាស្ត្រនេះគឺសក្តានុពលសម្រាប់ការពង្រីកមិនជាក់លាក់នៅក្នុងគំរូផ្សេងៗដូចជាទឹកសំណល់ និងទឹកបឹង ឬការប្រើ primers នៃភាពបរិសុទ្ធទាប។ ដើម្បីបង្កើនភាពប្រែប្រួលនៃ វិធីសាស្រ្តនៃការរកឃើញអេឡិចត្រូគីមីសម្រាប់ការរកឃើញ DNA នៃផលិតផល PCR ដែលមិនបានបន្សុតដោយប្រើអេឡិចត្រូត ENIG PCB ដែលមិនបានកែប្រែ វាចាំបាច់ត្រូវយល់កាន់តែច្បាស់អំពីកំហុសដែលណែនាំដោយ dNTPs និង primers ដែលមិនបានប្រើ និងដើម្បីបង្កើនប្រសិទ្ធភាពលក្ខខណ្ឌប្រតិកម្ម និងពិធីការនៃការវិភាគ។ ប៉ារ៉ាម៉ែត្ររូបវិទ្យាបន្ថែមដូចជា pH សីតុណ្ហភាព និងជីវសាស្រ្ត។ តម្រូវការអុកស៊ីសែន (BOD) នៃសំណាកទឹកក៏អាចនឹងត្រូវការវាស់វែងផងដែរ ដើម្បីបង្កើនភាពត្រឹមត្រូវនៃការវាស់វែង។
សរុបសេចក្តីមក យើងស្នើរឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាអេឡិចត្រូគីមី ENIG PCB ដែលមានតម្លៃទាបសម្រាប់ការរកឃើញមេរោគនៅក្នុងគំរូបរិស្ថាន (ទឹកបឹង)។ ខុសពីអេឡិចត្រូត oligonucleotide immobilized ឬស្រទាប់ខាងក្រោមផ្ទាល់ខ្លួនសម្រាប់ការចាប់សញ្ញា DNA ដែលទាមទារការផ្ទុក cryogenic ដើម្បីរក្សាភាពប្រែប្រួល។ 53,54 បច្ចេកទេសរបស់យើងប្រើ PCB ដែលមិនកែប្រែ អេឡិចត្រូតដែលមានអាយុកាលធ្នើយូរជាង និងមិនមានតម្រូវការផ្ទុកជាក់លាក់ទេ ដូច្នេះហើយសាកសមសម្រាប់ការអភិវឌ្ឍន៍នៃដំណោះស្រាយរង្វាស់ជាមួយនឹងដំណើរការគំរូស្វ័យប្រវត្តិដែលដាក់ពង្រាយក្នុង LMICs។ ឧបករណ៏ biosensor ប្រើប្រាស់ថ្នាំជ្រលក់ DNA-intercalating redox (MB) ដែលមានតម្លៃថោកសម្រាប់ការរកឃើញយ៉ាងឆាប់រហ័សនៃ amplicons គោលដៅ។ ការពង្រីកមិនជាក់លាក់ ជាទូទៅនៅក្នុងសំណាកបរិស្ថានកាត់បន្ថយភាពជាក់លាក់នៃវិធីសាស្ត្រចាប់សញ្ញានេះ ដោយសារតែការចងមិនជាក់លាក់នៃ MBs ទៅនឹង oligonucleotides តែមួយ និងទ្វេ។ និងចរន្តកំពូល DPV ដែលទទួលបានពីសំណាកដែលបានសាកល្បងគួរតែត្រូវបានបកស្រាយទាក់ទងទៅនឹងការឆ្លើយតបដែលទទួលបានពីការគ្រប់គ្រងអវិជ្ជមាន (NTC) សម្រាប់ការធ្វើតេស្តនីមួយៗ។ ការរចនា និងវិធីសាស្រ្តនៃឧបករណ៏អេឡិចត្រូគីមីដែលបានបង្ហាញនៅក្នុងការងារនេះអាចត្រូវបានរួមបញ្ចូលជាមួយ autosamplers ដើម្បីបង្កើតស្វ័យប្រវត្តិកម្មពេញលេញ និងទាប។ -ដំណោះស្រាយតម្លៃដែលអាចប្រមូល និងវិភាគគំរូ និងបញ្ជូនលទ្ធផលដោយឥតខ្សែត្រឡប់ទៅមន្ទីរពិសោធន៍។
Cashdollar, J. & Wymer, L. វិធីសាស្រ្តសម្រាប់ការប្រមូលផ្តុំដំបូងនៃមេរោគពីសំណាកទឹក៖ ការពិនិត្យឡើងវិញ និងការវិភាគមេតានៃការសិក្សាថ្មីៗ.J.Application.microorganism.115, ទំព័រ 1-11 (2013) ។
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Waterborne viruses: ឧបសគ្គចំពោះទឹកផឹកដែលមានសុវត្ថិភាព.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015) ។
Shrestha, S. et al.Wastewater epidemiology សម្រាប់ការឃ្លាំមើលទ្រង់ទ្រាយធំប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពនៃថ្លៃដើមនៃ COVID-19 នៅក្នុងប្រទេសដែលមានចំណូលទាប និងមធ្យម៖ បញ្ហាប្រឈម និងឱកាស។Water 13, 2897 (2021)។
Palecek, E. & Bartosik, M. អាស៊ីតនុយក្លេអ៊ែរ electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012)។
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylene blue ជាអ្នករើសអើងគីមីគីមីនៃសារធាតុ oligonucleotides តែមួយ និងពីរខ្សែ immobilized នៅលើស្រទាប់ខាងក្រោមមាស។ អ្នកវិភាគ 126, 1756-1759 (2001) ។
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ ការប្រៀបធៀប Cation និង Anion Intercalators សម្រាប់ការផ្លាស់ប្តូរអេឡិចត្រូគីមីនៃ DNA Hybridization ដោយ Long-Range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004)។
Wong, EL & Gooding, JJ Charge ផ្ទេរតាម DNA៖ អេឡិចត្រូគីមី DNA biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006)។
Fang, TH et al.Real-time PCR microfluidic device with concurrent electrochemical detection.biological sensor.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009)។
Win, BY et al.Signaling mechanism study and performance verification of a electrochemical real-time PCR system based on interaction of methylene blue with DNA.Analyst 136, 1573–1579 (2011) ។
Ramirez-Chavarria, RG et al.Loop-mediated isothermal amplification-based electrochemical sensor for detection of sars-cov-2 in wastewater samples.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022)។
Kumar, M. et al.Electrochemical sensing of SARS-CoV-2 amplicons with PCB electrodes.The sensor is activated.B Chemistry.343, 130169 (2021)។
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. ការរកឃើញប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពនៃ SARS-CoV-2 RNA នៅក្នុងប្រភាគរឹងនៃ wastewater.science.general environment.763, 144587 (2021)។
Alygizakis, N. et al.Analytical Methods for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020)។
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. ការរស់រានមានជីវិតនៃស្រោមសំបុត្រ bacteriophage Phi6 (ជាពពោះជំនួសសម្រាប់ SARS-CoV-2) នៅក្នុងដំណក់ទឹកមាត់ដែលហួតហើយដាក់លើកញ្ចក់ផ្ទៃ។science.Rep.១០, ១–១០ (ឆ្នាំ ២០២០)។
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Environmental persistence of SARS-CoV-2 surrogate (Phi6) in free-living amoeba.J.សុខភាពទឹក 20, 83 (2021)។
Mindich, L. ការវេចខ្ចប់យ៉ាងជាក់លាក់នៃបំណែកហ្សែនចំនួនបីនៃ RNA bacteriophage ខ្សែទ្វេរ \(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.៦៣, ១៤៩–១៦០ (១៩៩៩)។
Pirttimaa, MJ & Bamford, រចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំនៃ DH RNA phage\(\varphi\)6 តំបន់វេចខ្ចប់.RNA 6, 880–889 (2000)។
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – ពិធីការលឿន និងមានប្រសិទ្ធភាពសម្រាប់ការរៀបចំស្តុកមន្ទីរពិសោធន៍នៃ bacteriophages.PeerJ 4, e2261 (2016) ។
ពេលវេលាប្រកាស៖ ថ្ងៃទី ២៧ ឧសភា ២០២២