Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рақмет. Сіз пайдаланып жатқан шолғыш нұсқасында CSS қолдауы шектеулі. Ең жақсы тәжірибе алу үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer бағдарламасында үйлесімділік режимін өшіріңіз). қолдауды жалғастыра отырып, біз сайтты стильсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Қоршаған орта үлгілерін бақылаудың маңыздылығы COVID-19 пандемиясының басынан бері жоғары бағаланды және qPCR негізіндегі әдістер қымбат болғанымен, кейбір бақылау жұмыстары алтын стандартты қолдану арқылы орындалуда. Электрохимиялық ДНҚ биосенсорлары ықтимал үнемді қамтамасыз ете алады. Табысы төмен және орташа елдердегі қоршаған ортаның су үлгілерін бақылауға арналған шешім. Бұл жұмыста біз ENIG көмегімен көл суының тікенді үлгілерінен (SARS-CoV-2 үшін танымал суррогат) оқшауланған Phi6 фагынан алынған ампликондарды электрохимиялық анықтауды көрсетеміз. ПХД электродтарын бетін өзгертусіз аяқтау үшін.жыныс. Электрохимиялық сенсордың жауабы әртүрлі ұзындықтағы екі ДНҚ фрагменттері үшін мұқият сипатталды (\({117}\,\hbox {bp}\) және \({503}\,\hbox {bp}\)) және ПТР негізгі қоспаларындағы тұздардың метилен көк (МБ)-ДНҚ өзара әрекеттесуіне әсері. Біздің нәтижелеріміз ДНҚ фрагменттерінің ұзындығы электрохимиялық сезімталдықты айтарлықтай анықтайтынын көрсетеді және бұл жұмыста ПТР өнімдерін гельдік тазартусыз ұзын ампликондарды анықтау мүмкіндігін көрсетеді. су үлгілерін in situ өлшеу үшін маңызды.Вирустық жүктемеге арналған толық автоматтандырылған шешім жақсы нәтиже береді.
Су арқылы вирустың таралуы 1940 жылдардан бері полиомиелит пен Е1 гепатитінің су арқылы таралуының алғашқы дәлелдерімен қоғамдық денсаулыққа қауіп ретінде белгілі болды. Дүниежүзілік денсаулық сақтау ұйымы (ДДСҰ) денсаулық үшін орташа және жоғары маңыздылығы бар бірнеше су арқылы өтетін вирустық қоздырғыштарды жіктеді2. Дәстүрлі вирус анықтау әдістері алтын стандартты qPCR негізіндегі әдістерге сүйенеді, олар өте сезімтал және спецификалық, бірақ қымбат құралдарды пайдаланып зертханада сынау үшін білікті қызметкерлерді қажет етеді. Алайда ресурстары шектеулі төмен және орташа кірісі бар елдерде (LMIC) адам сынамаларды сынау қоршаған ортадағы су сынамаларының мониторингіне қарағанда басым болуы мүмкін. Сондықтан төмен және орташа кірісі бар елдерде су мен сарқынды су үлгілерінің тұрақты, нақты уақыт режимінде мониторингі үшін балама арзан әдістер қажет. осылайша оларды вирустық пандемияның ауыр әлеуметтік-экономикалық әсерінен қорғайды. Нуклеин қышқылдарына арналған арзан электрохимиялық биосенсорлар осы қанағаттандырылмаған қажеттілікке перспективалы әлеуетті шешім бере алады. Осы ДНҚ биосенсорларының көпшілігі комплементарлы ДНҚ тізбектерінің электродта иммобилизациялануымен жұмыс істейді. үлгіде сәйкес реттілік болған кезде бетті және будандастыруды жүзеге асырады. Оны кейін калий темір/ферроцианид сияқты тотығу-тотықсыздандырғыш медиаторларды пайдалана отырып, әртүрлі электрохимиялық әдістер арқылы сигналға түрлендіруге болады. Метилен көкі (МБ) осындай тотығу-тотықсыздандырғыш белсенді молекулалардың бірі болып табылады. оның бір тізбекті ДНҚ-мен спецификалық емес байланысуына қосымша қос тізбекті ДНҚ-ға (dsDNA) интеркалацияланатыны хабарланды5,6. МБ-ДНҚ кешендерін құру үшін МБ-ның интеркалациялану сипаты оларды бірнеше электрохимиялық ДНҚ-дағы тотығу-тотықсыздандырғыш медиаторлар ретінде танымал таңдау жасайды. сенсор конфигурациялары5,6,7,8,9. МБ-ның ДНҚ-ға интеркалациясы спецификалық емес және бұл электрохимиялық сенсордың ерекшелігі негізінен ПТР немесе изотермиялық күшейту үшін қолданылатын праймерлердің тазалығына байланысты болғанымен, ол нақты деректерді енгізу үшін өте қолайлы. -уақыттағы электрохимиялық негізделген qPCR немесе ДНҚ концентрациясын өлшеуге балама ретінде флуоресцентті изотермиялық күшейту 9 . Осындай іске асырудың бірінде Вон және т.б. Алтын электродтардың беті нақты уақыт режимінде 6-меркапто-1-гексанолмен (MCH) модификацияланды. Дифференциалды импульстік вольтамметрияны (DPV) пайдаланып МБ-мен ПТР ампликондарын өлшеу 9. Басқа жағдайларда, Рамирес және т.б. Экранда басылған электродтары бар МБ көмегімен RT-LAMP реакциясы арқылы сарқынды судағы SARS-CoV-2 анықтау. Платиналық электродтар да қолданылған. реакциялар кезінде ампликондарды электрохимиялық анықтауға арналған микрофлюидті ПТР платформасында in situ электродтар сияқты пайдаланылады 8 .Бұл зерттеулердің барлығы электродтардың беттік модификациясын талап етеді, бұл функционалдық электродтардың тұрақтылығы үшін арнайы сақтау талаптарының арқасында өндіріс пен пайдалану шығындарының жоғарылауын білдіреді.
Көл суының үлгілеріндегі концентрацияланған вирустық бөлшектерден алынған ампликондарды электрохимиялық анықтау жұмысының схемасы.
Жақында біз SARS-CoV-2 ампликондарының DPV негізіндегі арзан баспа платасының (ПХБ) электродтары бар электрохимиялық зондтауын және өзгертілмеген электродтардың бетіндегі МБ-ДНҚ кешендерінің адсорбциясы арқылы туындаған циклдік вольтметрияны (CV) көрсеттік. ағымдағы 11.Біз CDC ұсынған N1 алға және N2 кері праймерлерді пайдаланып түзілген ұзынырақ ДНҚ фрагменттері (N1-N2, \({943}\, \hbox) қысқа фрагменттермен салыстырғанда {bp}\)) сенсорлық жауапта жақсы сызықтылықты көрсеткенін хабарлаймыз. ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) N1 алға және N1 кері праймер жинақтары арқылы қалыптастырылды. Бұл зерттеулер нуклеазасыз суда дайындалған ДНҚ сұйылтулары арқылы хабарланады. Платформа сонымен қатар SARS-CoV анықтау үшін пайдаланылды. Үлгіленген сарқынды су үлгілеріндегі -2 ампликон (SARS-CoV-2 РНҚ-сы бар жалпы РНҚ үлгілерін көбейту арқылы алынған). РНҚ оқшаулау және төменгі ағынды өңдеу кезінде кесуге бейім болғандықтан,12,13 бұл гетерогенді үлгімен ұзағырақ фрагменттерді күшейту қиын. Сондықтан сарқынды судағы SARS-CoV-2 ампликонының электрохимиялық зондтауын көрсету қысқарақ \(72\,\hbox {bp}\) N1 фрагментімен шектеледі.
Бұл жұмыста біз көл суының үлгілерінен шоғырланған және оқшауланған Phi6 фагының ENIG PCB негізіндегі электрохимиялық зондтауының орындылығын зерттедік (1-сурет). Phi6 фагтары мөлшері (80-100 нм) бойынша SARS-CoV-2 және сондай-ақ липидті қабықшасы мен протеинге ие. Осы себептерге байланысты Phi6 бактериофагы SARS-CoV-2 және басқа қапталған патогенді РНҚ вирустары14,15 үшін танымал суррогат болып табылады. Фаг бөлшектерінен оқшауланған РНҚ кДНҚ синтезі үшін үлгі ретінде пайдаланылды. Ұзындығы 117 және 503 негізгі жұп екі ДНҚ фрагменттерін алу үшін ПТР. Алдыңғы жұмысымызда \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 фрагменттерін күшейту мәселесін ескере отырып, біз аралық ұзындықтағы фрагменттерді (\(117) нысанаға аламыз. \,\hbox {bp}\) және \(503 \,\hbox {bp}\)), қолжетімді праймерлерге негізделген. Электрохимиялық сенсордың жауабы кең концентрация диапазонында жүйелі түрде зерттелді (\({10}\,{) \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) - \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Екі фрагмент үшін де МБ болуы, тұздың сенсорлық реакцияға әсері спектрофотометриялық өлшемдер арқылы сипатталды және айқаспалы расталды. Бұл жұмыстың негізгі үлестері төмендегідей:
ДНҚ фрагментінің ұзындығы және үлгідегі тұздың болуы сезімталдыққа қатты әсер етеді.Біздің нәтижелеріміз электрохимиялық белсенділік ДНҚ концентрациясы мен ұзындығына байланысты вольтметриялық жауапта МБ, ДНҚ және сенсордың өзара әрекеттесуінің әртүрлі механизмдеріне байланысты екенін көрсетеді, ұзағырақ Фрагменттер жоғары сезімталдық көрсетеді, дегенмен тұз арасындағы электростатикалық әрекеттесулерге кері әсер етеді. МБ және ДНҚ.
ДНҚ концентрациясы өзгертілмеген электродтардағы МБ-ДНҚ өзара әрекеттесу механизмін анықтайды. Біз МБ-ДНҚ өзара әрекеттесуінің әртүрлі механизмдері ДНҚ концентрациясына байланысты екенін көрсетеміз. ДНҚ концентрациясында аз мөлшерде \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox) төмен. {l}}}\), біз электрохимиялық токтың реакциясы негізінен электродтағы МБ-ДНҚ адсорбциясымен анықталатынын байқадық, ал төмен концентрацияларда ДНҚ жоғары концентрацияларында электрохимиялық ток реакциясы тотығу-тотықсызданудың стерикалық тежелуімен анықталды. ДНҚ негізі жұптары арасында МБ кірістіруіне байланысты белсенділік.
ENIG ПХД негізіндегі Көл суының үлгілеріндегі вирустық нуклеин қышқылдарының электрохимиялық зондтауы Бақылаулар Повай көліндегі су үлгілерінен алынған Phi6 қосылған \(503\,\hbox {bp}\) ДНҚ фрагменттерін электрохимиялық анықтау арқылы расталды, IIT Мумбай кампусы. Нәтиже фаг.
Қолданудың төмен құны және толық автоматтандырылған бақылау жүйелеріне, олигонуклеотидтерге немесе электродтардағы аптамерлерге жарамдылық мерзімі ұзағырақ.
Phage Phi6 — Pseudomonas syringae жұқтыратын Cytoviridae тұқымдасының қабықшалы dsRNA вирусы. Phi6 фагының геномы 3 фрагмент түрінде болады: S (\(2,95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4,07) \,\hbox {Kb}\)) және L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Phi6 фаг патогенді емес BSL-1 Pseudomonas штаммын жұқтыратындықтан, оны пайдалану қауіпсіз. және зертханада оңай өсіруге болады. Phage Phi6 және оның иесі Pseudomonas syringae бактериялық вирустарға арналған Felix d'Herelle анықтамалық орталығынан, Лавал университетінен, Канададан сатып алынған (анықтамалық орталықтың каталог нөмірлері тиісінше HER-102 және HER-1102) .Phi6 фаг және оның иесі анықтамалық орталықтың нұсқауы бойынша қайта жандандырылды. Phage Phi6 соңғы титрлерді \(\шамамен 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { {\шамамен) алу үшін пластина лизисі және элюциясы арқылы тазартылды. ml}}\) (бляшка түзетін бірлік/ миллилитр). РНҚ өндірушінің нұсқауларына сәйкес GenElute™ әмбебап жалпы РНҚ тазарту жинағы (Sigma-Oldrich) арқылы тазартылған фаг бөлшектерінен бөлініп алынды. Қысқаша айтқанда, тазартылған Phi6 фаг суспензиясы\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) лизиденді және лизат РНҚ-ның шайыр бағанымен байланысуына мүмкіндік беру үшін айналдыру бағанына жүктелді. Содан кейін РНҚ элюция ерітіндісінде элюцияланады \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) жинақпен қамтамасыз етілген. РНҚ концентрациясын сіңіру арқылы \(260\,\hbox {nm}\) бағалаңыз. РНҚ \ ішінде аликвоталарда сақталды. ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) әрі қарай пайдаланғанша.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA синтез жинағы (Bio -Rad Laboratories) өндірушінің нұсқауларына сәйкес cDNA синтезі үшін үлгі ретінде пайдаланылды. Қысқаша айтқанда, cDNA синтез реакциясы 3 қадамнан тұрады: \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , \({20}\,{\hbox {min}}\) \({46}\,{^{\circ) бойынша кері транскрипциясы }\hbox {C}}\) және кері Диктофон \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) ішінде \({1}\,{\hbox {мин) }}\).1% агарозды гельде жұмыс істегенде, cDNA күтілетін үш РНҚ фрагментіне сәйкес үш жолақты көрсетті (деректер көрсетілмеген). Ұзындығы 117 және 503 bp екі ДНҚ фрагменттерін күшейту үшін келесі праймерлер пайдаланылды, miniPCR® mini8 термиялық циклінде ПТР үлгісі ретінде cDNA пайдалану:
\(117\,\hbox {bp}\) және \(503\,\hbox {bp}\) үшін праймерлер M сегментінің 1476-1575 нуклеотидтеріне және L сегментінің 458-943 нуклеотидтеріне сәйкес қышқыл .Барлық күшейтілген ПТР өнімдері 1% агароздық гельдерде электрофорезденді және күшейтілген мақсатты ДНҚ GeneJET гельді экстракциялау жинағы (Thermo Fisher Scientific) көмегімен тазартылды.
IIT Мумбай кампусындағы көл (Повай көлі, Повай, Мумбай) фаг бөлшектерін қосу үшін пайдаланылды. Көл суы \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) мембрана арқылы сүзілді. тоқтатылған бөлшектер, содан кейін Phi6 фаг қосылды. \({1}\,{\hbox {ml}}\) \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} қосыңыз. \) \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) сүзілген көл суы, \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Шағын аликвота болды. бляшка талдауы арқылы вирустық жүктемені өлшеуге арналған. Біз Phi6 вирусының түйілген бөлшектерін концентрациялаудың екі түрлі әдісін сынадық: (1) алюминий гидроксиді адсорбция-тұндыру әдісі,19 ол қоршаған орта үлгілерінен бірнеше қабықшалы РНҚ вирустарының концентрациясы үшін расталған және (2) ) Полиэтиленгликоль (PEG) негізіндегі вирус концентрациясы әдісі Flood et al.20 . PEG негізіндегі әдістің қалпына келтіру тиімділігі алюминий гидроксиді әдісімен салыстырғанда жақсырақ болып табылғандықтан, PEG негізіндегі әдіс көл суының үлгілерінен Phi6 бөлшектерін концентрациялау үшін пайдаланылды.
Пайдаланылған PEG әдісі келесідей болды: PEG 8000 және \(\hbox {NaCl}\) 8 % PEG 8000 және \(0,2\,\hbox {M} \) алу үшін Phi6-таяқшалы көл суының үлгілеріне қосылды. \ hbox {NaCl}\).Үлгілер шейкерде инкубацияланды\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), содан кейін \(4700 \,\hbox {g}\) \({45}\,{\hbox {min}}\ центрифугаланады. Супернатантты тастаңыз және түйіршіктерді \({1}\, {\hbox {ml}}\) сол үстіңгі затта. Барлық шпиондық және вирус концентрациясы эксперименттері үш данада орындалды. Концентрациядан кейін қалпына келтіру тиімділігін бляшка талдауы арқылы өлшеу үшін шағын аликвота сақталды. РНҚ бұрын сипатталғандай бөлініп алынып, элюцияланған. жинақпен қамтамасыз етілген элюционды буферде\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). РНҚ концентрациясы үлгіден үлгіге үш көшірмеде өзгеретіндіктен, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) РНҚ оның концентрациясына қарамастан үшеуі үшін де пайдаланылады, үлгілердің cDNA синтезі. cDNA синтезі бұрын сипатталғандай орындалды.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) \ (117\,\hbox {bp}\) және \(503\,\hbox { күшейту үшін 35 цикл үшін ПТР үлгісі ретінде пайдаланылды. bp}\) фрагменттері. Бұл үлгілер "1:1" түрінде, яғни сұйылтусыз көрсетілген. Теріс бақылау ретінде үлгісіз бақылау (NTC) орнатылды, ал тазартылған фагтан бөлінген РНҚ арқылы синтезделген кДНҚ орнатылды. оң бақылау (PC) үлгісі ретінде. Сандық ПТР (qPCR) Stratagene Mx3000P RT-PCR құралында Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies) көмегімен орындалды. Реакциялар бұрынғыдай үш данада орнатылды. сипатталған. Цикл шегі (Ct) барлық үлгілер үшін жазылды. Сонымен қатар, сұйылтылған үлгілер сүзілген көл суында 1:100 сұйылтылған cDNA көмегімен \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) болды. \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) 35 цикл үшін ПТР. Бұл үлгілер “1:100″ түрінде берілген.
ПХД электродтары қосымша алтынмен қаптауды қажет етпей, коммерциялық қол жетімді арзан электродсыз никельді иммерсионды алтын (ENIG) процесі арқылы жасалады. ENIG ПХД электродтарының сипаттамалары алдыңғы жұмысымызда егжей-тегжейлі берілген11. ENIG PCB электродтары үшін дәстүрлі электродтарды тазалау әдістері, мысалы: пиранья ерітіндісі немесе күкірт қышқылының циклдік вольтметриясы ұсынылмайды, өйткені олар жұқа алтын қабатының (қалыңдығы \(\шамамен\) \(100\,\hbox {nm }\)) қабығын тудыруы және бейімді мыс қабаттарын ашуы мүмкін. коррозияға 21, 22, 23, 24, 25. Сондықтан электродтарды IPA суланған түксіз шүберекпен тазалаңыз. Сыналатын үлгі \({50}\,{\upmu \hbox {M} арқылы инкубацияланды. }\) Оңай енгізу үшін \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) ішінде МБ. Біздің алдыңғы жұмысымызда , біз сенсордың сезімталдығы мен сызықтылығы МБ концентрациясын арттыру арқылы жақсарғанын байқадық 11 .Алдыңғы жұмысымызда айтылған оңтайландырулар негізінде біз \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) МБ қолдандық. осы зерттеуде ДНҚ ендіру үшін концентрациялар. Екі тізбекті ДНҚ (ds-DNA) электрохимиялық анықтауға анионды немесе катиондық интеркалаторларды қолдану арқылы қол жеткізуге болады. Аниондық интеркалаторлар ДНҚ-ны жақсырақ таңдағыштықпен анықтағанымен, олар түнгі инкубацияны қажет етеді, нәтижесінде анықтау уақыттары ұзарады. екінші жағынан, МБ сияқты катиондық интеркалаторлар ds-DNA6 электрохимиялық анықтау үшін шамамен \({1}\, {\hbox {h}}\) қысқа инкубация уақытын талап етеді. Әрбір өлшем сыналатын үлгіні сынауға арналған құрылғыға жіберуді қамтиды. электрод\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), содан кейін басқа үлгімен жалғастырмас бұрын IPA ылғалдандырылған шүберекпен тазалаңыз.бір өлшем. Әрбір үлгі 5 түрлі электродта сыналған, егер басқаша көрсетілмесе.DPV және CV өлшемдері PalmSens Sensit Smart потенциостаты арқылы орындалды, ал PSTrace бағдарламалық құралы потенциостат конфигурациясы мен деректерді алу үшін, соның ішінде максималды ток есептеулері үшін пайдаланылды. Келесі параметрлер пайдаланылады. DPV және CV өлшемдері үшін:
DPV: Тепе-теңдік уақыты = \(8\,\hbox {s}\), Кернеу қадамы = \(3\,\hbox {mV}\), Импульстік кернеу = \(25\,\hbox {mV}\), импульс ұзақтығы = \(50\,\hbox {ms}\), сканерлеу жылдамдығы = \({20}\,\hbox {мВ/с}\)
Түйіндеме: Тепе-теңдік уақыты = \(8\,\hbox {s}\), Кернеу қадамы = \(3\,\hbox {mV}\), Тасу жылдамдығы = \({300}\,\hbox {mV/s) }\)
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) МБ комплексті ДНҚ вольтаммограммаларынан алынған шыңдық токтар: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV және CV вольтаммограммалары ДНҚ-мен комплексті ENIG PCB электродтары \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) МБ (10–\({20}\,{\ hbox {ng концентрацияларында) алынды. }/{\upmu \hbox {l}}}\) яғни \(117\,\hbox {bp}\ ) және 0,03 үшін 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) for \(503\,\hbox {bp}\)). Өкілдік вольтаммограммалар Қосымша ақпараттағы S1 суретінде көрсетілген. 2-суретте нәтижелер көрсетілген. гельмен тазартылған ПТР өнімдерін пайдалана отырып, DPV және CV өлшемдерінің (ең жоғары ток). CV өлшемдерімен салыстырғанда, DPV өлшемдері жоғары сезімталдықты көрсетеді (ДНҚ концентрациясының функциясы ретіндегі ток), себебі CV өлшемдеріндегі фондық сыйымдылық токтары Фарадалық токтарды жасырады 26 .Деректер қорап сызбасындағы әрбір қорап үшін 5 электродтың өлшемдері бар. Барлық өлшемдер электродтар мен электродтардың өзгеруіне байланысты өлшеу қателіктерін болдырмау үшін бірдей электродтар жинағын пайдаланады. Біз ДНҚ төмен концентрациялары үшін DPV және CV өлшенетін ең жоғары токтардың өсу тенденциясын байқадық. , ұзағырақ (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ \(117) ) салыстырғанда. МБ-ДНҚ кешенінің адсорбциясы электродтағы зарядтың тасымалдануын жеңілдетеді, бұл токтың шыңының артуына ықпал етеді. Басқа зерттеулер МБ-ДНҚ интеркалациясына олигонуклеотидтер мөлшері мен реттілігінің әсерін көрсетті27,28,29,30. Гуанин Екі ампликонның (\(117\,\hbox {bp}\) және \(503\,\hbox {bp}\)) -цитозин (GC) мазмұны шамамен 50% болды, бұл байқаудың айырмашылығына байланысты екенін көрсетеді ампликон ұзындығына дейін. Алайда, жоғары ДНҚ концентрациясы үшін (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), \(503\,\hbox {bp} үшін) \) және \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) үшін \(117\,\hbox {bp}\)), біз екі күшейтуді байқаймыз Су астыларының ең жоғары токтары DPV және CV өлшемдерінде де азаяды. Бұл МБ ДНҚ-ның негізгі жұптары арасында қанығуы және интеркалациялануы, нәтижесінде МБ31,32-де тотықсыздандырылатын топтың тотығу-тотықсыздану белсенділігінің стерикалық тежелуіне әкеледі.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503) \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
ПТР негізгі қоспаларында болатын тұздар МБ және ДНҚ арасындағы электростатикалық әрекеттесулерге кедергі жасайды, сондықтан \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) \({50} \,{\) қосу арқылы upmu \hbox {M}}\) МБ-ДНҚ өзара әрекеттесуіне тұздың әсерін зерттеу үшін МБ гельмен тазартылған өнім. 3-суретте көрсетілгендей, ДНҚ жоғары концентрациялары үшін (\(>{2}\,{\) hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) және \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) үшін \(117\,\hbox {bp} \)), DPV және CV-де Тұзды қосу өлшемдерге айтарлықтай әсер еткен жоқ (Өкілетті вольтаммограммалар үшін Қосымша ақпараттағы S2 суретін қараңыз). Дегенмен, төмен ДНҚ концентрациясы, тұзды қосу сезімталдықты айтарлықтай төмендетеді, нәтижесінде ДНҚ концентрациясы бар ток айтарлықтай өзгермейді. Тұздың МБ-ДНҚ өзара әрекеттесуіне және интеркалациясына ұқсас теріс әсерлері туралы бұрын басқа зерттеушілер хабарлаған33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) катиондары ДНҚ-ның теріс фосфатты діңгегімен байланысады, осылайша МБ және ДНҚ арасындағы электростатикалық әрекеттесуді тежейді. ДНҚ жоғары концентрацияларында тотығу-тотықсыздану-белсенді МБ-ның стерикалық тежелуі төменгі пик токтарына әкеледі, сондықтан электростатикалық өзара әрекеттесулер. сенсордың жауабына айтарлықтай әсер етпейді. Ең бастысы, бұл биосенсор жоғарырақ ДНҚ концентрацияларын (сирек \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) немесе одан жоғары) анықтауға жақсырақ. ПТР өнімдерін гельмен тазарту мүмкін болмауы мүмкін қоршаған ортадағы су үлгілерін толық автоматтандырылған өңдеу үшін.
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) комплексті ДНҚ-ның әртүрлі концентрациялары үшін 600–700 \(\hbox {nm}\) толқын ұзындығы диапазоны үшін жұтылу қисығы астындағы аудан: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) тұзбен және тұзсыз (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) тұзы бар және тұзсыз (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) МБ үлгілеріне сәйкес келетін ДНҚ концентрациясы ДНҚ жоқ.
Жоғарыда келтірілген нәтижелерді қосымша тексеру үшін біз UV/Vis спектрофотометрін (Thermo Scientific Multiskan GO) пайдаланып оптикалық өлшемдерді орындадық, әрбір үлгі үшін \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) үлгілері қолданылды. Өлшем. ДНҚ концентрациясының жоғарылауымен жұтылу белгісі төмендейді, оны \(600\,\hbox {nm}\) толқын ұзындығының диапазоны үшін абсорбция қисығы астындағы тенденциядан \(700\,\hbox { nm}\) , 4-суретте көрсетілгендей (сіңіру спектрі Қосымша ақпаратта S3-суретте көрсетілген). ДНҚ концентрациясы \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox-тан төмен үлгілер үшін) {l}}}\), құрамында ДНҚ бар және тек МБ үлгілері (\(503\,\hbox {bp}\) және \(117\,\hbox {bp}\ үшін) арасында сіңіруде айтарлықтай айырмашылық болмады. ) ұзындық фрагменттері), тотығу-тотықсыздану-белсенді МБ стерикалық тежелуінің жоқтығын көрсетеді. Жоғары ДНҚ концентрацияларында біз сіңіру сигналының біртіндеп төмендеуін байқадық және тұздың қатысуымен сіңірудің азырақ төмендеуін байқадық. Бұл нәтижелер молекулалық ДНҚ гибридтеріндегі негізді жинақтаумен өзара әрекеттесу және стерикалық тежелу. Біздің нәтижелеріміз \(\pi\)–\(\pi ^*\) гипохроматтықты төмендетілген энергия деңгейлерімен байланыстыратын МБ-ДНҚ интеркалациясының спектроскопиялық зерттеулері туралы әдебиеттердегі есептерге сәйкес келеді. ) интеркалацияға байланысты электрондық ауысулар 36, 37, 38 қабаттары.
Phi6 фагының агарозды гель электрофорезі: көл суының үлгілерінен алынған ұзындықтағы \(117\,\hbox {bp}\) және \(503\,\hbox {bp}\) ПТР өнімдері. М-ДНҚ маркері;NTC-үлгісіз басқару, сәйкес ампликондарды қамтитын праймерлер;ДК оң бақылау;1, 2, 3-сұйылтылмаған (1:1) көл суының үш дана үлгілері. Жолақ \(503\,\ ішінде пайдаланылмаған олигонуклеотидтерге байланысты \(\шамамен 50\,\hbox {bp}\) көрінеді. hbox {bp}\) жолағы.
Біз сенсордың пайдалылығын Phi6 фагымен қосылған Powai көліндегі су үлгілерін пайдаланып бағаладық. Фагты су үлгілерінен бөлінген РНҚ концентрациясы 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), ал тазартылған фаг суспензияларынан бөлінген РНҚ қалпына келтіру тиімділігі шамамен 1 болатын \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) деп бағаланды. %.РНҚ cDNA-ға кері транскрипцияланды және ПТР және qPCR үшін үлгі ретінде пайдаланылды. Өнім өлшемі сенсормен сынау алдында агарозды гель электрофорезімен (5-сурет) расталды. Бұл үлгілер гельмен тазартылмаған, сондықтан ПТР-ның барлық компоненттері ретінде қызығушылық ампликондары сияқты. qPCR кезінде жазылған Ct мәндері (1-кесте) сәйкес су сынамаларынан бөлінген РНҚ концентрациясымен корреляцияланғаны көрсетілген. Ct мәні флуоресцентті сигнал үшін қажетті циклдар санын көрсетеді. шекті мәннен немесе фондық сигналдан асып кетеді. Жоғары Ct мәндері үлгі концентрациясының төмендігін көрсетеді және керісінше. NTC үлгілерінің Ct мәндері күтілгендей жоғары болды. \(\шамамен 3\) Ct мәндерінің арасындағы айырмашылық оң бақылау және сынақ үлгісі одан әрі әрбір сынақ үлгісі оң бақылаумен салыстырғанда шамамен 1% үлгіге ие екенін көрсетеді. Біз ұзағырақ ампликондар жақсырақ сезімталдыққа әкелетінін бұрын талқылаған болатынбыз. Біртекті емес орта үлгілерінен оқшауланған ұзағырақ фрагменттерді күшейту кемшіліктерді ескере отырып қиынға соғады. төмен вирус концентрациясы мен РНҚ ыдырауы. Дегенмен, вирусты байыту және ПТР күшейту хаттамасымен біз электрохимиялық зондтау үшін \(503\,\hbox {bp}\) фрагментін сәтті күшейте алдық.
6-суретте үлгі ретінде сұйылтылмаған cDNA (1:1) және 100 есе сұйылтылған cDNA үлгі ретінде (1:100 ) орындалған ПТР пайдаланылған \(503\,\hbox {bp}\) фрагмент ампликонының электрохимиялық сенсор нәтижелері көрсетілген. , NTC және PC-мен салыстырғанда (өкілетті вольтаммограммалар үшін Қосымша ақпараттағы S4 суретін қараңыз). 6-суреттегі қорап сызбасындағы әрбір қорапта 5 электродтағы үш үлгінің өлшемдері бар. Электродқа байланысты қателерді болдырмау үшін барлық үлгілерді өлшеу үшін бірдей электродтар пайдаланылды. -электродқа вариация. CV өлшемдерімен салыстырғанда, DPV өлшемдері сынақ және ДК үлгілерін ҰТҚ-дан ажырату үшін жақсырақ ажыратымдылықты көрсетеді, себебі, бұрын айтылғандай, фарадалық токтар соңғылардағы фондық сыйымдылық токтарына байланысты жасырылады. Ұзағырақ ампликондар үшін біз мынаны байқадық. теріс бақылау (NTC) оң бақылауға қатысты жоғары CV және DPV шыңы токтарына әкелді, ал оң және сұйылтылмаған сынақ үлгілері DPV шыңы токтарының ұқсас шыңы биіктіктерін көрсетті. Әрбір сұйылтылмаған (1:1) үшін өлшенген орташа және медианалық мәндер ) сынақ үлгісі мен компьютерді NTC үлгісі үшін сенсор шығысынан анық шешуге болады, ал сұйылтылған үлгі 1:100 үшін ажыратымдылық азырақ. cDNA 100 есе сұйылту үшін біз гель электрофорезі кезінде ешқандай жолақтарды байқамадық. (5-суретте көрсетілмеген жолақтар) және сәйкес DPV және CV шыңы токтары NTC үшін күтілетіндерге ұқсас болды. \(117\,\hbox {bp}\) фрагменті үшін нәтижелер Қосымша ақпаратта көрсетілген. Теріс бақылау электродтағы бос МБ адсорбциясы және МБ бір тізбекті праймер олигонуклеотидпен әрекеттесуі салдарынан ПХД сенсорының электрохимиялық реакциясын тудырды. Сондықтан үлгі сыналған сайын теріс бақылауды іске қосу керек және сынама үлгісін оң немесе теріс деп жіктеу үшін дифференциалды (салыстырмалы) өлшеуге қол жеткізу үшін теріс бақылаумен алынған шыңдық токпен салыстырғанда сынақ үлгісінің ең жоғары тогы39,40.
(a) DPV және (b) Көл суының үлгілеріндегі \(503\,\hbox {bp}\) фрагменттерді электрохимиялық анықтауға арналған CV шыңы тогы. Сынақ үлгілері үш данада өлшенді және үлгілік бақылау құралдарымен (NTC) салыстырылды және оң басқару элементтері (ДК).
Біздің қорытындыларымыз әр түрлі ДНҚ үшін әртүрлі ұзындықтағы ампликондарға арналған электрохимиялық сенсорлардың өнімділігіне әсер ететін әртүрлі механизмдерді көрсетеді, концентрациялары УК/Вис спектрофотометрі арқылы оптикалық өлшеулер арқылы тексеріледі. Біздің бақылауларымыз ДНҚ фрагменттерінің \(\шамамен\) дейін ұзағырақ болатынын көрсетеді. \(500\,\hbox {bp}\) жоғары сезімталдықпен анықталуы мүмкін және үлгідегі тұздың болмауы Сезімталдық ДНҚ концентрациясы жоғары сезімталдыққа әсер етеді (сирек \({\hbox {ng}/{\upmu) \hbox {l}}}\) және одан жоғары).Сонымен қатар, біз сынамалардың әртүрлі түрлерінің әсерін, соның ішінде тұз қосылған және қосылмаған гельмен тазартылған ампликондарды және DPV және CV өлшемдерінде көл суының үлгілерін қосуды зерттедік.Біз DPV жақсырақ ажыратымдылықты қамтамасыз еткенін байқадық, өйткені фондық сыйымдылық тогы CV өлшеміне де әсер етіп, оны азырақ сезімтал етеді.
Ұзақ фрагменттерді күшейту вирустық геномдық РНҚ тұтастығына байланысты. Бірнеше зерттеулер қоршаған ортадағы РНҚ деградациясына және оқшаулау кезінде сплайсинг мүмкіндігіне байланысты ұзағырақ фрагменттерді күшейту әрқашан тиімді бола бермейтінін көрсетті11,41,42,43,44 .Біз PEG негізіндегі вирус концентрациясы әдісі алюминий гидроксиді негізіндегі вирус концентрациясы әдісіне қарағанда, көл суының үлгілерінде Phi-6 спиктелген фагты концентрациялауда тиімдірек екенін байқадық. Ұзын ДНҚ фрагменттерін анықтау қабілеті мультиплекстік ПТР талабын еңсерді. бірнеше қысқа ұзындық үлгілерін күшейту және айқас ерекшелік мүмкіндігін азайту үшін.
Биологиялық үлгілер аз, сондықтан сынау үшін ең аз үлгілерді қажет ететін биосенсорды жобалау қажет. Осы зерттеуде пайдаланылған ENIG ПХД электродтары тек \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ қажет. ) электродтардың тиімді аймағын қамту үшін сынауға арналған үлгілер.Сонымен қатар, келесі үлгіні жіберер алдында бірдей электродты тазалағаннан кейін қайта пайдалануға болады. Күшейтілген үлгілер метилен көкінен басқа химиялық заттарды қосуды қажет етпейді, бұл арзан. және жиі қолданылатын химиялық зат. Әрбір электродты өндіру шамамен $0,55 (немесе INR 40) тұратындықтан, бұл биосенсор бар анықтау технологияларына үнемді балама бола алады. 2-кестеде бұл жұмысты әдебиетте ұзақ уақыт берілген басқа сенсорлармен салыстыру көрсетілген. Гетерогенді үлгілердегі ДНҚ фрагменттері.
МБ негізіндегі электрохимиялық анықтау хаттамалары ПТР ерекшелігіне сүйенетінін ескере отырып, бұл әдістің негізгі шектеуі ағынды сулар мен көл сулары сияқты гетерогенді үлгілерде немесе тазалығы төмен праймерлерді пайдалануда спецификалық емес күшейту мүмкіндігі болып табылады. модификацияланбаған ENIG PCB электродтары арқылы тазартылмаған ПТР өнімдерін ДНҚ анықтауға арналған электрохимиялық анықтау әдістері пайдаланылмаған dNTP және праймерлер жіберген қателерді жақсы түсіну және реакция жағдайлары мен талдау хаттамаларын оңтайландыру қажет. рН, температура және биологиялық сияқты қосымша физика-химиялық параметрлер Өлшеудің дәлдігін жақсарту үшін су үлгісінің оттегі қажеттілігін де (BOD) өлшеу қажет болуы мүмкін.
Қорытындылай келе, біз қоршаған орта (көл суы) үлгілерінде вирустарды анықтауға арналған арзан электрохимиялық ENIG PCB сенсорын ұсынамыз. Иммобилизацияланған олигонуклеотидтік электродтардан немесе сезімталдықты сақтау үшін криогенді сақтауды қажет ететін ДНҚ-сандауға арналған арнайы субстраттардан айырмашылығы,53,54 біздің техникамыз модификацияланбаған ПХД пайдаланады. жарамдылық мерзімі ұзағырақ және арнайы сақтау талаптары жоқ электродтар, сондықтан LMIC-де қолданылатын автоматтандырылған үлгіні өңдеу арқылы өлшеу шешімдерін әзірлеуге жарамды. Биосенсор мақсатты ампликондарды жылдам анықтау үшін арзан ДНҚ-интеркалациялау тотығу-тотықсыздандырғыш бояуларды (МБ) пайдаланады. Арнайы емес күшейту. Қоршаған ортаның үлгілерінде кең таралған МБ бір және екі тізбекті олигонуклеотидтерге спецификалық емес байланысуына байланысты осы зондтау әдісінің ерекшелігін төмендетеді.Сондықтан бұл сынақтың ерекшелігі праймерлерді оңтайландыруға және ПТР реакция жағдайларына байланысты. Сонымен қатар, CV және сыналған үлгілерден алынған DPV шыңы токтары әрбір сынақ үшін теріс бақылаудан (NTC) алынған жауаптарға қатысты түсіндірілуі керек. Осы жұмыста ұсынылған электрохимиялық сенсордың конструкциялары мен әдістерін толық автоматтандырылған және төмен деңгейлі үлгілерді әзірлеу үшін автоүлгілеуіштермен біріктіруге болады. - үлгілерді жинап, талдайтын және нәтижелерді зертханаға сымсыз жібере алатын шығын шешімі.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Су үлгілерінен вирустардың бастапқы концентрациясының әдістері: соңғы зерттеулерге шолу және мета-талдау.Қолдану.микроорганизм.115, 1-11 б. (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Су арқылы өтетін вирустар: қауіпсіз ауыз суға кедергілер.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Төмен және орташа кірісі бар елдерде COVID-19-ды үнемді кең ауқымды қадағалауға арналған ағынды сулардың эпидемиологиясы: қиындықтар мен мүмкіндіктер. Су 13, 2897 (2021).
Палечек, E. & Bartosik, M. Нуклеин қышқылының электрохимиясы.Химиялық.Рев.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Метилен көк алтын субстраттарда иммобилизацияланған бір және қос тізбекті олигонуклеотидтердің электрохимиялық дискриминаторы ретінде. Аналитик 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparison of Cation and Anion intercalators for electrochemical Transduction of DNA Hybridization by Long Range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ ДНҚ арқылы зарядты тасымалдау: селективті электрохимиялық ДНҚ biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al. Бір мезгілде электрохимиялық анықтауы бар нақты уақыттағы ПТР микрофлюидтік құрылғы. биологиялық сенсор. Биоэлектроника.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. Метилен көгінің ДНҚ-мен әрекеттесуіне негізделген электрохимиялық нақты уақыттағы ПТР жүйесінің сигнал беру механизмін зерттеу және өнімділігін тексеру. Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al. Сарқынды су үлгілерінде sars-cov-2 анықтауға арналған ілмекті изотермиялық күшейтуге негізделген электрохимиялық сенсор. Дж.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Кумар, М. және т.б. ПХД электродтары арқылы SARS-CoV-2 ампликондарының электрохимиялық зондтауы. Сенсор іске қосылды. B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Ағынды сулардың қатты фракциясында SARS-CoV-2 РНҚ тиімді анықтау.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al. SARS-CoV-2 ағынды суларда анықтаудың аналитикалық әдістері: хаттама және болашақ перспективалар. TraC трендті анал. Chemical.134, 116125 (2020).
Федоренко, А., Гринберг, М., Ореви, Т. және Каштан, Н. Конверттелген Phi6 бактериофагының (SARS-CoV-2 үшін суррогат) шыны беттерге тұндырылған буланған сілекей тамшыларында аман қалуы.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ. Еркін өмір сүретін амебадағы SARS-CoV-2 суррогатының (Phi6) экологиялық тұрақтылығы.Су денсаулығы 20, 83 (2021).
Mindich, L. Қос тізбекті РНҚ бактериофагының үш геномдық фрагменттерінің нақты қаптамасы\(\varphi\)6.микроорганизм.Мур.биология.Рев.63, 149–160 (1999).
Пирттимаа, MJ & Bamford, DH РНҚ фагының қайталама құрылымы \(\varphi\)6 орау аймағы.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al. Phages on the Tap – Бактериофагтардың зертханалық қорын дайындауға арналған жылдам және тиімді протокол.PeerJ 4, e2261 (2016).
Хабарлама уақыты: 27 мамыр 2022 ж