Ավելի երկար ամպլիկոններ ապահովում են ավելի լավ զգայունություն՝ ջրի նմուշներում վիրուսային նուկլեինաթթուների էլեկտրաքիմիական ընկալման համար՝ օգտագործելով PCB էլեկտրոդներ

Շնորհակալություն Nature.com այցելելու համար: Բրաուզերի տարբերակը, որը դուք օգտագործում եք, ունի CSS-ի սահմանափակ աջակցություն: Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված բրաուզեր (կամ անջատել համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում): Միևնույն ժամանակ, ապահովելու համար շարունակական աջակցություն, մենք կցուցադրենք կայքը առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Շրջակա միջավայրի նմուշների մոնիտորինգի կարևորությունը մեծապես գնահատվել է COVID-19 համաճարակի սկզբից ի վեր, և որոշ մոնիտորինգի ջանքեր են իրականացվում՝ օգտագործելով ոսկու ստանդարտը, չնայած qPCR-ի վրա հիմնված տեխնիկան թանկ է: Էլեկտրաքիմիական ԴՆԹ-ի բիոսենսորները կարող են ապահովել պոտենցիալ ծախսարդյունավետ լուծում ցածր և միջին եկամուտ ունեցող երկրներում շրջակա միջավայրի ջրի նմուշների մոնիտորինգի համար: Այս աշխատանքում մենք ցույց ենք տալիս Phi6 ֆագից ստացված ամպլիկոնների էլեկտրաքիմիական հայտնաբերումը, որոնք մեկուսացված են լճի ջրի նմուշներից (SARS-CoV-2-ի հանրաճանաչ փոխնակ), օգտագործելով ENIG: լրացնել PCB էլեկտրոդները առանց մակերեսի փոփոխության:սեռը: Էլեկտրաքիմիական սենսորային արձագանքը մանրակրկիտ բնութագրվել է տարբեր երկարությունների երկու ԴՆԹ բեկորների համար (\({117}\,\hbox {bp}\) և \({503}\,\hbox {bp}\)), և PCR-ի հիմնական խառնուրդներում աղերի ազդեցությունը մեթիլեն կապույտ (MB)-ԴՆԹ փոխազդեցությունների վրա: Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ ԴՆԹ-ի բեկորների երկարությունը էապես որոշում է էլեկտրաքիմիական զգայունությունը և ցույց է տալիս այս աշխատանքում, որ երկար ամպլիկոնները հայտնաբերելու ունակությունն առանց PCR արտադրանքի գելային մաքրման է: կարևոր է ջրի նմուշների տեղում չափման համար:Վիրուսային բեռի լիովին ավտոմատացված լուծումը լավ է խոստանում:
Ջրային ճանապարհով վիրուսի փոխանցումը հայտնի է որպես հանրային առողջության համար վտանգ 1940-ականներից ի վեր, երբ առաջին վկայությունն է պոլիոմիելիտի և հեպատիտ E1-ի ջրային ճանապարհով փոխանցման մասին: Առողջապահության համաշխարհային կազմակերպությունը (ԱՀԿ) դասակարգել է մի քանի ջրային վիրուսային պաթոգեններ, որոնք ունեն միջինից բարձր առողջապահական նշանակության2: Ավանդական վիրուս: Հայտնաբերման մեթոդները հիմնված են ոսկու ստանդարտ qPCR-ի վրա հիմնված տեխնիկայի վրա, որոնք շատ զգայուն և հատուկ են, սակայն պահանջում են հմուտ անձնակազմ լաբորատորիայում թանկարժեք գործիքների միջոցով փորձարկելու համար: Այնուամենայնիվ, ցածր և միջին եկամուտ ունեցող երկրներում (LMICs) սահմանափակ ռեսուրսներով, մարդկային Նմուշի փորձարկումը, ամենայն հավանականությամբ, կգերակայի բնապահպանական ջրի նմուշի մոնիտորինգին: Հետևաբար, ցածր և միջին եկամուտ ունեցող երկրներում ջրի և կեղտաջրերի նմուշների կայուն, իրական ժամանակում մոնիտորինգի համար անհրաժեշտ են այլընտրանքային էժան մեթոդներ՝ որպես հիվանդության առաջացող բռնկման վաղ նախազգուշացում: դրանով իսկ պաշտպանելով նրանց վիրուսի համաճարակի ծանր սոցիալ-տնտեսական ազդեցություններից: Նուկլեինաթթուների համար ցածրարժեք էլեկտրաքիմիական կենսասենսորները կարող են խոստումնալից պոտենցիալ լուծում տալ այս չբավարարված կարիքին: ԴՆԹ-ի այս կենսասենսորներից շատերն աշխատում են այն փաստով, որ ԴՆԹ-ի լրացուցիչ շղթաները անշարժացված են էլեկտրոդի վրա: մակերեսը և հիբրիդացվում են, երբ նմուշում առկա է համապատասխան հաջորդականություն: Այն այնուհետև այն կարող է փոխակերպվել ազդանշանի տարբեր էլեկտրաքիմիական տեխնիկայի միջոցով՝ օգտագործելով ռեդոքս-միջնորդներ, ինչպիսիք են կալիումի երկաթը/ֆերոցիանիդը: Հաղորդվում է, որ փոխկապակցվում է երկշղթա ԴՆԹ-ում (dsDNA)՝ ի լրումն միաշղթայի ԴՆԹ-ի ավելի ոչ սպեցիֆիկ կապի: սենսորային կոնֆիգուրացիաներ 5,6,7,8,9: Թեև ՄԲ-ի միացումը ԴՆԹ-ին ոչ սպեցիֆիկ է, և այս էլեկտրաքիմիական սենսորի առանձնահատկությունը մեծապես կախված է PCR-ի կամ իզոթերմային ուժեղացման համար օգտագործվող այբբենարանների մաքրությունից, այն լավ հարմար է իրական իրականացման համար: - ժամանակի էլեկտրաքիմիական վրա հիմնված qPCR կամ ֆլուորեսցենտային իզոթերմային ուժեղացում՝ որպես ԴՆԹ-ի կոնցենտրացիայի չափման այլընտրանք 9: Այդպիսի ներդրման ժամանակ Won et al. Ոսկու էլեկտրոդների մակերեսը փոփոխվել է 6-mercapto-1-hexanol-ով (MCH) իրական ժամանակում: PCR ամպլիկոնների չափում ՄԲ-ով` օգտագործելով դիֆերենցիալ իմպուլսային վոլտամետրիա (DPV)9: Այլ դեպքերում, Ռամիրեսը և այլոք: Կեղտաջրերում SARS-CoV-2-ի հայտնաբերումը RT-LAMP ռեակցիայի միջոցով, օգտագործելով MB էկրանով տպված էլեկտրոդներով: Պլատինի էլեկտրոդները նույնպես հայտնաբերվել են: օգտագործվում են որպես in situ էլեկտրոդներ միկրոհեղուկ PCR հարթակում, որը նախատեսված է ռեակցիաների ժամանակ ամպլիկոնները էլեկտրոքիմիականորեն հայտնաբերելու համար:
Լճի ջրի նմուշներում խտացված վիրուսային մասնիկներից ստացված ամպլիկոնների էլեկտրաքիմիական հայտնաբերման աշխատանքային հոսքի սխեման:
Վերջերս մենք ցուցադրեցինք SARS-CoV-2 ամպլիկոնների էլեկտրաքիմիական ընկալումը ցածր գնով տպագիր տպատախտակի (PCB) էլեկտրոդներով, որոնք հիմնված են DPV-ի և ցիկլային վոլտամետրիայի (CV) վրա՝ առաջացած ՄԲ-ԴՆԹ կոմպլեքսների կլանման հետևանքով չձևափոխված էլեկտրոդների մակերևույթի վրա: ընթացիկ 11.Մենք հայտնում ենք, որ ավելի երկար ԴՆԹ-ի բեկորները (N1-N2, \({943}\, \hbox), որոնք ձևավորվել են CDC-ի կողմից առաջարկվող N1 առջևի և N2 հակադարձ այբբենարանների միջոցով, համեմատած ավելի կարճ բեկորների {bp}\)) ավելի լավ գծայինություն են ցույց տվել սենսորային արձագանքում: (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) ձևավորվել է N1 առջևի և N1 հակադարձ այբբենարանների միջոցով: Այս ուսումնասիրությունները հաղորդվում են ԴՆԹ-ի նոսրացումների միջոցով, որոնք պատրաստված են նուկլեազազերծ ջրում: Պլատֆորմն օգտագործվել է նաև SARS-CoV-ի հայտնաբերման համար: -2 ամպլիկոն կեղտաջրերի սիմուլյացված նմուշներում (ստացված՝ SARS-CoV-2 ՌՆԹ-ով ընդհանուր ՌՆԹ-ի նմուշները ցցելու միջոցով): Քանի որ ՌՆԹ-ն ենթակա է կտրման մեկուսացման և ներքևում գտնվող մշակման ժամանակ, 12,13 դժվար է ուժեղացնել ավելի երկար բեկորները այս տարասեռ նմուշով: Հետևաբար, կեղտաջրերում SARS-CoV-2 ամպլիկոնի էլեկտրաքիմիական զգայունության ցուցադրումը սահմանափակվում է ավելի կարճ \(72\,\hbox {bp}\) N1 հատվածով:
Այս աշխատանքում մենք ուսումնասիրեցինք ENIG PCB-ի վրա հիմնված էլեկտրաքիմիական ընկալման հնարավորությունը Phi6 ֆագի կենտրոնացված և մեկուսացված լճի ջրի նմուշներից (նկ. 1): Phi6 ֆագերը չափերով (80-100 նմ) ​​համեմատելի են SARS-CoV-2 և SARS-CoV-2-ի հետ: ունի նաև լիպիդային թաղանթ և հասկի սպիտակուց: Այս պատճառներով բակտերիոֆագ Phi6-ը հայտնի փոխարինող է SARS-CoV-2-ի և այլ պաթոգեն ՌՆԹ վիրուսների համար14,15: Ֆագի մասնիկներից մեկուսացված ՌՆԹ-ն օգտագործվել է որպես կԴՆԹ-ի սինթեզի ձևանմուշ, որին հաջորդում է. PCR՝ 117 և 503 բազային զույգ երկարությամբ երկու ԴՆԹ բեկորներ ստանալու համար: Հաշվի առնելով \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 բեկորների ուժեղացման խնդիրը մեր նախորդ աշխատանքում, մենք թիրախավորում ենք միջանկյալ երկարության բեկորները (\(117 \,\hbox {bp}\) և \(503 \,\hbox {bp}\)), հիմնված առկա պրայմերների վրա: Էլեկտրաքիմիական սենսորի արձագանքը համակարգված կերպով ուսումնասիրվել է կոնցենտրացիայի լայն տիրույթում (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) մինչև \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) երկու հատվածների համար էլ ՄԲ-ի առկայությունը, աղի ազդեցությունը սենսորային արձագանքի վրա բնութագրվել և խաչաձև վավերացվել է սպեկտրոֆոտոմետրիկ չափումների միջոցով: Այս աշխատանքի հիմնական ներդրումը հետևյալն է.
ԴՆԹ-ի հատվածի երկարությունը և նմուշում աղի առկայությունը խիստ ազդում են զգայունության վրա:Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ էլեկտրաքիմիական ակտիվությունը կախված է վոլտամետրիկ արձագանքում ՄԲ-ի, ԴՆԹ-ի և սենսորի փոխազդեցության տարբեր մեխանիզմներից՝ կախված ԴՆԹ-ի կոնցենտրացիայից և երկարությունից, իսկ ավելի երկար հատվածները ցույց են տալիս ավելի բարձր զգայունություն, թեև աղը բացասաբար է ազդում էլեկտրաստատիկ փոխազդեցությունների վրա։ ՄԲ և ԴՆԹ:
ԴՆԹ-ի կոնցենտրացիան որոշում է ՄԲ-ԴՆԹ փոխազդեցության մեխանիզմը չփոփոխված էլեկտրոդներում: Մենք ցույց ենք տալիս, որ ՄԲ-ԴՆԹ փոխազդեցության տարբեր մեխանիզմներ կախված են ԴՆԹ-ի կոնցենտրացիայից: {l}}}\), մենք նկատեցինք, որ էլեկտրաքիմիական հոսանքի արձագանքը հիմնականում որոշվում էր էլեկտրոդի վրա ՄԲ-ԴՆԹ-ի կլանմամբ, մինչդեռ ավելի ցածր կոնցենտրացիաներում ԴՆԹ-ի բարձր կոնցենտրացիաներում էլեկտրաքիմիական հոսանքի արձագանքը որոշվում էր ռեդոքսի ստերիկ արգելակմամբ: ակտիվություն ԴՆԹ-ի բազային զույգերի միջև ՄԲ-ի ներդրման շնորհիվ:
ENIG PCB-ի վրա հիմնված վիրուսային նուկլեինաթթուների էլեկտրաքիմիական զննում լճի ջրի նմուշներում Դիտարկումները հաստատվել են Phi6-ով ավելացված \(503\,\hbox {bp}\) ԴՆԹ-ի բեկորների էլեկտրաքիմիական հայտնաբերմամբ, որոնք ստացվել են Powai Lake, IIT Mumbai Campus-ի ջրի նմուշներից: Արդյունք ֆագ.
Իրականացման ցածր արժեքը և լիովին ավտոմատացված մոնիտորինգի համակարգերին, օլիգոնուկլեոտիդներին կամ ապտամերներին ինտեգրվելու ավելի երկար պահպանման ժամկետ ունեցող էլեկտրոդների վրա:
Phage Phi6-ը Cytoviridae ընտանիքի dsRNA վիրուս է, որը վարակում է Pseudomonas syringae: Phi6 ֆագի գենոմը գոյություն ունի 3 բեկորների տեսքով՝ S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07): \,\hbox {Kb}\)) և L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\)) 16,17: Քանի որ Phi6 ֆագը վարակում է ոչ ախտածին BSL-1 Pseudomonas շտամը, այն անվտանգ է օգտագործել: և կարելի է հեշտությամբ աճեցնել լաբորատորիայում: Phage Phi6-ը և նրա հյուրընկալող Pseudomonas syringae-ը գնվել են Felix d'Herelle բակտերիալ վիրուսների տեղեկատու կենտրոնից, Լավալ համալսարան, Կանադա (տեղեկատու կենտրոնի կատալոգի համարներն են՝ համապատասխանաբար HER-102 և HER-1102): Phi6 ֆագը և նրա հյուրընկալողը վերակենդանացել են, ինչպես հրահանգվել է տեղեկատու կենտրոնը: Phi6-ը մաքրվել է թիթեղների լուծմամբ և լուծմամբ՝ վերջնական տիտրերը ստանալու համար \(\մոտ 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { մլ}}\) (ափսե ձևավորող միավորներ/մլիլիտր): ՌՆԹ-ն մեկուսացվել է մաքրված ֆագի մասնիկներից՝ օգտագործելով GenElute Universal Total RNA մաքրման հավաքածուն (Sigma-Aldrich)՝ ըստ արտադրողի ցուցումների: Համառոտ, մաքրված ֆագի Phi6 կասեցումը\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) լուծվեց, և լիզատը բեռնվեց պտտվող սյունակի վրա, որպեսզի ՌՆԹ-ն միանա խեժի սյունակին: Այնուհետև ՌՆԹ-ն զտվում է էլուցիոն լուծույթում \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) տրամադրված է հավաքածուի կողմից: Գնահատեք ՌՆԹ-ի կոնցենտրացիան ներծծման միջոցով \(260\,\hbox {nm}\): ՌՆԹ-ն պահվում էր փոքր չափերով \-ում: ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) մինչև հետագա օգտագործումը:\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA սինթեզի հավաքածու (Bio) -Rad Laboratories) օգտագործվել է որպես cDNA սինթեզի ձևանմուշ՝ հետևելով արտադրողի ցուցումներին: Հակիրճ, cDNA սինթեզի ռեակցիան բաղկացած է 3 քայլից՝ պրիմինգ \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\): )\({5}\,{\hbox {min} }\) , \({20}\,{\hbox {min}}\)-ի հակադարձ տառադարձում \({46}\,{^{\circ-ում) }\hbox {C}}\), և հակառակը Ձայնագրիչը գտնվում է \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)-ում \({1}\,{\hbox {min }}\): Երբ գործարկվում էր 1% ագարոզայի գելի վրա, cDNA-ն ցույց տվեց երեք ժապավեն, որոնք համապատասխանում էին ակնկալվող երեք ՌՆԹ բեկորներին (տվյալները ցուցադրված չեն): Հետևյալ պրայմերները օգտագործվել են 117 և 503 bp երկարությամբ ԴՆԹ-ի երկու բեկորների ուժեղացման համար. օգտագործելով cDNA որպես ձևանմուշ PCR-ի համար miniPCR® mini8 ջերմային ցիկլիչի մեջ.
\(117\,\hbox {bp}\) և \(503\,\hbox {bp}\) այբբենարանները համապատասխանում են M հատվածի 1476-1575 նուկլեոտիդներին և L հատվածի 458-943 նուկլեոտիդներին, համապատասխանաբար թթվային: .Բոլոր ուժեղացված PCR արտադրանքները էլեկտրոֆորացվել են 1% ագարոզայի գելերի վրա, և ուժեղացված թիրախային ԴՆԹ-ն մաքրվել է GeneJET գելի արդյունահանման հավաքածուի միջոցով (Thermo Fisher Scientific):
IIT Մումբայի համալսարանում գտնվող լիճը (Powai Lake, Powai, Mumbai) օգտագործվել է ֆագի մասնիկներ ավելացնելու համար: Լճի ջուրը զտվել է \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) թաղանթով հեռացնելու համար: կասեցված մասնիկներ, այնուհետև ավելացվեց Phi6 ֆագը: Ավելացնել \({1}\,{\hbox {ml}}\) \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}}-ից \) դեպի \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) ֆիլտրացված լճի ջուր, \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\): Փոքր չափաբաժին էր վերապահված է վիրուսային ծանրաբեռնվածության չափման համար՝ ափսեի վերլուծությամբ: Մենք փորձարկեցինք երկու տարբեր եղանակներ՝ ցցված Phi6 վիրուսի մասնիկները խտացնելու համար. (2) ) Պոլիէթիլեն գլիկոլի (PEG) վրա հիմնված վիրուսի համակենտրոնացման մեթոդը հարմարեցվել է Flood et al-ից:20 .Քանի որ պարզվել է, որ PEG-ի վրա հիմնված մեթոդի վերականգնման արդյունավետությունը ավելի լավ է, քան ալյումինի հիդրօքսիդի մեթոդը, PEG-ի վրա հիմնված մեթոդը կիրառվել է լճի ջրի նմուշներից Phi6 մասնիկները խտացնելու համար:
Օգտագործված PEG մեթոդը հետևյալն էր. PEG 8000 և \(\hbox {NaCl}\) ավելացվել են Phi6-ով պատված լճի ջրի նմուշներին՝ ստանալու 8% PEG 8000 և \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Նմուշները ինկուբացվել են թափահարողի վրա\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), այնուհետև ցենտրիֆուգվել է \(4700 \,\hbox {g}\)-ում \({45}\,{\hbox {min}}\): Հեռացրեք վերին հեղուկը և նորից կասեցրեք գնդիկը \({1}\-ում, {\hbox {ml}}\) միևնույն վերին նյութում: Բոլոր spiking-ի և վիրուսի կոնցենտրացիայի փորձերը կատարվել են եռակի: Կոնցենտրացիայից հետո փոքր մասնաբաժինը վերապահվել է ափսեի վերլուծության միջոցով վերականգնման արդյունավետությունը չափելու համար: ՌՆԹ-ն մեկուսացվել է, ինչպես նախկինում նկարագրված է և մաքրվել: փաթեթի կողմից տրամադրված լուծույթի բուֆերում\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\): Քանի որ ՌՆԹ-ի կոնցենտրացիան նմուշից նմուշ կտարբերվի եռակի, \({2}\,{\upmu \) ՌՆԹ-ի hbox {l}}\) օգտագործվում է բոլոր երեքի համար՝ անկախ նրա կոնցենտրացիայից, նմուշների cDNA սինթեզը: cDNA սինթեզն իրականացվել է ինչպես նախկինում նկարագրված: օգտագործվել է որպես ձևանմուշ \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR-ի համար 35 ցիկլով \ (117\,\hbox {bp}\) և \(503\,\hbox {) ուժեղացնելու համար: bp}\) բեկորներ: Այս նմուշները ներկայացված են որպես «1:1», այսինքն՝ առանց նոսրացման: Որպես բացասական հսկողություն ստեղծվել է առանց կաղապարի հսկողություն (NTC), մինչդեռ մաքրված ֆագից մեկուսացված ՌՆԹ-ի միջոցով սինթեզված cDNA-ն ստեղծվել է: որպես դրական հսկողության (PC) ձևանմուշ: Քանակական PCR (qPCR) իրականացվել է Stratagene Mx3000P RT-PCR գործիքում՝ օգտագործելով Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies): Ռեակցիաները ստեղծվել են եռակի, ինչպես նախկինում: նկարագրված է: Ցիկլի շեմը (Ct) գրանցվել է բոլոր նմուշների համար: Բացի այդ, նոսրացված նմուշները եղել են \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\)՝ օգտագործելով cDNA՝ նոսրացված 1:100 լճի ֆիլտրացված ջրի մեջ, որպես \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR 35 ցիկլերի համար: Այս նմուշները ներկայացված են որպես «1:100»:
PCB էլեկտրոդները արտադրվում են՝ օգտագործելով առևտրային մատչելի ցածր գնով Electroless Nickel immersion Gold (ENIG) գործընթացը՝ առանց լրացուցիչ ոսկեպատման անհրաժեշտության: ENIG PCB էլեկտրոդների բնութագրերը մանրամասն ներկայացված են մեր նախորդ աշխատանքում11: ENIG PCB էլեկտրոդների համար էլեկտրոդների մաքրման ավանդական մեթոդները, ինչպիսիք են. պիրանյայի լուծույթը կամ ծծմբաթթվի ցիկլային վոլտամետրիան խորհուրդ չի տրվում, քանի որ դրանք կարող են առաջացնել ոսկու բարակ շերտի կլեպ (հաստություն \(\մոտ\) \(100\,\hbox {nm }\)) և բացահայտել հիմքում ընկած պղնձի շերտերը, որոնք հակված են: 21, 22, 23, 24, 25 կոռոզիայից: Հետևաբար, էլեկտրոդները մաքրեք IPA-ով թրջված անթև շորով: Փորձարկվող նմուշը ինկուբացվել է \({50}\,{\upmu \hbox {M}) }\) ՄԲ-ում \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) հեշտ տեղադրման համար: Մեր նախորդ աշխատանքում , մենք նկատեցինք, որ սենսորի զգայունությունն ու գծայնությունը բարելավվել են՝ ավելացնելով ՄԲ կոնցենտրացիան 11 : Հիմնվելով մեր ավելի վաղ աշխատության մեջ ներկայացված օպտիմալացումների վրա՝ մենք օգտագործեցինք \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) ՄԲ կոնցենտրացիաներ այս հետազոտության մեջ ԴՆԹ-ի ներդրման համար: Երկաշղթա ԴՆԹ-ի (ds-DNA) էլեկտրաքիմիական հայտնաբերումը կարող է իրականացվել անիոնային կամ կատիոնային ինտերկալատորների միջոցով: Թեև անիոնային ինտերկալատորները հայտնաբերում են ԴՆԹ-ն ավելի լավ ընտրողականությամբ, նրանք պահանջում են գիշերային ինկուբացիա, ինչը հանգեցնում է հայտնաբերման ավելի երկար ժամանակի: Մյուս կողմից, կատիոնային ինտերկալատորները, ինչպիսիք են ՄԲ-ն, պահանջում են ավելի կարճ ինկուբացիոն ժամանակներ, մոտավորապես \({1}\,{\hbox {h}}\) ds-DNA6-ի էլեկտրաքիմիական հայտնաբերման համար: Յուրաքանչյուր չափում ենթադրում է փորձարկվող նմուշի բաժանում: էլեկտրոդ\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), այնուհետև մաքրեք IPA-ով խոնավացած կտորով, նախքան այլ նմուշի անցնելը:մեկ չափում: Յուրաքանչյուր նմուշ փորձարկվել է 5 տարբեր էլեկտրոդների վրա, եթե այլ բան նշված չէ: DPV և CV չափումները կատարվել են PalmSens Sensit Smart պոտենցիոստատի միջոցով, իսկ PSTrace ծրագրակազմն օգտագործվել է պոտենցիոստատի կազմաձևման և տվյալների հավաքագրման համար, ներառյալ առավելագույն հոսանքի հաշվարկները: Օգտագործվում են հետևյալ պարամետրերը: DPV և CV չափումների համար.
DPV՝ հավասարակշռության ժամանակ = \(8\,\hbox {s}\), լարման քայլ = \(3\,\hbox {mV}\), զարկերակային լարում = \(25\,\hbox {mV}\) , իմպուլսի տևողությունը = \(50\,\hbox {ms}\), սկանավորման արագությունը = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV՝ հավասարակշռության ժամանակ = \(8\,\hbox {s}\), լարման քայլ = \(3\,\hbox {mV}\), մաքրման արագություն = \({300}\,\hbox {mV/ վրկ) }\)
Պիկ հոսանքները, որոնք ստացվել են \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) ՄԲ-ով կոմպլեքսավորված ԴՆԹ-ի վոլտամոգրամներից. (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV:
DPV և CV վոլտամոգրամներ ստացվել են ENIG PCB էլեկտրոդների վրա \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) ՄԲ կոմպլեքսավորված ԴՆԹ-ով (10–\({20}\,{\ hbox {ng) կոնցենտրացիաներում։ }/{\upmu \hbox {l}}}\) այսինքն 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(117\,\hbox {bp}\ ) և 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(503\,\hbox {bp}\)-ի համար): Ներկայացուցիչ վոլտամմոգրամները ներկայացված են Նկար S1-ում` Լրացուցիչ տեղեկատվության մեջ: Նկար 2-ը ցույց է տալիս արդյունքները: DPV և CV չափումների (գագաթնակետային հոսանք)՝ օգտագործելով գելային մաքրված PCR արտադրանքները: CV չափումների համեմատ, DPV չափումները ցույց են տալիս ավելի բարձր զգայունություն (հոսանքը՝ որպես ԴՆԹ-ի կոնցենտրացիայի ֆունկցիա), քանի որ CV չափումների ֆոնային հզոր հոսանքները թաքցնում են ֆարադայական հոսանքները 26: տուփի սյուժեի յուրաքանչյուր տուփը պարունակում է 5 էլեկտրոդների չափումներ: Բոլոր չափումները օգտագործում են էլեկտրոդների նույն հավաքածուն՝ էլեկտրոդից էլեկտրոդ տատանումների պատճառով չափման սխալներից խուսափելու համար: Մենք նկատեցինք DPV և CV չափված գագաթնակետային հոսանքների աճի միտում ԴՆԹ-ի ավելի ցածր կոնցենտրացիաների համար: , ավելի երկար (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ համեմատած \(117) ) հատվածի: Սա համահունչ է էլեկտրոդների կլանման ակնկալվող միտումին, որը ներկայացված էր մեր նախորդ աշխատանքում: ՄԲ-ԴՆԹ համալիրի կլանումը հեշտացնում է էլեկտրոդի վրա լիցքի փոխանցումը, ինչը նպաստում է գագաթնակետային հոսանքի ավելացմանը: Այլ ուսումնասիրություններ ցույց են տվել օլիգոնուկլեոտիդների չափի և հաջորդականության ազդեցությունը ՄԲ-ԴՆԹ-ի միջակայքի վրա27,28,29,30: Գուանինը -ցիտոզինի (GC) պարունակությունը երկու ամպլիկոններում (\(117\,\hbox {bp}\) և \(503\,\hbox {bp}\)) եղել է մոտավորապես 50%, ինչը ցույց է տալիս, որ դիտարկման տարբերությունը պայմանավորված է. մինչև ամպլիկոնի երկարությունը: Այնուամենայնիվ, ԴՆԹ-ի ավելի բարձր կոնցենտրացիաների համար (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), \(503\,\hbox {bp}) \) և \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) \(117\,\hbox {bp}\)) համար), մենք դիտարկում ենք երկու ուժեղացում. Ենթակառուցվածքների գագաթնակետային հոսանքները կրճատվում են և՛ DPV, և՛ CV չափումների ժամանակ: Դա պայմանավորված է նրանով, որ ՄԲ-ը հագեցնում է և փոխկապակցվում է ԴՆԹ-ի բազային զույգերի միջև, ինչը հանգեցնում է MB31,32-ում վերականգնվող խմբի ռեդոքս ակտիվության ստերիկ արգելակմանը:
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV։
PCR-ի հիմնական խառնուրդներում առկա աղերը խանգարում են ՄԲ-ի և ԴՆԹ-ի էլեկտրաստատիկ փոխազդեցությանը, հետևաբար, ավելացնելով \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) \({50} \,{\) հետ: upmu \hbox {M}}\) ՄԲ գել-մաքրված արտադրանք ՄԲ-ԴՆԹ փոխազդեցության վրա աղի ազդեցությունը ուսումնասիրելու համար: Ինչպես ցույց է տրված Նկար 3-ում, մենք նկատեցինք, որ ԴՆԹ-ի ավելի բարձր կոնցենտրացիաների դեպքում (\(>{2}\,{\) hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) և \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) \(117\,\hbox {bp} \)), DPV-ում և CV-ում Աղի ավելացումը էականորեն չի ազդել չափումների վրա (տե՛ս Գծապատկեր S2-ում Լրացուցիչ տեղեկություններ ներկայացուցչական վոլտամմոգրամների համար): Այնուամենայնիվ, ժ. ԴՆԹ-ի ցածր կոնցենտրացիաները, աղի ավելացումը զգալիորեն նվազեցնում է զգայունությունը, ինչը հանգեցնում է ԴՆԹ-ի կոնցենտրացիայի հոսանքի էական փոփոխության: ՄԲ-ԴՆԹ-ի փոխազդեցությունների և ինտերկալացիայի վրա աղի նման բացասական ազդեցությունները նախկինում հաղորդվել են այլ հետազոտողների կողմից33,34:\(\hbox { Mg}^{2+}\) կատիոնները կապվում են ԴՆԹ-ի բացասական ֆոսֆատային ողնաշարի հետ՝ դրանով իսկ խոչընդոտելով ՄԲ-ի և ԴՆԹ-ի էլեկտրաստատիկ փոխազդեցությանը: ԴՆԹ-ի ավելի բարձր կոնցենտրացիաների դեպքում, ռեդոքս-ակտիվ ՄԲ-ների ստերիկ արգելակումը հանգեցնում է ավելի ցածր գագաթնակետային հոսանքների, ուստի էլեկտրաստատիկ փոխազդեցությունները էականորեն չեն ազդում սենսորի արձագանքի վրա: Հիմնական կետն այն է, որ այս կենսատվիչն ավելի հարմար է ԴՆԹ-ի ավելի բարձր կոնցենտրացիաները հայտնաբերելու համար (հազվադեպ \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) կամ ավելի բարձր), բնապահպանական ջրի նմուշների լիովին ավտոմատացված մշակման համար, որտեղ PCR արտադրանքի գելային մաքրումը հնարավոր չէ իրականացնել:
Կլանման կորի տակ գտնվող տարածքը 600–700 ալիքի երկարության միջակայքի համար \(\hbox {nm}\) ԴՆԹ-ի տարբեր կոնցենտրացիաների համար կոմպլեքսավորված \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) ՄԲ-ով. ) \(503\,\hbox {bp}\) աղով և առանց աղի (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) աղով և առանց աղի (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) ԴՆԹ-ի կոնցենտրացիաները, որոնք համապատասխանում են \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) ՄԲ նմուշներին ԴՆԹ չկա:
Վերոնշյալ արդյունքները լրացուցիչ ստուգելու համար մենք կատարեցինք օպտիկական չափումներ՝ օգտագործելով UV/Vis սպեկտրոֆոտոմետր (Thermo Scientific Multiskan GO), յուրաքանչյուրի համար օգտագործվեցին նմուշները \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\): Չափում: Կլանման նշանը նվազում է ԴՆԹ-ի կոնցենտրացիայի աճով, ինչպես երևում է կլանման կորի տակ գտնվող տարածքի միտումից ալիքի երկարության միջակայքի \(600\,\hbox {nm}\) մինչև \(700\,\hbox {): nm}\), ինչպես ցույց է տրված Նկար 4-ում (կլանման սպեկտրը ցույց է տրված նկ. S3-ում Լրացուցիչ տեղեկություններում): ԴՆԹ-ի կոնցենտրացիաներով նմուշների համար \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox-ից պակաս) {l}}}\), ԴՆԹ պարունակող և միայն ՄԲ նմուշների միջև ընդունման էական տարբերություն չկար (\(503\,\hbox {bp}\) և \(117\,\hbox {bp}\-ի համար): երկարությամբ բեկորներ), որը ցույց է տալիս ռեդոքս-ակտիվ ՄԲ-ի ստերիկ արգելակման բացակայությունը: ԴՆԹ-ի ավելի բարձր կոնցենտրացիաների դեպքում մենք նկատեցինք կլանման ազդանշանի աստիճանական նվազում և նկատեցինք կլանման ավելի փոքր նվազում աղի առկայության դեպքում: Այս արդյունքները վերագրվեցին մոլեկուլային: փոխազդեցություններ և ստերիկ արգելակում հիմքերի կուտակման հետ ԴՆԹ-ի հիբրիդներում: Մեր արդյունքները համահունչ են ՄԲ-ԴՆԹ ինտերկալացիայի սպեկտրոսկոպիկ ուսումնասիրությունների վերաբերյալ գրականության զեկույցներին, որոնք կապում են հիպոքրոմատիկությունը \(\pi\)–\(\pi ^*\-ում էներգիայի նվազեցված մակարդակների հետ։ ) Էլեկտրոնային անցումներ՝ կապված ինտերկալացիոն Շերտերի 36, 37, 38:
Phi6 ֆագի ագարոզայի գելային էլեկտրոֆորեզ. PCR արտադրանք \(117\,\hbox {bp}\) և \(503\,\hbox {bp}\) երկարությամբ լճի ջրի նմուշներից: M-DNA մարկեր;NTC-առանց կաղապարի հսկողություն, համապատասխան ամպլիկոններ պարունակող պրայմերներ;PC դրական հսկողություն;1, 2, 3-չնոսրացված (1:1) լճի ջրի նմուշներ եռակի: Շրջանակը տեսանելի է \(\մոտ 50\,\hbox {bp}\)՝ \(503\,\) չօգտագործված օլիգոնուկլեոտիդների պատճառով: hbox {bp}\) նրբ.
Մենք գնահատեցինք սենսորի օգտակարությունը՝ օգտագործելով Powai լճի ջրի նմուշները, որոնք ցցված էին Phi6 ֆագով: Ֆագով ցցված ջրի նմուշներից մեկուսացված ՌՆԹ-ի կոնցենտրացիաները տատանվում էին 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {): ml}}\), մինչդեռ մաքրված ֆագերի կասեցումներից մեկուսացվածները: ՌՆԹ-ն գնահատվել է որպես \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\)` մոտավորապես 1 վերականգնման արդյունավետությամբ: %.ՌՆԹ-ն հակադարձ տառադարձվել է cDNA-ի և օգտագործվել որպես PCR-ի և qPCR-ի ձևանմուշ: Արտադրանքի չափը հաստատվել է ագարոզայի գելային էլեկտրոֆորեզով (Նկար 5)՝ նախքան սենսորի հետ փորձարկումը: Այս նմուշները չեն մաքրվում գելից և, հետևաբար, պարունակում են PCR-ի բոլոր բաղադրիչները, Ցույց է տրվել, որ qPCR-ի ժամանակ գրանցված Ct արժեքները (Աղյուսակ 1) փոխկապակցված են համապատասխան ցցված ջրի նմուշներից մեկուսացված ՌՆԹ-ի կոնցենտրացիայի հետ: Ct արժեքը ցույց է տալիս լյումինեսցենտային ազդանշանի համար պահանջվող ցիկլերի քանակը: գերազանցել շեմը կամ ֆոնային ազդանշանը: Ct-ի ավելի բարձր արժեքները ցույց են տալիս կաղապարի ավելի ցածր կոնցենտրացիաներ և հակառակը: NTC նմուշների Ct արժեքները այնքան բարձր էին, որքան սպասվում էր: \(\մոտ 3\) Ct արժեքների տարբերությունը դրական հսկողությունը և փորձանմուշը ցույց են տալիս, որ յուրաքանչյուր փորձանմուշ ունի մոտավորապես 1% ձևանմուշ՝ համեմատած դրական հսկողության: Մենք նախկինում քննարկել ենք, որ ավելի երկար ամպլիկոնները հանգեցնում են ավելի լավ զգայունության: Տարասեռ շրջակա միջավայրի նմուշներից մեկուսացված ավելի երկար բեկորների ուժեղացումը դժվար է՝ հաշվի առնելով թերությունները: վիրուսի ցածր կոնցենտրացիայի և ՌՆԹ-ի քայքայման դեպքում: Այնուամենայնիվ, մեր վիրուսի հարստացման և PCR ուժեղացման արձանագրության միջոցով մենք կարողացանք հաջողությամբ ուժեղացնել \(503\,\hbox {bp}\) հատվածը էլեկտրաքիմիական զգայության համար:
Նկար 6-ը ցույց է տալիս \(503\,\hbox {bp}\) հատվածի ամպլիկոնի էլեկտրաքիմիական սենսորի արդյունքները, երկուսն էլ օգտագործելով չնոսրացված cDNA որպես ձևանմուշ (1:1), և 100 անգամ նոսրացված cDNA որպես ձևանմուշ (1:100 ) կատարված PCR: , համեմատած NTC-ի և PC-ի հետ (տես Նկար S4-ը Լրացուցիչ տեղեկատվության ներկայացուցչական վոլտամմոգրաֆիայի համար): Նկար 6-ի տուփի սյուժեի յուրաքանչյուր տուփ պարունակում է չափումներ երեք նմուշներից 5 էլեկտրոդներով: Նույն էլեկտրոդները օգտագործվել են բոլոր նմուշները չափելու համար՝ էլեկտրոդի պատճառով առաջացած սխալներից խուսափելու համար: - էլեկտրոդի տատանումներ: CV չափումների համեմատ, DPV չափումները ցույց են տալիս ավելի լավ լուծում՝ փորձարկման և ԱՀ նմուշները NTC-ներից տարբերելու համար, քանի որ, ինչպես նախկինում նշվեց, Ֆարադայական հոսանքները թաքնված են վերջիններիս մեջ ֆոնային հզոր հոսանքների պատճառով: Ավելի երկար ամպլիկոնների համար մենք նկատեցինք, որ բացասական հսկողությունը (NTC) հանգեցրեց ավելի բարձր CV և DPV գագաթնակետային հոսանքների՝ համեմատած դրական հսկողության, մինչդեռ դրական և չնոսրացված փորձանմուշները ցույց տվեցին DPV գագաթնակետային հոսանքների գագաթնակետային նույնական բարձրություններ: Չափված միջին և միջին արժեքները յուրաքանչյուր չնոսրացվածի համար (1:1): ) թեստային նմուշը և ԱՀ-ն կարող են հստակորեն լուծվել NTC նմուշի սենսորային ելքից, մինչդեռ 1:100 նոսրացված նմուշի լուծաչափը ավելի քիչ է արտահայտված: cDNA-ի 100 անգամ նոսրացման դեպքում մենք գել էլեկտրոֆորեզի ընթացքում որևէ ժապավեն չենք նկատել: (գծերը ցույց չեն տրված Նկար 5-ում), և համապատասխան DPV և CV գագաթնակետային հոսանքները նման էին NTC-ի համար ակնկալվողներին: \(117\,\hbox {bp}\) հատվածի արդյունքները ներկայացված են Լրացուցիչ տեղեկություններում: Բացասականը հսկողությունը առաջացրել է PCB սենսորից էլեկտրաքիմիական արձագանք՝ էլեկտրոդի վրա ազատ ՄԲ-ի կլանման և միաշղթա այբբենարանի օլիգոնուկլեոտիդի հետ ՄԲ-ի փոխազդեցության պատճառով: Հետևաբար, ամեն անգամ, երբ նմուշը փորձարկվում է, պետք է գործարկվի բացասական հսկողություն և Փորձարկման նմուշի գագաթնակետային հոսանքը՝ համեմատած բացասական հսկողության միջոցով ստացված առավելագույն հոսանքի հետ՝ դիֆերենցիալ (հարաբերական) չափման հասնելու համար39,40՝ փորձանմուշը որպես դրական կամ բացասական դասակարգելու համար:
(ա) DPV և (բ) CV գագաթնակետային հոսանք՝ լճի ջրի նմուշներում \(503\,\hbox {bp}\) բեկորների էլեկտրաքիմիական հայտնաբերման համար: Փորձնական նմուշները չափվել են եռակի և համեմատվել են առանց կաղապարի վերահսկման (NTC) և դրական հսկողություն (PC):
Մեր գտածոները ցույց են տալիս տարբեր մեխանիզմներ, որոնք ազդում են էլեկտրաքիմիական սենսորների աշխատանքի վրա տարբեր երկարությունների ամպլիկոնների համար տարբեր ԴՆԹ-ների համար, որոնց կոնցենտրացիաները ստուգվում են օպտիկական չափումներով՝ օգտագործելով UV/Vis սպեկտրոֆոտոմետրը: \(500\,\hbox {bp}\) կարելի է հայտնաբերել ավելի բարձր զգայունությամբ, և որ նմուշում աղի առկայությունը չի ազդում ԴՆԹ-ի զգայունության կոնցենտրացիայի վրա, որն ազդում է ավելի բարձր զգայունության վրա (հազվադեպ \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) և ավելի բարձր): Բացի այդ, մենք ուսումնասիրել ենք տարբեր տեսակի նմուշների ազդեցությունը, ներառյալ գելով մաքրված ամպլիկոնները՝ ավելացված աղով և առանց աղի, և լճի ջրի նմուշների ավելացում DPV և CV չափումների ժամանակ:Մենք նկատեցինք, որ DPV-ն ավելի լավ լուծում է ապահովում, քանի որ ֆոնային կոնդենսիվ հոսանքը նույնպես ազդում է CV-ի չափման վրա՝ դարձնելով այն ավելի քիչ զգայուն:
Ավելի երկար բեկորների ուժեղացումը կախված է վիրուսային գենոմային ՌՆԹ-ի ամբողջականությունից: Մի քանի ուսումնասիրություններ ցույց են տվել, որ ավելի երկար բեկորների ուժեղացումը միշտ չէ, որ արդյունավետ է շրջակա միջավայրում ՌՆԹ-ի քայքայման և մեկուսացման ընթացքում զուգավորման հնարավորության պատճառով11,41,42,43,44: Մենք նկատեցինք, որ PEG-ի վրա հիմնված վիրուսի կոնցենտրացիայի մեթոդը ավելի արդյունավետ էր Phi-6 ֆագի խտացման համար լճի ջրի նմուշներում, քան ալյումինի հիդրօքսիդի վրա հիմնված վիրուսի կոնցենտրացիայի մեթոդը: ԴՆԹ-ի երկար բեկորները հայտնաբերելու ունակությունն ապացուցեց, որ հաղթահարում է մուլտիպլեքսային PCR-ի պահանջը: ուժեղացնել մի քանի ավելի կարճ երկարությամբ կաղապարներ և նվազեցնել խաչաձև յուրահատկության հնարավորությունը:
Կենսաբանական նմուշները քիչ են, ուստի անհրաժեշտություն կա նախագծել կենսատվիչ, որը պահանջում է նվազագույն նմուշներ փորձարկման համար: Այս հետազոտության մեջ օգտագործվող ENIG PCB էլեկտրոդները պահանջում են միայն \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\): ) նմուշներ՝ էլեկտրոդների արդյունավետ տարածքը ծածկելու համար փորձարկման համար: Բացի այդ, նույն էլեկտրոդը կարող է կրկին օգտագործվել մաքրումից հետո, նախքան հաջորդ նմուշը տրամադրելը: Ընդլայնված նմուշները չեն պահանջում որևէ այլ քիմիական նյութի ավելացում, բացի մեթիլեն կապույտից, որը էժան է: և սովորաբար օգտագործվող քիմիական: Քանի որ յուրաքանչյուր էլեկտրոդի արտադրությունը արժե մոտ $0,55 (կամ INR 40), այս կենսացուցիչը կարող է լինել ծախսարդյունավետ այլընտրանք առկա հայտնաբերման տեխնոլոգիաներին: Աղյուսակ 2-ը ցույց է տալիս այս աշխատանքի համեմատությունը այլ սենսորների հետ, որոնք երկար ժամանակ գրված են գրականության մեջ: ԴՆԹ-ի բեկորները տարասեռ նմուշներում:
Հաշվի առնելով, որ ՄԲ-ի վրա հիմնված էլեկտրաքիմիական հայտնաբերման արձանագրությունները հիմնված են PCR-ի առանձնահատկությունների վրա, այս մեթոդի հիմնական սահմանափակումը տարասեռ նմուշներում ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացման հնարավորությունն է, ինչպիսիք են կեղտաջրերը և լճի ջուրը կամ օգտագործելով ցածր մաքրության պրայմերներ: Բարելավել զգայունությունը: Չմաքրված PCR արտադրանքի ԴՆԹ-ի հայտնաբերման էլեկտրաքիմիական հայտնաբերման մեթոդներ՝ օգտագործելով չփոփոխված ENIG PCB էլեկտրոդներ, անհրաժեշտ է ավելի լավ հասկանալ չօգտագործված dNTP-ների և պրայմերների կողմից առաջացած սխալները և օպտիմալացնել ռեակցիայի պայմանները և փորձարկման արձանագրությունները: Լրացուցիչ ֆիզիկաքիմիական պարամետրեր, ինչպիսիք են pH-ը, ջերմաստիճանը և կենսաբանական Ջրի նմուշի թթվածնի պահանջարկը (BOD) նույնպես կարող է անհրաժեշտ լինել չափման՝ չափման ճշգրտությունը բարելավելու համար:
Եզրափակելով՝ մենք առաջարկում ենք էժան էլեկտրաքիմիական ENIG PCB սենսոր՝ շրջակա միջավայրի (լճի ջրի) նմուշներում վիրուսի հայտնաբերման համար: Ի տարբերություն անշարժացված օլիգոնուկլեոտիդային էլեկտրոդների կամ հատուկ սուբստրատների ԴՆԹ-ի զգայության համար, որոնք պահանջում են կրիոգեն պահեստավորում՝ զգայունությունը պահպանելու համար, 53,54 մեր տեխնիկան օգտագործում է չփոփոխված PCB: էլեկտրոդներ ավելի երկար պահպանման ժամկետով և առանց հատուկ պահպանման պահանջների և, հետևաբար, հարմար են LMIC-ներում օգտագործվող նմուշների ավտոմատ մշակմամբ չափման լուծույթների մշակման համար: Կենսասենսորն օգտագործում է էժան ԴՆԹ-ինտերկալացնող ռեդոքս ներկեր (MB)՝ թիրախային ամպլիկոնների արագ հայտնաբերման համար: Ոչ հատուկ ուժեղացում: տարածված շրջակա միջավայրի նմուշներում նվազեցնում է այս զգայական մեթոդի յուրահատկությունը՝ պայմանավորված ՄԲ-ների ոչ սպեցիֆիկ կապով միակողմանի և երկշղթա օլիգոնուկլեոտիդների հետ: Հետևաբար, այս թեստի առանձնահատկությունը կախված է պրայմերների օպտիմալացումից և PCR ռեակցիայի պայմաններից: Բացի այդ, CV-ն և DPV-ի գագաթնակետային հոսանքները, որոնք ստացվում են փորձարկված նմուշներից, պետք է մեկնաբանվեն յուրաքանչյուր թեստի համար բացասական հսկողության (NTC) ստացված պատասխանների համեմատ: Այս աշխատանքում ներկայացված էլեկտրաքիմիական սենսորների ձևավորումներն ու մեթոդները կարող են ինտեգրվել ավտոսմայլիչների հետ՝ լիովին ավտոմատացված և ցածր մակարդակ ստեղծելու համար: - ծախսերի լուծում, որը կարող է հավաքել և վերլուծել նմուշները և անլար կերպով արդյունքները հետ ուղարկել լաբորատորիա:
Cashdollar, J. & Wymer, L. Ջրի նմուշներից վիրուսների սկզբնական կոնցենտրացիայի մեթոդներ. վերջին ուսումնասիրությունների վերանայում և մետա-վերլուծություն:Application.microorganism.115, էջ 1-11 (2013):
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Waterborne viruses: Barriers to safe drinking water.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015):
Shrestha, S. et al. Կեղտաջրերի համաճարակաբանությունը ցածր և միջին եկամուտ ունեցող երկրներում COVID-19-ի ծախսարդյունավետ լայնածավալ հսկողության համար. մարտահրավերներ և հնարավորություններ: Ջուր 13, 2897 (2021):
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012):
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN. Methylene blue որպես ոսկու ենթաշերտերի վրա անշարժացած մեկ և երկշղթա օլիգոնուկլեոտիդների էլեկտրաքիմիական տարբերակիչ: Analyst 126, 1756-1759 (2001):
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparison of Cation and Anion Intercalators for Electrochemical Transduction of DNA Hybridization by Long Range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004):
Wong, EL & Gooding, JJ Լիցքի փոխանցում ԴՆԹ-ի միջոցով. ընտրովի էլեկտրաքիմիական ԴՆԹ biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006):
Fang, TH et al. Իրական ժամանակում PCR միկրոհեղուկ սարք՝ միաժամանակյա էլեկտրաքիմիական հայտնաբերմամբ. կենսաբանական սենսոր. Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009 թ.):
Win, BY et al. Ազդանշանային մեխանիզմի ուսումնասիրություն և իրական ժամանակի էլեկտրաքիմիական PCR համակարգի աշխատանքի ստուգում, որը հիմնված է մեթիլեն կապույտի և ԴՆԹ-ի փոխազդեցության վրա: Վերլուծաբան 136, 1573–1579 (2011):
Ramirez-Chavarria, RG et al.Loop միջնորդավորված իզոթերմային ուժեղացման վրա հիմնված էլեկտրաքիմիական սենսոր՝ կեղտաջրերի նմուշներում sars-cov-2-ի հայտնաբերման համար:J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022):
Kumar, M. et al. SARS-CoV-2 ամպլիկոնների էլեկտրաքիմիական զննում PCB էլեկտրոդներով: Սենսորն ակտիվացված է: B Chemistry.343, 130169 (2021):
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. SARS-CoV-2 RNA-ի արդյունավետ հայտնաբերում կեղտաջրերի պինդ հատվածում.science.general environment.763, 144587 (2021):
Alygizakis, N. et al. Կեղտաջրերում SARS-CoV-2-ի հայտնաբերման վերլուծական մեթոդներ. արձանագրություն և ապագա հեռանկարներ.
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Enveloped bacteriophage Phi6 (SARS-CoV-2-ի փոխնակ) գոյատևումը գոլորշիացված թուքի կաթիլներում, որոնք նստած են ապակե մակերեսների վրա: Գիտություն: Rep.10, 1–10 (2020):
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ SARS-CoV-2 փոխնակ (Phi6) բնապահպանական կայունությունը ազատ ապրող ամեոբայում:Ջրի առողջություն 20, 83 (2021):
Mindich, L. Երկաշղթա ՌՆԹ բակտերիոֆագի երեք գենոմային բեկորների ճշգրիտ փաթեթավորում\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999):
Pirttimaa, MJ & Bamford, DH RNA phage\(\varphi\)6 փաթեթավորման շրջանի երկրորդական կառուցվածքը:RNA 6, 880-889 (2000):
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – Արագ և արդյունավետ արձանագրություն բակտերիոֆագների լաբորատոր պաշարների պատրաստման համար: PeerJ 4, e2261 (2016):