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COVID-19 のパンデミックが始まって以来、環境サンプルをモニタリングすることの重要性は非常に高く評価されており、qPCR ベースの技術は高価ですが、ゴールド スタンダードを使用していくつかのモニタリング作業が行われています。低所得国および中所得国の環境水サンプルをモニタリングするためのソリューション。表面改質なしで PCB 電極を完成させます。電気化学センサー応答は、長さが異なる 2 つの DNA フラグメント (\({117}\,\hbox {bp}\) および \({503}\,\hbox {bp}\)) について徹底的に特徴付けられました。メチレン ブルー (MB)-DNA 相互作用に対する PCR マスター ミックス中の塩の効果。 我々の結果は、DNA 断片の長さが電気化学的感度を大きく決定することを示しており、この研究では、PCR 産物のゲル精製なしで長いアンプリコンを検出する能力が水サンプルの in situ 測定に重要です。ウイルス負荷の完全に自動化されたソリューションは、良い兆候です。
水媒介性ウイルス感染は、1940 年代から公衆衛生上の危険として知られており、ポリオと E1 型肝炎の水媒介性感染の最初の証拠があります。検出方法は、非常に感度が高く特異的であるゴールド スタンダードの qPCR ベースの技術に依存していますが、高価な機器を使用して実験室でテストするには熟練した担当者が必要です。サンプル検査は、環境水サンプルのモニタリングよりも優先される可能性があります。したがって、新興疾患の発生の早期警告として、低中所得国で水と廃水のサンプルを持続的かつリアルタイムでモニタリングするための代替の低コストの方法が必要です。核酸用の低コストの電気化学バイオセンサーは、この満たされていないニーズに対する有望な解決策を提供する可能性があります.これらのDNAバイオセンサーの多くは、相補的なDNA鎖が電極に固定化されているという事実によって機能します.これは、鉄/フェロシアン化カリウムなどの酸化還元メディエーターを使用するさまざまな電気化学的手法によって信号に変換できます。メチレン ブルー (MB) は、そのような酸化還元活性分子の 1 つです。 MB-DNA 複合体を形成するための MB のインターカレートの性質により、MB はいくつかの電気化学的 DNA のレドックスメディエーターとして人気のある選択肢になります。 MB の DNA へのインターカレーションは非特異的であり、この電気化学センサーの特異性は PCR または等温増幅に使用されるプライマーの純度に大きく依存しますが、実際の実装に適しています。 -時間電気化学ベースのqPCRまたはDNA濃度測定の代替としての蛍光等温増幅 9 .1つのそのような実装では、Won et al.金電極の表面は、リアルタイムで6-メルカプト-1-ヘキサノール(MCH)で修飾されましたディファレンシャル パルス ボルタンメトリー (DPV) を使用した MB による PCR アンプリコンの測定 9. その他の場合、Ramirez et al.反応中にアンプリコンを電気化学的に検出するように設計されたマイクロ流体 PCR プラットフォームの in situ 電極として使用されます 8。
湖水サンプル中の濃縮ウイルス粒子から得られたアンプリコンの電気化学的検出のワークフローの概略図。
我々は最近、非修飾電極の表面への MB-DNA 複合体の吸着によって誘導される DPV およびサイクリックボルタンメトリー (CV) に基づく低コストのプリント回路基板 (PCB) 電極を用いた SARS-CoV-2 アンプリコンの電気化学的センシングを実証した ) ピークの変化現在11。より長い DNA フラグメント (CDC 推奨の N1 フォワードおよび N2 リバース プライマーを使用して形成された N1-N2、\({943}\、\hbox) は、短いフラグメント {bp}\) と比較して、センサー応答でより優れた直線性を示したことを報告します。 ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) は、N1 フォワード プライマー セットと N1 リバース プライマー セットを使用して形成されました。これらの研究は、ヌクレアーゼを含まない水で調製した DNA 希釈液を使用して報告されています。シミュレートされた廃水サンプル中の-2 アンプリコン (全 RNA サンプルに SARS-CoV-2 RNA をスパイクすることによって取得)。RNA は分離およびダウンストリーム処理中にせん断を受けやすいため 12,13、この不均一なサンプルでより長いフラグメントを増幅することは困難です。したがって、廃水中の SARS-CoV-2 アンプリコンの電気化学的センシングの実証は、より短い \(72\,\hbox {bp}\) N1 フラグメントに限定されます。
この作業では、湖水サンプルから濃縮および分離されたファージ Phi6 の ENIG PCB ベースの電気化学センシングの実現可能性を調査しました (図 1)。これらの理由から、バクテリオファージ Phi6 は、SARS-CoV-2 およびその他のエンベロープ病原性 RNA ウイルスの一般的な代替物です 14,15. ファージ粒子から分離された RNA は、cDNA 合成のテンプレートとして使用され、続いてPCR により、長さが 117 および 503 塩基対の 2 つの DNA フラグメントを取得します。以前の研究で \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 フラグメントを増幅するという課題があったため、中間の長さのフラグメント (\(117 \,\hbox {bp}\) および \(503 \,\hbox {bp}\))、利用可能なプライマーに基づく。 \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) から \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) の両方のフラグメントについてMB の存在、センサー応答に対する塩の影響は、分光光度測定によって特徴付けられ、相互検証されています。この研究の主な貢献は次のとおりです。
DNA 断片の長さとサンプル中の塩の存在は、感度に大きく影響します。私たちの結果は、電気化学的活性がボルタンメトリー応答における MB、DNA、およびセンサーの相互作用のさまざまなメカニズムに依存し、DNA 濃度と長さに依存することを示しています。長いフラグメントはより高い感度を示しますが、塩は間の静電相互作用に悪影響を及ぼしますMBとDNA。
DNA濃度は、未修飾電極におけるMB-DNA相互作用のメカニズムを決定します MB-DNA相互作用のさまざまなメカニズムは、DNA濃度に依存することを示しています。 {l}}}\)、電気化学的電流応答は主に電極上の MB-DNA の吸着によって決定されることが観察されましたが、低濃度では、高 DNA 濃度では、電気化学的電流応答は酸化還元の立体阻害によって決定されました。 DNA塩基対間のMB挿入による活性。
湖水サンプル中のウイルス性核酸の ENIG PCB ベースの電気化学的センシング IIT ムンバイ キャンパスのポワイ湖の水サンプルから得られた Phi6 が付加された \(503\,\hbox {bp}\) DNA フラグメントの電気化学的検出によって、観察結果が検証されました。結果ファージ。
低コストの実装と、完全に自動化された監視システム、オリゴヌクレオチド、または電極上のアプタマーへの統合の可能性があり、保存期間が長くなります。
ファージ Phi6 は、Pseudomonas syringae に感染する Cytoviridae ファミリーのエンベロープ dsRNA ウイルスです。Phi6 ファージのゲノムは、S (\(2.95\,\hbox {Kb}\))、M (\(4.07\) の 3 つのフラグメントの形で存在します。 \,\hbox {Kb}\)) および L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Phi6 ファージは非病原性の BSL-1 Pseudomonas 株に感染するため、安全に使用できます。ファージ Phi6 とそのホストである Pseudomonas syringae は、カナダのラヴァル大学にある細菌ウイルスの Felix d'Herelle リファレンス センターから購入しました (リファレンス センターのカタログ番号は、それぞれ HER-102 と HER-1102 です)。 .Phi6ファージとその宿主は、参照センターの指示に従って復活させた.ファージPhi6をプレート溶解と溶出により精製し、\(\about 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (プラーク形成単位/ミリリットル). RNA は、GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) を製造元の指示に従って使用して、精製されたファージ粒子から分離されました。 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) を溶解し、溶解物をスピンカラムにロードして、RNA を樹脂カラムに結合させました。その後、RNA は溶出液 \({ \(260\,\hbox {nm}\) での吸光度から RNA の濃度を推定します。RNA は \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) 今後使用するまで。\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA 合成キット (Bio -Rad Laboratories) を、製造元の指示に従って cDNA 合成のテンプレートとして使用しました。 簡単に説明すると、cDNA 合成反応は 3 つのステップで構成されます: \({25}\,{^{\circ}\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) 、\({46}\,{^{\circでの\({20}\,{\hbox {min}}\)の逆転写}\hbox {C}}\) と逆 レコーダーは \({1}\,{\hbox {min }}\).1% アガロースゲルで実行すると、cDNA は予想される 3 つの RNA フラグメントに対応する 3 つのバンドを示しました (データは示していません)。次のプライマーを使用して、長さ 117 および 503 bp の 2 つの DNA フラグメントを増幅しました。 miniPCR® mini8 サーマルサイクラーでの PCR のテンプレートとして cDNA を使用：
\(117\,\hbox {bp}\) および \(503\,\hbox {bp}\) のプライマーは、それぞれ M セグメントの 1476 ～ 1575 ヌクレオチドおよび L セグメントの 458 ～ 943 ヌクレオチドに対応します。増幅されたすべての PCR 産物を 1% アガロースゲルで電気泳動し、増幅された標的 DNA を GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific) を使用して精製しました。
IIT ムンバイ キャンパス (ポワイ湖、ポワイ、ムンバイ) の湖を使用して、ファージ粒子を追加しました。 \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}}の\({1}\,{\hbox {ml}}\)を追加\) を \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) にろ過した湖の水を \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\) で抽出した。プラーク アッセイによるウイルス負荷測定用に予約されています。スパイクされた Phi6 ウイルス粒子を濃縮する 2 つの異なる方法をテストしました。 (2) ) ポリエチレングリコール (PEG) ベースのウイルス濃縮法は、Flood らから採用されました。20.PEGベースの方法の回収効率が水酸化アルミニウム法よりも優れていることが判明したため、PEGベースの方法を使用して湖水サンプルからPhi6粒子を濃縮しました。
使用した PEG メソッドは次のとおりです。PEG 8000 および \(\hbox {NaCl}\) を Phi6 添加湖水サンプルに添加して、8 % PEG 8000 および \(0.2\,\hbox {M} \) を得ました。 \ hbox {NaCl}\).サンプルはシェーカーでインキュベートされました\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ )、\(4700 \,\hbox {g}\) で遠心分離すると \({45}\,{\hbox {min}}\) になります。上清を捨て、ペレットを \({1}\, {\hbox {ml}}\) を同じ上清に入れました。すべてのスパイクおよびウイルス濃縮実験は 3 回繰り返して実施しました。濃縮後、プラークアッセイによる回収効率の測定用に少量のアリコートを確保しました。RNA は前述のように分離し、溶出しました。キット付属の溶出バッファー\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\)。RNA 濃度は 3 連のサンプルごとに異なるため、\({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) の RNA は、サンプルの cDNA 合成に関係なく、3 つすべてに使用されます。cDNA 合成は、前述のように実行されました。 \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR のテンプレートとして、\(117\,\hbox {bp}\) および \(503\,\hbox {これらのサンプルは「1:1」、つまり希釈なしで表されます。テンプレートなしのコントロール (NTC) をネガティブ コントロールとして設定し、精製されたファージから分離した RNA を使用して合成した cDNA を設定しました。ポジティブコントロール（PC）のテンプレートとして。定量的PCR（qPCR）は、Stratagene Mx3000P RT-PCR装置で、Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix（Agilent Technologies）を使用して実行されました。反応は、以前と同様に3回設定されましたサイクル閾値 (Ct) は、すべてのサンプルについて記録されました。さらに、希釈されたサンプルは、ろ過された湖水で 1:100 に希釈された cDNA を使用して \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) でした。 \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) 35 サイクルの PCR。これらのサンプルは「1:100」として表されます。
PCB 電極は、追加の金メッキを必要とせずに、市販の低コストの無電解ニッケル浸漬金 (ENIG) プロセスを使用して製造されます。ENIG PCB 電極の仕様は、以前の研究で詳述されています。ピラニア溶液または硫酸サイクリックボルタンメトリーは、薄い金層 (厚さ \(\approx\) \(100\,\hbox {nm }\)) の剥離を引き起こし、下にある銅層が露出する可能性があるため、推奨されません。 21, 22, 23, 24, 25.したがって、IPA で湿らせた糸くずの出ない布で電極をクリーニングします。テストするサンプルを \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) 簡単に挿入できるように \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) の MB。 、MB 濃度を増加させることによってセンサーの感度と直線性が改善されることを観察しました 11 。以前の研究で報告された最適化に基づいて、\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB を使用しました二本鎖 DNA (ds-DNA) の電気化学的検出は、陰イオン性または陽イオン性インターカレーターを使用して実現できます。一方、MB などのカチオン性インターカレーターは、ds-DNA の電気化学的検出に約\({1}\,{\hbox {h}}\) という短いインキュベーション時間を必要とします。電極\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\)、次に別のサンプルに進む前に、IPA で湿らせた布でクリーニングします。特に明記しない限り、各サンプルは 5 つの異なる電極でテストされました。DPV および CV 測定は、PalmSens Sensit Smart ポテンシオスタットを使用して実行され、PSTrace ソフトウェアは、ピーク電流計算を含むポテンシオスタットの構成とデータ取得に使用されました。次の設定が使用されます。 DPV および CV 測定の場合:
DPV: 平衡時間 = \(8\,\hbox {s}\)、電圧ステップ = \(3\,\hbox {mV}\)、パルス電圧 = \(25\,\hbox {mV}\)、パルス幅 = \(50\,\hbox {ms}\)、スキャン速度 = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: 平衡時間 = \(8\,\hbox {s}\)、電圧ステップ = \(3\,\hbox {mV}\)、スイープ レート = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB と複合体を形成した DNA のボルタモグラムから得られたピーク電流: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV 、(b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV、(c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV、(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV および CV ボルタモグラムは、DNA と複合体を形成した ENIG PCB 電極 \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB (濃度 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) すなわち 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) for \(117\,\hbox {bp}\ ) および 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) for \(503\,\hbox {bp}\)).代表的なボルタモグラムを補足情報の図S1に示します。図2は結果を示していますゲル精製 PCR 産物を使用した DPV および CV 測定 (ピーク電流) の測定。CV 測定と比較して、DPV 測定はより高い感度 (DNA 濃度の関数としての電流) を示します。これは、CV 測定のバックグラウンド容量性電流がファラデー電流を隠すためです 26 。ボックスプロットの各ボックスには、5 つの電極からの測定値が含まれています。すべての測定では、電極間の変動による測定エラーを回避するために、同じ電極セットを使用しています。低濃度の DNA では、DPV および CV 測定ピーク電流の増加傾向が観察されました。 、より長い (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ \(117) ) フラグメントと比較。これは、以前の研究で報告された電極吸着の予想される傾向と一致しています。 MB-DNA 複合体の吸着は、電極上の電荷移動を促進し、ピーク電流の増加に寄与します。 - 2 つのアンプリコン (\(117\,\hbox {bp}\) および \(503\,\hbox {bp}\)) のシトシン (GC) 含有量は約 50% であり、観察された結果を示しています。ただし、DNA 濃度が高い場合 (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)、\(503\,\hbox {bp} の場合) \) および \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) for \(117\,\hbox {bp}\)) の場合、2 つの増幅が観察されます。サブのピーク電流は、DPV 測定と CV 測定の両方で減少します。これは、MB が飽和して DNA の塩基対間にインターカレートし、MB31,32 の還元性基の酸化還元活性が立体的に阻害されるためです。
在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV、(b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV、(c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV、(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
PCR マスター ミックスに存在する塩は、MB と DNA 間の静電相互作用を妨害するため、\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) を \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB-DNA 相互作用に対する塩の効果を研究するための MB ゲル精製製品。 hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) および \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) (\(117\,\hbox {bp} \)) の場合、DPV および CV では、塩の添加は測定値に大きな影響を与えませんでした (代表的なボルタモグラムについては、補足情報の図 S2 を参照してください)。より低い DNA 濃度では、塩の添加により感度が大幅に低下し、DNA 濃度による電流の有意な変化は生じません。MB-DNA 相互作用およびインターカレーションに対する塩の同様の悪影響は、他の研究者によって以前に報告されています 33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) 陽イオンは DNA の負のリン酸骨格に結合するため、MB と DNA の間の静電相互作用が妨げられます。DNA 濃度が高くなると、レドックス活性 MB の立体阻害によりピーク電流が低下するため、静電相互作用が低下します。センサーの応答に大きな影響を与えません。重要な点は、このバイオセンサーがより高い DNA 濃度の検出に適していることです (まれに \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) またはそれ以上)。 PCR 産物のゲル精製が不可能な環境水サンプルの完全自動処理用。
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB と複合体を形成したさまざまな濃度の DNA の波長範囲 600 ～ 700 \(\hbox {nm}\) の吸収曲線下面積: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) 塩の有無 (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) 塩の有無 (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB サンプルに対応する DNA 濃度 DNA なし。
上記の結果をさらに検証するために、UV/Vis 分光光度計 (Thermo Scientific Multiskan GO) を使用して光学測定を実行しました。測定.波長範囲 \(600\,\hbox {nm}\) から \(700\,\hbox { nm}\) 、図4に示すように(補足情報の図S3に示す吸収スペクトル)。DNA濃度が\({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)、DNA を含むサンプルと MB のみのサンプル (\(503\,\hbox {bp}\) および \(117\,\hbox {bp}\) の場合、取り込みに有意差はありませんでした。 ) 長さのフラグメント)、レドックス活性 MB の立体阻害がないことを示します。より高い DNA 濃度では、吸光度シグナルの緩やかな減少が観察され、塩の存在下での吸光度の減少がより少ないことがわかりました。これらの結果は分子に起因していました。我々の結果は、\(\pi\)–\(\pi ^*\で低色度とエネルギーレベルの低下を関連付けるMB-DNAインターカレーションの分光学的研究に関する文献の報告と一致しています。 ) インターカレーション層 36、37、38 による電子遷移。
ファージ Phi6 のアガロースゲル電気泳動: 湖水サンプルからの長さ \(117\,\hbox {bp}\) および \(503\,\hbox {bp}\) の PCR 産物。M-DNA マーカー。NTC-no-template コントロール、対応するアンプリコンを含むプライマー。PCポジティブコントロール;1, 2, 3-未希釈 (1:1) でスパイクされた湖水サンプルを 3 通。\(503\,\ hbox {bp}\) レーン。
Phi6 ファージをスパイクしたポワイ湖の水サンプルを使用して、センサーの有用性を評価しました。 ml}}\)、精製されたファージ懸濁液から分離されたものは、RNA が \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) であると推定され、回収効率は約 1 %.RNA は cDNA に逆転写され、PCR および qPCR のテンプレートとして使用されました。製品サイズは、センサーでテストする前にアガロースゲル電気泳動 (図 5) によって確認されました。これらのサンプルはゲル精製されていないため、PCR のすべての成分が含まれています。 qPCR 中に記録された Ct 値 (表 1) は、対応するスパイクされた水サンプルから分離された RNA の濃度と相関することが示されました。Ct 値は、蛍光シグナルがCt 値が高いほどテンプレート濃度が低いことを示し、その逆も同様です。NTC サンプルの Ct 値は、予想どおり高かったです。陽性対照と試験サンプルはさらに、各試験サンプルが陽性対照と比較して約 1% のテンプレートを持っていることを示しています。アンプリコンが長いほど感度が向上することは以前に説明しました。しかし、ウイルス濃縮と PCR 増幅プロトコルにより、\(503\,\hbox {bp}\) フラグメントを電気化学センシング用に増幅することに成功しました。
図 6 は、\(503\,\hbox {bp}\) フラグメント アンプリコンの電気化学センサーの結果を示しています。テンプレートとして希釈していない cDNA (1:1) と 100 倍希釈した cDNA をテンプレート (1:100) として使用し、PCR を実行しました。 、NTCおよびPCと比較して（代表的なボルタモグラムの補足情報の図S4を参照）。図6の箱ひげ図の各ボックスには、5つの電極での3つのサンプルからの測定値が含まれています。電極によるエラーを回避するために、同じ電極を使用してすべてのサンプルを測定しましたCV測定と比較して、DPV測定はNTCからテストサンプルとPCサンプルを区別するためのより良い解像度を示します。これは、前述のように、後者のバックグラウンド容量性電流によりファラデー電流が隠されているためです。陰性対照 (NTC) は、陽性対照と比較して高い CV および DPV ピーク電流をもたらしましたが、陽性および未希釈の試験サンプルは、DPV ピーク電流の同様のピーク高さを示しました。 ) 試験サンプルと PC は、NTC サンプルのセンサー出力から明確に分離できますが、1:100 希釈サンプルの解像度はそれほど顕著ではありません.cDNA の 100 倍希釈では、ゲル電気泳動中にバンドは観察されませんでした。 (レーンは図 5 には示されていません)、対応する DPV および CV ピーク電流は、NTC で予想されるものと同様でした。\(117\,\hbox {bp}\) フラグメントの結果は、補足情報に示されています。コントロールは、電極上のフリー MB の吸着と、MB と一本鎖プライマー オリゴヌクレオチドとの相互作用により、PCB センサーからの電気化学的応答を誘発しました。したがって、サンプルをテストするたびに、ネガティブ コントロールを実行し、試験サンプルのピーク電流を陰性対照によって得られたピーク電流と比較して、試験サンプルを陽性または陰性として分類するための微分（相対）測定 39,40 を達成します。
(a) DPV、および (b) 湖水サンプル中の \(503\,\hbox {bp}\) フラグメントの電気化学的検出のための CV ピーク電流。陽性対照 (PC)。
私たちの調査結果は、さまざまな DNA のさまざまな長さのアンプリコンの電気化学センサーの性能に影響を与えるさまざまなメカニズムを示しており、UV/Vis 分光光度計を使用した光学測定によって濃度が確認されています。 \(500\,\hbox {bp}\) はより高い感度で検出でき、サンプル中の塩の存在は影響しないこと 感度 高感度に影響を与える DNA 濃度 (まれに \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) および上記). さらに、塩を添加した場合と添加しない場合のゲル精製アンプリコン、DPV および CV 測定における湖水サンプルの添加など、さまざまな種類のサンプルの影響を調査しました。バックグラウンドの容量性電流も CV 測定に影響を与え、感度が低下するため、DPV の方が分解能が高いことがわかりました。
より長いフラグメントの増幅は、ウイルスゲノム RNA の完全性に依存します。いくつかの研究では、環境中の RNA の分解と分離中のスプライシングの可能性により、より長いフラグメントの増幅が常に効率的であるとは限らないことが示されています11,41,42,43,44湖水サンプルに添加したファージ Phi-6 の濃縮において、水酸化アルミニウムベースのウイルス濃縮法よりも、PEG ベースのウイルス濃縮法の方が効果的であることがわかりました。長い DNA 断片を検出する能力は、マルチプレックス PCR の要件を克服することが証明されました。複数の短いテンプレートを増幅し、交差特異性の可能性を減らします。
生物学的サンプルは希少であるため、テストに最小限のサンプルしか必要としないバイオ センサーを設計する必要があります。 ）電極の有効領域をカバーするためのテスト用サンプル。さらに、次のサンプルを分注する前に洗浄後に同じ電極を再利用できます。増幅されたサンプルは、安価なメチレンブルー以外の化学物質の添加を必要としません。各電極の製造コストは約 0.55 ドル (または INR 40) であるため、このバイオセンサーは、既存の検出技術に代わる費用対効果の高い代替手段となる可能性があります。異種サンプル中の DNA フラグメント。
MB ベースの電気化学的検出プロトコルが PCR の特異性に依存していることを考えると、この方法の主な制限は、廃水や湖水などの不均一なサンプルや低純度のプライマーを使用した場合の非特異的増幅の可能性です。未修飾の ENIG PCB 電極を使用した未精製の PCR 産物の DNA 検出のための電気化学的検出方法では、未使用の dNTP とプライマーによって導入されるエラーをよりよく理解し、反応条件とアッセイプロトコルを最適化する必要があります。pH、温度、生物学的パラメータなどの追加の物理化学的パラメータ測定の精度を向上させるために、水サンプルの酸素要求量 (BOD) も測定する必要がある場合があります。
結論として、環境 (湖水) サンプル中のウイルス検出用の低コストの電気化学的 ENIG PCB センサーを提案します。貯蔵寿命が長く、特定の保管要件がない電極であり、したがって LMIC に導入された自動サンプル処理による測定ソリューションの開発に適しています。バイオセンサーは、ターゲットアンプリコンの迅速な検出のために、安価な DNA インターカレート レドックス色素 (MB) を利用します。非特異的増幅環境サンプルで一般的な CV は、MB が一本鎖および二本鎖オリゴヌクレオチドに非特異的に結合するため、この検出方法の特異性を低下させます。したがって、このテストの特異性は、プライマーおよび PCR 反応条件の最適化に依存します。テストされたサンプルから得られた DPV ピーク電流は、各テストのネガティブ コントロール (NTC) から得られた応答と比較して解釈する必要があります。 -サンプルを収集して分析し、結果をワイヤレスでラボに送信できるコストの高いソリューション。
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投稿時間: 2022 年 5 月 27 日