უფრო გრძელი ამპლიკონები უზრუნველყოფს უკეთეს მგრძნობელობას ვირუსული ნუკლეინის მჟავების ელექტროქიმიური სენსორისთვის წყლის ნიმუშებში PCB ელექტროდების გამოყენებით

გმადლობთ, რომ ეწვიეთ Nature.com-ს. ბრაუზერის ვერსიას, რომელსაც იყენებთ, აქვს CSS-ის შეზღუდული მხარდაჭერა. საუკეთესო გამოცდილებისთვის, გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). იმავდროულად, უზრუნველყოთ მხარდაჭერის გაგრძელება, ჩვენ გამოვაჩენთ საიტს სტილის და JavaScript-ის გარეშე.
გარემოს ნიმუშების მონიტორინგის მნიშვნელობა დიდად არის დაფასებული COVID-19 პანდემიის დაწყებიდან და მონიტორინგის გარკვეული ძალისხმევა ხორციელდება ოქროს სტანდარტის გამოყენებით, თუმცა qPCR-ზე დაფუძნებული ტექნიკა ძვირია. ელექტროქიმიური დნმ-ის ბიოსენსორებმა შეიძლება უზრუნველყონ პოტენციურად ეკონომიური ეფექტი. გადაწყვეტა გარემოს წყლის ნიმუშების მონიტორინგისთვის დაბალი და საშუალო შემოსავლის ქვეყნებში. ამ ნამუშევარში ჩვენ ვაჩვენებთ ამპლიკონების ელექტროქიმიურ აღმოჩენას, რომლებიც მიღებულია Phi6 ფაგისგან, იზოლირებული ტბის წყლის ნიმუშებიდან (SARS-CoV-2-ის პოპულარული სუროგატი), ENIG-ის გამოყენებით. PCB ელექტროდების დასრულება ზედაპირის მოდიფიკაციის გარეშე.სქესი. სენსორის ელექტროქიმიური პასუხი საფუძვლიანად იყო დახასიათებული სხვადასხვა სიგრძის დნმ-ის ორი ფრაგმენტისთვის (\({117}\,\hbox {bp}\) და \({503}\,\hbox {bp}\)) და მარილების ეფექტი PCR მასტერ მიქსებში მეთილენის ცისფერ (MB)-დნმ-ის ურთიერთქმედებებზე. ჩვენი შედეგები აჩვენებს, რომ დნმ-ის ფრაგმენტების სიგრძე მნიშვნელოვნად განსაზღვრავს ელექტროქიმიურ მგრძნობელობას და ამ ნაშრომში ადასტურებს, რომ PCR პროდუქტების გელით გაწმენდის გარეშე ხანგრძლივი ამპლიკონების გამოვლენის უნარი არის მნიშვნელოვანია წყლის ნიმუშების ადგილზე გაზომვისთვის.ვირუსული დატვირთვის სრულად ავტომატიზირებული გადაწყვეტა კარგია.
წყლის ვირუსის გადაცემა ცნობილია, როგორც საზოგადოებრივი ჯანმრთელობის საფრთხე 1940-იანი წლებიდან, პირველი მტკიცებულება პოლიომიელიტისა და ჰეპატიტის E1-ის წყალში გადაცემის შესახებ. ჯანდაცვის მსოფლიო ორგანიზაციამ (WHO) მოახდინა წყლის ვირუსული პათოგენების კლასიფიცირება ზომიერი და მაღალი ჯანმრთელობის მნიშვნელობის 2. ტრადიციული ვირუსი. გამოვლენის მეთოდები ეყრდნობა ოქროს სტანდარტებს qPCR-ზე დაფუძნებულ ტექნიკას, რომელიც ძალიან მგრძნობიარე და სპეციფიკურია, მაგრამ მოითხოვს კვალიფიციურ პერსონალს ლაბორატორიაში ძვირადღირებული ინსტრუმენტების გამოყენებით შესამოწმებლად. თუმცა, დაბალი და საშუალო შემოსავლის მქონე ქვეყნებში (LMICs) შეზღუდული რესურსებით, ადამიანური სინჯის ტესტირება, სავარაუდოდ, უპირატესობას ანიჭებს გარემოსდაცვითი წყლის ნიმუშების მონიტორინგს. ამიტომ, საჭიროა ალტერნატიული დაბალფასიანი მეთოდები წყლისა და ჩამდინარე წყლების ნიმუშების მდგრადი, რეალურ დროში მონიტორინგისთვის დაბალი და საშუალო შემოსავლის მქონე ქვეყნებში, როგორც ადრეული გაფრთხილება დაავადების განვითარებადი ეპიდემიების შესახებ. რითაც იცავს მათ ვირუსის პანდემიის მძიმე სოციალურ-ეკონომიკური ზემოქმედებისგან. ნუკლეინის მჟავების დაბალფასიან ელექტროქიმიურ ბიოსენსორებს შეუძლიათ უზრუნველყონ ამ დაუკმაყოფილებელი მოთხოვნილების იმედისმომცემი პოტენციური გადაწყვეტა. დნმ-ის ამ ბიოსენსორებიდან ბევრი მუშაობს იმით, რომ დნმ-ის დამატებითი ძაფები იმობილირდება ელექტროდზე. ზედაპირი და ჰიბრიდიზაცია, როდესაც ნიმუშში შესატყვისი თანმიმდევრობაა. ეს შეიძლება გარდაიქმნას სიგნალად სხვადასხვა ელექტროქიმიური ტექნიკით რედოქს შუამავლების გამოყენებით, როგორიცაა კალიუმის რკინა/ფეროციანიდი. მეთილენის ლურჯი (MB) არის ერთ-ერთი ასეთი რედოქს-აქტიური მოლეკულა, რომელსაც აქვს მოხსენებული იყო, რომ ურთიერთდაკავშირებულია ორჯაჭვიან დნმ-ში (dsDNA) გარდა მისი უფრო არასპეციფიკური შეკავშირებისა ერთჯაჭვიან დნმ-თან5,6. MB-ების ურთიერთდაკავშირება MB-დნმ კომპლექსების ფორმირებისთვის მათ პოპულარულ არჩევანს ხდის, როგორც რედოქს მედიატორები რამდენიმე ელექტროქიმიურ დნმ-ში. სენსორის კონფიგურაციები 5,6,7,8,9.მიუხედავად იმისა, რომ MB-ის დნმ-თან შეერთება არასპეციფიკურია და ამ ელექტროქიმიური სენსორის სპეციფიკა დიდწილად დამოკიდებულია PCR ან იზოთერმული გამაძლიერებლისთვის გამოყენებული პრაიმერების სისუფთავეზე, ის კარგად არის შესაფერისი რეალური განხორციელებისთვის. -დროის ელექტროქიმიურ საფუძველზე qPCR ან ფლუორესცენციის იზოთერმული გაძლიერება, როგორც დნმ-ის კონცენტრაციის გაზომვის ალტერნატივა 9. ერთ-ერთ ასეთ განხორციელებაში, Won et al. ოქროს ელექტროდების ზედაპირი მოდიფიცირებული იყო 6-მერკაპტო-1-ჰექსანოლით (MCH) რეალურ დროში. PCR ამპლიკონების გაზომვა MB-ით დიფერენციალური პულსური ვოლტამეტრიის გამოყენებით (DPV)9. სხვა შემთხვევებში, რამირეზი და სხვები. SARS-CoV-2-ის გამოვლენა ჩამდინარე წყალში RT-LAMP რეაქციით MB-ის გამოყენებით ეკრანზე დაბეჭდილი ელექტროდებით. ასევე იყო პლატინის ელექტროდები. გამოიყენება როგორც in situ ელექტროდები მიკროფლუიდური PCR პლატფორმაში, რომელიც შექმნილია რეაქციების დროს ამპლიკონების ელექტროქიმიურად აღმოსაჩენად 8 . ყველა ეს კვლევა მოითხოვს ელექტროდების ზედაპირის მოდიფიკაციას, რაც გულისხმობს წარმოების და საოპერაციო ხარჯების გაზრდას ამ ფუნქციონალიზებული ელექტროდების სტაბილურობისთვის სპეციალური შენახვის მოთხოვნების გამო.
ტბის წყლის ნიმუშებში კონცენტრირებული ვირუსული ნაწილაკებისგან მიღებული ამპლიკონების ელექტროქიმიური გამოვლენის სამუშაო ნაკადის სქემა.
ჩვენ ცოტა ხნის წინ ვაჩვენეთ SARS-CoV-2 ამპლიკონების ელექტროქიმიური სენსორული დაბეჭდილი მიკროსქემის (PCB) ელექტროდები, რომლებიც დაფუძნებულია DPV-ზე და ციკლურ ვოლტამეტრიაზე (CV), რომელიც გამოწვეულია MB-DNA კომპლექსების ადსორბციით არამოდიფიცირებული ელექტროდების ზედაპირზე) პიკში ცვლილებები. მიმდინარე11.ჩვენ ვატყობინებთ, რომ უფრო გრძელი დნმ-ის ფრაგმენტები (N1-N2, \({943}\, \hbox) ჩამოყალიბებული CDC-ის მიერ რეკომენდებული N1 წინა და N2 უკუ პრაიმერების გამოყენებით უფრო მოკლე ფრაგმენტებთან შედარებით {bp}\)) აჩვენა უკეთესი წრფივობა სენსორის პასუხში. (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) ჩამოყალიბდა N1 წინა და N1 საპირისპირო პრაიმერის ნაკრების გამოყენებით. ეს კვლევები მოხსენებულია დნმ-ის განზავების გამოყენებით, რომელიც მომზადებულია ნუკლეაზასგან თავისუფალ წყალში. პლატფორმა ასევე გამოიყენებოდა SARS-CoV-ის გამოსავლენად. -2 ამპლიკონი ჩამდინარე წყლების სიმულაციური ნიმუშებში (მიღებულია მთლიანი რნმ-ის ნიმუშების SARS-CoV-2 რნმ-ით გაჟღენთვით). ვინაიდან რნმ მგრძნობიარეა თხრილის მიმართ იზოლაციისა და დამუშავების დროს, 12,13 რთულია უფრო გრძელი ფრაგმენტების გაძლიერება ამ ჰეტეროგენული ნიმუშით. ამიტომ, ჩამდინარე წყლებში SARS-CoV-2 ამპლიკონის ელექტროქიმიური სენსიდიის ჩვენება შემოიფარგლება უფრო მოკლე \(72\,\hbox {bp}\) N1 ფრაგმენტით.
ამ ნაშრომში ჩვენ გამოვიკვლიეთ ENIG PCB-ზე დაფუძნებული ელექტროქიმიური ზონდირების შესაძლებლობა ფაგის Phi6 კონცენტრირებული და იზოლირებული ტბის წყლის ნიმუშებიდან (ნახ. 1). Phi6 ფაგები ზომით (80-100 ნმ) შედარებულია SARS-CoV-2-თან და ასევე აქვს ლიპიდური მემბრანა და ცილა. PCR 117 და 503 ბაზის წყვილის სიგრძის ორი დნმ-ის ფრაგმენტის მისაღებად. ჩვენს წინა ნაშრომში \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 ფრაგმენტების გაძლიერების გამოწვევის გათვალისწინებით, ჩვენ ვამიზნებთ შუალედური სიგრძის ფრაგმენტებს (\(117 \,\hbox {bp}\) და \(503 \,\hbox {bp}\)), ხელმისაწვდომი პრაიმერების საფუძველზე. ელექტროქიმიური სენსორის პასუხი სისტემატურად იყო შესწავლილი კონცენტრაციის ფართო დიაპაზონში (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) to \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) ორივე ფრაგმენტისთვის MB-ის არსებობა, მარილის ეფექტი სენსორის პასუხზე დახასიათებულია და ჯვარედინი დადასტურებულია სპექტროფოტომეტრიული გაზომვებით. ამ სამუშაოს ძირითადი წვლილი შემდეგია:
დნმ-ის ფრაგმენტის სიგრძე და ნიმუშში მარილის არსებობა ძლიერ მოქმედებს მგრძნობელობაზე.ჩვენი შედეგები აჩვენებს, რომ ელექტროქიმიური აქტივობა დამოკიდებულია MB-ის, დნმ-ის და სენსორის ურთიერთქმედების სხვადასხვა მექანიზმზე ვოლტამეტრულ პასუხში, დნმ-ის კონცენტრაციისა და სიგრძის მიხედვით, უფრო გრძელი ფრაგმენტები აჩვენებენ უფრო მაღალ მგრძნობელობას, თუმცა მარილი უარყოფითად მოქმედებს ელექტროსტატიკურ ურთიერთქმედებებზე. MB და დნმ.
დნმ-ის კონცენტრაცია განსაზღვრავს MB-დნმ-ის ურთიერთქმედების მექანიზმს უცვლელ ელექტროდებში ჩვენ ვაჩვენეთ, რომ MB-DNA ურთიერთქმედების სხვადასხვა მექანიზმები დამოკიდებულია დნმ-ის კონცენტრაციაზე. {l}}}\), ჩვენ დავაკვირდით, რომ ელექტროქიმიური დენის რეაქცია ძირითადად განისაზღვრებოდა MB-დნმ-ის ადსორბციით ელექტროდზე, ხოლო ქვედა კონცენტრაციებში დნმ-ის მაღალ კონცენტრაციებში ელექტროქიმიური დენის რეაქცია განისაზღვრა რედოქსის სტერული ინჰიბირებით. აქტივობა დნმ-ის ბაზის წყვილებს შორის MB ჩასმის გამო.
ENIG PCB-ზე დაფუძნებული ვირუსული ნუკლეინის მჟავების ელექტროქიმიური სენსაცია ტბის წყლის ნიმუშებში დაკვირვებები დადასტურდა Phi6-ით დამატებული \(503\,\hbox {bp}\) დნმ-ის ფრაგმენტების ელექტროქიმიური გამოვლენით, მიღებული წყლის ნიმუშებიდან Powai Lake, IIT Mumbai Campus. შედეგის ფაგი.
განხორციელების დაბალი ღირებულება და ინტეგრაციის პოტენციალი სრულად ავტომატიზირებულ მონიტორინგის სისტემებში, ოლიგონუკლეოტიდებში ან აპტამერებზე ელექტროდებზე, რომელთა შენახვის ვადა უფრო გრძელია.
Phi6 Phi6 არის Cytoviridae ოჯახის გარსული dsRNA ვირუსი, რომელიც აინფიცირებს Pseudomonas syringae. Phi6 ფაგის გენომი არსებობს 3 ფრაგმენტის სახით: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07). \,\hbox {Kb}\)) და L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. ვინაიდან Phi6 ფაგი აინფიცირებს არაპათოგენურ BSL-1 Pseudomonas შტამს, მისი გამოყენება უსაფრთხოა. და ადვილად შეიძლება გაიზარდოს ლაბორატორიაში. Phage Phi6 და მისი მასპინძელი Pseudomonas syringae შეძენილი იქნა ბაქტერიული ვირუსების Felix d'Herelle საცნობარო ცენტრიდან, ლავალის უნივერსიტეტი, კანადა (საცნობარო ცენტრის კატალოგის ნომრები არის HER-102 და HER-1102, შესაბამისად) Phi6 ფაგი და მისი მასპინძელი აღორძინდა რეფერენციული ცენტრის მითითებით. Phi6 Phi6 გაწმენდილი იქნა ფირფიტის ლიზისით და გამორეცხვით საბოლოო ტიტრების მისაღებად \(\დაახლოებით 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { მლ}}\) (დაფის წარმომქმნელი ერთეული/მილილიტრი). რნმ იზოლირებული იყო გასუფთავებული ფაგის ნაწილაკებიდან GenElute™ უნივერსალური რნმ-ის გამწმენდი ნაკრების (Sigma-Aldrich) გამოყენებით მწარმოებლის ინსტრუქციის მიხედვით. მოკლედ, გაწმენდილი ფაგის Phi6 სუსპენზია\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) იყო ლიზირებული და ლიზატი ჩაიტვირთა სპინის სვეტზე, რათა რნმ-ს მიბმულიყო ფისოვანი სვეტთან. შემდეგ რნმ გამოირეცხება ელუციის ხსნარში \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) მოწოდებული ნაკრებით. შეაფასეთ რნმ-ის კონცენტრაცია შთანთქმის მიხედვით \(260\,\hbox {nm}\). რნმ ინახებოდა ალიკვოტებში \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) შემდგომ გამოყენებამდე.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA სინთეზის ნაკრები (Bio -Rad Laboratories) გამოიყენებოდა როგორც შაბლონი cDNA სინთეზისთვის მწარმოებლის მითითებების შესაბამისად. მოკლედ, cDNA სინთეზის რეაქცია შედგება 3 ეტაპისგან: პრაიმინგი \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\). )\({5}\,{\hbox {წთ} }\) , \({20}\,{\hbox {min}}\)-ის საპირისპირო ტრანსკრიფცია \({46}\,{^{\circ-ზე) }\hbox {C}}\), და უკან ჩამწერი არის \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) \({1}\,{\hbox {წთ. }}\). 1% აგაროზის გელზე მუშაობისას, cDNA აჩვენებდა სამ ზოლს, რომელიც შეესაბამება მოსალოდნელ სამ რნმ ფრაგმენტს (მონაცემები არ არის ნაჩვენები). cDNA-ის გამოყენებით PCR-ის შაბლონად miniPCR® mini8 თერმოციკლერში:
პრაიმერები \(117\,\hbox {bp}\) და \(503\,\hbox {bp}\) შეესაბამება M სეგმენტის 1476-1575 ნუკლეოტიდს და L სეგმენტის 458-943 ნუკლეოტიდს, შესაბამისად მჟავას. .ყველა გაძლიერებული PCR პროდუქტი ელექტროფორიზირებული იყო 1% აგაროზის გელებზე და გაძლიერებული სამიზნე დნმ გაწმენდილი იქნა GeneJET გელის ექსტრაქციის ნაკრების გამოყენებით (Thermo Fisher Scientific).
ტბა IIT მუმბაის კამპუსში (Powai Lake, Powai, Mumbai) გამოიყენებოდა ფაგის ნაწილაკების დასამატებლად. ტბის წყალი გაფილტრული იყო \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) მემბრანის მეშვეობით მოსაშორებლად. შეჩერებული ნაწილაკები და შემდეგ დაემატა Phi6 ფაგი. დაამატეთ \({1}\,{\hbox {ml}}\) \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) გაფილტრულ ტბის წყალში, \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). მცირე ნაწილი იყო რეზერვირებულია ვირუსული დატვირთვის გაზომვისთვის დაფების ანალიზით. ჩვენ გამოვცადეთ ორი განსხვავებული მეთოდი წვეტიანი Phi6 ვირუსის ნაწილაკების კონცენტრირებისთვის: (1) ალუმინის ჰიდროქსიდის ადსორბცია-ნალექის მეთოდი,19, რომელიც დადასტურებულია გარემოს ნიმუშებიდან რამდენიმე შემოგარსული რნმ ვირუსის კონცენტრაციისთვის, და (2) ) პოლიეთილენ გლიკოლის (PEG) დაფუძნებული ვირუსის კონცენტრაციის მეთოდი ადაპტირებული იყო Flood et al.20. ვინაიდან PEG-ზე დაფუძნებული მეთოდის აღდგენის ეფექტურობა უკეთესი აღმოჩნდა, ვიდრე ალუმინის ჰიდროქსიდის მეთოდის, PEG-ზე დაფუძნებული მეთოდი გამოიყენებოდა ტბის წყლის ნიმუშებიდან Phi6 ნაწილაკების კონცენტრირებისთვის.
გამოყენებული PEG მეთოდი იყო შემდეგი: PEG 8000 და \(\hbox {NaCl}\) დაემატა Phi6-ს ტბის წყლის ნიმუშებს, რათა მიიღოთ 8% PEG 8000 და \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\). ნიმუშები ინკუბირებული იყო შეიკერზე\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), შემდეგ ცენტრიფუგირებულია \(4700 \,\hbox {g}\) არის \({45}\,{\hbox {min}}\). გადააგდეთ სუპერნატანტი და ხელახლა გააჩერეთ გრანულები \({1}\, {\hbox {ml}}\) ერთსა და იმავე ზენატანში. სპიკინგისა და ვირუსის კონცენტრაციის ყველა ექსპერიმენტი ჩატარდა სამჯერ. კონცენტრაციის შემდეგ, მცირე ნაწილი დაჯავშნული იყო აღდგენის ეფექტურობის გასაზომად დაფების ანალიზით. რნმ იზოლირებული იყო, როგორც ადრე იყო აღწერილი და გამოირეცხა. ნაკრების მიერ მოწოდებულ გამორეცხვის ბუფერში\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). ვინაიდან რნმ-ის კონცენტრაცია განსხვავდება ნიმუშიდან სინჯში სამჯერ, \({2}\,{\upmu \ რნმ-ის hbox {l}}\) გამოიყენება სამივესთვის, მიუხედავად მისი კონცენტრაციისა, ნიმუშების cDNA სინთეზი. cDNA სინთეზი შესრულდა ისე, როგორც ადრე იყო აღწერილი.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA გამოიყენებოდა თარგად \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR-ისთვის 35 ციკლისთვის \ (117\,\hbox {bp}\) და \(503\,\hbox {) გასაძლიერებლად bp}\) ფრაგმენტები. ეს ნიმუშები წარმოდგენილია როგორც „1:1″, ანუ განზავების გარეშე. არათარგის კონტროლი (NTC) შეიქმნა როგორც უარყოფითი კონტროლი, ხოლო cDNA სინთეზირებული იყო გასუფთავებული ფაგისგან იზოლირებული რნმ-ის გამოყენებით. როგორც დადებითი კონტროლის შაბლონი (PC). რაოდენობრივი PCR (qPCR) შესრულდა Stratagene Mx3000P RT-PCR ინსტრუმენტში Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies) გამოყენებით. რეაქციები დაყენებული იყო სამჯერ, როგორც ადრე. აღწერილია. ციკლის ბარიერი (Ct) დაფიქსირდა ყველა ნიმუშისთვის. გარდა ამისა, განზავებული ნიმუშები იყო \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA-ს გამოყენებით, განზავებული 1:100 ტბის გაფილტრულ წყალში, როგორც \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR 35 ციკლისთვის. ეს ნიმუშები წარმოდგენილია როგორც „1:100″.
PCB ელექტროდები დამზადებულია კომერციულად ხელმისაწვდომი დაბალი ღირებულების ელექტრო უნიკელის ჩაძირვის ოქროს (ENIG) პროცესის გამოყენებით, დამატებითი ოქროს მოოქროვების გარეშე. ENIG PCB ელექტროდების სპეციფიკაციები დეტალურად არის აღწერილი ჩვენს წინა ნაშრომში11. ENIG PCB ელექტროდებისთვის, ელექტროდების გაწმენდის ტრადიციული მეთოდები, როგორიცაა არ არის რეკომენდებული პირანას ხსნარი ან გოგირდმჟავას ციკლური ვოლტამეტრია, რადგან მათ შეუძლიათ გამოიწვიონ ოქროს თხელი ფენის აქერცვლა (სისქე \(\დაახლოებით\) \(100\,\hbox {nm }\)) და გამოაშკარავონ სპილენძის ქვედა ფენები, რომლებიც მიდრეკილია. კოროზიისკენ 21, 22, 23, 24, 25. ამიტომ, ელექტროდები გაწმინდეთ უბინაო ქსოვილით, დასველებული IPA-ით. შესამოწმებელი ნიმუში ინკუბირებული იყო \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) მბაიტი \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) მარტივი ჩასართავად. ჩვენს წინა ნამუშევარში , ჩვენ დავაკვირდით, რომ სენსორის მგრძნობელობა და წრფივობა გაუმჯობესდა მეგაბაიტის კონცენტრაციის გაზრდით 11 .ჩვენს ადრინდელ ნაშრომში მოხსენებულ ოპტიმიზაციებზე დაყრდნობით, ჩვენ გამოვიყენეთ \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB კონცენტრაციები ამ კვლევაში დნმ-ის ჩასართავად. ორჯაჭვიანი დნმ-ის ელექტროქიმიური გამოვლენა (ds-DNA) შეიძლება მიღწეული იყოს ანიონური ან კათიონური ინტერკალატორების გამოყენებით. მიუხედავად იმისა, რომ ანიონური ინტერკალატორები ავლენენ დნმ-ს უკეთესი სელექციურობით, ისინი საჭიროებენ ინკუბაციას ღამით, რაც იწვევს გამოვლენის უფრო დიდ დროს. მეორეს მხრივ, კათიონურ ინტერკალატორებს, როგორიცაა MB, ესაჭიროებათ უფრო მოკლე ინკუბაციური დრო, დაახლოებით \({1}\,{\hbox {h}}\) ds-DNA6-ის ელექტროქიმიური გამოვლენისთვის. ყოველი გაზომვა გულისხმობს ნიმუშის გაცემას ელექტროდი\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), შემდეგ გაწმინდეთ IPA-ს დასველებული ქსოვილით, სანამ სხვა ნიმუშს გააგრძელებთ.ერთი გაზომვა.თითოეული ნიმუში შემოწმდა 5 სხვადასხვა ელექტროდზე, თუ სხვაგვარად არ იყო მითითებული. DPV და CV გაზომვები ჩატარდა PalmSens Sensit Smart პოტენციოსტატის გამოყენებით და PSTrace პროგრამული უზრუნველყოფა იყო გამოყენებული პოტენციოსტატის კონფიგურაციისა და მონაცემების მისაღებად, პიკის დენის გამოთვლების ჩათვლით. გამოყენებულია შემდეგი პარამეტრები. DPV და CV გაზომვებისთვის:
DPV: წონასწორობის დრო = \(8\,\hbox {s}\), ძაბვის ნაბიჯი = \(3\,\hbox {mV}\), პულსის ძაბვა = \(25\,\hbox {mV}\) , პულსის ხანგრძლივობა = \(50\,\hbox {ms}\), სკანირების სიხშირე = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: წონასწორობის დრო = \(8\,\hbox {s}\), ძაბვის საფეხური = \(3\,\hbox {mV}\), გაწმენდის სიჩქარე = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
პიკური დენები, მიღებული დნმ-ის ვოლტამოგრამებიდან, კომპლექსური \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV და CV ვოლტამოგრამები მიღებულ იქნა ENIG PCB ელექტროდებზე \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB კომპლექსურად დნმ-თან (კონცენტრაციით 10–\({20}\,{\ hbox {ng). }/{\upmu \hbox {l}}}\) ანუ 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(117\,\hbox {bp}\ ) და 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(503\,\hbox {bp}\)). წარმომადგენლობითი ვოლტამოგრამები ნაჩვენებია სურათზე S1-ზე დამატებითი ინფორმაციაში. სურათი 2 გვიჩვენებს შედეგებს DPV და CV გაზომვები (პიკური დენი) გელით გაწმენდილი PCR პროდუქტების გამოყენებით. CV გაზომვებთან შედარებით, DPV გაზომვები აჩვენებს უფრო მაღალ მგრძნობელობას (დენი, როგორც დნმ-ის კონცენტრაციის ფუნქცია), რადგან ფონური ტევადი დენები CV გაზომვებში მალავს ფარადის დენებს 26 .მონაცემები ყუთში თითოეული ყუთი შეიცავს გაზომვებს 5 ელექტროდიდან. ყველა გაზომვა იყენებს ელექტროდების ერთსა და იმავე კომპლექტს, რათა თავიდან იქნას აცილებული გაზომვის შეცდომები ელექტროდიდან ელექტროდამდე ცვალებადობის გამო. ჩვენ დავაკვირდით DPV და CV გაზომილი პიკური დენების მზარდ ტენდენციას დნმ-ის დაბალი კონცენტრაციისთვის. , უფრო გრძელი (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ \(117) ) ფრაგმენტთან შედარებით. ეს შეესაბამება ელექტროდის ადსორბციის მოსალოდნელ ტენდენციას, რომელიც მოხსენებულია ჩვენს წინა ნაშრომში. MB-DNA კომპლექსის ადსორბცია ხელს უწყობს მუხტის გადაცემას ელექტროდზე, რაც ხელს უწყობს პიკური დენის გაზრდას. სხვა კვლევებმა აჩვენა ოლიგონუკლეოტიდის ზომისა და თანმიმდევრობის გავლენა MB-დნმ-ის ინტერკალაციაზე27,28,29,30. გუანინი -ციტოზინის (GC) შემცველობა ორ ამპლიკონში (\(117\,\hbox {bp}\) და \(503\,\hbox {bp}\)) იყო დაახლოებით 50%, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ დაკვირვების განსხვავება განპირობებულია ამპლიკონის სიგრძემდე. თუმცა, დნმ-ის უფრო მაღალი კონცენტრაციისთვის (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), \(503\,\hbox {bp}) \) და \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) \(117\,\hbox {bp}\)), ჩვენ ვაკვირდებით ორ გაძლიერებას ქვედანაყოფების პიკური დენები შემცირებულია როგორც DPV, ასევე CV გაზომვებში. ეს იმის გამო ხდება, რომ MB გაჯერებულია და ურთიერთქმედებს დნმ-ის ბაზის წყვილებს შორის, რაც იწვევს MB31,32-ში რედუქციური ჯგუფის რედოქს აქტივობის სტერული ინჰიბირებას.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
PCR მასტერ მიქსებში არსებული მარილები ერევა ელექტროსტატიკურ ურთიერთქმედებებში MB-სა და დნმ-ს შორის, ამიტომ \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) \({50} \,{\) დამატებით upmu \hbox {M}}\) მბ გელით გაწმენდილი პროდუქტი MB-დნმ-ის ურთიერთქმედების შესახებ მარილის ეფექტის შესასწავლად. როგორც ნაჩვენებია სურათზე 3, ჩვენ დავაკვირდით, რომ დნმ-ის უფრო მაღალი კონცენტრაციისთვის (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) და \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) \(117\,\hbox {bp} \)), DPV-ში და CV-ში მარილის დამატებამ მნიშვნელოვნად არ იმოქმედა გაზომვებზე (იხ. სურათი S2 დამატებითი ინფორმაციაში წარმომადგენლობითი ვოლტამოგრამებისთვის). თუმცა, დნმ-ის დაბალი კონცენტრაციით, მარილის დამატება მნიშვნელოვნად ამცირებს მგრძნობელობას, რაც არ იწვევს დენის მნიშვნელოვან ცვლილებას დნმ-ის კონცენტრაციასთან ერთად. მარილის მსგავსი უარყოფითი ზემოქმედება MB-დნმ-ის ურთიერთქმედებებზე და ინტერკალაციაზე ადრე იყო მოხსენებული სხვა მკვლევარების მიერ33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) კათიონები უკავშირდებიან დნმ-ის უარყოფით ფოსფატის ხერხემალს, რითაც აფერხებენ ელექტროსტატიკური ურთიერთქმედებას MB-სა და დნმ-ს შორის. დნმ-ის მაღალ კონცენტრაციებში, რედოქს-აქტიური MB-ების სტერული დათრგუნვა იწვევს პიკის დაბალ დენებს, ამიტომ ელექტროსტატიკური ურთიერთქმედება. მნიშვნელოვნად არ იმოქმედებს სენსორის პასუხზე. მთავარი ის არის, რომ ეს ბიოსენსორი უკეთესად შეეფერება დნმ-ის უფრო მაღალი კონცენტრაციების აღმოჩენას (იშვიათად \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ან უფრო მაღალი), გარემოსდაცვითი წყლის ნიმუშების სრულად ავტომატიზირებული დამუშავებისთვის, სადაც PCR პროდუქტების გელით გაწმენდა შესაძლოა შეუძლებელი იყოს.
ფართობი შთანთქმის მრუდის ქვეშ ტალღის სიგრძის დიაპაზონისთვის 600-700 \(\hbox {nm}\) დნმ-ის სხვადასხვა კონცენტრაციისთვის კომპლექსური \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) მბ: (a ) \(503\,\hbox {bp}\) მარილით და მის გარეშე (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) მარილით და მის გარეშე (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) დნმ-ის კონცენტრაცია, რომელიც შეესაბამება \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB ნიმუშები დნმ არ არის.
ზემოაღნიშნული შედეგების შემდგომი გადამოწმებისთვის, ჩვენ შევასრულეთ ოპტიკური გაზომვები UV/Vis სპექტროფოტომეტრის გამოყენებით (Thermo Scientific Multiskan GO), ნიმუშები \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) გამოყენებული იყო თითოეულისთვის. გაზომვა. შთანთქმის ხელმოწერა მცირდება დნმ-ის კონცენტრაციის მატებასთან ერთად, როგორც ჩანს შთანთქმის მრუდის ქვეშ არსებული ფართობის ტენდენციიდან ტალღის სიგრძის დიაპაზონისთვის \(600\,\hbox {nm}\) \(700\,\hbox {. nm}\) , როგორც ნაჩვენებია ნახ. 4-ში (შთანთქმის სპექტრი ნაჩვენებია ნახ. S3-ზე დამატებით ინფორმაციაში). ნიმუშებისთვის დნმ-ის კონცენტრაციით ნაკლები \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox) {l}}}\), არ იყო მნიშვნელოვანი განსხვავება შეწოვაში დნმ-ის შემცველ და მხოლოდ MB ნიმუშებს შორის (\(503\,\hbox {bp}\) და \(117\,\hbox {bp}\) ) სიგრძის ფრაგმენტები), რაც მიუთითებს რედოქს-აქტიური MB-ის სტერული დათრგუნვის არარსებობაზე. დნმ-ის მაღალ კონცენტრაციებზე, ჩვენ დავაფიქსირეთ შთანთქმის სიგნალის თანდათანობითი დაქვეითება და აღვნიშნეთ შთანთქმის ნაკლები შემცირება მარილის არსებობისას. ეს შედეგები მიეკუთვნება მოლეკულურს. ურთიერთქმედება და სტერული დათრგუნვა დნმ-ის ჰიბრიდებში ბაზის დაწყობასთან. ჩვენი შედეგები შეესაბამება ლიტერატურაში მოხსენებებს MB-დნმ-ის ინტერკალაციის სპექტროსკოპიული კვლევების შესახებ, რომლებიც აკავშირებენ ჰიპოქრომატულობას \(\pi\)–\(\pi ^*\-ში ენერგიის შემცირებულ დონეებთან. ) ელექტრონული გადასვლები ინტერკალაციის ფენების 36, 37, 38 გამო.
ფაგის Phi6-ის აგაროზის გელის ელექტროფორეზი: PCR პროდუქტები სიგრძის \(117\,\hbox {bp}\) და \(503\,\hbox {bp}\) ტბის წყლის ნიმუშებიდან. M-დნმ მარკერი;NTC-არა შაბლონის კონტროლი, შესაბამისი ამპლიკონების შემცველი პრაიმერები;კომპიუტერის დადებითი კონტროლი;1, 2, 3-გაუხსნელი (1:1) ტბის წყლის ნიმუშები სამჯერ. ზოლი ჩანს \(\დაახლოებით 50\,\hbox {bp}\) გამოუყენებელი ოლიგონუკლეოტიდების გამო \(503\,\). hbox {bp}\) შესახვევი.
ჩვენ შევაფასეთ სენსორის სარგებლობა Powai Lake წყლის ნიმუშების გამოყენებით Phi6 ფაგით. რნმ-ის კონცენტრაციები, რომლებიც იზოლირებულია ფაგის წვეტიანი წყლის ნიმუშებიდან, მერყეობდა 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), ხოლო ისინი, რომლებიც იზოლირებულია გაწმენდილი ფაგის სუსპენზიებიდან, რნმ შეფასდა, როგორც \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) აღდგენის ეფექტურობით დაახლოებით 1. %. ასევე საინტერესო ამპლიკონები. qPCR-ის დროს დაფიქსირებული Ct მნიშვნელობები (ცხრილი 1) ნაჩვენები იყო, რომ კორელაციას უწევს რნმ-ის კონცენტრაციას, რომელიც იზოლირებულია შესაბამისი წვეტიანი წყლის ნიმუშებიდან. Ct მნიშვნელობა ავლენს ფლუორესცენტური სიგნალისთვის საჭირო ციკლების რაოდენობას. გადააჭარბოს ზღურბლს ან ფონის სიგნალს. Ct უფრო მაღალი მნიშვნელობები მიუთითებს შაბლონის დაბალ კონცენტრაციაზე და პირიქით. NTC ნიმუშების Ct მნიშვნელობები იყო ისეთივე მაღალი, როგორც მოსალოდნელი იყო. განსხვავება \(\დაახლოებით 3\) Ct მნიშვნელობებს შორის დადებითი კონტროლი და ტესტის ნიმუში ასევე მიუთითებს იმაზე, რომ თითოეულ სატესტო ნიმუშს აქვს დაახლოებით 1% შაბლონი დადებით კონტროლთან შედარებით. ჩვენ ადრე განვიხილეთ, რომ უფრო გრძელი ამპლიკონები იწვევს უკეთეს მგრძნობელობას. ჰეტეროგენული გარემოს ნიმუშებიდან გამოყოფილი გრძელი ფრაგმენტების გაძლიერება რთულია უარყოფითი მხარეების გათვალისწინებით. ვირუსის დაბალი კონცენტრაციისა და რნმ-ის დეგრადაციის. თუმცა, ჩვენი ვირუსის გამდიდრებისა და PCR გაძლიერების პროტოკოლით, ჩვენ შევძელით წარმატებით გამეძლიერებინა \(503\,\hbox {bp}\) ფრაგმენტი ელექტროქიმიური ზონდირებისთვის.
სურათი 6 გვიჩვენებს ელექტროქიმიური სენსორის შედეგებს \(503\,\hbox {bp}\) ფრაგმენტის ამპლიკონის, ორივე გამოყენებით განუზავებელი cDNA შაბლონად (1:1) და 100-ჯერ განზავებული cDNA, როგორც შაბლონი (1:100 ) შესრულებული PCR. NTC-თან და PC-თან შედარებით (იხ. სურათი S4 დამატებითი ინფორმაციაში წარმომადგენლობითი ვოლტამოგრამებისთვის). 6-ში მოცემული ყუთის თითოეული ყუთი შეიცავს გაზომვებს სამი ნიმუშიდან 5 ელექტროდზე. იგივე ელექტროდები გამოიყენებოდა ყველა ნიმუშის გასაზომად, ელექტროდის გამო შეცდომების თავიდან ასაცილებლად. -ელექტროდის ცვალებადობა. CV გაზომვებთან შედარებით, DPV გაზომვები აჩვენებს უკეთეს გარჩევადობას, რათა განასხვავოს ტესტი და კომპიუტერის ნიმუშები NTC-ებისგან, რადგან, როგორც უკვე აღვნიშნეთ, ფარადის დენები დამალულია ამ უკანასკნელის ფონური ტევადობის დენების გამო. უფრო გრძელი ამპლიკონებისთვის, ჩვენ დავინახეთ, რომ ნეგატიური კონტროლი (NTC) იწვევდა უფრო მაღალ CV და DPV პიკური დენებით დადებით კონტროლთან შედარებით, ხოლო დადებითი და განუზავებელი ტესტის ნიმუშები აჩვენებდნენ DPV პიკური დენების მსგავსი პიკის სიმაღლეებს. გაზომილი საშუალო და მედიანური მნიშვნელობები თითოეული გაუხსნელისთვის (1:1). ) ტესტის ნიმუში და პერსონალური კომპიუტერი შეიძლება აშკარად ამოიცნონ სენსორის გამომავალიდან NTC ნიმუშისთვის, ხოლო გარჩევადობა 1:100 განზავებული ნიმუშისთვის ნაკლებად გამოხატულია. cDNA-ს 100-ჯერ განზავებისას, ჩვენ არ დავაფიქსირეთ ზოლები გელის ელექტროფორეზის დროს. (ხაზები არ არის ნაჩვენები სურათზე 5) და შესაბამისი DPV და CV პიკური დენები იყო NTC მოსალოდნელის მსგავსი. შედეგები \(117\,\hbox {bp}\) ფრაგმენტისთვის ნაჩვენებია დამატებით ინფორმაციაში. უარყოფითი კონტროლმა გამოიწვია ელექტროქიმიური პასუხი PCB სენსორისგან ელექტროდზე თავისუფალი MB ადსორბციისა და MB-ის ურთიერთქმედების გამო ერთჯაჭვიან პრაიმერის ოლიგონუკლეოტიდთან. ამიტომ, ყოველ ჯერზე ნიმუშის ტესტირებაზე, უნდა ჩატარდეს უარყოფითი კონტროლი და ტესტის ნიმუშის პიკური დენი, ნეგატიური კონტროლის მიერ მიღებულ პიკთან შედარებით, დიფერენციალური (ფარდობითი) გაზომვის მისაღწევად39,40 ტესტის ნიმუშის დადებით ან უარყოფითად კლასიფიკაციისთვის.
(ა) DPV, და (ბ) CV პიკური დენი \(503\,\hbox {bp}\) ფრაგმენტების ელექტროქიმიური გამოვლენისთვის ტბის წყლის ნიმუშებში. სატესტო ნიმუშები გაზომილი იყო სამჯერ და შედარება შაბლონის გარეშე (NTC) და დადებითი კონტროლი (PC).
ჩვენი დასკვნები ასახავს სხვადასხვა მექანიზმებს, რომლებიც გავლენას ახდენენ ელექტროქიმიური სენსორების მუშაობაზე სხვადასხვა სიგრძის ამპლიკონებისთვის სხვადასხვა დნმ-ისთვის, კონცენტრაციით დამოწმებული ოპტიკური გაზომვებით UV/Vis სპექტროფოტომეტრის გამოყენებით. ჩვენი დაკვირვებები ხაზს უსვამს იმ აზრს, რომ უფრო გრძელი დნმ-ის ფრაგმენტები \(\დაახლოებით\)-მდეა. \(500\,\hbox {bp}\) შეიძლება გამოვლინდეს უფრო მაღალი მგრძნობელობით და რომ მარილის არსებობა ნიმუშში არ ახდენს მგრძნობელობის დნმ-ის კონცენტრაციას, რაც გავლენას ახდენს მაღალ მგრძნობელობაზე (იშვიათად \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) და ზემოთ). გარდა ამისა, ჩვენ გამოვიკვლიეთ სხვადასხვა ტიპის ნიმუშების ეფექტი, მათ შორის გელით გაწმენდილი ამპლიკონები დამატებული მარილით და გარეშე, და ტბის წყლის ნიმუშების დამატება DPV და CV გაზომვებში.ჩვენ დავაკვირდით, რომ DPV უზრუნველყოფდა უკეთეს გარჩევადობას, რადგან ფონური ტევადი დენი ასევე გავლენას ახდენს CV გაზომვაზე, რაც მას ნაკლებად მგრძნობიარეს ხდის.
გრძელი ფრაგმენტების გაძლიერება დამოკიდებულია ვირუსული გენომის რნმ-ის მთლიანობაზე. რამდენიმე კვლევამ აჩვენა, რომ გრძელი ფრაგმენტების გაძლიერება ყოველთვის არ არის ეფექტური გარემოში რნმ-ის დეგრადაციისა და იზოლაციის დროს შერწყმის პოტენციალის გამო11,41,42,43,44. ჩვენ დავაკვირდით, რომ PEG-ზე დაფუძნებული ვირუსის კონცენტრაციის მეთოდი უფრო ეფექტური იყო ტბის წყლის ნიმუშებში მოხვედრილი ფაგის Phi-6-ის კონცენტრირებისთვის, ვიდრე ალუმინის ჰიდროქსიდზე დაფუძნებული ვირუსის კონცენტრაციის მეთოდი. დნმ-ის გრძელი ფრაგმენტების გამოვლენის უნარი დადასტურდა, რომ გადალახავს მოთხოვნას მულტიპლექსური PCR-ისთვის. მრავალი მოკლე სიგრძის შაბლონის გაძლიერება და ჯვარედინი სპეციფიკის შესაძლებლობის შემცირება.
ბიოლოგიური ნიმუშები მწირია, ამიტომ საჭიროა ბიოსენსორის დაპროექტება, რომელიც მოითხოვს მინიმალურ ნიმუშებს ტესტირებისთვის. ENIG PCB ელექტროდებს, რომლებიც გამოიყენება ამ კვლევაში, საჭიროებს მხოლოდ \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) ნიმუშები ტესტირებისთვის ელექტროდების ეფექტური ფართობის დასაფარად. გარდა ამისა, იგივე ელექტროდი შეიძლება ხელახლა იქნას გამოყენებული გაწმენდის შემდეგ მომდევნო ნიმუშის გაცემამდე. გაძლიერებული ნიმუშები არ საჭიროებს სხვა ქიმიკატების დამატებას მეთილენის ლურჯის გარდა, რაც იაფია. და საყოველთაოდ გამოყენებული ქიმიკატი. ვინაიდან თითოეული ელექტროდის დამზადება ღირს დაახლოებით $0,55 (ან INR 40), ეს ბიოსენსორი შეიძლება იყოს ეკონომიური ალტერნატივა არსებული აღმოჩენის ტექნოლოგიებისთვის. ცხრილი 2 გვიჩვენებს ამ სამუშაოს შედარებას სხვა სენსორებთან, რომლებიც დიდი ხნის განმავლობაში იყო მოხსენებული ლიტერატურაში. დნმ-ის ფრაგმენტები ჰეტეროგენულ ნიმუშებში.
იმის გათვალისწინებით, რომ MB-ზე დაფუძნებული ელექტროქიმიური გამოვლენის პროტოკოლები ეყრდნობა PCR-ის სპეციფიკას, ამ მეთოდის მთავარი შეზღუდვაა არასპეციფიკური გაძლიერების პოტენციალი ჰეტეროგენულ ნიმუშებში, როგორიცაა ჩამდინარე წყლები და ტბის წყალი, ან დაბალი სისუფთავის პრაიმერების გამოყენებით. მგრძნობელობის გასაუმჯობესებლად ელექტროქიმიური აღმოჩენის მეთოდები გაუსუფთავებელი PCR პროდუქტების დნმ-ის გამოვლენისთვის შეუცვლელი ENIG PCB ელექტროდების გამოყენებით, საჭიროა უკეთ გავიგოთ გამოუყენებელი dNTP-ებითა და პრაიმერებით შემოტანილი შეცდომები და რეაქციის პირობების ოპტიმიზაცია და ანალიზის პროტოკოლები. დამატებითი ფიზიკურ-ქიმიური პარამეტრები, როგორიცაა pH, ტემპერატურა და ბიოლოგიური წყლის ნიმუშის ჟანგბადის მოთხოვნილება (BOD) შეიძლება ასევე საჭირო გახდეს გაზომვის სიზუსტის გასაუმჯობესებლად.
დასასრულს, ჩვენ ვთავაზობთ იაფფასიან ელექტროქიმიურ ENIG PCB სენსორს ვირუსის აღმოსაჩენად გარემოს (ტბის წყალი) ნიმუშებში. იმობილიზებული ოლიგონუკლეოტიდური ელექტროდებისგან ან დნმ-ის სენსორული სუბსტრატებისგან განსხვავებით, რომლებიც საჭიროებენ კრიოგენურ შენახვას მგრძნობელობის შესანარჩუნებლად,53,54 ჩვენი ტექნიკა იყენებს შეუცვლელ PCB-ს. ელექტროდები უფრო ხანგრძლივი შენახვის ვადით და სპეციალური შენახვის მოთხოვნების გარეშე და, შესაბამისად, შესაფერისია საზომი გადაწყვეტილებების შესაქმნელად, ნიმუშის ავტომატური დამუშავებით, განლაგებული LMIC-ებში. ბიოსენსორი იყენებს იაფფასიან დნმ-ის ინტერკალირებად რედოქს საღებავებს (MB) სამიზნე ამპლიკონების სწრაფი აღმოსაჩენად. არასპეციფიკური გაძლიერება. გავრცელებული გარემო ნიმუშებში ამცირებს ამ სენსორული მეთოდის სპეციფიკას MB-ების არასპეციფიკური შეკავშირების გამო ერთ და ორჯაჭვიან ოლიგონუკლეოტიდებთან. ამიტომ, ამ ტესტის სპეციფიკა დამოკიდებულია პრაიმერების ოპტიმიზაციაზე და PCR რეაქციის პირობებზე. გარდა ამისა, CV და ტესტირებული ნიმუშებიდან მიღებული DPV პიკური დენები ინტერპრეტირებული უნდა იყოს უარყოფითი კონტროლიდან (NTC) მიღებულ პასუხებთან მიმართებაში თითოეული ტესტისთვის. ამ ნაშრომში წარმოდგენილი ელექტროქიმიური სენსორის დიზაინი და მეთოდები შეიძლება ინტეგრირებული იყოს ავტოსამპლერებთან, რათა შეიქმნას სრულად ავტომატიზირებული და დაბალი - ფასიანი გადაწყვეტა, რომელსაც შეუძლია ნიმუშების შეგროვება და ანალიზი და შედეგების უსადენოდ გადაცემა ლაბორატორიაში.
Cashdollar, J. & Wymer, L. ვირუსების საწყისი კონცენტრაციის მეთოდები წყლის ნიმუშებიდან: ბოლო კვლევების მიმოხილვა და მეტა-ანალიზი.Application.microorganism.115, გვ.1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Waterborne viruses: Barriers to უსაფრთხო სასმელი წყლისთვის.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. ჩამდინარე წყლების ეპიდემიოლოგია დაბალი და საშუალო შემოსავლის მქონე ქვეყნებში COVID-19-ის ეკონომიური ფართომასშტაბიანი ზედამხედველობისთვის: გამოწვევები და შესაძლებლობები. წყალი 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN მეთილენის ლურჯი, როგორც ოქროს სუბსტრატებზე იმობილიზირებული ერთჯერადი და ორჯაჭვიანი ოლიგონუკლეოტიდების ელექტროქიმიური დისკრიმინატორი. ანალიტიკოსი 126, 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparison of Cation and Anion Intercalators for Electrochemical Transduction of DNA Hybridization by Long-range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ მუხტის გადაცემა დნმ-ით: სელექციური ელექტროქიმიური დნმ-ის ბიოსენსორი.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Real-time PCR microfluidic device concurrent electrochemical detection.biological sensor.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. სიგნალიზაციის მექანიზმის შესწავლა და ელექტროქიმიური რეალურ დროში PCR სისტემის შემოწმება, რომელიც დაფუძნებულია მეთილენის ლურჯის დნმ-თან ურთიერთქმედების საფუძველზე. ანალიტიკოსი 136, 1573-1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al. მარყუჟის შუამავლობით იზოთერმული გაძლიერება დაფუძნებული ელექტროქიმიური სენსორი sars-cov-2-ის გამოვლენისთვის ჩამდინარე წყლების ნიმუშებში. J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al. SARS-CoV-2 ამპლიკონების ელექტროქიმიური სენსაცია PCB ელექტროდებით. სენსორი გააქტიურებულია.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. SARS-CoV-2 RNA-ს ეფექტური გამოვლენა ჩამდინარე წყლების მყარ ფრაქციაში.მეცნიერება.ზოგადი გარემო.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al. ანალიტიკური მეთოდები SARS-CoV-2 გამოვლენისთვის ჩამდინარე წყლებში: პროტოკოლი და მომავალი პერსპექტივები. TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. გარსით დაფარული ბაქტერიოფაგის Phi6 (SARS-CoV-2-ის სუროგატი) გადარჩენა შუშის ზედაპირებზე დეპონირებულ ნერწყვის აორთქლებულ წვეთებში.მეცნიერება.რეპ.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ SARS-CoV-2 სუროგატის (Phi6) გარემოსდაცვითი მდგრადობა თავისუფალ ამებაში.J.წყლის ჯანმრთელობა 20, 83 (2021).
Mindich, L. ორჯაჭვიანი რნმ ბაქტერიოფაგის სამი გენომიური ფრაგმენტის ზუსტი შეფუთვა\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, DH RNA ფაგის\(\varphi\)6 შეფუთვის რეგიონის მეორადი სტრუქტურა.RNA 6, 880-889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – სწრაფი და ეფექტური პროტოკოლი ბაქტერიოფაგების ლაბორატორიული მარაგების მოსამზადებლად.PeerJ 4, e2261 (2016).