Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com. Vafraútgáfan sem þú notar hefur takmarkaðan stuðning fyrir CSS. Til að fá bestu upplifunina mælum við með að þú notir uppfærðan vafra (eða slökktir á samhæfnistillingu í Internet Explorer). Í millitíðinni, til að tryggja áframhaldandi stuðning, við munum sýna síðuna án stíla og JavaScript.
Mikilvægi þess að fylgjast með umhverfissýnum hefur verið metið mjög frá upphafi COVID-19 heimsfaraldursins, og nokkrar vöktunaraðgerðir eru gerðar með því að nota gullstaðalinn, þó að tækni sem byggir á qPCR sé dýr. Rafefnafræðilegir DNA lífskynjarar gætu veitt hugsanlega hagkvæman lausn til að fylgjast með umhverfisvatnssýnum í lágtekju- og millitekjulöndum. Í þessari vinnu sýnum við rafefnafræðilega greiningu á amplicons fengnum úr Phi6-fögum sem eru einangraðir úr vatnssýnum með stökkum (vinsæl staðgöngumáti fyrir SARS-CoV-2), með því að nota ENIG til að klára PCB rafskaut án yfirborðsbreytinga.kynlíf. Rafefnafræðilega skynjarasvörun var rækilega skilgreind fyrir tvö DNA brot af mismunandi lengd (\({117}\,\hbox {bp}\) og \({503}\,\hbox {bp}\)), og áhrif salta í PCR masterblöndum á víxlverkun metýlenbláa (MB)-DNA. Niðurstöður okkar sýna að lengd DNA brota ræður marktækt rafefnafræðilegu næmi og sýna í þessari vinnu að hæfileikinn til að greina langa amplicons án hlauphreinsunar á PCR vörum er mikilvægt fyrir in situ mælingar á vatnssýnum.Alveg sjálfvirk lausn fyrir veiruálag lofar góðu.
Veirusmit í vatni hefur verið þekkt sem lýðheilsuáhætta síðan á fjórða áratug síðustu aldar, með fyrstu vísbendingum um smit á mænusótt og lifrarbólgu E1 í vatni. Alþjóðaheilbrigðismálastofnunin (WHO) hefur flokkað nokkra vatnsborna veirusýkla sem hafa miðlungs til mikla heilsufarsþýðingu2. Hefðbundin veira Uppgötvunaraðferðir byggja á gullstöðluðum qPCR-tækni, sem er mjög viðkvæm og sértæk, en krefjast hæft starfsfólks til að prófa á rannsóknarstofunni með dýrum tækjum. Hins vegar, í lágtekju- og millitekjulöndum (LMIC) með takmarkað fjármagn, manneskjur sýnatökupróf eru líkleg til að hafa forgang fram yfir vöktun vatnssýna í umhverfinu. Þess vegna er þörf á öðrum ódýrum aðferðum fyrir sjálfbæra rauntíma vöktun á vatni og frárennslissýnum í lágtekju- og millitekjulöndum sem snemma viðvörun um uppkomu sjúkdóma, þannig að vernda þá fyrir alvarlegum félagslegum og efnahagslegum áhrifum vírusfaraldursins. Ódýrir rafefnafræðilegir lífskynjarar fyrir kjarnsýrur gætu veitt vænlega mögulega lausn á þessari óuppfylltu þörf. Margir af þessum DNA lífskynjara vinna með því að sambótar DNA þræðir eru óhreyfðir á rafskautinu. yfirborðið og blanda saman þegar samsvarandi röð er til staðar í sýninu. Þessu er síðan hægt að breyta í merki með ýmsum rafefnafræðilegum aðferðum með því að nota redoxmiðlara eins og kalíumjárn/ferrósýaníð. Metýlenblátt (MB) er ein slík redoxvirk sameind, sem hefur Greint hefur verið frá því að það blandist inn í tvíþátta DNA (dsDNA) auk ósértækari bindingar þess við einþátta DNA5,6. Innifalandi eðli MBs til að mynda MB-DNA fléttur gerir þá að vinsælum valkostum sem redoxmiðlarar í nokkrum rafefnafræðilegum DNA skynjarastillingar5,6,7,8,9.Þrátt fyrir að samsetning MB við DNA sé ósértæk og sérhæfni þessa rafefnafræðilega skynjara veltur að miklu leyti á hreinleika primeranna sem notaðir eru fyrir PCR eða jafnhita mögnun, hentar hann vel til að útfæra raunverulegan -tíma rafefnafræðilega byggt qPCR eða flúrljómun jafnhita mögnun sem valkostur við DNA styrk mælingu 9. Í einni slíkri útfærslu, Won et al.Yfirborði gull rafskauta var breytt með 6-merkaptó-1-hexanóli (MCH) í rauntíma mæling á PCR magnara með MB með því að nota diffurpúlsspennumælingu (DPV)9.Í öðrum tilfellum, Ramirez o.fl. Greining á SARS-CoV-2 í afrennsli með RT-LAMP viðbrögðum með því að nota MB með skjáprentuðum rafskautum.Platínu rafskaut hafa einnig verið notaðar eins og in situ rafskaut í örvökva PCR vettvangi sem er hannað til að greina rafefnafræðilega mælingar á viðbrögðum 8 . Allar þessar rannsóknir krefjast yfirborðsbreytinga á rafskautunum, sem þýðir aukinn framleiðslu- og rekstrarkostnað vegna sérstakra geymslukrafna fyrir stöðugleika þessara virku rafskauta.
Skýringarmynd af vinnuflæði fyrir rafefnafræðilega uppgötvun á amplicons fengnum úr þéttum veiruögnum í vatnssýnum.
Við sýndum nýlega rafefnafræðilega skynjun á SARS-CoV-2 magnara með ódýrum prentplötu (PCB) rafskautum byggðar á DPV og hringspennumælingu (CV) framkallað af aðsog MB-DNA fléttna á yfirborði óbreyttra rafskauta ) breytingar á toppi núverandi 11.Við greinum frá því að lengri DNA bútar (N1-N2, \({943}\, \hbox) sem mynduðust með því að nota CDC-ráðlagða N1 fram- og N2 afturábak frumra samanborið við styttri brot {bp}\)) sýndu betri línuleika í skynjarasvörun ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) mynduð með því að nota N1 áfram og N1 afturábak grunnsett. Greint er frá þessum rannsóknum með því að nota DNA þynningar útbúnar í nukleasafríu vatni. Pallurinn var einnig notaður til að greina SARS-CoV -2 amplicons í hermdu afrennslissýnum (fengið með því að fylla heildar RNA sýni með SARS-CoV-2 RNA). Þar sem RNA er næmt fyrir klippingu við einangrun og niðurstreymisvinnslu,12,13 er erfitt að magna upp lengri brot með þessu ólíka sýni. Þess vegna er sönnun á rafefnafræðilegri skynjun á SARS-CoV-2 magni í skólpvatni takmörkuð við styttra \(72\,\hbox {bp}\) N1 brotið.
Í þessari vinnu könnuðum við hagkvæmni ENIG PCB-undirstaða rafefnafræðilegrar skynjunar á fögum Phi6 sem er einangrað og einangrað úr vatnssýnum í stöðuvatni (mynd 1). Phi6 fög eru sambærileg að stærð (80-100 nm) og SARS-CoV-2 og hafa einnig lípíðhimnu og broddprótein.Af þessum ástæðum er bakteríufagur Phi6 vinsæl staðgengill fyrir SARS-CoV-2 og aðrar hjúpaðar sjúkdómsvaldandi RNA veirur14,15.RNA einangrað úr fagögnum var notað sem sniðmát fyrir myndun cDNA og síðan PCR til að fá tvö DNA brot sem eru 117 og 503 basapör að lengd. Miðað við áskorunina um að magna \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 brot í fyrri verkum okkar, miðum við við brot á millilengd (\(117) \,\hbox {bp}\) og \(503 \,\hbox {bp}\)), byggt á tiltækum grunni. Rafefnafræðilega skynjarasvörun var kerfisbundin rannsökuð á breiðu styrkleikasviði (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) til \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\))) Fyrir bæði brot í tilvist MB hefur áhrif salts á skynjarasvörun verið einkennd og krossstaðfest með litrófsmælingum. Helstu framlög þessarar vinnu eru sem hér segir:
Lengd DNA búta og tilvist salts í sýninu hafa mikil áhrif á næmi.Niðurstöður okkar sýna að rafefnafræðileg virkni er háð mismunandi verkunarháttum víxlverkunar MB, DNA og skynjarans í rafmælingarsvöruninni, allt eftir DNA styrk og lengd, með lengri Brot sýna hærra næmni, þó salt hafi neikvæð áhrif á rafstöðueiginleika samskipti milli MB og DNA.
DNA styrkur ákvarðar virkni MB-DNA víxlverkunar í óbreyttum rafskautum Við sýnum fram á að mismunandi aðferðir MB-DNA víxlverkunar eru háðar DNA styrk. Við DNA styrk undir lítið magn af \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), sáum við að rafefnafræðileg straumsvörun var aðallega ákvörðuð af aðsog MB-DNA á rafskautinu, en við lægri styrk Við háan DNA styrk var rafefnafræðileg straumsvörun ákvörðuð af sterískri hömlun á redox virkni vegna MB innsetningar á milli DNA basapöra.
ENIG PCB-undirstaða rafefnafræðileg skynjun á veirukjarnsýrum í vatnssýnum í stöðuvatni Athuganirnar voru staðfestar með rafefnafræðilegri greiningu á Phi6-viðbættum \(503\,\hbox {bp}\) DNA bútum sem fengust úr vatnssýnum frá Powai Lake, IIT Mumbai háskólasvæðinu Niðurstaða fagur.
Lítill kostnaður við innleiðingu og möguleiki á samþættingu í fullkomlega sjálfvirk vöktunarkerfi, fákirni eða aptamer á rafskautum með lengri geymsluþol.
Phage Phi6 er hjúpuð dsRNA veira af Cytoviridae fjölskyldunni sem sýkir Pseudomonas syringae. Erfðamengi Phi6 phage er til í formi 3 brota: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) og L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Þar sem Phi6 fagurinn sýkir BSL-1 Pseudomonas stofn sem ekki er sjúkdómsvaldandi er óhætt að nota og er auðvelt að rækta það á rannsóknarstofunni.Phage Phi6 og hýsilinn Pseudomonas syringae voru keyptir frá Felix d'Herelle Reference Center for Bacterial Viruses, Laval University, Kanada (vörulistanúmer tilvísunarmiðstöðva eru HER-102 og HER-1102, í sömu röð) .Phi6 fagur og hýsil hans voru endurlífgaðir samkvæmt leiðbeiningum frá viðmiðunarmiðstöðinni.Phage Phi6 var hreinsaður með plötulýsi og skolun til að fá lokatítra með \(\um 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (plötumyndandi einingar/ millilítra).RNA var einangrað úr hreinsuðum föguögnum með því að nota GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Í stuttu máli, hreinsuð phage Phi6 sviflausn\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) var leyst og lýsatið var sett á snúningssúlu til að leyfa RNA að bindast resínsúlunni. RNA er síðan skolað í skolunarlausninni \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) frá settinu. Áætlaðu styrk RNA með gleypni við \(260\,\hbox {nm}\).RNA var geymt í deilum í \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) þar til frekari notkun.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA Synthesis Kit (Bio -Rad Laboratories) var notað sem sniðmát fyrir cDNA myndun í samræmi við leiðbeiningar framleiðanda. Í stuttu máli samanstendur cDNA myndun hvarf af 3 skrefum: grunnur við \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {mín} }\) , öfug umritun á \({20}\,{\hbox {mín}}\) á \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), og öfugt Upptökutækið er í \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) í \({1}\,{\hbox {mín. }}\). Þegar keyrt var á 1% agarósa hlaupi sýndi cDNA þrjú bönd sem samsvara væntanlegum þremur RNA brotum (gögn ekki sýnd). Eftirfarandi primers voru notaðir til að magna upp tvö DNA brot sem voru 117 og 503 bp að lengd, með því að nota cDNA sem sniðmát fyrir PCR í miniPCR® mini8 hitauppstreymi:
Tímarnir fyrir \(117\,\hbox {bp}\) og \(503\,\hbox {bp}\) samsvara 1476-1575 núkleótíðum í M-hlutanum og 458-943 núkleótíðum í L-hlutanum, í sömu röð. .Allar magnaðar PCR vörur voru rafdrættar á 1% agarósa hlaupum og magnað mark DNA var hreinsað með því að nota GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
Vatn á IIT Mumbai háskólasvæðinu (Powai Lake, Powai, Mumbai) var notað til að bæta við fögum ögnum. Vatnið var síað í gegnum \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) himnu til að fjarlægja svifreiðum, og svo var Phi6 fögum bætt við. Bættu við \({1}\,{\hbox {ml}}\) af \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) til \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) síað vatnsvatn, í \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Lítill skammtur var frátekin fyrir veiruálagsmælingu með skellugreiningu. Við prófuðum tvær mismunandi aðferðir til að einbeita spiked Phi6 veiruögnum: (1) álhýdroxíð aðsogs-útfellingaraðferð,19 sem hefur verið staðfest fyrir styrk nokkurra hjúpaðra RNA veira úr umhverfissýnum, og (2) ) Veiruþéttniaðferðin sem byggir á pólýetýlen glýkól (PEG) var aðlöguð frá Flood o.fl.20 .Þar sem endurheimtur skilvirkni PEG-undirstaða aðferðarinnar reyndist vera betri en álhýdroxíðaðferðarinnar, var PEG-undirstaða aðferðin notuð til að þétta Phi6 agnir úr vatnssýnum.
PEG aðferðin sem notuð var var sem hér segir: PEG 8000 og \(\hbox {NaCl}\) var bætt við Phi6-gadda vatnssýni til að fá 8% PEG 8000 og \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\). Sýni voru ræktuð á hristara\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), síðan skilið í skilvindu við \(4700 \,\hbox {g}\) er \({45}\,{\hbox {mín}}\). Fleygið flotinu og blandið kúlunni aftur í \({1}\, {\hbox {ml}}\) í sama flotvatni. Allar tilraunir með áfyllingu og veiruþéttni voru gerðar í þríriti. Eftir þéttingu var lítill skammtur geymdur til að mæla endurheimtarvirkni með skelluprófi. RNA var einangrað eins og áður hefur verið lýst og skolað út í búnaði sem fylgir skolunarbuffi\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Þar sem styrkur RNA er breytilegur frá sýni til sýnis í þríriti, er \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) af RNA er notað fyrir öll þrjú óháð styrk cDNA nýmyndun sýna.cDNA nýmyndun var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA var notað sem sniðmát fyrir \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR í 35 lotur til að magna upp \ (117\,\hbox {bp}\) og \(503\,\hbox { bp}\) brot. Þessi sýni eru táknuð sem „1:1″, þ.e. án þynningar. No-template control (NTC) var sett upp sem neikvæð viðmiðun, en cDNA myndað með RNA einangrað úr hreinsuðum fögum var sett upp sem sniðmát fyrir jákvæða viðmiðun (PC). Magn PCR (qPCR) var framkvæmd í Stratagene Mx3000P RT-PCR tæki með því að nota Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Viðbrögð voru sett upp í þríriti eins og áður lýst.Hringrásarþröskuldur (Ct) var skráður fyrir öll sýni. Auk þess voru þynntu sýnin \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) með því að nota cDNA þynnt 1:100 í síuðu stöðuvatni sem \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR í 35 lotur. Þessi sýni eru sýnd sem „1:100″.
PCB rafskautin eru framleidd með ódýru raflausu nikkelimmersion gulli (ENIG) ferli án þess að þörf sé á frekari gullhúðun. ENIG PCB rafskautaforskriftir eru tilgreindar í fyrri verkum okkar11.Fyrir ENIG PCB rafskaut, hefðbundnar rafskautshreinsunaraðferðir eins og Ekki er mælt með piranha lausn eða brennisteinssýru hringspennumælingu þar sem þau geta valdið flögnun á þunnu gulllaginu (þykkt \(\u.þ.b.) \(100\,\hbox {nm }\)) og afhjúpað undirliggjandi koparlög sem eru viðkvæm fyrir til tæringar 21, 22, 23, 24, 25. Þrífið því rafskautin með lólausum klút vættum með IPA. Sýnið sem á að prófa var ræktað með \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB í \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) til að auðvelda innsetningu. Í fyrri verkum okkar , við tókum eftir því að næmni og línuleiki skynjarans var bætt með því að auka MB styrkinn 11 . Byggt á hagræðingum sem greint var frá í fyrri vinnu okkar notuðum við \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB styrkur til að fella DNA inn í þessa rannsókn. Rafefnafræðileg uppgötvun tvíþátta DNA (ds-DNA) er hægt að ná með því að nota anjónískar eða katjónískar intercalators. Þó að anjónísk intercalators greini DNA með betri sértækni, þurfa þeir ræktun yfir nótt, sem leiðir til lengri greiningartíma. á hinn bóginn þurfa katjónískir millikaflar eins og MB styttri ræktunartíma, um það bil \({1}\,{\hbox {h}}\) fyrir rafefnafræðilega greiningu á ds-DNA6. Hver mæling felur í sér að sýninu sem á að prófa á rafskaut\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), síðan hreinsað með IPA-vættri tusku áður en haldið er áfram með annað sýni.ein mæling.Hvert sýni var prófað á 5 mismunandi rafskautum nema annað sé tekið fram.DPV og CV mælingar voru gerðar með PalmSens Sensit Smart potentiostat og PSTrace hugbúnaður var notaður fyrir potentiostat stillingar og gagnaöflun, þar á meðal útreikninga á toppstraumi. Eftirfarandi stillingar eru notaðar. fyrir DPV og CV mælingar:
DPV: Jafnvægistími = \(8\,\hbox {s}\), spennuþrep = \(3\,\hbox {mV}\), púlsspenna = \(25\,\hbox {mV}\) , púlslengd = \(50\,\hbox {ms}\), skannahraði = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
Ferilskrá: Jafnvægistími = \(8\,\hbox {s}\), Spennuþrep = \(3\,\hbox {mV}\), Sóphraði = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Hámarksstraumar fengnir úr voltammograms af DNA flóknum með \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) ferilskrá, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) ferilskrá.
DPV og CV voltammograms voru fengin á ENIG PCB rafskautum \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB samsett með DNA (í styrkleika 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) þ.e. 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) fyrir \(117\,\hbox {bp}\ ) og 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) fyrir \(503\,\hbox {bp}\)). Fulltrúaspennumyndir eru sýndar á mynd S1 í viðbótarupplýsingum. Mynd 2 sýnir niðurstöðurnar af DPV og CV mælingum (hámarksstraumur) með því að nota gelhreinsaðar PCR vörur. Samanborið við CV mælingar sýna DPV mælingar hærra næmi (straumur sem fall af DNA styrk) vegna þess að rafrýmd bakgrunnsstraumar í CV mælingum fela Faradaic strauma 26 .Gögnin fyrir hvern kassa í kassapallinu inniheldur mælingar frá 5 rafskautum. Allar mælingar nota sama sett af rafskautum til að forðast mæliskekkjur vegna breytileika rafskauts til rafskauts. Við sáum vaxandi tilhneigingu í DPV og CV mældum toppstraumum fyrir lægri styrk DNA , lengra (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ samanborið við \(117) ) brot. Þetta er í samræmi við væntanlega þróun rafskautauppsogs sem greint var frá í fyrri verkum okkar. frásog MB-DNA flókins auðveldar hleðsluflutning á rafskautinu, sem stuðlar að aukningu hámarksstraumsins. Aðrar rannsóknir hafa sýnt áhrif fákímastærðar og -raðar á MB-DNA innskot27,28,29,30.Gúanínið -sýtósín (GC) innihald ampliconanna tveggja (\(117\,\hbox {bp}\) og \(503\,\hbox {bp}\))) var um það bil 50%, sem gefur til kynna að athugunin. Mismunurinn er vegna til amplicon lengd. Hins vegar, fyrir hærri DNA styrk (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), fyrir \(503\,\hbox {bp} \) og \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) fyrir \(117\,\hbox {bp}\)), sjáum við tvær mögnanir. hámarksstraumar undirflokkanna minnka bæði í DPV og CV mælingum. Þetta er vegna þess að MB mettar og fléttast á milli basapöra af DNA, sem leiðir til sterískrar hömlunar á redoxvirkni afoxandi hópsins í MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Sölt sem eru til staðar í PCR masterblöndum trufla rafstöðueiginleika milli MB og DNA, þannig að með því að bæta \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) við \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB hlauphreinsuð vara til að rannsaka áhrif salts á MB-DNA víxlverkun. Eins og sýnt er á mynd 3, sáum við að fyrir hærri DNA styrk (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) og \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) fyrir \(117\,\hbox {bp} \)), í DPV og CV. Saltbæti hafði ekki marktæk áhrif á mælingarnar (sjá mynd S2 í viðbótarupplýsingum fyrir dæmigerða rafhlöðumyndir). Hins vegar kl. lægri DNA styrkur, salti dregur verulega úr næmni, sem leiðir ekki til marktækra breytinga á straumi með DNA styrk.Svip neikvæð áhrif salts á MB-DNA milliverkanir og innheimtu hafa áður verið greint frá af öðrum rannsakendum33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) katjónir bindast neikvæðum fosfatgrunni DNA og hindrar þar með rafstöðueiginleika milli MB og DNA. Við hærri DNA styrk leiðir sterísk hömlun á redoxvirkum MBs í lægri toppstrauma, þannig að rafstöðueiginleikar hafa ekki marktæk áhrif á svörun skynjarans. Lykilatriðið er að þessi lífnemi hentar betur til að greina hærri DNA styrk (sjaldan \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) eða hærri), fyrir fullkomlega sjálfvirka vinnslu á umhverfisvatnssýnum, þar sem hlauphreinsun á PCR vörum gæti ekki verið framkvæmanleg.
Svæði undir frásogsferilnum fyrir bylgjulengdarbilið 600–700 \(\hbox {nm}\) fyrir mismunandi styrki DNA sem er flókið með \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) með og án salts (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) með og án salts (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) DNA styrkur sem samsvarar \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB sýni Ekkert DNA.
Til að sannreyna enn frekar ofangreindar niðurstöður framkvæmdum við sjónmælingar með UV/Vis litrófsmæli (Thermo Scientific Multiskan GO), sýnin \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) voru notuð fyrir hvert Mæling. Frásogsmerkið minnkar með auknum DNA styrk eins og sjá má af þróun svæðisins undir frásogsferilnum fyrir bylgjulengdarsviðið \(600\,\hbox {nm}\) til \(700\,\hbox { nm}\), eins og sýnt er á mynd 4 (gleypnisvið sýnt á mynd S3 í viðbótarupplýsingum). Fyrir sýni með DNA styrk minni en \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), var enginn marktækur munur á upptöku milli sýna sem innihalda DNA og eingöngu MB (fyrir \(503\,\hbox {bp}\) og \(117\,\hbox {bp}\ ) lengdarbrot), sem gefur til kynna að sterísk hömlun á redoxvirku MB sé ekki til staðar. Við hærri DNA styrk sáum við smám saman minnkun á gleypnimerkinu og tókum eftir minni lækkun á gleypni í viðurvist salts. Þessar niðurstöður voru raktar til sameinda víxlverkanir og sterísk hömlun við basa stöflun í DNA blendingum. Niðurstöður okkar eru í samræmi við skýrslur í bókmenntum um litrófsrannsóknir á MB-DNA víxlun sem tengir litleysi við minnkað orkustig í \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) rafrænar umbreytingar vegna innskots Laga 36, 37, 38.
Agarósa hlaup rafskaut á fögum Phi6: PCR afurðir af lengd \(117\,\hbox {bp}\) og \(503\,\hbox {bp}\) úr vatnssýnum úr stöðuvatni.M-DNA merki;NTC-no-template control, primers sem innihalda samsvarandi amplicons;PC jákvæð stjórn;1, 2, 3-óþynnt (1:1) vatnssýni með stökkum í þríriti. Band sést við \(\um 50\,\hbox {bp}\) vegna ónotaðra fákjarna í \(503\,\ hbox {bp}\) braut.
Við metum notagildi skynjarans með því að nota vatnssýni úr Powai Lake með Phi6 fögum. Styrkur RNA sem var einangraður úr sýnum með fögum stungnum var á bilinu 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), en þær sem voru einangraðar úr hreinsuðum fögum sviflausnum. RNA var metið til að vera \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) með endurheimtarvirkni um það bil 1 %.RNA var öfugt umritað í cDNA og notað sem sniðmát fyrir PCR og qPCR. Stærð vöru var staðfest með agarósa gel rafdrætti (Mynd 5) fyrir prófun með skynjaranum. Þessi sýni eru ekki gelhreinsuð og innihalda því alla þætti PCR sem Einnig var sýnt fram á að Ct gildin sem skráð voru við qPCR (tafla 1) voru í fylgni við styrk RNA sem var einangrað úr samsvarandi vatnssýnum. fara yfir þröskuldinn eða bakgrunnsmerkið.Hærri Ct gildi gefa til kynna lægri sniðmátsstyrk og öfugt. Ct gildi NTC sýnanna voru eins há og búist var við. Munurinn á \(\u.þ.b. 3\) Ct gildum á milli jákvæða samanburðurinn og prófunarsýnin gefa ennfremur til kynna að hvert prófsýni hafi um það bil 1% sniðmát samanborið við jákvæða samanburðinn. Við höfum áður fjallað um að lengri mælingar leiði til betra næmis. Mögnun lengri brota sem eru einangruð úr ólíkum umhverfissýnum er krefjandi miðað við ókostina með lágum veirustyrk og niðurbroti RNA. Hins vegar, með veiruauðgun og PCR mögnunaraðferð, tókst okkur að magna upp \(503\,\hbox {bp}\) brotið til rafefnafræðilegrar skynjunar.
Mynd 6 sýnir niðurstöður rafefnafræðilegra skynjara \(503\,\hbox {bp}\) bútamplicon, bæði með því að nota óþynnt cDNA sem sniðmát (1:1) og 100-falt þynnt cDNA sem sniðmát (1:100 ) framkvæmt PCR , samanborið við NTC og PC (sjá mynd S4 í viðbótarupplýsingum fyrir dæmigerðar voltammograms). Hver kassi í kassaplotunni á mynd 6 inniheldur mælingar úr þremur sýnum á 5 rafskautum. Sömu rafskaut voru notuð til að mæla öll sýni til að forðast villur vegna rafskauts -til-rafskautsbreytingar. Samanborið við CV mælingar sýna DPV mælingar betri upplausn til að greina prófunar- og PC sýni frá NTC vegna þess að eins og áður hefur komið fram eru Faradaic straumar falir vegna rafrýmdra bakgrunnsstrauma í þeim síðarnefndu. Fyrir lengri magnara, tókum við eftir því að neikvæða viðmiðunin (NTC) leiddi til hærri CV og DPV toppstrauma miðað við jákvæða samanburðinn, en jákvæð og óþynnt prófunarsýni sýndu svipaða topphæð DPV toppstrauma. Mæld meðal- og miðgildi fyrir hvern óþynntan (1:1) ) Prófsýni og PC er hægt að greina greinilega úr skynjaraúttakinu fyrir NTC sýnishornið, en upplausnin fyrir 1:100 þynnt sýni er minna áberandi. Fyrir 100-falda þynningu á cDNA sáum við ekki neinar bönd við hlaup rafskaut (brautir ekki sýndar á mynd 5), og samsvarandi DPV og CV toppstraumar voru svipaðir og búist var við fyrir NTC. Niðurstöður fyrir \(117\,\hbox {bp}\) brotið eru sýndar í viðbótarupplýsingum. stýring olli rafefnafræðilegri svörun frá PCB skynjaranum vegna aðsogs á lausu MB á rafskautinu og víxlverkunar MB við einþátta primer fákiminn. Þess vegna verður að keyra neikvæða samanburð í hvert skipti sem sýni er prófað og hámarksstraumur prófunarsýnisins borinn saman við hámarksstrauminn sem neikvæða eftirlitið fékk til að ná mismunamælingu (afstætt)39,40 til að flokka prófunarsýnið sem jákvætt eða neikvætt.
(a) DPV og (b) CV hámarksstraumur fyrir rafefnafræðilega greiningu á \(503\,\hbox {bp}\) brotum í vatnssýnum. jákvæð eftirlit (PC).
Niðurstöður okkar sýna mismunandi aðferðir sem hafa áhrif á frammistöðu rafefnafræðilegra skynjara fyrir magni af mismunandi lengd fyrir mismunandi DNA, með styrk sannreyndan með sjónmælingum með UV/Vis litrófsmæli. Athuganir okkar undirstrika þá innsýn að lengri DNA brot allt að \(\u.þ.b.) \(500\,\hbox {bp}\) er hægt að greina með hærra næmi og að tilvist salts í sýninu veldur ekki Næmni DNA styrkur sem hefur áhrif á hærra næmi (sjaldan \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) og að ofan). Auk þess könnuðum við áhrif mismunandi tegunda sýna, þar á meðal hlauphreinsuðum amplicons með og án viðbætts salts, og viðbót vatnssýna í DPV og CV mælingum.Við sáum að DPV gaf betri upplausn, þar sem rafrýmd bakgrunnsstraumur hefur einnig áhrif á CV mælingu, sem gerir hana minna viðkvæma.
Mögnun lengri brota veltur á heilleika erfðaefnis-RNA veiru. Nokkrar rannsóknir hafa sýnt að mögnun lengri brota er ekki alltaf skilvirk vegna niðurbrots RNA í umhverfinu og möguleika á splicing við einangrun11,41,42,43,44 .Við komumst að því að veiruþéttniaðferðin sem byggir á PEG var áhrifaríkari við að einbeita fögum Phi-6 sem var spýttur í vatnssýni en veiruþéttniaðferðin sem byggir á áli. Eiginleikinn til að greina langa DNA búta reyndist vinna bug á kröfunni um multiplex PCR til að magna upp mörg styttri sniðmát og draga úr möguleikanum á krosssérhæfni.
Lífsýni eru af skornum skammti, svo það er þörf á að hanna lífskynjara sem krefst lágmarkssýni til prófunar. ENIG PCB rafskautin sem notuð voru í þessari rannsókn þurftu aðeins \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) sýni til að prófa til að hylja virkt svæði rafskautanna. Að auki er hægt að endurnýta sama rafskaut eftir hreinsun áður en næsta sýni er afgreitt. Ekki þarf að bæta við neinum efnum öðrum en metýlenbláu, sem er ódýrt. og algengt efni. Þar sem hvert rafskaut kostar um $0,55 (eða INR 40) í framleiðslu, getur þessi lífskynjari verið hagkvæmur valkostur við núverandi greiningartækni. Tafla 2 sýnir samanburð á þessari vinnu við aðra skynjara sem greint hefur verið frá í bókmenntum í langan tíma. DNA bútar í ólíkum sýnum.
Í ljósi þess að MB-undirstaða rafefnafræðilegar greiningaraðferðir byggja á sérhæfni PCR, er megin takmörkun þessarar aðferðar möguleiki á ósértækri mögnun í ólíkum sýnum eins og frárennsli og vatnsvatni eða með því að nota lághreinleika grunna. Til að bæta næmi rafefnafræðilegar greiningaraðferðir fyrir DNA uppgötvun á óhreinsuðum PCR vörum með því að nota óbreytt ENIG PCB rafskaut, það er nauðsynlegt til að skilja betur villur sem ónotaðar dNTP og primers koma inn og til að hámarka hvarfskilyrði og prófunaraðferðir. Viðbótar eðlisefnafræðilegar breytur eins og pH, hitastig og líffræðilegar breytur Einnig gæti þurft að mæla súrefnisþörf (BOD) vatnssýnisins til að bæta nákvæmni mælingar.
Að lokum leggjum við til ódýran rafefnafræðilegan ENIG PCB skynjara til að greina vírusa í umhverfissýnum (vatnsvatns) sýnum. Ólíkt óhreyfðum fákirni rafskautum eða sérsniðnum hvarfefnum fyrir DNA skynjun sem krefjast frystigeymslu til að viðhalda næmni, 53,54 tækni okkar notar óbreytt PCB rafskaut með lengri geymsluþol og engar sérstakar kröfur um geymslu og því hentugar fyrir þróun mælilausna með sjálfvirkri sýnavinnslu sem notuð er í LMICs. Lífnemarinn notar ódýr DNA-intercalating redox litarefni (MB) til að greina markamplicons hratt. Ósértæk mögnun algengt í umhverfissýnum dregur úr sérhæfni þessarar skynjunaraðferðar vegna ósértækrar bindingar MBs við ein- og tvíþátta fákirni. Þess vegna er sérhæfni þessa prófs háð hagræðingu primers og PCR hvarfskilyrða. Auk þess er CV og DPV hámarksstrauma sem fengnir eru úr prófuðu sýnunum ætti að túlka miðað við svörin sem fást frá neikvæðu viðmiðuninni (NTC) fyrir hverja prófun. Rafefnafræðilegu skynjarahönnunina og aðferðirnar sem kynntar eru í þessari vinnu er hægt að samþætta við sjálfvirka sýnatökutæki til að þróa fullkomlega sjálfvirkan og lágan -kostnaðarlausn sem getur safnað og greint sýni og sent niðurstöður þráðlaust til baka á rannsóknarstofuna.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Aðferðir við upphafsstyrk vírusa úr vatnssýnum: endurskoðun og meta-greining á nýlegum rannsóknum.J.Application.microorganism.115, bls. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Vatnsbornar veirur: Hindranir fyrir öruggu drykkjarvatni.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. o.fl.Wastewater epidemiology for hagkvæmt stórfellt eftirlit með COVID-19 í lág- og millitekjulöndum: áskoranir og tækifæri.Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Kjarnsýru rafefnafræði.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Metýlenblátt sem rafefnafræðilegur aðgreiningaraðili ein- og tvíþátta fákjarna sem eru óhreyfð á gullhvarfefni.Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Samanburður á katjóna- og anjónamillitækjum fyrir rafefnafræðilega flutning á DNA-bræðslu með langdrægum rafeindaflutningi.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Hleðsluflutningur í gegnum DNA: sértækur rafefnafræðilegur DNA lífskynjari.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH o.fl. Rauntíma PCR örflæðistæki með samhliða rafefnafræðilegri uppgötvun.líffræðilegur skynjari.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY o.fl.Signaling mechanism study and performance sannprófun á rafefnafræðilegu rauntíma PCR kerfi sem byggir á samspili metýlenblás við DNA.Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG o.fl. Lykkjumiðluð jafnvarma mögnunartengdur rafefnafræðilegur skynjari til að greina sars-cov-2 í frárennslissýnum.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. o.fl. Rafefnafræðileg skynjun á SARS-CoV-2 magnara með PCB rafskautum. Skynjarinn er virkjaður.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Skilvirk uppgötvun SARS-CoV-2 RNA í föstu hluta afrennslisvatns.vísindi.almennt umhverfi.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Analytical Methods for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Survival of the enveloped bacteriophage Phi6 (staðgöngulyf fyrir SARS-CoV-2) í uppgufuðum munnvatnsdropum sem settir eru á gleryfirborð.vísindi.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Umhverfisþol SARS-CoV-2 staðgengils (Phi6) í frílifandi amöbu.J.Water Health 20, 83 (2021).
Mindich, L. Nákvæmar umbúðir þriggja erfðafræðilegra brota af tvíþátta RNA bakteríufrumum\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Secondary structure of the DH RNA phage\(\varphi\)6 packaging region.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. o.fl.Phages on the Tap – Fljótleg og skilvirk aðferð til að útbúa rannsóknarstofubirgðir af bakteríufrumum.PeerJ 4, e2261 (2016).
Birtingartími: 27. maí 2022