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L'importanza del monitoraggio dei campioni ambientali è stata molto apprezzata dall'inizio della pandemia di COVID-19 e alcuni sforzi di monitoraggio vengono eseguiti utilizzando il gold standard, sebbene le tecniche basate su qPCR siano costose. I biosensori elettrochimici del DNA potrebbero fornire un potenziale vantaggio economico soluzione per il monitoraggio dei campioni di acqua ambientale nei paesi a basso e medio reddito. In questo lavoro, dimostriamo il rilevamento elettrochimico degli ampliconi ottenuti dal fago Phi6 isolato da campioni di acqua di lago addizionati (un surrogato popolare per SARS-CoV-2), utilizzando ENIG per completare gli elettrodi PCB senza modificare la superficie.sesso. La risposta del sensore elettrochimico è stata accuratamente caratterizzata per due frammenti di DNA di diverse lunghezze (\({117}\,\hbox {bp}\) e \({503}\,\hbox {bp}\)), e il effetto dei sali nelle master mix PCR sulle interazioni blu di metilene (MB)-DNA. I nostri risultati mostrano che la lunghezza dei frammenti di DNA determina in modo significativo la sensibilità elettrochimica e dimostrano in questo lavoro che la capacità di rilevare lunghi ampliconi senza la purificazione del gel dei prodotti PCR è importante per la misurazione in situ di campioni d'acqua.Una soluzione completamente automatizzata per la carica virale fa ben sperare.
La trasmissione di virus per via acquosa è nota come un pericolo per la salute pubblica sin dagli anni '40, con la prima evidenza di trasmissione per via acquosa di poliomielite ed epatite E1. i metodi di rilevamento si basano su tecniche basate su qPCR gold standard, che sono altamente sensibili e specifiche, ma richiedono personale qualificato per testare in laboratorio utilizzando strumenti costosi. Tuttavia, nei paesi a basso e medio reddito (LMIC) con risorse limitate, l'uomo è probabile che i test sui campioni abbiano la precedenza sul monitoraggio dei campioni di acqua ambientale. Pertanto, sono necessari metodi alternativi a basso costo per il monitoraggio sostenibile e in tempo reale dei campioni di acqua e acque reflue nei paesi a basso e medio reddito come preallarme di focolai di malattie emergenti, proteggendoli così dai gravi impatti socioeconomici della pandemia virale. I biosensori elettrochimici a basso costo per gli acidi nucleici potrebbero fornire una promettente soluzione potenziale a questa esigenza insoddisfatta. Molti di questi biosensori del DNA funzionano grazie al fatto che i filamenti complementari del DNA sono immobilizzati sull'elettrodo superficie e ibridare quando una sequenza corrispondente è presente nel campione. Questo può quindi essere convertito in un segnale mediante varie tecniche elettrochimiche utilizzando mediatori redox come ferro/ferrocianuro di potassio. Il blu di metilene (MB) è una di queste molecole redox-attive, che ha stato segnalato per intercalare nel DNA a doppio filamento (dsDNA) oltre al suo legame più non specifico al DNA a singolo filamento5,6. La natura intercalante degli MB per formare complessi MB-DNA li rende una scelta popolare come mediatori redox in diversi DNA elettrochimici configurazioni del sensore5,6,7,8,9. Sebbene l'intercalazione di MB al DNA non sia specifica e la specificità di questo sensore elettrochimico dipenda in gran parte dalla purezza dei primer utilizzati per la PCR o l'amplificazione isotermica, è adatto per l'implementazione di reali qPCR a tempo elettrochimico o amplificazione isotermica a fluorescenza come alternativa alla misurazione della concentrazione del DNA9. In una di queste implementazioni, Won et al. La superficie degli elettrodi d'oro è stata modificata con 6-mercapto-1-esanolo (MCH) per il misurazione di ampliconi PCR con MB mediante voltammetria differenziale a impulsi (DPV)9. utilizzati come elettrodi in situ in una piattaforma PCR microfluidica progettata per rilevare elettrochimicamente gli ampliconi durante le reazioni 8. Tutti questi studi richiedono la modifica della superficie degli elettrodi, implicando un aumento dei costi di produzione e operativi a causa di requisiti di stoccaggio speciali per la stabilità di questi elettrodi funzionalizzati.
Schema del flusso di lavoro per il rilevamento elettrochimico di ampliconi ottenuti da particelle virali concentrate in campioni di acqua di lago.
Recentemente abbiamo dimostrato il rilevamento elettrochimico degli ampliconi SARS-CoV-2 con elettrodi a circuito stampato (PCB) a basso costo basati su DPV e voltammetria ciclica (CV) indotta dall'adsorbimento di complessi MB-DNA sulla superficie di elettrodi non modificati) variazioni di picco corrente11.Segnaliamo che i frammenti di DNA più lunghi (N1-N2, \({943}\, \hbox) formati utilizzando i primer N1 forward e N2 reverse raccomandati dal CDC rispetto ai frammenti più corti {bp}\)) hanno mostrato una migliore linearità nella risposta del sensore (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) formato utilizzando i set di primer N1 forward e N1 reverse. Questi studi sono riportati utilizzando diluizioni di DNA preparate in acqua priva di nucleasi. La piattaforma è stata utilizzata anche per rilevare SARS-CoV -2 ampliconi in campioni di acque reflue simulate (ottenuti aggiungendo campioni di RNA totale con RNA SARS-CoV-2). Poiché l'RNA è suscettibile di taglio durante l'isolamento e l'elaborazione a valle,12,13 è difficile amplificare frammenti più lunghi con questo campione eterogeneo. Pertanto, la dimostrazione del rilevamento elettrochimico dell'amplicone SARS-CoV-2 nelle acque reflue è limitata al frammento più corto \(72\,\hbox {bp}\) N1.
In questo lavoro, abbiamo studiato la fattibilità del rilevamento elettrochimico basato su PCB ENIG del fago Phi6 concentrato e isolato da campioni di acqua del lago (Fig. 1). I fagi Phi6 sono di dimensioni paragonabili (80-100 nm) a SARS-CoV-2 e hanno anche una membrana lipidica e una proteina spike. Per questi motivi, il batteriofago Phi6 è un surrogato popolare per SARS-CoV-2 e altri virus a RNA patogeni avvolti14,15. L'RNA isolato dalle particelle fagiche è stato utilizzato come modello per la sintesi del cDNA seguito da PCR per ottenere due frammenti di DNA di 117 e 503 paia di basi di lunghezza. Data la sfida di amplificare \(943\,\hbox {bp}\) frammenti N1-N2 nel nostro lavoro precedente, miriamo a frammenti di lunghezza intermedia (\(117 \,\hbox {bp}\) e \(503 \,\hbox {bp}\)), basati sui primer disponibili. La risposta del sensore elettrochimico è stata sistematicamente studiata su un ampio intervallo di concentrazione (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) a \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Per entrambi i frammenti in la presenza di MB, l'effetto del sale sulla risposta del sensore è stata caratterizzata e validata in modo incrociato mediante misurazioni spettrofotometriche. I principali contributi di questo lavoro sono i seguenti:
La lunghezza del frammento di DNA e la presenza di sale nel campione influenzano fortemente la sensibilità.I nostri risultati mostrano che l'attività elettrochimica dipende da diversi meccanismi di interazione di MB, DNA e sensore nella risposta voltammetrica, a seconda della concentrazione e della lunghezza del DNA, con frammenti più lunghi che mostrano una maggiore sensibilità, sebbene il sale abbia un effetto negativo sulle interazioni elettrostatiche tra MB e DNA.
La concentrazione del DNA determina il meccanismo dell'interazione MB-DNA in elettrodi non modificati Dimostriamo che diversi meccanismi di interazione MB-DNA dipendono dalla concentrazione del DNA. A concentrazioni di DNA inferiori a una piccola quantità di \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), abbiamo osservato che la risposta della corrente elettrochimica era principalmente determinata dall'adsorbimento di MB-DNA sull'elettrodo, mentre a concentrazioni più basse Ad alte concentrazioni di DNA, la risposta della corrente elettrochimica era determinata dall'inibizione sterica del redox attività dovuta all'inserzione di MB tra le coppie di basi del DNA.
Rilevamento elettrochimico basato su PCB ENIG di acidi nucleici virali in campioni di acqua di lago Risultato fago.
Basso costo di implementazione e potenziale per l'integrazione in sistemi di monitoraggio completamente automatizzati, oligonucleotidi o aptameri su elettrodi con durata di conservazione più lunga.
Phage Phi6 è un virus dsRNA avvolto della famiglia Cytoviridae che infetta Pseudomonas syringae. Il genoma del fago Phi6 esiste sotto forma di 3 frammenti: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07 \,\hbox {Kb}\)) e L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Poiché il fago Phi6 infetta un ceppo BSL-1 Pseudomonas non patogeno, è sicuro da usare e può essere facilmente coltivato in laboratorio. Phage Phi6 e il suo ospite Pseudomonas syringae sono stati acquistati dal Felix d'Herelle Reference Centre for Bacterial Viruses, Laval University, Canada (i numeri di catalogo del centro di riferimento sono rispettivamente HER-102 e HER-1102) Il fago .Phi6 e il suo ospite sono stati rianimati come indicato dal centro di riferimento. Il fago Phi6 è stato purificato mediante lisi su piastra ed eluizione per ottenere titoli finali con \(\circa 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (unità formanti placca/ millilitri). L'RNA è stato isolato da particelle fagiche purificate utilizzando il kit di purificazione dell'RNA totale universale GenElute™ (Sigma-Aldrich) secondo le istruzioni del produttore. In breve, una sospensione Phi6 fagica purificata\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) è stato lisato e il lisato è stato caricato su una colonna di rotazione per consentire all'RNA di legarsi alla colonna di resina. L'RNA viene quindi eluito nella soluzione di eluizione \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) fornito dal kit. Stimare la concentrazione di RNA per assorbanza a \(260\,\hbox {nm}\). L'RNA è stato immagazzinato in aliquote in \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) fino a ulteriore utilizzo.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) The iScript cDNA Synthesis Kit (Bio -Rad Laboratories) è stato utilizzato come modello per la sintesi del cDNA seguendo le istruzioni del produttore. )\({5}\,{\hbox {min} }\) , trascrizione inversa di \({20}\,{\hbox {min}}\) in \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), e viceversa Il registratore è in \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) per \({1}\,{\hbox {min }}\). Quando eseguito su un gel di agarosio all'1%, il cDNA mostrava tre bande corrispondenti ai tre frammenti di RNA attesi (dati non mostrati). I seguenti primer sono stati usati per amplificare due frammenti di DNA di 117 e 503 bp di lunghezza, utilizzando il cDNA come templato per la PCR in un termociclatore miniPCR® mini8:
I primer per \(117\,\hbox {bp}\) e \(503\,\hbox {bp}\) corrispondono a 1476-1575 nucleotidi del segmento M e 458-943 nucleotidi del segmento L, rispettivamente acido Tutti i prodotti PCR amplificati sono stati sottoposti a elettroforesi su gel di agarosio all'1% e il DNA bersaglio amplificato è stato purificato utilizzando il kit di estrazione del gel GeneJET (Thermo Fisher Scientific).
Un lago presso il campus IIT Mumbai (Powai Lake, Powai, Mumbai) è stato utilizzato per aggiungere particelle fagiche. L'acqua del lago è stata filtrata attraverso una membrana \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) per rimuovere particelle sospese, quindi è stato aggiunto il fago Phi6. Aggiungi \({1}\,{\hbox {ml}}\) di \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) a \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) acqua di lago filtrata, in \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Una piccola aliquota è stata riservato alla misurazione della carica virale mediante analisi della placca. Abbiamo testato due diversi metodi per concentrare particelle di virus Phi6 addizionate: (1) il metodo di adsorbimento-precipitazione dell'idrossido di alluminio,19 che è stato convalidato per la concentrazione di diversi virus RNA avvolti da campioni ambientali, e (2) ) Il metodo di concentrazione del virus basato sul polietilenglicole (PEG) è stato adattato da Flood et al.20. Poiché l'efficienza di recupero del metodo basato su PEG è risultata migliore di quella del metodo con idrossido di alluminio, è stato utilizzato il metodo basato su PEG per concentrare particelle Phi6 da campioni di acqua di lago.
Il metodo PEG utilizzato è stato il seguente: PEG 8000 e \(\hbox {NaCl}\) sono stati aggiunti a campioni di acqua di lago addizionati con Phi6 per ottenere l'8% di PEG 8000 e \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\). I campioni sono stati incubati su un agitatore\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), quindi centrifugato a \(4700 \,\hbox {g}\) è \({45}\,{\hbox {min}}\). Scartare il supernatante e risospendere il pellet in \({1}\, {\hbox {ml}}\) nello stesso surnatante. Tutti gli esperimenti di spiking e concentrazione del virus sono stati eseguiti in triplicato. Dopo la concentrazione, una piccola aliquota è stata riservata per la misurazione dell'efficienza di recupero mediante il test della placca. L'RNA è stato isolato come precedentemente descritto ed eluito nel tampone di eluizione fornito dal kit\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Poiché la concentrazione di RNA varia da campione a campione in triplicato, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) dell'RNA viene utilizzato per tutti e tre indipendentemente dalla sua concentrazione sintesi di cDNA dei campioni. La sintesi di cDNA è stata eseguita come descritto in precedenza.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA è stato utilizzato come modello per \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR per 35 cicli per amplificare \ (117\,\hbox {bp}\) e \(503\,\hbox { bp}\) frammenti. Questi campioni sono rappresentati come “1:1″, cioè senza diluizione. Un controllo no-template (NTC) è stato allestito come controllo negativo, mentre è stato allestito un cDNA sintetizzato utilizzando RNA isolato da fago purificato come modello per un controllo positivo (PC). La PCR quantitativa (qPCR) è stata eseguita in uno strumento Stratagene Mx3000P RT-PCR utilizzando Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Le reazioni sono state impostate in triplicato come in precedenza descritto. La soglia del ciclo (Ct) è stata registrata per tutti i campioni. Inoltre, i campioni diluiti sono stati \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) utilizzando cDNA diluito 1:100 in acqua di lago filtrata come \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR per 35 cicli. Questi campioni sono rappresentati come "1:100".
Gli elettrodi PCB sono fabbricati utilizzando un processo ENIG (Electroless Nickel Immersion Gold) a basso costo disponibile in commercio senza la necessità di ulteriore placcatura in oro. Le specifiche degli elettrodi PCB ENIG sono dettagliate nel nostro lavoro precedente11. la soluzione di piranha o la voltammetria ciclica dell'acido solforico non sono raccomandate in quanto possono causare la desquamazione del sottile strato d'oro (spessore \(\circa\) \(100\,\hbox {nm }\)) ed esporre gli strati di rame sottostanti che sono inclini alla corrosione 21, 22, 23, 24, 25. Pertanto, pulire gli elettrodi con un panno privo di lanugine inumidito con IPA. Il campione da testare è stato incubato con \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB in \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) per un facile inserimento. Nel nostro lavoro precedente , abbiamo osservato che la sensibilità e la linearità del sensore sono state migliorate aumentando la concentrazione di MB 11 . Sulla base delle ottimizzazioni riportate nel nostro lavoro precedente, abbiamo utilizzato \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB concentrazioni per incorporare il DNA in questo studio. Il rilevamento elettrochimico del DNA a doppio filamento (ds-DNA) può essere ottenuto utilizzando intercalanti anionici o cationici. Sebbene gli intercalanti anionici rilevino il DNA con una migliore selettività, richiedono un'incubazione durante la notte, con conseguenti tempi di rilevamento più lunghi. d'altra parte, gli intercalanti cationici come MB richiedono tempi di incubazione più brevi, circa \({1}\,{\hbox {h}}\) per il rilevamento elettrochimico di ds-DNA6. Ogni misurazione comporta la dispensazione del campione da testare sul elettrodo\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), quindi pulire con uno straccio inumidito con IPA, prima di procedere con un altro campione.una misurazione. Ogni campione è stato testato su 5 elettrodi diversi se non diversamente specificato. Le misurazioni DPV e CV sono state eseguite utilizzando un potenziostato PalmSens Sensit Smart e il software PSTrace è stato utilizzato per la configurazione del potenziostato e l'acquisizione dei dati, inclusi i calcoli della corrente di picco. Vengono utilizzate le seguenti impostazioni per misurazioni DPV e CV:
DPV: tempo di equilibrio = \(8\,\hbox {s}\), gradino di tensione = \(3\,\hbox {mV}\), tensione di impulso = \(25\,\hbox {mV}\) , durata dell'impulso = \(50\,\hbox {ms}\), velocità di scansione = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: tempo di equilibrio = \(8\,\hbox {s}\), gradino di tensione = \(3\,\hbox {mV}\), velocità di scansione = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Correnti di picco ottenute da voltammogrammi di DNA complessato con \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
I voltammogrammi DPV e CV sono stati ottenuti su elettrodi ENIG PCB \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB complessati con DNA (a concentrazioni di 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) cioè 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) per \(117\,\hbox {bp}\ ) e 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) per \(503\,\hbox {bp}\)). I voltammogrammi rappresentativi sono mostrati nella Figura S1 in Informazioni supplementari. La Figura 2 mostra i risultati delle misurazioni DPV e CV (corrente di picco) utilizzando prodotti PCR purificati con gel. Rispetto alle misurazioni CV, le misurazioni DPV mostrano una maggiore sensibilità (corrente in funzione della concentrazione del DNA) poiché le correnti capacitive di fondo nelle misurazioni CV nascondono le correnti faradaiche 26 . I dati per ogni casella nel boxplot contiene misurazioni da 5 elettrodi. Tutte le misurazioni utilizzano lo stesso set di elettrodi per evitare errori di misurazione dovuti alla variazione da elettrodo a elettrodo. Abbiamo osservato una tendenza all'aumento delle correnti di picco misurate DPV e CV per concentrazioni inferiori di DNA , più lungo (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ rispetto al frammento \(117) ). Ciò è coerente con la tendenza prevista dell'adsorbimento dell'elettrodo riportata nel nostro lavoro precedente. Il l'adsorbimento del complesso MB-DNA facilita il trasferimento di carica sull'elettrodo, che contribuisce all'aumento della corrente di picco. Altri studi hanno mostrato l'effetto della dimensione e della sequenza degli oligonucleotidi sull'intercalazione MB-DNA27,28,29,30.La guanina -il contenuto di citosina (GC) dei due ampliconi (\(117\,\hbox {bp}\) e \(503\,\hbox {bp}\)) era approssimativamente del 50%, indicando che l'osservazione La differenza è dovuta alla lunghezza dell'amplicone. Tuttavia, per concentrazioni di DNA più elevate (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), per \(503\,\hbox {bp} \) e \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) per \(117\,\hbox {bp}\)), si osservano due amplificazioni le correnti di picco dei sottotipi sono ridotte sia nelle misurazioni DPV che CV. Questo perché MB satura e si intercala tra le coppie di basi del DNA, con conseguente inibizione sterica dell'attività redox del gruppo riducibile in MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
I sali presenti nelle master mix PCR interferiscono con le interazioni elettrostatiche tra MB e DNA, quindi aggiungendo \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) con \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) Prodotto purificato con gel MB per studiare l'effetto del sale sull'interazione MB-DNA. Come mostrato nella Figura 3, abbiamo osservato che per concentrazioni di DNA più elevate (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) e \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) per \(117\,\hbox {bp} \)), in DPV e CV L'aggiunta di sale non ha influenzato in modo significativo le misurazioni (vedere la Figura S2 in Informazioni supplementari per i voltammogrammi rappresentativi). Tuttavia, a minori concentrazioni di DNA, l'aggiunta di sale riduce notevolmente la sensibilità, senza che si verifichino cambiamenti significativi nella corrente con la concentrazione di DNA. Simili effetti negativi del sale sulle interazioni MB-DNA e sull'intercalazione sono stati precedentemente riportati da altri ricercatori I cationi Mg}^{2+}\) si legano alla spina dorsale del fosfato negativo del DNA, ostacolando così l'interazione elettrostatica tra MB e DNA. non influenzano in modo significativo la risposta del sensore. Il punto chiave è che questo biosensore è più adatto a rilevare concentrazioni di DNA più elevate (raramente \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) o superiori), per l'elaborazione completamente automatizzata di campioni di acqua ambientale, in cui la purificazione del gel dei prodotti PCR potrebbe non essere fattibile.
Area sotto la curva di assorbimento per l'intervallo di lunghezze d'onda 600–700 \(\hbox {nm}\) per varie concentrazioni di DNA complessato con \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) con e senza sale (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) con e senza sale (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Concentrazioni di DNA corrispondenti a \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB campioni Nessun DNA.
Per verificare ulteriormente i risultati di cui sopra, abbiamo eseguito misurazioni ottiche utilizzando uno spettrofotometro UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), i campioni \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) sono stati utilizzati per ogni Misurazione. La firma di assorbimento diminuisce con l'aumentare della concentrazione di DNA, come si può vedere dall'andamento dell'area sotto la curva di assorbimento per l'intervallo di lunghezze d'onda da \(600\,\hbox {nm}\) a \(700\,\hbox { nm}\) , come mostrato in Fig. 4 (spettro di assorbimento mostrato in Fig. S3 in Informazioni supplementari). Per campioni con concentrazioni di DNA inferiori a \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), non vi era alcuna differenza significativa nell'assorbimento tra campioni contenenti DNA e solo MB (per \(503\,\hbox {bp}\) e \(117\,\hbox {bp}\ ) lunghezza frammenti), che indica l'assenza di inibizione sterica di MB redox-attivo. A concentrazioni di DNA più elevate, abbiamo osservato una graduale diminuzione del segnale di assorbanza e notato una minore diminuzione dell'assorbanza in presenza di sale. Questi risultati sono stati attribuiti a molecolari interazioni e inibizione sterica con impilamento di basi negli ibridi di DNA. I nostri risultati sono coerenti con i rapporti in letteratura sugli studi spettroscopici dell'intercalazione MB-DNA che associano l'ipocromaticità a livelli di energia ridotti in \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) transizioni elettroniche dovute agli strati di intercalazione 36, 37, 38.
Elettroforesi su gel di agarosio del fago Phi6: prodotti di PCR di lunghezza \(117\,\hbox {bp}\) e \(503\,\hbox {bp}\) da campioni di acqua di lago. Marcatore M-DNA;Controllo NTC-no-template, primer contenenti ampliconi corrispondenti;controllo positivo PC;1, 2, 3-non diluiti (1:1) campioni di acqua di lago addizionati in triplice copia. Una banda è visibile a \(\circa 50\,\hbox {bp}\) a causa di oligonucleotidi inutilizzati nel \(503\,\ hbox {bp}\) corsia.
Abbiamo valutato l'utilità del sensore utilizzando campioni di acqua del lago Powai addizionati con fago Phi6. ml}}\), mentre quelli isolati da sospensioni fagiche purificate L'RNA è stato stimato essere \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) con un'efficienza di recupero di circa 1 %.RNA è stato retrotrascritto in cDNA e utilizzato come modello per PCR e qPCR. La dimensione del prodotto è stata confermata dall'elettroforesi su gel di agarosio (Figura 5) prima del test con il sensore. Questi campioni non sono purificati con gel e quindi contengono tutti i componenti della PCR come così come gli ampliconi di interesse. I valori Ct registrati durante qPCR (Tabella 1) hanno dimostrato di correlare con la concentrazione di RNA isolato dai corrispondenti campioni di acqua addizionati. Il valore Ct rivela il numero di cicli necessari per il segnale fluorescente per superare la soglia o il segnale di fondo. Valori Ct più alti indicano concentrazioni di templato inferiori e viceversa. I valori Ct dei campioni NTC erano alti come previsto. La differenza nei valori Ct \(\circa 3\) tra il controllo positivo e il campione di prova indicano inoltre che ciascun campione di prova ha circa l'1% di templato rispetto al controllo positivo. Abbiamo discusso in precedenza che ampliconi più lunghi portano a una migliore sensibilità. L'amplificazione di frammenti più lunghi isolati da campioni ambientali eterogenei è impegnativa dati gli svantaggi di bassa concentrazione virale e degradazione dell'RNA. Tuttavia, con il nostro protocollo di arricchimento del virus e amplificazione PCR, siamo stati in grado di amplificare con successo il frammento \(503\,\hbox {bp}\) per il rilevamento elettrochimico.
La Figura 6 mostra i risultati del sensore elettrochimico dell'amplicone del frammento \(503\,\hbox {bp}\), entrambi utilizzando cDNA non diluito come modello (1:1) e cDNA diluito 100 volte come modello (1:100) eseguito PCR , rispetto a NTC e PC (vedere la Figura S4 in Informazioni supplementari per voltammogrammi rappresentativi). Ogni casella nel boxplot nella Figura 6 contiene misurazioni da tre campioni a 5 elettrodi. Gli stessi elettrodi sono stati utilizzati per misurare tutti i campioni per evitare errori dovuti all'elettrodo -to-elettrodo. Rispetto alle misurazioni CV, le misurazioni DPV mostrano una migliore risoluzione per distinguere i campioni di test e PC dagli NTC perché, come accennato in precedenza, le correnti faradaiche sono nascoste a causa delle correnti capacitive di fondo in quest'ultimo. Per ampliconi più lunghi, abbiamo osservato che il controllo negativo (NTC) ha prodotto correnti di picco CV e DPV più elevate rispetto al controllo positivo, mentre i campioni di test positivi e non diluiti hanno mostrato altezze di picco simili delle correnti di picco DPV. I valori medi e mediani misurati per ciascun campione non diluito (1:1 ) campione di prova e PC possono essere chiaramente risolti dall'uscita del sensore per il campione NTC, mentre la risoluzione per il campione diluito 1:100 è meno pronunciata. Per una diluizione 100 volte del cDNA, non abbiamo osservato alcuna banda durante l'elettroforesi su gel (corsie non mostrate nella Figura 5) e le corrispondenti correnti di picco DPV e CV erano simili a quelle previste per NTC. I risultati per il frammento \(117\,\hbox {bp}\) sono mostrati in Informazioni supplementari. Il negativo controllo ha indotto una risposta elettrochimica dal sensore PCB a causa dell'adsorbimento di MB libero sull'elettrodo e dell'interazione del MB con l'oligonucleotide del primer a filamento singolo. Pertanto, ogni volta che viene analizzato un campione, è necessario eseguire un controllo negativo e il corrente di picco del campione di prova rispetto alla corrente di picco ottenuta dal controllo negativo per ottenere una misurazione differenziale (relativa)39,40 per classificare il campione di prova come positivo o negativo.
(a) DPV e (b) corrente di picco CV per il rilevamento elettrochimico di frammenti \(503\,\hbox {bp}\) in campioni di acqua lacustre. I campioni di prova sono stati misurati in triplicato e confrontati con controlli senza modello (NTC) e controlli positivi (PC).
I nostri risultati illustrano diversi meccanismi che influenzano le prestazioni dei sensori elettrochimici per ampliconi di diverse lunghezze per diversi DNA, con concentrazioni verificate mediante misurazioni ottiche utilizzando uno spettrofotometro UV/Vis. Le nostre osservazioni sottolineano l'intuizione che frammenti di DNA più lunghi fino a \(\circa\) \(500\,\hbox {bp}\) può essere rilevato con una maggiore sensibilità e che la presenza di sale nel campione non è sensibile Sensibilità Concentrazione di DNA che influisce su una maggiore sensibilità (raramente \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) e sopra). Inoltre, abbiamo studiato l'effetto di diversi tipi di campioni, inclusi ampliconi purificati con gel con e senza aggiunta di sale e l'aggiunta di campioni di acqua di lago nelle misurazioni DPV e CV.Abbiamo osservato che DPV ha fornito una migliore risoluzione, poiché la corrente capacitiva di fondo influisce anche sulla misurazione CV, rendendola meno sensibile.
L'amplificazione di frammenti più lunghi dipende dall'integrità dell'RNA genomico virale. Diversi studi hanno dimostrato che l'amplificazione di frammenti più lunghi non è sempre efficiente a causa della degradazione dell'RNA nell'ambiente e del potenziale di splicing durante l'isolamento11,41,42,43,44 Abbiamo osservato che il metodo di concentrazione del virus basato su PEG era più efficace nel concentrare il fago Phi-6 addizionato a campioni di acqua del lago rispetto al metodo di concentrazione del virus basato su idrossido di alluminio. La capacità di rilevare lunghi frammenti di DNA ha dimostrato di superare il requisito per la PCR multiplex per amplificare più modelli di lunghezza inferiore e ridurre la possibilità di specificità incrociata.
I campioni biologici sono scarsi, quindi è necessario progettare un biosensore che richieda campioni minimi per i test. Gli elettrodi ENIG PCB utilizzati in questo studio richiedevano solo \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) campioni per il test per coprire l'area effettiva degli elettrodi. Inoltre, lo stesso elettrodo può essere riutilizzato dopo la pulizia prima di erogare il campione successivo. I campioni amplificati non richiedono l'aggiunta di sostanze chimiche diverse dal blu di metilene, che è un prodotto economico e sostanze chimiche comunemente usate. Poiché ogni elettrodo costa circa $ 0,55 (o INR 40) per la produzione, questo biosensore può essere un'alternativa conveniente alle tecnologie di rilevamento esistenti. La tabella 2 mostra un confronto di questo lavoro con altri sensori riportati in letteratura per lungo tempo Frammenti di DNA in campioni eterogenei.
Dato che i protocolli di rilevamento elettrochimico basati su MB si basano sulla specificità della PCR, una delle principali limitazioni di questo metodo è il potenziale per l'amplificazione non specifica in campioni eterogenei come acque reflue e acque lacustri o l'utilizzo di primer a bassa purezza. Per migliorare la sensibilità di metodi di rilevamento elettrochimico per il rilevamento del DNA di prodotti PCR non purificati utilizzando elettrodi PCB ENIG non modificati, è necessario comprendere meglio gli errori introdotti da dNTP e primer inutilizzati e ottimizzare le condizioni di reazione e i protocolli di analisi. Parametri fisico-chimici aggiuntivi come pH, temperatura e parametri biologici Potrebbe essere necessario misurare anche la domanda di ossigeno (BOD) del campione d'acqua per migliorare l'accuratezza della misurazione.
In conclusione, proponiamo un sensore PCB ENIG elettrochimico a basso costo per il rilevamento di virus in campioni ambientali (acqua di lago). A differenza degli elettrodi oligonucleotidici immobilizzati o dei substrati personalizzati per il rilevamento del DNA che richiedono la conservazione criogenica per mantenere la sensibilità,53,54 la nostra tecnica utilizza PCB non modificato elettrodi con una durata di conservazione più lunga e senza requisiti di conservazione specifici e quindi adatti per lo sviluppo di soluzioni di misurazione con elaborazione automatizzata del campione implementata negli LMIC. comune nei campioni ambientali riduce la specificità di questo metodo di rilevamento a causa del legame non specifico degli MB agli oligonucleotidi a singolo e doppio filamento. Pertanto, la specificità di questo test dipende dall'ottimizzazione dei primer e delle condizioni di reazione della PCR. Inoltre, il CV e le correnti di picco DPV ottenute dai campioni testati devono essere interpretate in relazione alle risposte ottenute dal controllo negativo (NTC) per ciascun test. I progetti e i metodi dei sensori elettrochimici presentati in questo lavoro possono essere integrati con gli autocampionatori per sviluppare un sistema completamente automatizzato e a bassa soluzione economica in grado di raccogliere e analizzare campioni e trasmettere i risultati in modalità wireless al laboratorio .
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Tempo di pubblicazione: maggio-27-2022